发明名称：一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵 方法以及干菌粉制备 方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域， 尤其是涉及一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵 方 法以及制备得到的干菌粉。

背景技术

[0002] 微生态制剂是经特殊工艺制成的微生物菌剂， 含有对宿主有益的微生物。 微生 态制剂具有天然无毒、 促进宿主健康的作用， 在人体保健、 动物健康领域应用 日益广泛。

[0003] 乳酸菌类和芽孢杆菌类微生态制剂是饲料工业 使用最为广泛的两大品种。 乳酸 菌类主要包括乳酸菌、 双歧杆菌等， 芽孢杆菌类主要包括枯草芽孢杆菌、 地衣 芽孢杆菌等。

[0004] 乳酸菌类微生态制剂通过产乳酸、 改变肠道 pH、 调理肠道微环境发挥作用。 此 类微生态制剂抗逆性差， 在加工过程中易失去活性。 芽孢杆菌类微生态制剂能 产生芽孢， 可耐受高温、 胃酸、 胆碱等不良环境， 抗逆性强， 但其不具备乳酸 菌类的肠道调理功能。

[0005] 凝结芽孢杆菌 （Bacillus coagulans) ， 革兰阳性菌， 是一种产乳酸的芽孢杆菌

。 凝结芽孢杆菌特点在于： 1， 肠道厌氧环境下产乳酸， 形成酸性环境， 抑制病 原微生物生长， 有益于宿主健康； 2， 能以芽孢状态存在， 耐高温、 耐胃酸、 耐 胆碱、 环境抗逆性强。 可以说， 凝结芽孢杆菌兼具乳酸菌类和芽孢杆菌类微生 态制剂的优点。

[0006] 由于良好的饲喂效果和加工性能， 凝结芽孢杆菌已列入饲料添加剂名录， 成为 饲料微生态制剂行业的重要成员。

[0007] 人们对凝结芽孢杆菌的关注日益增多， 幵展了大量研究工作。 ZL200710122111 .X公布了一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备� �� 发酵液活菌数最高 5.0x10 9 cfu/mL。 ZL 200810235512.0公布了凝结芽胞杆菌 CGMCC No.2602的液态发酵工 艺。 IT发酵罐中， 发酵液总菌数 6.0x 10 ⁹ cfu/mL、 芽孢数 5.8x10 ⁹

cfu/mL、 芽孢率 96.7<¾。 ZL 201110428027.7公布了一种凝结芽孢杆菌 CICC No.20138的固态发酵工艺， 菌体量 1.16x 10 ^1Q cfu/g、 芽孢率 77.2<¾。 ZL

201210464404.7公布了凝结芽胞杆菌 CGMCC No.6681的反馈补料培养工艺， 发 酵液活菌数最高 5.8x10 fu/mL。

[0008] 尽管业界幵展了大量研究工作， 但市场上凝结芽孢杆菌的售价依然居高不下， 产品推广有一定难度。 究其原因， 还是凝结芽孢杆菌产业化发酵水平低、 加工 过程菌体损失高、 成品菌体含量低。 这些不利因素直接造成产品价格高， 影响 凝结芽孢杆菌的普及应用。

技术问题

[0009] 针对现有技术存在的上述问题， 本申请人提供了一种凝结芽孢杆菌及其高密度 发酵方法以及干菌粉制备方法。 本发明是新幵发的凝结芽孢杆菌， 具有高密度 发酵和高菌体含量的特点， 有利于降低产品成本， 有助于产品市场推广， 对于 促进畜禽健康养殖具有积极意义。

问题的解决方案

技术解决方案

[0010] 本发明的技术方案如下：

[0011] 本发明提供的凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulcmi) 已保存于中国典型培养物保 藏中心， 菌种保藏号 CCTCC M 2015273。 具体是通过以下步骤来实现的：

[0012] 1、 凝结芽孢杆菌的筛选

[0013] 从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品 称取 2g， 加入 98ml无菌生理盐水 ， 80°C热处理 lOmin后， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20min， 吸取上清液 lml 加入 LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。 通过对菌株进行形态学观察、 生理生 化实验、 16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种� �

[0014] 最终得到编号为 ZS-007的菌种， 鉴定为凝结芽孢杆菌 Bacillus coagula ) 。

[0015] ZS-007于 2015年 5月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2015273。

[0016] 2、 凝结芽孢杆菌的产乳酸能力测试 [0017] 将凝结芽孢杆菌 ZS-007接种于产酸能力测试培养基中， 并在 37°C下静置培养进 行产乳酸能力测试。 所用产酸能力测试培养基组成为： 葡萄糖 20 g/L， 蛋白胨 10 g/L， 酵母粉 5 g/L， 磷酸二氢钾 2 g/L， 硫酸镁 l g/L， 硫酸锰 0.5

g/L。 培养基用 10<¾NaOH调节 pH7.0后， 121 °C灭菌 20 min。

[0018] 利用 HPLC检测发酵液中的乳酸含量， 结果见图 1。 从图 1中可以看到乳酸含量 在 10g/L左右。

[0019] 3、 凝结芽孢杆菌高密度发酵

[0020] (1) 菌种活化

[0021] 将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养 基上， 25-37°C下培养 24-48hr; 然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面， 25-37°C下培养 24-48hr。

[0022] 营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成 均为： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏

3g/L, 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.2-7.4。

[0023] (2) 摇瓶培养

[0024] 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 18-30hr。

[0025] 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L，

pH7.2-7.4。 250mL摇瓶装液量为 20mL， 500mL摇瓶装液量为 50mL。

[0026] 培养条件： 摇瓶转速 200r/min， 温度 25-37°C。

[0027] (3) 种子罐扩培

[0028] 扩培菌种以用于后期发酵。 种子罐培养基组成： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4。 种子罐体积 10-1000L, 装液量 50-80%。

[0029] 培养条件： 搅拌转速 180-250r/min， 通气量 0.5-1.0vvm， 温度 25-37°C， 培养吋 间 18-30hr。

[0030] (4) 发酵罐发酵

[0031] 以 0.1%-10<¾的接种量将种子液接入发酵罐， 发酵培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10 g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 发 酵罐体积 l-50m ³ ， 装液量 50-80%。

[0032] 培养条件： 搅拌转速 100-200r/min， 通气量 0.5-0.8vvm， 温度 25-37°C， 培养吋 间 16-48hr。 [0033] 取发酵液镜检吋， 当 90%以上的菌体都形成芽孢吋， 即到发酵终点， 得到最终 发酵液。

[0034] 采用平板涂布法测定最终发酵液活菌数和芽孢 数， 并计算芽孢率。 其中， 芽孢 率为芽孢数与活菌数的比值。 所用培养基为营养琼脂培养基： 蛋白胨 10g/L， 牛 肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.2-7.4。 测定最终发酵液活菌数吋 ， 梯度稀释后测定； 测定芽孢数吋， 取最终发酵液于 80°C热处理 10min， 梯度稀 释后测定。 最终发酵液中活菌数 1.5x10 ^1Q cfu/mL以上、 芽孢数1.4 10 /!1^以 上、 芽孢率 90.8%以上。

[0035] 4、 干菌粉制备

[0036] 最终发酵液离心后收集湿菌泥， 采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。 操作条件为： 进风温度 210 °C， 出风温度 100 °C。 干菌粉中活菌数 8.0x10 "cfu/g以上。

[0037] 所得干菌粉可与淀粉、 葡萄糖、 以及其它符合标准的载体等填充剂混合后得到 凝结芽孢杆菌微生态制剂。

发明的有益效果

有益效果

[0038] 本发明有益的技术效果在于：

[0039] 本发明采用液体发酵工艺， 发酵液中凝结芽孢杆菌活菌数 1.52x10 i。cfu/mL以 上、 芽孢数 1.38x10 W cfu/mL以上、 芽孢率 90.8%以上。 喷雾干燥获得的干菌粉中 ， 活菌数 8.0x10 11 cfu/g以上。 干菌粉可与淀粉、 葡萄糖等填充剂混合后得到凝结 芽孢杆菌微生态制剂。

[0040] 本发明生产工艺简单稳定， 发酵液中活菌数高， 可直接减少应用成本， 有利于 产品推广。 这对于推动凝结芽孢杆菌微生态制剂的广泛应 用具有意义。

对附图的简要说明

附图说明

[0041] 图 1为本发明凝结芽孢杆菌的 HPLC检测发酵液中的乳酸含量。

本发明的实施方式 [0042] 实施例 1 : 凝结芽孢杆菌的筛选

[0043] 从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品 称取 2g， 加入 98ml无菌生理盐水 ， 80°C热处理 lOmin后， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20min， 吸取上清液 1 ml加入 LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。 通过对菌株进行形态学观察、 生理 生化实验、 16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种� �

[0044] 最终得到编号为 ZS-007的菌种， 鉴定为凝结芽孢杆菌 Bacillus coagula ) 。

[0045] ZS-007于 2015年 5月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2015273。

[0046]

[0047] 实施例 2: lm ³ 发酵罐制备

[0048] 菌种活化： 将实施例 1得到的菌种接种至营养琼脂斜面培养基上， 30°C下培养 2 4hr后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面， 30°C下培养 24hr。 营养琼脂斜面培养基 及营养琼脂茄子瓶的组成均为： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.2-7.4。

[0049] 摇瓶培养： 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 20hr。 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4 , 摇瓶装液量 50mL/500mL 三角瓶。 培养条件： 摇瓶转速 200r/min， 温度 30。C。

[0050] 发酵罐发酵： 收集 20瓶三角瓶液体作为种子接入 lm 3发酵罐。 lm 3发酵罐装液 量 65%。 培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10

g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 将培养好的种子接入发酵罐 进行发酵。 培养条件： 搅拌转速 200r/min， 通气量 0.8wm， 温度 30°C， 培养吋间 40-44hr。

[0051] 发酵液中， 活菌数 1.52x 10 ^1Q cfu/g， 芽孢数 1.38x10 ^1Q cfu/g， 芽孢率 90.8<¾。

[0052]

[0053] 实施例 3 : 3m ³ 发酵罐制备

[0054] 菌种活化同实施例 2。

[0055] 摇瓶培养： 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 20hr。 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4, 摇瓶装液量为 20mL/250mL三角瓶。 培养条件： 摇瓶转速 200r/ min， 温度 30°C。

[0056] 种子罐扩培： 收集 10瓶 250mL摇瓶种子液用于种子罐接种。 种子罐培养基组成 ： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4。 种子罐体积 30L， 装液 量 80<¾。 培养条件： 搅拌转速 200r/min， 通气量 0.8vvm， 温度 30°C， 培养吋间 20 hr。

[0057] 发酵罐发酵： 3m 3发酵罐装液量 70%。 培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10 g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 将培养好的 种子接入发酵罐进行发酵。 培养条件： 搅拌转速 150r/min， 通气量 0.7 _V vm， 温度 35°C， 培养吋间 36-42hr。

[0058] 发酵液中， 活菌数 1.79x10 ¹⁽⁾ cfu/g， 芽孢数 1.72x10 ¹⁽⁾ cfu/g， 芽孢率 96.1<¾。

[0059]

[0060] 实施例 4: 30m 3发酵罐和干菌粉制备

[0061] 菌种活化同实施例 2

[0062] 摇瓶培养： 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 20hr。 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4, 摇瓶装液量 50mL/500mL 三角瓶。 培养条件： 摇瓶转速 200r/min， 温度 30。C。

[0063] 种子罐扩培： 收集 20瓶 500mL摇瓶种子液用于种子罐接种。 种子罐培养基组成 ： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4。 种子罐体积 500L， 装 液量 75%。 培养条件： 搅拌转速 200r/min， 通气量 0.8vvm， 温度 30°C， 培养吋间 20hr。

[0064] 发酵罐发酵： 30m 3发酵罐装液量 70%。 培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10 g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 将培养好的 种子接入发酵罐进行发酵。 培养条件： 搅拌转速 100r/min， 通气量 0.6v _V m， 温度 35°C， 培养吋间 40-45hr。

[0065] 发酵液中， 活菌数 1.99x10 ¹⁽ cfu/g， 芽孢数 1.92x10 ¹⁽ cfu/g， 芽孢率 96.5<¾。

[0066] 离心收集湿菌泥， 采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。 操作条件为： 进风温度 210 °C， 出风温度 100 °C。 干菌粉中活菌数 8.32x10 "cfu/ga [0067]

[0068] 实施例 5: 干菌粉制备

[0069] 采用实施例 4中的发酵方法获得凝结芽胞杆菌发酵液， 离心收集湿菌泥， 采用 喷雾干燥工艺得到干菌粉。 操作条件为： 进风温度 220 °C， 出风温度 100 °C。 干 菌粉中活菌数 6.54x10 "cfu/ga

[0070]

[0071] 对于本领域技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 这些改进或变 换都属于本发明所附权利要求的保护范围。

打印件 (原件为电子形式)

0-1 PCT/RO/134表 (SAFE)有关保藏的微生物

或其他生物材料的说明 (PCT细则笫 13条

之二）

0-1-1 软件版本 CEPCT

版本 1.01.00 MT/FOP 20140331/0.20.5.21

0-2 国际申请号 PCT/CN2016/090895

0-3 申请人或代理人的档案号 HY0082

1 下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

1-1 页码 0015

1-2 行号： 1-2

1-3 保藏事项

1-3-1 保藏单位名称 中国典型培养物保藏中心

1-3-2 保藏单位地址 中国湖北省武汉市武汉大学，邮政编码: 430072， Hubei

(CN)。

1-3-3 保藏日期 2015年 5月 03日（03.05.2015)

1-3-4 保藏号 CCTCC M2015273

1-4 补充说明

1-5 本说明是对下列指定国 所有指定国

1-6 单独提交的说明

这些说明将随后提交给国际局 由受理局填写

0-4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

0-4-1 受权官员 由国际局填写

0-5 国际局收到本表格日期：

0-5-1 受权官员