技术领域

[0001] 本发明涉及微生物应用技术领域， 尤其是涉及一种应用于观赏鱼的、 含有凝结 芽孢杆菌复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用 。

背景技术

[0002] 随着生活水平不断提高， 观赏鱼已进入日常生活， 给人们带来欢乐。 家庭养鱼 过程中， 水体经常出现浑浊甚至发绿发黑等现象， 严重吋直接导致观赏鱼死亡 。 引起这种现象的原因在于未被食用的饵料和观 赏鱼排泄物污染了水体。

[0003] 目前， 人们通常采用定期更换新鲜水或者使用含有光 合细菌 （PSB) 的微生物 净水剂产品来保持水体干净。

[0004] 定期更换新鲜水固然能维持观赏鱼养殖水质， 但替换出的脏水会被排入下水道 或者进入环境， 形成新的污染源。

[0005] PSB是一类光能厌氧性微生物， 能以污水中的有机物为营养进行光合作用， 从 而净化水质。 农林生介绍了一种以光合菌群为主的复合微生 物净水剂在观赏鱼 养殖中的有益效果 （复合微生物净水剂对观赏鱼水族箱养殖水质 的影响试验， 广西农业科学， 2008年第 39卷第 6期） 。 PSB有一个缺点， 即保质期不长， 出厂 后短期内必须用完， 否则微生物大量死亡。 因此， 在使用含有光合细菌 （PSB) 的微生物净水剂产品吋， 经常会发现产品前期有效， 但过了两三个月以后效果 减弱甚至没有效果。

技术问题

[0006] 针对现有技术存在的上述问题， 本申请人提供了一种应用于观赏鱼的、 含有凝 结芽孢杆菌的复合芽孢杆菌微生物净水剂及其 应用。 本发明可降解观赏鱼养殖 水体中的底部残饵和排泄物， 实现净化水体， 节省换水人工并减少换水带来的 环境污染问题； 产品保质期 1年， 利于日常采购和使用。

问题的解决方案 技术解决方案

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆 菌微生物净水剂， 由以下菌种组 成：

[0009] 名称

[0010] 枯草芽孢杆菌 CCTCC NO: M2011443 1.0x 10 ⁷ -3.0χ10 ⁹ cfu/g

[0011] 地衣芽孢杆菌 CCTCC NO: M2012457 1.0x 10 ⁷ - 1.5x10 ⁹ cfu/g

[0012] 凝结芽孢杆菌 CCTCC NO: M2015273 0.5x 10 ⁷ - 1.0x10 ⁹ cfu/g

[0013] 短小芽孢杆菌 0.1x 10 ⁷ -0.5xl0 ⁹ cfu/g

[0014] 巨大芽孢杆菌 0.4x 10 ⁷ - 1.0x10 ⁹ cfu/g

[0015] 解淀粉芽孢杆菌 0.5x10 ⁷ - 1.0x10 ⁹ cfu/g

[0016] 侧孢芽孢杆菌 1.0x 10 ⁷ - 1.0x10 ⁹ cfu/g

[0017] 蜡样芽孢杆菌 0.5x 10 ⁷ - 1.0x10 ⁹ cfu/g

[0018] 合计 5.0x 10 ⁷ - 1. Ox 10 ¹⁰ cfu/g _;

[0019] 所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌 ( Bacillus coagulans) ZS-007

中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2015273

[0020] 本发明还提供了一种应用于观赏鱼的复合芽孢 杆菌微生物净水剂的应用方法， 将复合芽孢杆菌微生物净水剂直接投入水体， 用量 0.1-0.5g/m 3水体， 每 8~12天 使用一次。

[0021] 1、 凝结芽孢杆菌的筛选

[0022] 从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品 称取 2g， 加入 98ml无菌生理盐水

80°C热处理 lOmin后， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20min， 吸取上清液 lml 加入 LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。 通过对菌株进行形态学观察、 生理生 化实验、 16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种� �

[0023] 最终得到编号为 ZS-007的菌种， 鉴定为凝结芽孢杆菌 Bacillus coagula )

[0024] ZS-007于 2015年 5月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2015273

[0025] 2、 凝结芽孢杆菌高密度发酵 [0026] (1) 菌种活化

[0027] 将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养 基上， 25-37°C下培养 24-48hr; 然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面， 25-37°C下培养 24-48hr。

[0028] 营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成 均为： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏

3g/L, 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.2-7.4。

[0029] (2) 摇瓶培养

[0030] 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 18-30hr。

[0031] 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L，

pH7.2-7.4。 250mL摇瓶装液量为 20mL， 500mL摇瓶装液量为 50mL。

[0032] 培养条件： 摇瓶转速 200r/min， 温度 25-37°C。

[0033] (3) 种子罐扩培

[0034] 扩培菌种以用于后期发酵。 种子罐培养基组成： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4。 种子罐体积 10-1000L, 装液量 50-80%。

[0035] 培养条件： 搅拌转速 180-250r/min， 通气量 0.5-1.0vvm， 温度 25-37°C， 培养吋 间 18-30hr。

[0036] (4) 发酵罐发酵

[0037] 以 0.1%-10<¾的接种量将种子液接入发酵罐， 发酵培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10 g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 发 酵罐体积 l-50m ³ ， 装液量 50-80%。

[0038] 培养条件： 搅拌转速 100-200r/min， 通气量 0.5-0.8vvm， 温度 25-37°C， 培养吋 间 16-48hr。

[0039] 取发酵液镜检吋， 当 90%以上的菌体都形成芽孢吋， 即到发酵终点， 得到最终 发酵液。

[0040] 采用平板涂布法测定最终发酵液活菌数和芽孢 数， 并计算芽孢率。 其中， 芽孢 率为芽孢数与活菌数的比值。 所用培养基为营养琼脂培养基： 蛋白胨 10g/L， 牛 肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.2-7.4。 测定最终发酵液活菌数吋 ， 梯度稀释后测定； 测定芽孢数吋， 取最终发酵液于 80°C热处理 10min， 梯度稀 释后测定。 最终发酵液中活菌数 1.5x10 ^1Q cfu/mL以上、 芽孢数1.4 10 /!1^以 上、 芽孢率 90.8%以上。

[0041] 3、 凝结芽孢杆菌干菌粉制备

[0042] 最终发酵液离心后收集湿菌泥， 采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。 操作条件为： 进风温度 210 °C， 出风温度 100 °C。 干菌粉中活菌数 8.0x10 "cfu/g以上。

[0043] 本发明的实现方式： 将枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 凝结芽孢杆菌、 短小芽 孢杆菌、 巨大芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 侧孢芽孢杆菌、 蜡样芽孢杆菌进行 复配得到复合芽孢杆菌微生物净水剂产品。 该复合芽孢杆菌微生物净水剂产品 直投式使用， 用量 0.1-0.5g产品 /m 3水体， 每 8-12天使用一次。 产品保质期 1年。 发明的有益效果

有益效果

[0044] 本发明有益的技术效果在于：

[0045] 本发明的作用原理： （1 ) 多种芽孢杆菌发挥协同作用， 多余饵料和观赏鱼排 泄物用作微生物繁殖所需的营养物质而被大量 消耗； （2) 微生物代谢产生很多 酶类， 有效去除水体中的氨氮、 亚硝酸盐等不利因素； （3) 形成的微生物菌体 聚合物可充当观赏鱼饵料， 直接被吞食； （4) 微生物以芽孢状态存在， 抗逆性 强， 产品保质期长。

[0046] 本发明直接投放于观赏鱼养殖水体进行水质改 良， 有效解决换水带来的环境污 染问题； 本发明实现了水质稳定， 延长换水周期甚至可不换水； 同吋， 产品保 质周期长达 1年， 便于日常采购和使用。

本发明的实施方式

[0047] 实施例 1

[0048] 1、 凝结芽孢杆菌的筛选

[0049] 从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品 称取 2g， 加入 98ml无菌生理盐水 ， 80°C热处理 lOmin后， 在 37°C摇床上 120 rpm条件下振荡 20min， 吸取上清液 1 ml加入 LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。 通过对菌株进行形态学观察、 生理 生化实验、 16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种� �

[0050] 最终得到编号为 ZS-007的菌种， 鉴定为凝结芽孢杆菌 (^ Bacillus coagulant 。 [0051] ZS-007于 2015年 5月 3日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC

M 2015273。

[0052] 2、 30m ³ 发酵罐制备

[0053] 菌种活化： 将得到的菌种接种至营养琼脂斜面培养基上， 30°C下培养 24hr后划 线转接于营养琼脂茄子瓶斜面， 30°C下培养 24hr。 营养琼脂斜面培养基及营养琼 脂茄子瓶的组成均为： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， 琼脂 15-20g/L ， pH7.2-7.4。

[0054] 摇瓶培养： 将活化好的菌种接种至摇瓶中， 振荡培养 20hr。 摇瓶培养基配方： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4, 摇瓶装液量 50mL/500mL 三角瓶。 培养条件： 摇瓶转速 200r/min， 温度 30。C。

[0055] 种子罐扩培： 收集 20瓶 500mL摇瓶种子液用于种子罐接种。 种子罐培养基组成 ： 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 3g/L， 氯化钠 5g/L， pH7.2-7.4。 种子罐体积 500L， 装 液量 75%。 培养条件： 搅拌转速 200r/min， 通气量 0.8vvm， 温度 30°C， 培养吋间 20hr。

[0056] 发酵罐发酵： 30m 3发酵罐装液量 70%。 培养基组成： 葡萄糖 25 g/L， 蛋白胨 15 g/L， 酵母粉 10 g/L， 磷酸二氢钾 l g/L， 硫酸镁 0.5 g/L， 初始 pH7.0。 将培养好的 种子接入发酵罐进行发酵。 培养条件： 搅拌转速 100r/min， 通气量 0.6v _V m， 温度 35°C， 培养吋间 40-45hr。

[0057] 发酵液中， 活菌数 1.99x10 ¹⁽⁾ cfu/g， 芽孢数 1.92x10 ¹⁽⁾ cfu/g， 芽孢率 96.5<¾。

[0058] 3、 干菌粉制备

[0059] 离心收集湿菌泥， 采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。 操作条件为： 进风温度 210 °C， 出风温度 100 °C。 干菌粉中活菌数 8.32x10 "cfu/ga

[0060]

[0061] 实施例 2

[0062] 本复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量 如表 1 :

[0063] 表 1

[] [表 1]

[0064] 其中， 枯草芽孢杆菌 CCTCC NO: 2011443、 地衣芽孢杆菌 CCTCC NO: 2012457 购买于中国典型培养物保藏中心； 凝结芽孢杆菌 CCTCC

NO:M2015273为实施例 1所制备。 短小芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆 菌、 侧孢芽孢杆菌、 蜡样芽孢杆菌为市售产品。

[0065] 应用吋， 产品直接投放于观赏鱼缸内， 用量 0.2g/m 3水体， 每 10天使用一次。

同吋进行对照试验， 在另外一个同规格、 观赏鱼数量和大小一致的鱼缸中， 使 用不含有凝结芽孢杆菌 CCTCC NO: M2015273的产品。 两个缸均正常喂食。

[0066] 不含有凝结芽孢杆菌 CCTCC NO: M2015273的芽孢杆菌微生物净水剂， 鱼缸在 前 1个月内可不换水， 水质较为干净； 从第二个月幵始， 鱼缸底部有排泄物沉淀 出现， 水质逐渐变浑浊。 不到第三个月， 鱼出现浮头现象， 不得不换水。

[0067] 含有凝结芽孢杆菌 CCTCC NO: M2015273的芽孢杆菌微生物净水剂， 鱼缸 4个 月内未换水， 水质干净， 底部未见饵料、 排泄物沉淀， 鱼未出现死亡现象。 期 间， 主要水质指标变化情况如表 2所示， 污染因子指标下降， 水质稳定。

[0068] 表 2 [表 2]

[0069]

[0070] 实施例 3

[0071] 按实施例 1中的复合芽孢杆菌微生物净水剂室温下放置 1年后再使用， 产品直接 投放于观赏鱼缸内， 用量 0.2g/m 3水体， 每 10天使用一次。

[0072] 正常喂食， 鱼缸 4个月内未换水， 水质干净， 底部未见饵料、 排泄物沉淀， 鱼 未出现死亡现象。

[0073]

[0074] 实施例 4

[0075] 复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量如 表 3:

[0076] 表 3

[]

[表 3]

[0077] 应用吋， 产品直接投放于观赏鱼缸内， 用量 0.1g/m冰体， 每 10天使用一次。

正常喂食， 鱼缸一年内未换水， 水质常年保持清亮， 底部干净， 鱼未出现死亡 现象。

[0078]

[0079] 实施例 5

[0080] 复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量如 表 4:

[0081] 表 4

[]

[表 4]

[0082] 应用吋， 产品直接投放于观赏鱼缸内， 用量 0.1g/m冰体， 每 10天使用一次。

正常喂食， 鱼缸一年内未换水， 水质常年保持清亮， 底部干净， 鱼未出现死亡 现象。

[0083] 对于本领域技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 这些改进或变 换都属于本发明所附权利要求的保护范围。

打印件 (原件为电子形式)

-1 PCT/RO/134表 (SAFE)有关保藏的微生物

或其他生物材料的说明 (PCT细则笫 13条

之二）

-1-1 软件版本 CEPCT

版本 1.01.00 MT/FOP 20140331/0.20.5.21

-2 国际申请号 PCT/CN2016/090894

-3 申请人或代理人的档案号 HY0081 下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

-1 页码 0024

-2 行号： 1-2

-3 保藏事项

-3-1 保藏单位名称 中国典型培养物保藏中心

-3-2 保藏单位地址 中国湖北省武汉市武汉大学，邮政编码: 430072， Hubei

(CN)。

-3-3 保藏日期 2015年 5月 03日（03.05.2015)

-3-4 保藏号 CCTCC M2015273

-4 补充说明

-5 本说明是对下列指定国 所有指定国

-6 单独提交的说明

这些说明将随后提交给国际局 由受理局填写 -4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

-4-1 受权官员 由国际局填写 -5 国际局收到本表格日期： -5-1 受权官员