本发明属于酶学和药物化学领域， 涉及一种芽孢杆菌、 透明质酸 酶、 以及其用途。 本发明还涉及一种寡聚透明质酸或其盐或者低 分子 透明质酸或其盐的制备方法， 以及所述芽孢杆菌、 透明质酸酶、 寡聚 透明质酸或其盐、 低分子透明质酸或其盐的用途。 背景技术

透明质酸（hya luronic acid, HA)是一种酸性黏多糖， 由 N-乙酰氨 基葡糖和 D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子� ��胺聚糖， 存 在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。 透明质酸广泛用于医药、 化妆品、 食品等领域， 分子量一般为 10 ⁵ - 10 ⁷ Da (道尔顿） 。

寡聚透明质酸是指分子量小于 l OkDa的透明质酸。研究表明， 分子 量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量 的透明质酸甚至表现出截 然相反的活性（郭学平等，低分子量及寡聚玻 璃酸，中国生化药物杂志， 2003, 24 ( 3 ) ： 148-150 ) 。

研究表明， 寡聚透明质酸在体内具有促血管生成作用， 在体外可促 进内皮细胞的增生， 促进创伤愈合 ( West DC, Kumar S. The effect of hyaluronate and its oligosaccharides on endothelial cell proliferation and monolayer integrity. Exp Cell Res. 1989， 183(1): 179-96 ) 。 寡聚透 明质酸盐具有促血管生成、 促进创伤愈合等生物活性， 在医药领域具 有良好的应用前景。

在炎症过程中，寡聚透明质酸对树突细胞和巨 噬细胞等免疫活性细 胞具有强力活化作用 （Termeer C, Benedix F， Sleeman J， et al. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. J Exp Med. 2002, 195(1):99-111 ) 。

寡聚透明质酸在体外可抑制小鼠 TA3/St乳腺癌细胞、 大鼠 CG神 经胶盾瘤细胞、人 HCT克隆瘤细胞及人 LXI肺癌细胞的生长， 具有抗 肿瘤作用 （ Ghatak S, Misra S, Toole BP. Hyaluronan constitutively regulates ErbB2 phosphorylation and signaling complex formation in carcinoma cells. J Biol Chem. 2005, 280(10): 8875-83 ) 。

此外， 寡聚透明质酸盐分子中的羟基、 羧基和其他极性基团可与 水分子形成氢键而结合大量的水分， 保水效果明显， 因此寡聚透明质 酸盐可用于防晒、 抗衰老、 保湿化妆品中。

目前， 透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降 解、 生物降解 三大类， 物理降解法 4艮难将透明质酸降至 l OkDa以下，化学降解法和酶 法可以制备寡聚透明质酸，但化学降解法制备 寡聚透明质酸， 需要较剧 烈的反应条件（如较高的酸碱浓度等）才能达 到最大程度的降解。 此时， 不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖酪 酸和乙酰氨基葡糖）残基的 结构也遭到破坏， 如乙酰基被水解掉， 单糖六元环断裂等（表现在红外 图镨上是与欧洲药典标准图镨不一致），对制 得的寡聚透明质酸的生物 活性产生一定影响（郭学平等， 低分子量及寡聚玻璃酸， 中国生化药物 杂志， 2003， 24 ( 3 )： 148-150 )。 化学降解法制备的寡聚透明质酸还 容易发生褐变（专利申请号 201110008110. 9 ) ， 生产过程会污染环境。 而酶解法降解透明质酸时， 只断裂单糖分子间的糖苷键， 不会对其他结 构造成破坏， 而且酶解法反应条件温和， 不用强酸强碱， 制备的寡聚透 明质酸不会发生褐变， 不会造成环境污染， 并且酶解法制备的寡聚透明 质酸的结构完整， 红外图谱与欧洲药典图谱一致， 因此酶解法最适合制 备寡聚透明质酸。

降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶（又 称为玻璃酸酶）， 根 据作用机制的不同，可以分为 3类： （1)内切 乙酰 葡糖苷酶， 为水解酶， 作用于 p -1, 4 糖苷键， 终产物主要为四糖， 也可作用于软 骨素或 u酸软骨素， 并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物 毒液 来源的属于此类。 （2)水蛭、 十二指肠虫来源的透明质酸酶， 为内切- 葡糖苷酸酶， 作用于 P -1, 3糖苷键， 也是水解酶， 主要降解产物是 四糖， 特异性降解透明质酸； （3)细菌透明质酸酶， 也称为透明质酸裂 解酵（ hya luronate lyase ) ， 作用于 β _1，4 糖苷键， 通过 β -消去机 制得到 4， 5 -不饱和双糖 ( Krei l, G， Hya luronidases— a group of neglected enzymes, Protein Sci, 1995， 4 (9) : 1666-1669 ) 。

目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的方法是化 学降解法，由于含透 明质酸酶的动物组织来源有限，有文献 4艮道的微生物来源透明质酸酶发 酵液单位酶活较低 ， 发酵液最 高 酶活是 1. 3xl 0 ² IU/mL

( WO2010130810A1; Ei leen Ingham, K. Τ. Hol land, G. Gowland and W. J. Cunl if f e, Pur if icat ion and Part ia l Characterizat ion of Hya luronate Lyase (EC4. 2. 2. 1) f rom Propionibacter ium acnes, Journa l of Genera l Microbiology (1979) , 115, 411-418 ) ， 其余文献 报导的酶活均低于 100IU/mL， 不可能大规模制备透明质酸酶， 也就不 可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐。

此外，目前一般将分子量在 10 ⁴ Da - 10 ⁶ Da的透明质酸称为低分子透 明质酸（LMW-HA ) 。 分子量为 2万- 6万的 LMW-HA可刺激体外培养的 骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞集落的数 目和单个集落的面积（US 5646129 ) 。 使用含有妥布霉素和分子量为 50万的 HA的滴眼液治疗细 菌性角膜溃疡， 与只含妥布霉素的滴眼液相比， 可显著缩短愈合时间

( Gandolf i SA， Massar i A, Orsoni JG. Low-mo 1 ecu 1 a r-we i gh t sodium hya luronate in the treatment of bacter ia l cornea l ulcers s [J] . Graefes Arch Cl in Exp Ophthalmol, 1992, 230 (1) : 20-23 ) 。 韩国 专利（KR20080087941 )提供了一种含分子量小于 10万的 HA的组合物， 该组合物易于被人体吸收， 口服可有效改善皮肤皱紋、 提高皮肤弹性。 日本专利（ JP ² 000-1037 ² 3 )提供了一种含分子量 ² 0万- ⁴ 0万 HA的组 合物， 该组合物可促进毛发生长。 但是， 与寡聚透明质酸或其盐的情形 类似，酶解法制备的低分子透明质酸或其盐在 结构上比化学法制备的要 完整，化学法制备的低分子透明质酸或其盐的 结构会发生开环、脱乙酰 基等。

LMW-HA 因其相对分子质量较小， 外用时可被皮肤更好的吸收， 促 进皮肤营养的供给和废物排泄，从而防止皮肤 老化， 达到深层保湿和美 容养颜的效果， 而且还可促进表皮细胞的增殖和分化， 清除氧自由基， 修复日光或紫外线伤害的皮肤。 口服 LMW-HA易于吸收， 不仅可以活化 皮肤细胞，保持表皮湿润，同时具有良好的增 强免疫功能和抗衰老功能。 因此化妆品用及保健食品用 HA多为 LMW-HA。 另外， LMW-HA还具有促血 管生成、 细胞免疫活化和促进骨生成的作用，对治疗细 菌性角膜溃疡也 有良好的疗效， 在医药领域应用广泛。

LMW-HA是由高分子量 HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、 化学降解、生物降解三大类。 物理降解法中的超声降解法虽然不添加化 学试剂和酶， 艮难将高分子量 HA降解至分子量 200kDa以下（覃彩凤， 王淼， 陈晓峰.透明质酸的降解方法及工艺条件研究 [J] . 2007, 4: 32-36 )。 机械研磨法也是一种有效降低 HA相对分子量的方法， 有专利 报道在室温下研磨时间为 0. 5h - 12h,振荡频率为 10Hz - 30Hz，但不适 用于大规模生产（CN101942037A )。 化学降解法会造成结构破坏， 这时 不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖醛 酸和乙酰氨基葡糖）残基的 结构也可能遭到破坏， 如乙酰基被水解掉、 单糖六元环断裂等。

有报道酶解法生产低分子 HA的制备过程，先将 HA从发酵液中分离 纯化出来，然后再加入透明质酸酶进行酶解， 再经过膜过滤、 乙醇沉淀、 脱水干燥得到低分子 HA ( CN101020724A ) ， 上述制备工艺所用的透明 质酸酶为透明质酸酶成品， 价格 ί艮高， 4艮难实现工业化生产。 目前， 有 文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位 酶活较低，发酵液最高酶 活是 1. 3 x l 0 ² IU/mL ( WO2010130810A1 ) ， 其余文献报道的酶活均低于 10 ² IU/mL, 因此应用酶切法大规模生产低分子量 HA目前很难实现。 发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动， 得到了一种芽孢杆菌 和一种透明质酸酶。 该透明质酸酶活性高， 可达 10 ⁵ IU/mL (发酵液）， 纯化后可以达到 8 X 10 ⁶ - 1. 5 X 10 ⁷ IU/mg,远高于目前文献中报道的最 高酶活。 该透明质酸酶的分子量为 123KDa , 最适作用温度及 pH分别 为 42 °C、 6. 5， 热稳定性和 pH稳定性高。 该酶可催化裂解透明质酸和 硫酸软骨素， 但是不能降解海藻酸钠， 肝素钠， 壳聚糖， 几丁质和羟 曱基纤维素钠。利用该透明质酸酶降解高分子 透明质酸，反应速度快、 反应条件温和、 环境污染小， 可大规模工业化生产低分子透明质酸及 寡聚透明质酸， 还可生产低分子硫酸软骨素（本发明中是指分 子量为

1， 000 - 10， 000的硫酸软骨素， 也称为低分子量硫酸软骨素） 。 本发 明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分 子量透明质酸或其盐 进行降解， 酶活高、 条件温和、 操作简单、 无环境污染； 并且得到的 寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质酸或其 盐的结构完整， 颜色无 褐变。 由此提供了下述发明： 本发明的一个方面涉及一种芽孢杆菌， 其保藏编号为 CGMCC NO. 5744 , 保藏日期为 2012年 2月 8 日， 保藏单位是中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC ) 。

针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶 活性低、 来源有 限、 成本高的缺点， 发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶 的 芽孢杆菌 、 Bacillus sp. ) A50， 该菌种已经在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心（ CGMCC )进行了保藏，保藏号为 CGMCC NO. 5744 , 保藏时间为 2012年 2月 8 日。 本发明的另一方面涉及一种制备透明质酸酶的 方法， 包括使用本 发明的芽孢杆菌的步骤； 具体地， 包括下述步骤：

将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养、种子培养 、发酵培养、 离心、 硫酸铵分级沉淀、 超滤， 制得透明质酸酶。

根据本发明任一项所述的制备透明质酸酶的方 法， 包括如下步 骤：

( 1 )将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养， 得斜面菌种；

( 2 )取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中， 在 25 - 40°C、 100 - 200rpm的条件下培养 10 - 24h, 得种子液；

( 3 )将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中， 在 25 - 40°C、 100 - 300rpm的条件下培养 12 - 24h, 得透明质酸酶发酵液； ( 4) 离心分离发酵液， 取上清液；

( 5 )将上清液用硫酸铵分级沉淀， 过滤（例如采用 0.65μπι的微 孔滤膜进行过滤） ， 得到粗制的透明质酸酶；

( 6)将步骤（5)沉淀出来的粗制透明质酸酶溶于� �酸盐緩冲液 中， 超滤除去小分子杂质， 得纯化的透明质酸酶。

可选地， 步骤（6 )也可以采用如下的步骤（6- 1 )至 （6- 3) ：

( 6- 1 ) ： 将步骤（5) 中的粗制透明质酸酶溶于 ρΗ4.5- 8.0的 緩冲溶液中， 得粗酶液； 将粗酶液装入截留分子量为 3. OxlO ³ - 1.4 X 10 ⁴ Da的透析袋， 放入 pH4.5 - 8.0的緩沖溶液中， 4°C下透析过夜；

( 6- 2) ： 将透析后的粗酶液进行离子交换色谱分离， 色谱柱填 料是 DEAE琼脂糖凝胶 FF介质， 用 0 - 0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱， 并收集洗脱峰；

( 6- 3) ： 将步骤（ 6 - 2 )得到的透明质酸酶样品进行冷冻真空 干燥， 得到白色粉末， 即为透明质酸酶。

步骤 6 - 1至 6 - 3是对透明质酸酶的进一步纯化。

上述分离纯化透明质酸酶的方法中， SDS-PAGE 电泳检测步骤 ( 6-2 )得到的透明质酸酶纯度达到 97%以上。

上述步骤（1 ) 中， 每 lOOmL斜面培养基中含有以下成分： 蛋白 胨 0.2- 2.0g,酵母粉 0.2- 2.0g, Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05- 0.15g, 葡萄糖 0.5— 1.5g， 琼脂粉 2.0g， pH调至 6.0— 8.0， 斜面培养的温度为 25 - 40°C。

上述步骤（2) 中， 每 lOOmL种子培养基中含有以下成分： 蛋白 胨 0.2- 2.0g,酵母粉 0.2- 2.0g, Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05- 0.15g, 葡萄糖 0.5— 1.5g， pH调至 6.0— 8.0。

上述步骤（3) 中， 每 lOOmL发酵培养基中含有以下成分： 蛋白 胨 0.2- 2.0g,酵母粉 0.2- 2.0g, Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05 - 0.15g,葡萄糖 0.5 - 1.5g,吐温 800.05mL, pH调至 6.0 - 8.0。

可采用盐酸、 硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养 基、 种子培养基和发酵培养基 PH。 斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现 有技术得到， 不需 付出创造性的劳动。 种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接 种 量的种子液即可， 发酵培养基的接种量一般在 3 - 15 %即可。

上述步骤（4 )中， 发酵液离心的转速为 10000 - 15000rpm， 离心 时间为 10 - 20min。

上述步骤（5 ) 中， 硫酸铵分级沉淀的步骤是： 将上清液中加入 硫酸铵， 使其质量体积浓度为 20 % - 25 % , 过滤除去产生的沉淀， 然 后继续加入硫酸铵， 至其质量体积浓度为 35 % -40%为止，得到的沉淀 即为透明质酸酶。 本发明中所述的质量体积浓度的意思是： 每 mL上 清液中含有硫酸铵的质量（g ) 。

上述步骤（6 ) 中， 磷酸盐緩冲液的 pH优选为 6. 0， 浓度优选为 50腿 ol /L， 在实际应用中可酌情变动。 超滤所用的为超滤膜。 超滤膜 的截留分子量为 3xl 0 ⁴ Da。

本发明的再一方面涉及一种透明质酸酶， 其由上面任一项所述的 制备透明质酸酶的方法制得。

本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中 的酶活可达到 1 x10 ^s - 3xl 0 ⁵ IU/mL ， 大 大 高 于 文献报道 中 的 最 高 酶活 ( 1. 3xl 0 ² IU/mL ) , 且该酶热稳定性和 pH稳定性高， 用其降解高分子 透明质酸， 制备寡聚或低分子透明质酸， 成本显著降低， 可用于大规 模生产， 解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题， 在生化研究领 域及寡聚或低分子透明质酸的生产方面有广阔 的应用前景。 本发明还涉及一种分离的多肽（或蛋白），其 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示； 具体地， 所述多肽（或蛋白） 为透明质酸酶。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸， 其编码 SEQ ID NO: 2 所示 所示的氨基酸序列； 具体地， 所述多核苷酸的序列为 SEQ ID NO: 3 所示的序列或 SEQ ID NO: 3的互 卜序列。

本发明还涉及一种重组载体， 其含有本发明的多核苷酸。

本发明还涉及一种重组宿主细胞， 其含有本发明的重组载体。 本发明的再一方面涉及一种制备寡聚透明质酸 或寡聚透明质酸 盐的方法， 包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或 者含有本发 明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对分子 量大于 lOkDa的透明质 酸或其盐进行降解的步骤。

根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸 盐的方法， 其包含 如下步骤：

1 )配制透明质酸或其盐溶液： 向纯化水中加入分子量大于 lOkDa 的透明质酸或其盐， 配制成质量体积浓度为 1- 30%的溶液；

2)酶解： 调节步骤 1) 中溶液的温度为 20 - 48°C、 pH为 4- 9， 然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶， 将透明质酸或其盐酶解至所需 分子量， 得酶解液；

3) 灭活： 将酶解液在 50 - 90°C下保持 10- 60min， 对芽孢杆菌 透明质酸酶进行灭活；

优选地， 还包括如下步骤：

4) 过滤： 向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐， 搅拌至完全 溶解， 然后用孔径为 0.45μιη的滤膜过滤， 得滤液， 每 100mL酶解液 中加入 0.1 - 10g的易溶性无机盐；

5)沉淀： 将步骤 4)的滤液与滤液体积 3- 20倍的醇或酮混合均 匀， 析出寡聚透明质酸盐沉淀；

6)脱水干燥： 将步骤 5)中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来， 用 有机溶剂脱水， 然后真空干燥， 得寡聚透明质酸盐。

根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸 盐的方法， 其中， 步骤 1) 中， 每 lkg透明质酸或其盐加 2xl0 ⁷ - 5xl0 ⁷ IU的芽孢杆菌透 明质酸酶。

根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质 酸盐的方法， 其 中， 步骤 2) 中， 酶解温度为 35 - 45°C， 酶解 pH为 5.5-7.5， 将透 明质酸酶解至分子量为大于或等于 3000Da, 并且小于 10 ⁴ Da。

根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质 酸盐的方法， 其满 足如下的 A- F中的任一项或多项： A. 步骤 1 ) 中， 透明质酸盐为透明质酸的钠盐、 鉀盐、 镁盐、 钙 盐或锌盐；

B. 步骤 2 ) 中， 采用酸或碱调节 pH至 4 - 9， 所述酸为盐酸、 冰 乙酸、 酸或磷酸， 所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；

C. 步骤 3 )中， 将酶解液在 55 - 65 °C下保持 20 - 30min， 对芽孢 杆菌透明质酸酶进行灭活；

D. 步骤 4 ) 中， 所述易溶性无机盐为钠盐、 钾盐、 钙盐、 锌盐或 镁盐； 优选钠、 鉀、 钙、 锌、 镁的氯化物、 硫酸盐或硝酸盐；

E. 步骤 5 )中， 所述醇或酮为乙醇、 丙酮、 甲醇、 丙醇或异丙醇；

F. 步骤 6 ) 中， 脱水所用的有机溶剂为酮或醇。

上述方法中， 所用的芽孢杆菌透明质酸酶即芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 发酵得到的透明质酸酶比活为 8xl 0 ⁶ - 1. 5xl 0 ⁷ IU/mg , 酵的加入量为每 kg 透明质酸或其盐中加 2xl 0 ⁷ - 5xl 0 ⁷ IU 的纯化酶。 透明质酸酶对透明质酸有 ί艮好的降解性， 只要加 入合适的透明质酸酶， 即可以得到任意小分子量的透明质酸， 因此在 酶解时， 控制时间的长短即可得到所需分子量的透明质 酸。

此外， 步骤 4 ) 中以滤膜过滤酶解液， 滤去透明质酸酶等杂质， 提高了产物的纯度， 所选滤膜为本领域常用的过滤膜即可， 只要满足 孔径的要求都能用于本发明，滤膜的孔径为 0. 45μιη，材质可以是纤维 素酯类、 聚砜类、 或聚酰胺类。

上述步骤 6 ) 中， 脱水所用的有机溶剂为与水互溶的有机溶剂， 优选的， 有机溶剂为酮或醇， 最优选的为乙醇和 /或丙酮。 不拘于理 论的限制， 将所述有机溶剂加入寡聚透明质酸盐沉淀中可 以带走沉淀 中的大部分水，

本发明的制备寡聚透明质酸或其盐的方法操作 简单， 条件温和， 对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来 源的透明质酸酶成本低， 适合大规模工业化生产， 制备的寡聚透明质酸盐具有结构完整、 透皮 吸收性好、 纯度高、 无细胞毒性、 抗氧化能力强等优点， 可用在化妆 品、 食品及医药领域， 前景广阔。 本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡 聚透明质酸盐， 其 由本发明中任一项所述的制备寡聚透明质酸或 寡聚透明质酸盐的方 法制得。

本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡 聚透明质酸盐， 其

N-乙酰氨基葡糖和 D-葡糖酪酸双糖的含量 > 65%、 >70%, >75%、 >80%、 >85%、 >90%或>95% (w/w) ； 具体地， 所述 N_乙酰氨 基葡糖和 D-葡糖酪酸双糖的含量通过 HPLC法测得。 更具体地， HPLC 的条件为： 采用糖分析柱进行高效液相色谱测定； 流动相为 0.4mol/L NaH ₂ P0 ₄ 溶液； 速为 0.6ml/min; 柱温为 35°C; 检测波长为 232nm; 进样量为 20 L。

例如可以采用下面的步骤：

a.标准对照品溶液： 称取一定量的标准对照品（ Hyaluronic acid disaccharide ADiHA sodium salt, H9649, Sigma ) 用磚酸盐緩冲液

( pH6.0, 5mmol/L)溶解配制成 Img/mL的溶液， 得到标准对照品溶 液；

b.样品预处理：称取一定量的待测样品（比较� �� 1-7、实施例 13-26 制备）， 用磷酸盐緩冲液（ pH6.0, 5腿 ol/L )溶解配制成 Img/mL的溶 液。取 lmL样品溶液加入 1000IU的透明质酸酶（可以为实施例 10-12 制备） ， 42°C水浴 2h; 酶解结束后， 将酶解液煮沸 2min使酶失活， 得到样品酶解液。

将样品酶解液转移至 20mL容量瓶中， 加入流动相稀释至刻度， 混匀， 过滤即得供试液。

c标准对照品溶液处理： 取 lmL标准对照品溶液采用流动相稀释 20倍， 过滤待用。

d.色谱条件： 采用糖分析柱进行高效液相色谱测定； 流动相为 0.4mol/L NaH ₂ P0 ₄ 溶液； 流速为 0.6ml/min; 柱温为 35°C; 检测波长 为 232nm; 进样量为 20 L;

e.结果计算： 采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样 品进行色谱分离， 按外标法以透明质酸双糖峰面积计算； 具体地， 按以下公式计算寡聚 透明质酸或其盐的含量（以 N-乙酰氨基葡糖和 D-葡糖醛酸双糖的含量 表示 ) ： 寡聚透明质酸或其盐的含量 ( % )= _A ^A ^ ^C ^ ^QQ , χΐοο%

A _R xW _x x(100-h)

Ax: 待测样品的透明质酸双糖峰面积；

A _R : 标准对照品的透明质酸双糖峰面积；

Wx: 待测样品称样量， mg;

C _R : 标准对照品溶液浓度， mg/mL;

h( % )为待测样品干燥失重。

具体方法也可以参照公开号为 CN102323344A的中国专利申请， 其全部内容在此通过引用并入本发明。

根据本发明的任一项所述的寡聚透明质酸或寡 聚透明质酸盐， 其 通过 HPLC法和咔唑法测得的含量的差值小于 1%。

根据本发明的任一项所述的寡聚透明质酸或寡 聚透明质酸盐， 其 分子量为大于或等于 3000Da， 并且小于 10 ⁴ Da。 具体地， 所述寡聚透 明质酸或寡聚透明质酸盐为酶解法（酶切法） 制得； 更具体地， 由本 发明的透明质酸酶制得。

根据本发明的任一项所述的寡聚透明质酸盐为 白色粉末或颗粒， 含量大于 95 %， 其 0. 1 %水溶液的 pH在 6 - 8之间。 其红外图谱与欧 洲药典标准图谱一致， 性能良好， 结构未被破坏。 本发明的再一方面涉及一种制备低分子透明质 酸或低分子透明 质酸盐的方法， 包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或 者含有 本发明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对 分子量大于 l OOOkDa的 透明质酸或其盐进行降解的步骤。

根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸 或低分子透明质 酸盐的方法， 其包含如下步骤： 1 ) 配制透明质酸或其盐溶液： 向纯化水中加入分子量大于

100 OkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度� � 0.1 - 2 %的溶液；

2 )酶解： 调节步骤 1 ) 中溶液的温度为 20 - 48°C、 pH为 4- 9， 然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶， 将透明质酸或其盐酶解至所需 分子量， 得酶解液；

3) 灭活： 将酶解液在 50 - 90°C下保持 10- 60min, 对芽孢杆菌 透明质酸酶进行灭活；

优选地， 还包括如下步骤：

4 ) 过滤： 向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐， 搅拌至完全 溶解， 然后用孔径为 0.45μπι的滤膜过滤， 得滤液， 每 100mL酶解液 中加入 0.1 - 10g的易溶性无机盐；

5 )沉淀： 将步骤 4 )的滤液与滤液体积 1 - 10倍的醇或酮混合均 匀， 析出低分子透明质酸盐沉淀；

6 )脱水干燥： 将步骤 5) 中的低分子透明质酸盐沉淀分离出来， 用有机溶剂脱水， 然后真空干燥， 得低分子透明质酸盐。

根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸 或低分子透明质 酸盐的方法，其中，步骤 1 )中，每 lkg透明质酸或其盐中加 10 ⁶ - 10 ⁷ IU 的芽孢杆菌透明质酸酶。

根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸 或低分子透明质 酸盐的方法， 其中， 步骤 2 ) 中， 酶解温度为 35 - 45°C， 酶解 pH为 5.5- 7· 5，将透明质酸酶解至分子量为 lOkda - lOOOkDa;优选为 lOkDa - 77 OkDa 或 lOkDa - 700kDa或 lOkDa - 600kDa或 lOkDa - 500kDa;更 优选为 lOkDa - 400kDa; 进一步优选为 lOkDa - 300kDa、 lOkDa - 200kDa、 lOkDa - 15 OkDa, lOkDa - lOOkDa, 1 OkDa - 5 OkDa或 1 OkDa - 30kDa。

根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸 或低分子透明质 酸盐的方法， 其满足如下的 A-F中的任一项或多项：

A. 步骤 1 ) 中， 透明质酸盐为透明质酸的钠盐、 鉀盐、 镁盐、 钙 盐或锌盐； B. 步骤 2) 中， 采用酸或碱调节 pH至 4-9， 所述酸为盐酸、 冰 乙酸、 酸或磷酸， 所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；

C. 步骤 3)中， 将酶解液在 55 - 65°C下保持 20 - 30min， 对芽孢 杆菌透明质酸酶进行灭活；

D. 步骤 4) 中， 所述易溶性无机盐为钠盐、 钾盐、 钙盐、 锌盐或 镁盐； 优选钠、 鉀、 钙、 锌、 镁的氯化物、 硫酸盐或硝酸盐；

E. 步骤 5)中， 所述醇或酮为乙醇、 丙酮、 甲醇、 丙醇或异丙醇；

F. 步骤 6) 中， 脱水所用的有机溶剂为酮或醇。

本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或 低分子透明质酸 盐， 其由本发明中任一项所述的制备低分子透明盾 酸或低分子透明质 酸盐的方法制得。

本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或 低分子透明质酸 盐， 其 N-乙酰氨基葡糖和 D-葡糖醛酸双糖的含量 > 90%或> 95% (w/w)； 具体地， 所述 N-乙酰氨基葡糖和 D-葡糖酪酸双糖的含量通 过 HPLC法测得。 更具体地， HPLC的条件为： 采用糖分析柱进行高效 液相色谱测定； 动相为 0.4mol/LNaH ₂ P0 ₄ 溶液； 速为 0.6ml/min; 柱温为 35°C; 检测波长为 232nm; 进样量为 20 L。 具体的方法也可 以参照上面的测寡聚透明质酸或其盐的含量 （N-乙酰氨基葡糖和 D- 葡糖酪酸双糖的含量） 的方法进行。

根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或 低分子透明质酸 盐， 其分子量为 lOkDa- lOOOkDa; 优选为 10kDa- 770kDa 或 10kDa - 700kDa 或 10kDa- 600kDa 或 lOkDa - 500kDa; 更优选为 10kDa- 400kDa; 进一步优选为 lOkDa - 300kDa、 lOkDa - 200kDa、 lOkDa - 150kDa、 lOkDa - lOOkDa, lOkDa - 50kDa或 lOkDa - 30kDa。 具体地， 所述低分子透明质酸或低分子透明质酸盐为酶 解法 （酶切法）制得； 更具体地， 由本发明的透明质酸酶制得。

根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或 低分子透明质酸 盐， 其通过 HPLC法和咔唑法测得的含量的差值小于 1%。

不拘于理论的限制， 在相同酶量的情况下， 只要控制不同的酶解 时间即可得到不同分子量的透明质酸盐， 即只要控制合适的酶解时间 即可得到低分子量透明质酸盐或寡聚透明质酸 盐。 但实际上， 会出现 时间长了酶的活性可能降低、 透明质酸盐的溶液会染菌等问题， 所以 优选通过控制加不同的酶量来控制得到不同分 子量的透明质酸盐， 如 制备低分子透明质酸盐时可加酶量少一些， 制备寡聚透明质酸盐时则 需加酶量多一些。

可以间隔取样检测产物的分子量。 寡聚透明质酸盐和低分子透明 质酸盐的分子量测定采用 GPC-MALLS法或 Laurent法 （ GPC-MALLS法 更方便一些）； 本领域技术人员可以根据本领域知识自行选择 合适的 检测时间间隔。 本发明的再一方面涉及一种组合物， 其包含本发明中任一项所述 的透明质酸酶、 本发明的多核苷酸、 本发明的重组载体、 本发明的重 组宿主细胞、 本发明任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明 质酸盐、 或者本发明任一项所述的低分子透明质酸或低 分子透明质酸盐； 可选 地， 其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅 料。 具体地， 所述 组合物为化妆品、 食品、 或药物； 更具体地， 所述化妆品为防晒、 晒 后修复、 抗衰老、 或保湿的化妆品。 本发明的再一方面涉及本发明的芽孢杆菌或本 发明的多核苷酸 或本发明的重组载体或本发明的重组宿主细胞 在制备透明质酸酶中 的用途。

可以利用本领域人员知悉的技术手段， 将本发明的编码透明质酸 酶的多核苷酸克隆至表达载体， 转导至合适的宿主细胞， 表达本发明 的透明质酸酶。

本发明还涉及本发明中任一项所述的透明质酸 酶在制备寡聚透 明质酸或寡聚透明质酸盐、 低分子透明质酸或低分子透明质酸盐、 或 者低分子硫酸软骨素中的用途。

本发明还涉及本发明任一项所述的寡聚透明质 酸或寡聚透明质 酸盐或者本发明任一项所述的低分子透明质酸 或低分子透明质酸盐 在制备促血管生成和 /或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或防� � 或晒后修复或促进 HUVEC细胞增殖或抗肿瘤 （例如乳腺癌、 肺癌、 或 神经胶盾瘤）或提高免疫力的药物或者在制备 食品或保健品或化妆品 中的用途； 具体地， 所述化妆品为防晒、 晒后修复、 抗衰老、 或保湿 的化妆品。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外促血 管生成和 /或促进 创伤愈合或抗氧化或清除自由基或促进 HUVEC细胞增殖或抑制肿瘤细 胞（例如乳腺癌细胞、 肺癌细胞、 或神经胶盾瘤细胞） 的方法， 包括 给与受试者或使用有效量的本发明任一项所述 的寡聚透明质酸或寡 聚透明质酸盐或者本发明任一项所述的低分子 透明质酸或低分子透 明质酸盐的步骤； 具体地， 所述受试者为哺乳动物， 更具体地， 所述 受试者为人。

在本发明中， 如果没有特别说明， "寡聚透明质酸或寡聚透明质 酸盐" 亦简称为 "寡聚透明质酸或其盐" ， 寡聚透明质酸或寡聚透明 质酸盐的分子量小于 l OkDa; 优选地， 大于或等于 3000Da， 并且小于 10 ⁴ Da。 寡聚透明质酸盐的种类并不特别限定， 包括但不限于： 钠盐、 鉀盐、 钙盐、 镁盐、 锌盐等等。

在本发明中， 如果没有特别说明， "低分子透明质酸或低分子透 明质酸盐" 亦简称为 "低分子透明质酸或其盐" ， 低分子透明质酸或 低分子透明质酸盐的分子量为 l OkDa - l OOOkDa ; 优选为 l OkDa - 500kDa; 更优选为 l OkDa - 400kDa; 进一步优选为 l OkDa - 300kDa、 l OkDa - 200kDa、 l OkDa - 150kDa、 l OkDa - l OOkDa, 10kDa - 50kDa或 l OkDa - 30kDa _o 低分子透明质酸盐的种类并不特别限定， 包括但不限 于： 钠盐、 鉀盐、 钙盐、 镁盐、 锌盐等等。

本发明中， 对于某个成分的含量的百分比， 如果没有特别说明， 均指重量百分比 （w/w ) 。 下面还给出了本发明涉及的部分术语的解释。 表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸序列、 启动子和转录及翻译终止信 号的重组表达载体。 可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来 制 备重组表达载体， 该载体可以包括一个或多个方便的限制位点， 以便 在这些位点插入或取代编码透明质酸酶的核酸 序列。 或者， 可以通过 将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适 当表达载体而表达本 发明所述核酸序列。 制备表达载体时， 可使编码序列位于载体中以便 与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何便于进行重组 DNA操作并表达核酸序列 的载体（例如质粒或病毒）。 载体的选择通常取决于载体与它将要导入 的宿主细胞的相容性。 载体可以是线性或闭环质粒。

载体可以是自主复制型载体（即存在于染色体 外的完整结构， 可 独立于染色体进行复制）， 例如质粒、 染色体外元件、 微小染色体或 人工染色体。 载体可包含保证自我复制的任何机制。 或者， 载体是一 个当导入宿主细胞时， 将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起 复制的载体。 此外， 可应用单个载体或质粒， 或总体包含将导入宿主 细胞基因组的全部 DNA的两个或多个载体或质粒， 或转座子。

优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择 转化细胞的选择 标记。 选择标记是这样一个基因， 其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗 性、 对重金属的抗性， 或赋予营养缺陷体原养型等。 细菌选择标记的 例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的 da l基因， 或者抗生素如氨苄 青霉素、 卡那霉素、 氯霉素或四环素的抗性标记。

优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到 宿主细胞基因组 中， 或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行 自主复制的元件。

就进行自主复制的情况而言， 载体还可以包含复制起点， 使载体 能在目标宿主细胞中自主地复制。 复制起点可以带有使其在宿主细胞 中成为温度敏感型的突变（参见例如， fEhr l ich， 1978 , 美国国家科学 院学报 75: 1433)。

可以向宿主细胞插入一个以上拷贝的本发明核 酸序列以提高该 基因产物的产量。 该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的 至少 一个附加拷贝插入宿主细胞基因组中， 或者与该核酸序列一起插入一 个可扩增的选择标记， 通过在有合适选择试剂存在下培养细胞， 挑选 出含有扩增拷贝的选择性标记基因、 从而含有附加拷贝核酸序列的细 胞。

用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表 达载体的操作是 本领域技术人员所熟知的（参见例如 Sambrook等，分子克隆实验手册， 第二版， 冷泉港实验室出版社， 冷泉港， 紐约， 1989)。 宿主细胞

本发明还涉及包含可用来重组生产透明质酸酶 的本发明所述核 酸序列 （多核苷酸） 的重组宿主细胞。 可将包含本发明之核酸序列的 载体导入宿主细胞， 从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制 的 染色体外载体形式得以维持。 术语 "宿主细胞" 涵盖任何由于复制期 间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。 宿主细胞的选择很大程度上 取决于透明质酸酶编码基因及其来源。

宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞， 例如细菌或酵母细胞。 可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导 入宿主细胞。 制备方法

本发明还涉及重组制备本发明透明质酸酶的方 法， 该方法包括： (a)在适于产生透明质酸酶的条件下， 培养含有核酸构建体的宿主细 胞， 该核酸构建体包含编码所述透明质酸酶的核酸 序列； 和（b)回收 该肽。

在本发明所述制备方法中， 用本领域已知方法在合适透明质酸酶 产生的营养培养基中培养细胞。 例如， 可以在合适的培养基中， 在允 许透明质酸酶表达和 /或分离的条件下， 通过摇瓶培养、 实验室或工 业发酵罐中小规模或大规模发酵（包括连续、 分批、 分批加料或固态 发酵）来培养细胞。 在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的培养基 中， 采用本领域已知的步骤进行培养。 合适的培养基可由供应商提供或者 可以参照公开的组成（例如， 美国典型培养物保藏中心的目录中所述） 来制备。 如果透明质酸酶被分泌到培养基中， 则可以直接从培养基中 回收。 如果透明质酸酶不分泌， 可以从细胞裂解物中回收。

可以用本领域已知方法回收所产生的透明质酸 酶。 例如， 可以通 过常规操作（包括， 但不限于离心、 过滤、 抽提、 喷雾干燥、 蒸发或 沉淀）从培养基中回收。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明 所述透明质酸酶， 这些操作包括， 但不限于层析（例如， 离子交换层析、 亲和层析、 疏 水作用层析、 层析聚焦、 和大小排阻层析）、 HPLC；、 电泳（例如， 制备 性等电点聚焦）、差示溶解度（例如硫酸铵沉 淀）、 SDS-PAGE或抽提（参 见例如，蛋白质纯化， J. C. Janson和 Lars Ryden编， VCH Publ i shers, New York, 1989)。 发明的有益效果

本发明利用芽孢杆菌生产寡聚透明质酸或其盐 或者低分子透明 质酸或其盐的制备方法操作简单， 条件温和， 对产品结构无破坏， 无 环境污染， 而且发酵来源的透明质酸酶成本低， 适合大规模工业化生 产。 本发明制备的寡聚透明质酸盐或低分子透明质 酸盐具有结构完 整、 透皮吸收性好、 纯度高、 无细胞毒性、 抗氧化能力强、 颜色无褐 变等优点， 可用在化妆品、 食品及医药领域。 附图说明

Fig. 1： SDS-PAGE电泳图。 其中， Marker为 Uns ta ined Prote in Mo lecular We ight Marker , 泳道 1、 2、 3分另' J为实施例 10、 11、 12 制备的透明质酸酶。

Fig. 2： 不同方法制备的寡聚透明质酸盐的红外图谱， 其中： Fig. 2 (A)为透明质酸钠的欧洲药典标准图谱，

Fig. 2 (B)为比较例 1寡聚透明质酸盐的红外图谱， Fig.2 (C)为实施例 13制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，

Fig.2 (D)为实施例 14制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，

Fig.2 (E)为实施例 15制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，

Fig.2 (F)为实施例 16制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，

Fig.2 (G)为实施例 17制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，

Fig.2 (H)为实施例 18制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱。

Fig.3: 温度对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶 的热稳定 性实验结果。 Fig.3(A), 温度对酶活性的影响； Fig.3(B), 透明质酸 酶的热稳定性实验结果。

Fig.4： pH对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的 pH稳定性 实验结果。 Fig.4(A), pH对酶活性的影响； Fig.4(B), 透明质酸酶的 pH稳定性实验结果。

Fig.5(A): 寡聚透明质酸盐的透皮吸收比例图。

Fig.5(B): 寡聚透明质酸盐的 DPPH自由基清除能力图。

Fig.5 (C)： 低分子透明质酸盐的 DPPH自由基清除能力图。

Fig.5(D): 寡聚透明质酸盐的还原能力图。

Fig.5(E): 低分子透明质酸盐的还原能力图。

Fig.6 (A)： 寡聚透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照后的修复作用。

Fig.6(B): 低分子透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照后的修复作 用。

Fig.6 (C)： 寡聚透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照的防护作用。

Fig.6 (D)： 低分子透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照的防护作用。 本发明涉及保藏的生物材料：

本发明芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50, 其于 2012年 2月 8 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心 （CGMCC) ， 保 藏号为 CGMCC No. 5744, 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号中国科学院微生物研究所， 100101。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内 的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译的 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说 明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获 得的常规产品。 下述的实施例或比较例或实验例中， 寡聚透明质酸盐及低分子透 明质酸盐的分子量测定采用 GPC-MALLS法； 含量测定采用 HPLC法或 咔唑法。 寡聚透明质酸或低分子透明质酸与直接发酵制 得的透明质酸 (结构未被破坏）都是由 N-乙酰氨基葡糖和 D-葡糖醛酸双糖重复单 位构成的， 因此它们的含量等于双糖的含量， 可以用芽孢杆菌透明质 酸酶将寡聚透明质酸或低分子透明质酸或者普 通透明质酸降解成双 糖， 通过 HPLC法测定双糖含量， 得到寡聚透明质酸盐或低分子透明 质酸盐的含量。 还可采用咔唑法 （凌沛学.透明质酸【M】 .北京： 中 国轻工业出版社， 2002 )测定寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质 酸或其盐的含量。 如果透明质酸或其盐的结构受到破坏， 则透明质酸 酶不会对破坏部分的糖苷键进行裂解， 这样会造成双糖含量降低。 咔 唑法的测定原理是通过测定己糖酪酸的含量来 推测寡聚透明质酸或 低分子透明质酸或直接发酵制得的透明质酸的 含量。 因此， 也可用这 两种方法测得的含量的差值来间接地考察透明 质酸或其盐的结构是 否受到破坏及破坏的程度。

本发明降解透明质酸或其盐所用的透明质酸酶 （即芽孢杆菌透明 质酸酶， 下同）是由芽孢杆菌 A50发酵得透明质酸酶发酵液， 然后经 离心、 硫酸铵分级沉淀、 超滤等步骤得到的。 其制备过程是： 取斜面 菌种 （芽孢杆菌 ( Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 )接种于已灭 菌的种子培养基中， 25 - 40°C、 100 - 200rpm下培养 10 - 24小时， 然 后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 3-15%， 25- 40°C、 100 - 300rpm下培养 12-24小时， 发酵过程中用酸将 pH维持 在 6.0- 8.0， 发酵结束得透明质酸酶发酵液， 发酵液经 10000 - 15000rpm离心 10 - 20min得上清液，将上清液中加入硫酸铵，使其� �� 量体积浓度为 20% -25%, 过滤除去产生的沉淀， 然后继续加入硫酸 铵， 至其质量体积浓度为 35%-40%为止，取得到的沉淀即为透明质酸 酶，溶于磷酸盐緩冲液中， 最后经 3xl0 ⁴ Da的超滤膜除去小分子杂质， 得酶解用透明质酸酶。

所用的培养基为：

斜面培养基（ lOOmL) ： 蛋白胨 0.2- 2.0g， 酵母粉 0.2 - 2.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 00.05 - 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g， 琼脂粉 2.0g， pH调至 6.0-8.0， 水， 斜面培养的温度为 25 - 40°C。

种子培养基（ lOOmL) ： 蛋白胨 0.2-2.0g， 酵母粉 0.2 - 2.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 00.05 - 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g， pH调至 6.0- 8.0。

发酵培养基（ lOOmL) ： 蛋白胨 0.2-2.0g， 酵母粉 0.2 - 2.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 00.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 00.05 - 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g， 吐温 80 0.05mL, pH调至 6.0-8.0。

采用中国药典方法 （参照中国药典 2010版 附录 VII C 玻璃酸酶 测定法） 测定由以上方案制得的发酵液中的透明质酸酶 活力在 lxlO ⁵ - 3xl0 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 8xl0 ⁶ - 1.5xl0 ⁷ IU/mg _o 实施例 1: 芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的获得和鉴定

1. 芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的获取

将装有富集培养基的平 打开盖， 放置于空气中， 收集空气中沉 降菌， 约 1小时后， 盖上盖， 置于 25 - 40°C培养箱中有氧培养， 培养 24 小时后， 将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中， 25 - 40°C, 150rpm, 有氧培养 12-16 小时， 采用中国药典方法测定透明质酸酶 活力， 选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种， 菌种酶活力可达 10 ⁵ IU/mL。

上述所采用的各培养基组成如下：

富集培养基（ lOOmL) ： 蛋白胨 0.2- 2· 0g， 酵母粉 0.2 - 2.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05 - 0.15g， 透明质酸钠 0.01 - lg， 琼脂粉 2.0g。

筛选培养基（ lOOmL) ： 蛋白胨 0.2- 2.0g， 酵母粉 0.2 - 2.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05 - 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05 - 0.15g， 透明质酸钠 0.01 - lg。

得到芽孢杆菌 Bacillussp. ) A50于 2012年 2月 8 日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC) ， 保藏号为 CGMCC NO. 5744, 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号中国 科学院微生物研究所， 100101。

2. 芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的形态特征

菌体杆状， 单个或链状。 菌落乳白色， 有皱褶。

3. 芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的分子生物学特征鉴定 按照 Weisburg的方法合成细菌 16S rDNA通用引物：

引物 1: 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ； ( SEQ ID NO:

4) ；

引物 2:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3' ( SEQ ID NO:5) ₀ 以菌株 A50的总 DNA(使用北京天恩泽柱式细菌基因组 DNAout 试剂盒提取） 为模板， 扩增其 16S rDNA片段， PCR扩增反应体系如 下：

lOxPCR 緩冲液 5.0 μΐ

dNTP (10 mM) 1.0 μΐ

引物 1(10 μΜ) 1.0 μΐ

引物 2 (10 μΜ) 1.0 μΐ

Taq DNA 聚合酶 (5]/μΙ) 0.5 μΐ

DNA 模板 ( 50 ng/ μΐ) 0.5 μΐ

加去离子水至总体积 50 μΐ PCR反应条件如下:

95°C min

30个循环

72 °C 10 min

4°C 反应终止。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检验后测序（ Weisburg W G, Bams S M, Pelletier D A, et al. 16S ribosomal DNA ampliflcation for phylogenetic study [J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697-703 ) 。 得到的 16SrDNA ( SEQ ID NO: 1， 1418bp )如下： gcggctggct cct tacggt t accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgat tact agcgattccg get tcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg ct tcgaat ta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaat tc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacact t agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtt tgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaga aagccgcct t cgccactggt gt tcctccac atctctacgc at t tcaccgc tacacgtgga attccgcttt cctct tctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataat tc cggacaacgc t tgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt act tgt tct t ccctaacaac agagctttac gacccgaagg cct tcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga gccgt tacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtat tagct ccggt t tccc gaagt tatcc cagtcttaca ggcaggt tgc ccacgtgt ta ctcacccgtc cgccgctaac caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca ( SEQ ID NO: 1 ) 。 实施例 2: 透明质酸酶的克隆和序列分析

用细菌基因组 DNA提取试剂盒抽提芽孢杆菌 Bacillus、 A50的 基因组 DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA提取结果。 然后对基 因组进行测序获取该菌株的全基因组鸟枪序列 。 同时将从芽孢杆菌 { Bacillus) A50的发酵液中分离纯化出来的透明质酸酶， 进行 N端 测序以及胰蛋白酶降解后的内肽段测序， 获取该透明质酸酶的部分氨 基酸序列。 用 NCBI上的 BLAST工具将上述全基因组鸟枪序列与部分 氨基酸序列进行比对，找到与氨基酸序列相似 性为 100 %的基因片段， 从而找到透明质酸酶基因所在的大体位置。 再根据透明质酸酶的 N端 序列、 SDS-PAGE电泳条带大小， 以及利用 GeneTool软件分析开放阅 读框（0RF) ， 确定出目标基因的具体位置及完整的核苷酸序 列， 再 利用 BioEdit软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。

透明质酸酶的氨基酸序列 （SEQ ID NO: 2， 1106 aa )如下： NESTLLLNTSFEETEAPKSGWDQLGAPKWGVWRPTGSPIVTITKEASRTGEYGLKIAAA QSARAAVSQDVPVQGGQTYQLGTWLKTDNIVSGQGARLRVVLYEGTQQLGLLYSSRLTGT HDW SQIKMEVKTPANADSIRVQLFFETGTGTALFDDVSLQLIQPATSIAIEESEITIKEQETG LLH AQMVPADASSKVSWVSADPSIATVDNGKVTGVNPGGTTIMAFTDNGLAATSTVKVIKNDG IER PEVTQLDLQPKELELGSGQVRLLQAIIAPATADAEKLVWSSSNEAVASIQKGLIEAKASG TAV ITVETEDGSLKSESQITVTDAVVDEYDQLRKKW SLMTGLDSYDPTNVRMNEMIQNQTKSAET LWKTMFKNNDRSFLWINFASTDNSADIRDSYRNLTTMAKAFANEHSSLYRNPQLLKDITE ALE WLYQNRYNESIAQYSNWWHWEIGVPNELNSLMVLLYDYLDQDSIHRYLKVVDHFQPDPTK SGA TTPEKYREALGANRIDVSKVVGVRGVIVKDATKIAAARDALSQTFENVTEGDGFYEDGSF VQH OOOVOOVIOOIIVOIIOIOOIOVOIVOIOOOVVVVOOIOVVVVVOOOIIOVVOIVOIVIV VOI VOVIOOIOVOOIVOOOVIIOOOVIIVOVOOOVVVOIOVOVVVIIOOVOOOIVOVVOOOVV VOV IOOOVIIVOIOIOOIOVVOOVOIOOOVVVOOOVVOIIVIIOVOOVVVVVOIIVIOIIOOO IOV OOVVOIVVOOIIOIOOVOOIVIOOIIOVVVVOVOOIVOOOOIOVOOOVOOVOOOIVIIVV OOO VOIIOOIIVOOOIOVVOIOOVOIVOOIIOOVOOIOVVOOVVVOOVVOVIOIVOOIIOVOV OVV IOOVOOOOOOOVVOIIVIOOIVOIVVVVVOIVOIOVVVVIOOOVIOVIOVOOOIOOIIOO OOO VVIVOOOVIIIIOOOIVIIVOOVVOVOOOOOOOOOIVVVIOIOOOOVIIOOVVIOOOVVI VOI IOOOVOOOIIVOOIVOOIVOOOOOOIOIOOOIIOIVIOVVVOOIOOVOOOIVOIOOIOOI IOO IVOVOVOOIVOOIIVIIIOOVOVVVOOVOOVOVVVOIVOOVOIVVVOIOVVVOVVOOIVI OOI IVOOIOOVIOOVOOOVOOIVOIOOVOOIOVOIIIOIVOIVOIIIVIOOOOVOVIOOOOVV OOV OVVVOIIIOIIIIOOVOOIOIOOOIVOOVIVOOOOIVVOOOIOOIOVOVVVIOOVOOIVV VVV IVVVOOOIOOIIVOOVOOOVOOOIOVVIIVOVVOIIOIOVIIIOVIIOOOOIOOVOOVOO OVV OOVVOIVIVIIIIOIIOOOVOIOOOOOOOOOOVVOIOOOOVOIOOIVIVVIVOVOVOVVO IOO OIOOVOOOVIIOVOIVIOOVOVOOOOOOOOVOIIOIOOVIOIVOOVOVOIOIOOOOIOOV OVI OOIOIVVOOOOOOOOOOIIVVVVVIIIOOIVIOVOIOOOOVIOOOOVVOOVVOOVVVOVI IVO OVVIOIIVOOOOOVVOOOOVIOOVOVOOIOIOIOOOOIVVVVOOVOOIOOVIIVVOIVOO OIO

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基于 NCBI/BLAST软件的氨基酸序列同源性分析表明： 与 SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列相似性最高的蛋白是一种解藻 朊类芽孢杆菌 ( Paenibacillus a lginolyticus ) 的黄原胶裂解酶 Xa lB前体， 相似 度达 46 %， 相似度在 31 - 46 %之间的蛋白大部分是透明质酸裂解酶， 还有黄原胶裂解酶、 多糖裂解酶 -8家族，还有一些假定的或未命名的 蛋白质， 它们都属于粘多糖（GAG ) 裂解酶家族。

基于 NCBI/BLAST软件的基因序列同源性分析表明：未� �现与 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列同源的序列， 说明具有 SEQ ID NO: 3所 示核苷酸序列的透明质酸酶基因是一种新的基 因。 实施例 3: 透明质酸酶的制备（ 1 )

斜面培养基组成（ l OOmL ) :蛋白胨 0. 2g，酵母粉 2. 0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. 05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. 05g， 葡萄糖 0. 5g， 琼脂粉 2. 0g， 用盐酸将 pH 调至 6. 0。

种子培养基组成（ l OOmL ) :蛋白胨 0. 2g，酵母粉 2. 0g， ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. 05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. 05g， 葡萄糖 0. 5g， 用盐酸将 pH调至 6. 0。

发酵培养基组成（ l OOmL ) :蛋白胨 0. 2g，酵母粉 2. 0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. 05g , MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. 05g , 葡萄糖 0. 5g， Tween80 (吐温 80 ) 0. 05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 25 °C， 150rpm培养 24小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10 %， 25 °C， 200rpm 培养 24小时， 发酵过程中用硫酸将 pH维持在 6.0， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 lOOOOrpm离心 20min得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 20%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 35%为止， 取得到的沉淀即为透明质酸酶， 将得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐緩冲液（ pH6.0， 50腿 ol/L) 中， 最后经 3χ 10 ⁴ Da的超滤膜除去小分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 Ι. Ο χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 8. O x 10 ⁶ IU/mg。 实施例 4: 透明质酸酶的制备（ 2 )

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.0g，酵母粉 1.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 1.0g， 琼脂粉 2.0g， 用磷酸将 pH调 至 7.0。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.0g，酵母粉 1.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 1.0g， 用磷酸将 pH调至 7.0。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.0g，酵母粉 1.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 1.0g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 30°C， lOOrpm培养 15小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 35°C, 300rpm 培养 16小时， 发酵过程中用硫酸将 pH维持在 7.0， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 15000rpm离心 lOmin得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 22%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 38%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷 酸盐緩冲液（ pH6.0, 50mmol/L )中， 最后经 3 x 10 ⁴ Da的超滤膜除去小 分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 3.0 X 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 9.5 x 10 ⁶ IU/mg。 实施例 5: 透明质酸酶的制备（3)

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.5g，酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g， 葡萄糖 1.5g， 琼脂粉 2.0g， 用硫酸将 pH 调至 8.0。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.5g，酵母粉 1.5g， ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g， 葡萄糖 1.5g， 用¾酸将 pH调至 8.0。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 0.5g，酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05g, 葡萄糖 1.5g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 35°C， 200rpm培养 13小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 40°C, lOOrpm 培养 12小时， 发酵过程中用盐酸将 pH维持在 7.0， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 12000rpm离心 15min得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 25%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 35%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷 酸盐緩冲液（pH6.0, 50腿 ol/L)中， 最后经 3 χ 10 ⁴ Da的超滤膜除去小 分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 1. 2 χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 9. O x 10 ⁶ IU/mg。 实施例 6: 透明质酸酶的制备（ 4 )

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 2.0g，酵母粉 0.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05g， 葡萄糖 1.0g， 琼脂粉 2.0g， 用硫酸将 pH 调至 6.5。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 2.0g，酵母粉 0.5g， ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05g， 葡萄糖 1.0g， 用¾酸将 pH调至 6.5。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.5g,酵母粉 0.2g, Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g, 葡萄糖 1.5g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 40°C， 180rpm培养 10小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 36" , 280rpm 培养 15小时， 发酵过程中用磷酸将 pH维持在 8.0， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 lOOOOrpm离心 20min得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 20%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 40%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷 酸盐緩冲液（ pH6.0, 50mmol/L )中， 最后经 3 x 10 ⁴ Da的超滤膜除去小 分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 1.5 χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 8.2 X 10 ⁶ IU/mg。 实施例 7: 透明质酸酶的制备 ( 5 )

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 0.5g，酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 0.5g， 琼脂粉 2. Og, 用磷酸将 pH 调至 7.5。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 0.5g，酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 0.5g， 用磷酸将 pH调至 7.5。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 2.0g,酵母粉 0.2g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.05g, 葡萄糖 0.5g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 36°C， 120rpm培养 14小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 30°C, 180rpm 培养 20小时， 发酵过程中用磷酸将 pH维持在 7.5， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 lOOOOrpm离心 20min得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 25%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 40%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷 酸盐緩沖液（pH6.0, 50腿 ol/L)中， 最后经 3x 10 ⁴ Da的超滤膜除去小 分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 2.0 χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 9.3 X 10 ⁶ IU/mg。 实施例 8: 透明质酸酶的制备（6 )

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.0g，酵母粉 1.0g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g, 葡萄糖 1.5g， 琼脂粉 2. Og, 用盐酸将 pH 调至 7.0。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1. Og,酵母粉 1. Og, Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0. lg, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g， 葡萄糖 1.5g， 用盐酸将 pH调至 7.0。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 1.5g，酵母粉 0.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g, 葡萄糖 1.5g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 32°C， 150rpm培养 18小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 28°C， 200rpm 培养 22小时， 发酵过程中用盐酸将 pH维持在 8.0， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 15000离心 lOmin得上清液， 将上清液中 加入硫酸铵， 使其浓度为 24%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续加入 硫酸铵， 至其浓度为 36%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐 緩冲液（ pH6.0, 50匪 ol/L )中， 最后经 3 χ 10 ⁴ Da的超滤膜除去小分子 杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 1. 8 χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 8.4 X 10 ⁶ IU/mg。 实施例 9: 透明质酸酶的制备（ 7 )

斜面培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 2.0g,酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g， 葡萄糖 0.5g， 琼脂粉 2.0g， 用磷酸将 pH 调至 7.0。

种子培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 2.0g,酵母粉 1.5g, ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.05g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0.15g， 葡萄糖 0.5g， 用磷酸将 pH调至 7.0。

发酵培养基组成（ lOOmL):蛋白胨 0.5g，酵母粉 1.5g， Κ ₂ ΗΡ0 ₄ ·3Η ₂ 0 0.15g, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0. lg, 葡萄糖 1.0g， Tween80 0.05mL。

取斜面菌种 （芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744 ) 接种于已灭菌的种子培养基中， 30°C， 200rpm培养 20小时， 然后将 种子液接种于已灭菌的发酵培养基中， 接种量为 10%， 34°C, 220rpm 培养 14小时， 发酵过程中用磷酸将 pH维持在 7.5， 发酵生产得到透 明质酸酶发酵液， 发酵液经 12000rpm离心 15min得上清液， 将上清 液中加入硫酸铵， 使其浓度为 25%， 过滤除去产生的沉淀， 然后继续 加入硫酸铵， 至其浓度为 38%为止，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷 酸盐緩冲液（ pH6.0, 50mmol/L )中， 最后经 3 x 10 ⁴ Da的超滤膜除去小 分子杂质， 得纯化后透明质酸酶。

采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活 力为 1.2 χ 10 ⁵ IU/mL, 纯化后的透明质酸酶比活为 8.1 x 10 ⁶ IU/mg。 实施例 10: 透明质酸酶的制备（8)

将芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的发酵液（例如可以使用实施 例 3- 9中任一实施例中制备的发酵液）在 4°C下离心除去菌体， 收集 上清液。 向上清液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 使其质量体积浓度达 到 20%， 过滤除掉沉淀， 继续向滤液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 至 其质量体积浓度达到 40%， 过滤收集沉淀。 将沉淀溶解于 pH4.5 的 Na ₂ HP0 ₄ -柠檬酸緩冲液中， 得到粗酶液。 将上述粗酶液装入截留分子 量为 3.0 X 10 ³ Da的透析袋中，放入 pH4.5的 Na ₂ HP0 ₄ -杵檬酸緩冲液中， 4°C， 透析过夜。 将透析袋内的溶液进行离子交换色谱分离， 色谱柱 填料是 DEAE琼脂糖凝胶 FF介质， 用 0 - 0.5M NaCl溶液进行梯度洗 脱， 收集洗脱峰。 将最终收集下来的洗脱液跑 SDS-PAGE 电泳， 检测 分离纯化效果。 电泳结果如 Fig.1中的 1泳道所示： 透明质酸酶纯度 为 97.6%。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱� ��进行冷冻真空干 燥， 得到白色粉末， 即为透明质酸酶。 得到的透明质酸酶比活为 1.3 X 10 ⁷ IU/mg。 实施例 11: 透明质酸酶的制备（9)

将芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的发酵液（例如可以使用实施 例 3- 9中任一实施例中制备的发酵液）在 4°C下离心除去菌体， 收集 上清液。 向上清液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 使其质量体积浓度达 到 25%， 过滤除掉沉淀， 继续向滤液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 至 其质量体积浓度达到 40%，过滤收集沉淀。将沉淀溶解于 50mM、 pH6.5 的 Na ₂ HP0 ₄ - NaH ₂ P0 ₄ 緩冲液中， 得到粗酶液。 将上述粗酶液装入截留 分子量为 1. O x 10 ⁴ Da的透析袋中，放入 50mM,pH6.5的 a ₂ HP0 ₄ -NaH ₂ P0 ₄ 緩冲溶液中， 4°C， 透析过夜。 将透析袋内的溶液进行离子交换色谱 分离， 色谱柱填料是 DEAE琼脂糖凝胶 FF介质， 用 Q - 0.5M NaCl溶 液进行梯度洗脱， 收集洗脱峰。将最终收集下来的洗脱液跑 SDS-PAGE 电泳， 检测分离纯化效果。 电泳结果如 Fig.1中的 2泳道所示： 透明 质酸酶纯度为 98.1。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱� �进行冷 冻真空干燥， 得到白色粉末， 即为透明质酸酶。 得到的透明质酸酶比 活为 1.4 X 10 ⁷ IU/mg。 实施例 12: 透明质酸酶的制备（10)

将芽孢杆菌 Bacillus sp. ) A50的发酵液（例如可以使用实施 例 3- 9中任一实施例中制备的发酵液）在 4°C下离心除去菌体， 收集 上清液。 向上清液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 使其质量体积浓度达 到 20%， 过滤除掉沉淀， 继续向滤液中緩慢加入硫酸铵固体粉末， 至 其质量体积浓度达到 40%，过滤收集沉淀。将沉淀溶解于 50mM、 pH8.0 的 Na ₂ HP0 ₄ -NaH ₂ P0 ₄ 緩冲液中， 得到粗酶液。 将上述粗酶液装入截留分 子量为 1.4 X 10 ⁴ Da的透析袋中， 放入 50mM, ρΗ8· 0的 a ₂ HP0 ₄ -NaH ₂ P0 ₄ 緩冲溶液中， 4°C， 透析过夜。 将透析袋内的溶液进行离子交换色谱 分离， 色谱柱填料是 DEAE琼脂糖凝胶 FF介质， 用 0 - 0.5M NaCl溶 液进行梯度洗脱， 收集洗脱峰。将最终收集下来的洗脱液跑 SDS-PAGE 电泳， 检测分离纯化效果。 电泳结果如 Fig.1中的泳道 3所示： 透明 质酸酶纯度为 97.5%。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱� ��进行 冷冻真空干燥， 得到白色粉末， 即为透明质酸酶。 得到的透明质酸酶 比活为 1.5 X 10 ⁷ IU/mg。

本发明透明质酸酶酶活性高， 热稳定性和 pH稳定性好， 能够满 足工业化大批量降解透明质酸所需的酶用量， 且酶的制备过程简单、 条件温和， 成本低，解决了化学降解污染环境、生物降解 酶来源有限、 活性低、 价格高的缺陷。 下面列举以本发明比酶活在 8 X 10 ⁶ - 1.5 X 10 ⁷ IU/mg之间的透明 质酸酶酶切法制备寡聚透明质酸盐或低分子透 明质酸盐的实施例。 实施例 13: 寡聚透明质酸钠的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 2 χ 10 ⁴ Da的透明质酸钠 300kg， 待完全溶解后， 用冰乙酸 调节 pH为 4.0， 并升温至 20°C， 加入 1.35 X 10 ¹⁽⁾ IU的芽孢杆菌透明 质酸酶（实施例 3制备） ， 酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时 （中间不断取 样釆用 GPC-MALLS法监测） ， 将温度升高至 50°C， 维持 60min， 加入 lkg NaCl, 用 0.45μπι的混合纤维素滤膜过滤酶解液， 然后用 20m ³ 的 乙醇沉淀， 得到透明质酸钠沉淀， 该沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥 即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白 色颗粒， HPLC法测得含 量为 96.8%; 咔唑法测得含量为 97.5%; 分子量 8.6kDa， pH6.8。 其 红外图谱见 Fig.2(C)， 与欧洲药典标准图谱 Fig.2(A)—致（欧洲药 典标准图谱的样品是未经降解的） 。 实施例 14: 寡聚透明质酸钟的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 3x l0 ⁶ Da的透明质酸钟 10kg, 待完全溶解后， 用氢氧化 钠调节 pH为 9.0, 并升温至 48°C, 加入 4 X 10 ⁸ IU的芽孢杆菌透明质 酸酶（实施例 4制备） ， 酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时， 将温度升高至 90°C， 维持 10min， 加入 100kg KC1， 用 0.45μπι的聚砜滤膜过滤酶解 液， 然后用 5m ³ 的丙酮沉淀， 得到透明质酸钟沉淀， 该沉淀用丙酮脱 水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钾。 该寡聚透明质酸钾为白色粉 末， HPLC法测得含量为 98.8%; 咔唑法测得含量为 98.3%; 分子量 3.2kDa, pH6.5, 其红外图语 Fig.2 (D)与欧洲药典标准图语一致。 实施例 15: 寡聚透明质酸钠的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 1.6 x l0 ⁶ Da的透明质酸钠 30kg， 待完全溶解后， 用氢氧 化钟调节 pH为 8.0， 并升温至 40°C， 加入 1.2 X 10 ⁹ IU的芽孢杆菌透 明质酸酶（实施例 5制备） ， 酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时， 将温度升 高至 60°C， 维持 60min， 加入 50kgNaCl， 用 0.45μπι的尼龙滤膜过滤 酶解液， 然后用 10m ³ 的丙醇沉淀， 得到透明质酸钠沉淀， 该沉淀用丙 醇脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。 该寡聚透明质酸钠为白 色粉末， HPLC法测得含量为 97.6%; 咔唑法测得含量为 97.8%; 分子 量 6.2kDa， pH7.1， 其红外图傳 Fig.2 (E)与欧洲药典标准图语一致。 实施例 16: 寡聚透明质酸钙的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 8 x l0 ⁵ Da的透明质酸钙 60kg, 待完全溶解后， 用冰乙酸 调节 pH为 7.0， 并升温至 35°C， 加入 2.4 X 10 ⁹ IU的芽孢杆菌透明质 酸酶（实施例 6制备） ， 酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时， 将温度升高至 70°C， 维持 30min， 加入 35kg CaCl ₂ ， 用 0.45μπι的聚醚砜滤膜过滤酶 解液， 然后用 3m ³ 的异丙醇沉淀， 得到透明质酸钙沉淀， 该沉淀用异 丙醇脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钙。 该寡聚透明质酸钙为 白色粉末， HPLC法测得含量为 96.6%； 咔唑法测得含量为 97.3%; 分 子量 5.6kDa, pH6.5，其红外图语 Fig.2 (F)与欧洲药典标准图语一致。 实施例 17: 寡聚透明质酸钠的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 2 χ 10 ⁵ Da的透明质酸钠 200kg， 待完全溶解后， 用硫酸调 节 pH为 6.0， 并升温至 25" ， 加入 8 X 10 ⁹ IU的芽孢杆菌透明质酸酶 (实施例 7制备），酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时，将温度升高至 80°C， 维持 20min， 加入 60kg NaCl, 用 0.45μπι的聚醚砜滤膜过滤酶解液， 然后用 6m ³ 的曱醇沉淀， 得到透明质酸钠沉淀， 该沉淀用甲醇脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。 该寡聚透明质酸钠为白色颗粒， HPLC法测得含量为 98.7 %；咔唑法测得含量为 98.3%;分子量 7.6kDa, pH7.3， 其红外图谱 Fig.2(G)与欧洲药典标准图谱一致。 实施例 18: 寡聚透明质酸锌的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 10 ⁵ Da的透明质酸 100kg, 待完全溶解后， 用氢氧化钠调 节 pH为 5.0， 并升温至 20°C， 加入 4 X 10 ⁹ IU的芽孢杆菌透明质酸酶 (实施例 8制备），酶解至分子量小于 10 ⁴ Da时，将温度升高至 55°C， 维持 40min， 加入 20kg ZnCl ₂ ， 用 0.45μπι的硝化纤维素滤膜过滤酶解 液， 然后用 4.5m ³ 的乙醇沉淀， 得到透明质酸锌沉淀， 该沉淀用乙醇 脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸锌。 该寡聚透明质酸锌为白色 颗粒， HPLC法测得含量为 96.8%; 咔唑法测得含量为 97.6%; 分子量 9. lkDa, pH6.8, 其红外图语 Fig.2 (H)与欧洲药典标准图语一致。 实施例 19: 低分子透明质酸钠的制备（ 1 )

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 3χ 10 ⁶ Da的透明质酸钠 lkg， 待完全溶解后， 调节温度为 48°C, 用氢氧化钠调节 pH为 9.0， 边搅拌边加入 10 ⁷ IU芽孢杆菌透明 质酸酶（实施例 9制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将温度升高 至 50°C， 维持 60min。 加入 2kg NaCl, 完全溶解后经 0.45μπι的聚丙 烯滤芯过滤， 然后用 lm ³ 的丙酮沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉淀用 丙酮脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明质酸 钠为白色粉末， HPLC法测得含量为 98.3%；咔唑法测得含量为 98.5%; 经测定分子量为 931kDa。 实施例 20: 低分子透明质酸钾的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 l x l 0 ⁶ Da的透明质酸钟 20kg , 待完全溶解后， 调节温度 为 20°C， 用冰乙酸调节 pH为 4. 0， 边搅拌边加入 10 ⁸ IU芽孢杆菌透明 质酸酶（实施例 7制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将温度升高 至 90°C， 维持 10min。 加入 100kg KC1， 溶解后经 0. 45μπι的硝化纤维 素滤芯过滤， 然后用 10m ³ 的乙醇沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉淀 用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钾。 该低分子透明质 酸鉀为白色颗粒， HPLC 法测得含量为 96. 8 % ; 咔唑法测得含量为

97. 5%; 分子量 15kDa。 实施例 21 : 低分子透明质酸锌的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 1. 61 10 ⁶ Da的透明质酸钠 12kg， 待完全溶解后， 调节温 度为 45 °C， 用冰乙酸调节 pH为 5. 0， 边搅拌边加入 2 X 10 ⁷ IU的芽孢 杆菌透明质酸酶（实施例 8制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将 温度升高至 80°C， 维持 20min。 加入 40kg ZnCl ₂ , 溶解后 0. 45μπι的 聚醚砜滤芯过滤， 然后用 3m ³ 的曱醇沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉 淀用曱醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸锌。 该低分子透明 质酸锌为白色颗粒， HPLC法测得含量为 98. 5 % ; 咔唑法测得含量为

98. 2%; 分子量 754kDa。 实施例 22: 低分子透明质酸钾的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 1. 77 X 10 ⁶ Da的透明质酸钾 10kg, 待完全溶解后， 调节温 度为 38 °C， 用稀磷酸调节 pH为 6. 0， 边搅拌边加入 5 X 10 ⁷ IU的芽孢 杆菌透明质酸酶（实施例 9制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将 温度升高至 60°C， 维持 30min _o 加入 30kg K ₂ S0 ₄ ， 溶解后经 0. 45μιη 的聚醚砜滤芯过滤， 然后用 5m ³ 的异丙醇沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉淀用异丙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钾。 该低分 子透明质酸钟为白色颗粒， HPLC法测得含量为 96. 3 % ; 咔唑法测得 含量为 97. 3%; 分子量 421kDa。 实施例 23: 低分子透明质酸镁的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 2. 25 x l 0 ⁶ Da的透明质酸镁 8kg， 待完全溶解后， 调节温 度为 42 °C， 用稀 υ酸调节 pH为 5. 5， 边搅拌边加入 3 x l0 ⁷ IU的芽孢 杆菌透明质酸酶（实施例 6制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将 温度升高至 55 °C， 维持 50min加入 60kg MgCl ₂ , 溶解后经 0. 45Mm的 聚丙烯滤芯过滤， 然后用 2. 4m ³ 的丙醇沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该 沉淀用丙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸镁。 该低分子透 明质酸镁为白色粉末， HPLC法测得含量为 97. 2 % ; 咔唑法测得含量 为 98. 1%; 分子量 538kDa„ 实施例 24: 低分子透明质酸钙的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 2. 46 x l 0 ⁶ Da的透明质酸钙 5kg， 待完全溶解后， 调节温 度为 40°C， 用冰乙酸调节 pH为 7. 0， 边搅拌边向加入 5 X 10 ⁷ IU的芽 孢杆菌透明质酸酶（实施例 5制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将温度升高至 65 °C， 维持 40min。 加入 50kg CaCl ₂ ， 溶解后经 0. 45μιη 的聚丙烯滤芯过滤， 然后用 4. 5m ³ 的丙酮沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉淀用丙酮脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钙。 该低分子 透明质酸钙为白色颗粒， HPLC法测得含量为 98. 1 % ; 咔唑法测得含 量为 98. 2%; 分子量 205kDa _o 实施例 25: 低分子透明质酸钠的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 2.78xl0 ⁶ Da的透明质酸钠 2kg， 待完全溶解后， 调节温 度为 35°C， 用冰乙酸调节 pH为 6.5， 边搅拌边向加入 2 X 10 ⁷ IU的芽 孢杆菌透明质酸酶（实施例 4制备）进行酶解。 酶解至所需分子量， 将温度升高至 58°C， 维持 50min。 加入 70kg Na ₂ S0 ₄ ， 溶解后经 0.45Mm 的硝化纤维素滤芯过滤， 然后用 4.8m ³ 的乙醇沉淀， 得到低分子 HA沉 淀， 该沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低 分子透明质酸钠为白色粉末， HPLC法测得含量为 98.6%; 咔唑法测 得含量为 98.3%; 分子量 332kDa。 实施例 26: 低分子透明质酸钠的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中加入 lm ³ 纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加 入分子量为 1.41 X 10 ⁶ Da的透明质酸钠 15kg， 待完全溶解后， 调节温 度为 43°C， 用氢氧化钠调节 pH为 8.0， 边搅拌边向加入 4xl0 ⁷ IU的 芽孢杆菌透明质酸酶（实施例 3制备）进行酶解。酶解至所需分子量， 将温度升高至 65°C， 维持 40min。 加入 80kg NaCl， 溶解后经 0.45μιη 的聚砜滤芯过滤， 然后用 8m ³ 的乙醇沉淀， 得到低分子 HA沉淀， 该沉 淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明 质酸钠为白色颗粒， HPLC法测得含量为 98.2%; 咔唑法测得含量为 99.1%; 分子量 38kDa„ 实施例 27: 透明质酸酶应用于低分子硫酸软骨素的制备

向 lm ³ 不锈钢溶解罐中配制 lm ³ pH6.0的磷酸盐緩冲液， 边搅拌 边向该溶解罐中加入分子量为 5xl0 ⁴ Da的硫酸软骨素 50kg， 待完全 溶解后， 并升温至 37°C， 加入 9xl0 ⁸ IU的芽孢杆菌透明质酸酶（例 如可以使用实施例 3-9 中任一实施例中制备的透明质酸酶） ， 酶解 至分子量 5000Da时， 将温度升高至 50°C， 维持 60min， 用 0.45μπι的 滤芯过滤酶解液， 然后用 20m ³ 的乙醇沉淀， 得到低分子硫酸软骨素沉 淀， 该沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子硫酸软骨素成品。 该 酸软骨素为白色颗粒， 含量 95. 8 %， 分子量 5. lkDa， pH6. 8。 比较例 1 : 化学降解法制备寡聚透明质酸钠 ( 1 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 8 X 10 ⁵ Da的透明质酸钠 50g , 待完全溶解后， 加浓盐酸 10mL， 降解至 分子量小于 10 ⁴ Da时， 用氢氧化钠调节 pH至 6. 2， 用 0. 45μπι的混合 纤维素滤膜过滤降解液， 然后用 10L的乙醇沉淀， 得到透明质酸钠沉 淀， 该沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。 该寡聚 透明质酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 63. 8 % ; 咔唑法测得 含量为 98. 9%; 分子量 8. lkDa， pH4. 8。 其红外图语见 F ig. 2 (B)， 其 与与欧洲药典标准图谱有差异。 比较例 2: 化学降解法制备寡聚透明质酸钠 （2 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 5 X 10 ⁵ Da的透明质酸钠 100g， 待完全溶解后， 加浓盐酸 10mL， 降解至 分子量小于 10 ⁴ Da时， 用氢氧化钠调节 pH至 6. 5， 用 0. 45μπι的聚砜 滤膜过滤降解液， 然后用 10L的乙醇沉淀， 得到透明质酸钠沉淀， 该 沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。 该寡聚透明质 酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 60. 2 % ; 咔唑法测得含量为 99. 2%; 分子量 7. 6kDa， ρΗ4· 2。 比较例 3: 化学降解法制备低分子透明质酸钠 ( 1 )

向 1L 烧杯中加入 1L 纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1 X 10 ⁶ Da的透明质酸钠 10g，待完全溶解后，加氢氧化钠 5g，升温至 65 °C， 降解所需分子量时， 用冰乙酸调节 pH至 6. 5， 用 0. 45μπι的聚砜滤膜过 滤降解液， 然后用 5L的乙醇沉淀， 得到低分子透明质酸钠沉淀， 该沉 淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明 质酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 68. 2 % ; 咔唑法测得含量为

97. 5%； 分子量 15kDa， pH6. 9。 比较例 4: 化学降解法制备低分子透明质酸钠 （2 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1. 41 X 10 ⁶ Da 的透明质酸钠 15g， 待完全溶解后， 加氢氧化钠 6g， 升温至 65 °C， 降解所需分子量时， 用浓盐酸调节 pH至 6. 2， 用 0. 45μπι的聚砜 滤膜过滤降解液，然后用札的乙醇沉淀，得到 低分子透明质酸钠沉淀， 该沉淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子 透明质酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 70. 5 % ; 咔唑法测得含 量为 96. 8%; 分子量 39. 2kDa， pH6. 4。 比较例 5: 化学降解法制备低分子透明质酸钠 ( 3 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1. 61 X 10 ⁶ Da的透明质酸钠 8g，待完全溶解后，加氢氧化钠 6g，升温至 60°C， 降解所需分子量时， 用冰乙酸调节 pH至 6. 8， 用 0. 45μπι的聚砜滤膜过 滤降解液， 然后用札的乙醇沉淀， 得到低分子透明质酸钠沉淀， 该沉 淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明 质酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 73. 2 % ; 咔唑法测得含量为

98. 5%； 分子量 330kDa， pH6. 2。 比较例 6: 化学降解法制备低分子透明质酸钠 （4 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水， 边搅拌边向烧杯中加入分子量为 2. 25 X 10 ⁶ Da的透明质酸钠 5g，待完全溶解后，加氢氧化钠 5g，升温至 60°C， 降解所需分子量时， 用冰乙酸调节 pH至 6. 6， 用 0. 45μπι的聚砜滤膜过 滤降解液， 然后用 2L的乙醇沉淀， 得到低分子透明质酸钠沉淀， 该沉 淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明 质酸钠为微黄色粉末， HPLC法测得含量为 89. 9 % ; 咔唑法测得含量为 96. 8%; 分子量 530kDa， pH7. 5。 比较例 7: 化学降解法制备低分子透明质酸钠 ( 5 )

向 1L烧杯中加入 1L纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为 2. 46 X 10 ⁶ Da的透明质酸钠 4g，待完全溶解后，加氢氧化钠 4g，升温至 60°C， 降解所需分子量时， 用浓盐酸调节 pH至 6. 2， 用 0. 45μπι的聚砜滤膜过 滤降解液， 然后用 3L的乙醇沉淀， 得到低分子透明质酸钠沉淀， 该沉 淀用乙醇脱水， 然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。 该低分子透明 质酸钠为白色粉末， 1^1^ 法测得含量为95. 8 %； 咔唑法测得含量为 98. 5%; 分子量 770kDa， pH7. 6。 实验例 1 : 酶解法 （酶切法） 与化学降解法制备的寡聚透明质酸 盐的结构比较

寡聚透明质酸或低分子透明质酸与普通透明质 酸都是由 N-乙酰 氨基葡糖和 D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的，因此它们的� ��量等于双 糖的含量， 可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或 低分子透明 质酸或者普通透明质酸降解成双糖， 通过 HPLC法测定双糖含量， 得 到寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的含量 ； 同时用咔唑法测定寡 聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的含量。 如果透明质酸或其盐的结 构受到破坏， 则透明质酸酶不会对破坏部分的糖苷键进行裂 解， 这样 会造成双糖含量降低。 HPLC法与咔唑法的测定值差别越大，说明寡聚 透明质酸盐或低分子量透明质酸盐的结构破坏 越大。

具体方法可以参照公开号为 CN102323344A的中国专利申请， 其 全部内容在此通过引用并入本发明。

例如 HPLC法可以采用下面的步骤：

a.标准对照品溶液： 称取一定量的标准对照品（ Hya luronic ac id di sacchar ide ADiHA sodium sa l t, H9649 , S igma ) 用磚酸盐緩冲液

( pH6. 0, 5mmo l /L )溶解配制成 lmg/mL的溶液， 得到标准对照品溶 液；

b.样品预处理： 称取一定量的待测样品（比较例 1-7、 实施例 13 - 26制备）， 用磷酸盐緩冲液（ ρΗ6· 0， 5腿 o l /L )溶解配制成 lmg/mL 的溶液。 取 lmL样品溶液加入 1000IU的透明质酸酶（可以为实施例 10- 12制备的透明质酸酶）， 42" 水浴 2h; 酶解结束后， 将酶解液煮 沸 2min使酶失活， 得到样品酶解液。

将样品酶解液转移至 20mL容量瓶中， 加入流动相稀释至刻度， 混匀， 过滤即得供试液。

c标准对照品溶液处理： 取 lmL标准对照品溶液采用流动相稀释 20倍， 过滤待用。

d.色谱条件： 采用糖分析柱进行高效液相色谱测定； 流动相为 0.4mol/L NaH ₂ P0 ₄ 溶液； 流速为 0.6ml/min; 柱温为 35°C; 检测波长 为 232nm; 进样量为 20 L;

e.结果计算：

采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样 品进行色谱分离， 按外标法以峰面积计算， 按以下公式计算透明质酸盐含量： 透明质酸盐含量 C(%)=- -χ100%

A _R xW _x x(100-h)

Ax: 待测样品的透明质酸双糖峰面积；

A _R : 标准对照品的透明质酸双糖峰面积； Wx: 待测样品称样量， mg;

C _R : 标准对照品溶液浓度， mg/mL;

h( % )为待测样品干燥失重。

将比较例 1-2与实施例 13-18中得到的寡聚透明质酸盐的含: 进行比较， 见表 1。 表 1: 寡聚透明质酸盐的含:

比较例 实施例

1 2 13 14 15 16 17 18 含量

63.8 60.2 96.8 98.8 97.6 96.6 98.7 96.8

(HPLC法， %)

含量 98.9 99.2 97.5 98.3 97.8 97.3 98.3 97.6 (咔唑法， ％)

含量差值（％ ) 35. 1 39 0. 7 0. 5 0. 2 0. 7 0. 4 0. 8 从表 1可以看出， HPLC法和咔唑法测得的化学降解法制备的寡聚 透明质酸盐含量差别较大， HPLC法和咔唑法测得的酶切法制备的寡聚 透明质酸盐含量差别不大， 均小于 1%。说明酶切法制备的寡聚透明质 酸盐结构完整， 而化学降解法制备的寡聚透明质酸盐结构破坏 较大。

同时红外图谱表明， 酶切法制备的寡聚透明质酸盐与欧洲药典标 准图谱一致， 而化学降解法制备的寡聚透明质酸盐在波数 1610cm— ¹ 附 近与欧洲药典标准图谱差别较大， 表明化学降解法制备的寡聚透明质 酸盐结构被破坏， 而酶切法制备的寡聚透明质酸盐结构完整。 实验例 2: 酶解法 （酶切法） 与化学降解法制备的低分子透明质 酸盐的结构比较

将比较例 3 - 7及实施例 19 - 26中得到的低分子透明质酸盐的含 量进行比较， 见表 2 - 3。

具体步骤参照实验例 1。

表 2: 低分子透明质酸盐的含量（比较例 3 - 7 )

表 3: 低分子透明质酸盐的含量（实施例 19 - 26 )

实施例 20 26 24 25 22 23 21 19 分子量（ KDa ) 15 38 205 332 421 538 754 931 含量

96. 8 98. 2 98. 1 98. 6 96. 3 97. 2 98. 5 98. 3 ( HPLC法， ％)

含量 97. 5 99. 1 98. 2 98. 3 97. 3 98. 1 98. 2 98. 5 (咔唑法， ％)

差值 （％ ) 0. 7 0. 9 0. 1 0. 3 1. 0 0. 9 0. 3 0. 2 从表 2、 3 可以看出， 化学降解法制备的低分子透明质酸盐当分 子量小于 77 万时， 随着分子量的降低， 两种含量测定值差别越大； 而酶解法制备的低分子透明质酸盐随分子量的 变化， 这两种方法测的 含量差值均很小， 均小于 1%， 这个现象说明酶解法产生的低分子透明 质酸结构是完整的， 而化学降解法制备的低分子透明质酸盐当分子 量 小于 77万时， 分子量越低， 结构破坏越大。

动物酶降解得到的寡聚透明质酸盐， 具有促血管生成、 促进创伤 愈合、 抗肿瘤及免疫调节等生物活性。 微生物来源透明质酸酶降解得 到的寡聚透明质酸盐的生物学活性尚未见报道 。 但后面的实验研究表 明该发明中得到的寡聚透明质酸盐无细胞毒性 ， 与化学降解法得到的 寡聚透明质酸盐相比， 具有清除自由基作用强， 还原能力强， 防晒及 晒后修复作用强，因此可用于化妆品中；该寡 聚透明质酸盐分子量小， 易于被肠道吸收， 可用于食品中； 同时该寡聚透明质酸盐具有促血管 生成、 促进创伤愈合的作用， 因此可用于医药领域。

微生物来源透明质酸酶降解得到的低分子透明 质酸盐的生物学 活性也尚未见报道。 但上面的实施例 19 - 26表明， 酶切法制备的低 分子透明质酸盐结构完整， 同时以下的实验研究表明该发明中得到的 低分子透明质酸盐， 具有清除自由基作用强， 还原能力强， 也具有防 晒及晒后修复作用， 因此可用于化妆品及药品中； 同时该低分子透明 质酸盐可用于食品中， 保持皮肤的润滑、 弹性。 实验例 3: 温度对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶 的热稳 定性实验

用 pH6.0的磷酸盐緩冲液配制终浓度为 2mg/mL的 HA溶液， 取 9.9mL作为底物溶液， 并加入 ΙΟΟμΙ适当稀释（只要 232nm处的吸收 值在 0.3 - 0.7之间即可）的透明质酸酶液（例如可以使用 实施例 3 - 12 中任一实施例中制备的透明质酸酶）， 不同温度下水浴反应 30min后， 煮沸 2min， 以提前灭活的酶液稀释液作为对照， 待冷却至室温时测定 232nm处的吸收值（该数值的大小代表透明质酸� ��活性的高低）， 结果 如 Fig. 3 (A)所示， 最适反应温度为 42°C。

将透明质酸酶的酶液分别在 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C下恒 温保存不同时间测残余酶活， 结果如 Fig. 3 (B)所示： 40°C、 45°C两个 温度下酶活非常稳定， 6h内几乎没有降低， 表明该透明质酸酶在 45°C 以下活性非常稳定， 满足室温下工业生产的需要。 实验例 4: pH对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的 _P H稳 定性实验

分别配制 pHl. 0 - pH12. 0的緩冲液，并用这些緩冲液配制相应 pH 下 2mg/mL的透明质酸溶液， 分别取不同 pH的 9. 9mL HA溶液作为底 物溶液， 并加入 100 适当稀释（只要 232nm处的吸收值在 0.3 - 0.7 之间即可） 的透明质酸酶液（例如可以使用实施例 3 - 12中任一实施 例中制备的透明质酸酶） ， 水浴反应 30min后， 煮沸 2min， 以提前灭 活的酶液稀释液作为对照， 待冷却至室温时测定 232nm处的吸收值， 结果如 Fig. 4 (A)所示： 该酶的最适 pH为 6. 5，在 pH < 4. 0或 pH > 9. 0 时该酶无活性。

将透明质酸酶（例如可以使用实施例 3 - 12中任一实施例中制备 的透明质酸酶）用不同 pH的緩冲液适当稀释，并在室温下放置不同时 间测定残余酶活， 结果如 Fig. 4 (B)所示： 该酶在 pH5. 0 - 6. 0之间酶 活较稳定， 6h内基本没有降低。

可见， 本发明的透明质酸酶不仅酶活性高， 而且热稳定性和 pH 稳定性好， 能够满足工业化大批量降解透明质酸所需的酶 用量， 且酶 的制备过程简单、 条件温和， 成本低， 解决了化学降解污染环境、 生 物降解酶来源有限、 活性低、 价格高的缺陷。 实验例 5: 酶的底物特异性实验 用 pH 6. 0的磷酸盐緩冲溶液分别配制终浓度为 10mg/mL的硫酸 软骨素、 海藻酸钠、肝素钠、 壳聚糖、 几丁质和羟曱基纤维素钠溶液， 各取 9. 9mL作为底物溶液，并加入 l OO L稀释适当倍数（只要 232nm 处的吸收值在 0.3 - 0.7之间即可） 的透明质酸酶液（例如可以使用实 施例 3 - 12中任一实施例中制备的透明质酸酶）， 42 °C水浴反应 30min 后， 煮沸 2min， 以提前灭活的酶液稀释液作为对照， 待冷却至室温时 测定 232nm处的吸收值。 结果如表 4所示。

表 4 : 透明质酸酶的底物特异性

结果显示， 透明质酸酶不仅可以催化裂解透明质酸， 也能作用于 硫酸软骨素， 但是不能降解海藻酸钠、 肝素钠、 壳聚糖、 几丁质和羟 曱基纤维素钠。 实验例 6 : 化学降解法和酶切法制得的寡聚透明质酸盐的 细胞毒 性比较研究

试验采用 L929小鼠成纤维细胞（购买自中国科学院典型� �养物保 藏委员会细胞库）作为观察细胞， RPMI-1640培养基添加 10 %胎牛血 清作为完全培养基， 阴性对照为不添加任何供试样品的完全培养基 ， 阳 性对照为 5g/L苯酚溶液（溶于完全培养基） ， 空白对照为无细胞完全 培养基， 供试品为完全培养基加寡聚透明质酸钠样品。 培养 72h后， 按 下式计算相对增殖率 RGR、 。

式中： RGR——相对增殖率， ％;

A——供试品组（阴性、 阳性组）吸光度， 扣除空白；

Ao——阴性对照组吸光度， 扣除空白。

细胞毒性根据 ^^按表 5分级标准确定级别。 阳性对照组至少为 3级反应， 供试品细胞毒性反应程度不大于 2级时， 认为其细胞毒性 可接受。

表 5 : 细胞毒性反应分级（根据美国药典） 表 6: 寡聚透明质酸钠的细胞毒性实验结果

样品浓度 RGR 细胞毒性 样品 OD ₅₇₀ ( 士 SD)

( % , w/v) ( % ) 级别

0. 25 0. 762 ± 0. 062 8卜4. 36 1

0. 5 0. 681 ± 0. 092 1— 2

1. 0 0. 629 士 0. 057 68. 14 2

比较例 1

2. 0 0. 452 ± 0. 052 3

3. 0 0. 357 ± 0. 023 3

4. 0 0. 193 ± 0. 024 15. 21 4

0. 25 0. 985 ± 0. 063 110. 94 0

0. 5 1. 147 ± 0. 059 130. 43 0

1. 0 1. 075 ± 0. 041 121. 74 0

实施例 13

2. 0 0. 929 ± 0. 095 104. 21 0

3. 0 0. 646 ± 0. 038 70. 20 2

4. 0 0. 471 ± 0. 039 3

0. 25 1. 012 ± 0. 057 113. 58 0

0. 5 1. 107 ± 0. 044 124. 24 0

实施例 14 1. 0 0. 998 ± 0. 045 112. 01 0

2. 0 0. 935 ± 0. 026 104. 94 0

3. 0 0. 742 ± 0. 030 83. 28 1 4. 0 0. 520 ± 0. 030 58. 36 2

0. 25 0. 898 ± 0. 060 100. 79 0

0. 5 0. 997 ± 0. 045 111. 90 0

1. 0 0. 925 ± 0. 038 103. 82 0

实施例 15

2. 0 0. 832 ± 0. 041 93. 38 1

3. 0 0. 605 ± 0. 058 67. 90 2

4. 0 0. 450 ± 0. 049 50. 51 2

0. 25 1. 015 ± 0. 029 113. 92 0

0. 5 1. 090 ± 0. 035 0

1. 0 0. 985 ± 0. 038 110. 55 0

实施例 16

2. 0 0. 886 ± 0. 055 99. 44 1

3. 0 0. 721 ± 0. 032 80. 92 1

4. 0 0. 489 ± 0. 033 54. 88 2

0. 25 0. 932 ± 0. 054 104. 60 0

0. 5 1. 005 ± 0. 067 112. 79 0

1. 0 0. 974 ± 0. 051 109. 32 0

实施例 17

2. 0 0. 889 ± 0. 055 99. 78 1

3. 0 0. 719 ± 0. 042 80. 70 1

4. 0 0. 530 ± 0. 039 59. 48 2

0. 25 1. 033 ± 0. 055 115. 94 0

0. 5 1. 213 ± 0. 048 136. 14 0

1. 0 1. 098 ± 0. 029 123. 23 0

实施例 18

2. 0 0. 980 ± 0. 028 109. 99 0

3. 0 0. 726 ± 0. 030 81. 48 1

4. 0 0. 501 ± 0. 037 56. 23 2

阴性对照 0. 891 ± 0. 030 100. 00 0

阳性对照 0. 071 ± 0. 010 0. 43 4

结果表明， 化学降解法制备的寡聚透明质酸钠浓度不大于 1. 0 % 时，是无细胞毒性的；酶切法制备的寡聚透明 质酸钠浓度不大于 3. 0 % 时， 是无细胞毒性的。 与化学法降解的寡聚透明质酸钠相比， 同样浓 度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠对促进细胞 增殖有显著性影响 （ p

< 0. 05 ) 。 实验例 7: 酶切法制得的透明质酸盐的透皮吸收、 抗氧化活性以 及还原能力研究

1. 酶切法制备的寡聚透明质酸盐的透皮吸收研究

将无毛小鼠的皮肤材料固定于透皮吸收仪的扩 散池， 向扩散池的 供给体一侧加入 0. 5 %的寡聚透明质酸盐（分别为实施例 13-18制备） 溶液， 每三小时取样一次， 检测接受液中的寡聚透明质酸盐含量。 结 果如 Fig. 5 ( A )所示。 从图中可以看出， 寡聚透明质酸盐可以进入皮 肤内部被吸收。

2. 寡聚透明质酸盐和低分子透明质酸盐的抗氧化 活性研究 分别对酶切法和化学降解法制备的寡聚透明质 酸盐和低分子透 明质酸盐清除 DPPH自由基能力和还原能力进行了初步研究。

所用试剂和细胞株：

不同分子量的透明质酸盐：

酶切寡聚透明质酸盐： 实施例 13 - 18制备；

化学法制备的寡聚透明质酸盐： 按照比较例 1 - 2制备；

酶切低分子透明质酸盐： 实施例 19 - 26制备；

化学法制备的低分子透明质酸盐： 比较例 3 - 7制备；

高分子透明质酸钠 （分子量 161万， HA-1610k ) ： 华熙福瑞达生 物医药有限公司生产。

1 ) 自由基清除能力研究

清除 DPPH自由基能力的测定原理是：二苯基苦味肼� �由基（DPPH ) 是一种稳定的以氮为中心的自由基， DPPH的曱醇或乙醇溶液呈紫色， 在 510 - 530nm波长处有最大吸收， 其浓度与吸光度呈线性关系。 在 有自由基清除剂存在时， 自由基清除剂提供 1个电子与 DPPH的孤对 电子配对使其褪色， 褪色程度与接收的电子呈定量关系， 表现为溶液 颜色变浅， 吸光度减小 (Al i s i, C. S.等. Free radica l scaveng ing and in-vitro antioxidant effects of ethanol extract of the medicinal herb Chromolaena odorata Linn. British Journal of Pharmaceutical Research , 2011, 1 (4)， 141-155.)。 自由基清除 剂的能力越强，吸光度越小。分别精密量取 0. lmMDPPH( 2-曱基 -2， 3- 二氢 -5， 6-二苯基吡嗪） 乙醇溶液 5. OmL和不同浓度寡聚透明质酸盐 或低分子透明质酸盐样品溶液 5. OmL置具塞试管中， 混匀。 以等体积 的水与 95%乙醇混合溶液为空白对照。 室温放置 30分钟， 于 523nm 处分别测定溶液吸光度值。

、 _K 八 , _0/ Λ _ι HA与 DPPH反应后的吸光度值

l示牟 ^{/0) 单独 )^H的吸光度值

寡聚透明质酸盐的实验结果如 Fig.5 (B) , 从图中可以看出， 与 化学降解法制备的寡聚透明质酸钠（比较例 1或比较例 2制备）相比， 同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠（实 施例 13-18制备）具有 更强的 DPPH自由基清除能力， p< 0.05。

低分子透明质酸盐的实验结果如 Fig.5 (C) 。

从图中可以看出， 不论是化学降解法制备的低分子透明质酸盐还 是酶切法制备的低分子透明质酸盐， 随着分子量的降低， 自由基清除 能力提高。 但是， 分子量相近的低分子透明质酸盐， 酶切法制备的低 分子透明质酸盐的自由基清除能力大于化学降 解法制备的低分子透 明质酸盐。 分子量大于 100万的透明质酸盐几乎无自由基清除能力。

2 )还原能力测定

还原能力测定原理： 铁氰化钾在 pH6.6的弱酸性环境下， 被还原 性物质还原生成黄血盐 K ₄ Fe(CN) ₆ ， 其再与 FeCl ₃ 提供的三价铁离子作 用生成普鲁士蓝 （ Fe ₄ [K ₄ Fe (CN) ₆ ] ₃ ) ， 其在 700nm处有特定吸收， 以 测定普鲁士蓝的生成量为指标， 吸光度值越大， 其还原能力越强。 以 透明质酸盐水溶液为原料， 测定其在此体系中生成普鲁士蓝的量， 以 此来判定还原能力大小 ( Oyaizu, M. Antioxidant activity of browing products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44， 307-315 ) 。 分别精密量取不同浓度寡聚透明质酸盐 （实施例 13- 18 制备） 和低分子透明质酸盐 （实施例 19- 26制备） 的溶液 2.5mL和磷酸盐 溶液 2.5mL置具塞试管中， 加入 2.5mL 1.0%铁氰化钟溶液， 混匀， 50°C水浴 20分钟。 水浴后迅速冷却， 加入 2.5mL 10%三氯乙酸溶液， 3000rpm， 离心 10分钟。 取上清液 8mL加 5mL水与 lmL 0.1%三氯化 铁溶液， 以等体积的水代替三氯化铁溶液为空白对照。 室温放置 10 分钟， 于 70 Onm处测定溶液吸光度值。

寡聚透明质酸盐的还原能力结果如 Fig.5(D)，从图中可以看出， 与化学降解法制备的寡聚透明质酸盐（比较例 1或比较例 2制备）相 比， 同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸盐具有 更强的还原能力， p < 0.05。

低分子透明质酸盐的还原能力结果如 Fig.5 (E) , 从图中可以看 出， 不论是化学降解法制备的低分子透明质酸盐还 是酶切法制备的低 分子透明质酸盐， 随着分子量的降低， 还原能力提高。 但是， 分子量 相近的低分子透明质酸盐， 酶切法制备的低分子透明质酸盐的还原能 力大于化学降解法制备的低分子透明质酸盐。 分子量大于 100万的透 明质酸盐几乎无还原能力。

从上面的实验结果可以看出， 酶切法制备的寡聚透明质酸盐（例 如寡聚透明质酸钠）和低分子透明质酸盐 （例如低分子透明质酸钠） 比化学法降解得到的寡聚透明质酸盐（例如寡 聚透明质酸钠）和低分 子透明质酸盐 （例如低分子透明质酸钠）具有更强的 DPPH 自由基清 除能力和还原能力， 因此可以有效清除人体内的自由基， 减少黑色素 的形成， 故可用在化妆品中， 有防晒、 晒后修复、 美白、 抗衰老的功 效； 还可用在保健食品及食品中，可清除体内自由 基，有抗衰老作用； 也可用在药品中， 抵抗自由基对人体的侵害。 实验例 8: 酶切法制备的透明质酸盐在保健食品中的功效 研究

1.酶切寡聚透明质酸盐在保健食品中的功效� ��究

以一种以寡聚透明质酸盐为主要功效成分的保 健型口服液为例， 寡聚透明质酸盐添加量为 0. 05 - 2 %。 口服液配方： 添加 0. 5 %寡聚 透明质酸盐 （实施例 13 - 18中任一实施例制备） ， 再添加 25 %食用 糖或蜂蜜， 用纯水溶解。 溶解完全后采用超滤设备除菌， 灌入 10mL 口服液瓶（经高温或紫外线臭氧消毒后） 中， 扎盖密封， 以上操作均 在净化车间。 然后经产品质量检验后即得寡聚透明质酸盐口 服液。 受 试者年龄为 30 - 65岁，分为 6组，每组 30人，每人每天服用 10 - 20mL 寡聚透明质酸盐口服液， 连续服用一个月， 使用效果如表 7。 另有对 照组 30人， 每天服用只含有食用糖或蜂蜜的溶液。

表 7: 寡聚透明质酸盐口服液服用效果

样品 评价项目 明显变化 稍有变化 无变化

1.皮肤光滑， 水润有弹性 24 5 1

买

2.面色红润， 皱纹减少， 显

施 17 8 5

得年青

例

3.抵抗力增强， 不易生病 23 4 3

13

4.身轻体健， 不易疲劳 12 13 5

实 1.皮肤光滑， 水润有弹性 25 4 1

施 2.面色红润， 皱纹减少， 显

21 6 3 例 得年青

14 3.抵抗力增强， 不易生病 22 5 3

4.身轻体健， 不易疲劳 14 11 5

实 1.皮肤光滑， 水润有弹性 22 5 3

施 2.面色红润， 皱纹减少， 显

19 7 4

例 得年青

15 3.抵抗力增强， 不易生病 21 5 4

4.身轻体健， 不易疲劳 13 12 5

实 1.皮肤光滑， 水润有弹性 23 5 2

施 2.面色红润， 皱纹减少， 显

17 9 4

例 得年青

16 3.抵抗力增强， 不易生病 22 5 3 4.身轻体健， 不易疲劳 14 11 5 实 1.皮肤光滑， 水润有弹性 24 4 2 施 2.面色红润， 皱纹减少， 显

18 8 4 例 得年青

17 3.抵抗力增强， 不易生病 23 5 2

4.身轻体健， 不易疲劳 13 13 4 实 1.皮肤光滑， 水润有弹性 21 7 2 施 2.面色红润， 皱纹减少， 显

19 6 5 例 得年青

18 3.抵抗力增强， 不易生病 20 7 3

4.身轻体健， 不易疲劳 12 12 6

1.皮肤光滑， 水润有弹性 1 7 22 对 2.面色红润， 皱纹减少， 显

0 7 23

'昭"、 得年青

组 3.抵抗力增强， 不易生病 0 3 27

4.身轻体健， 不易疲劳 1 6 23

从表 7可以看出， 寡聚透明质酸钠作为保健品可直接食用， 极易 吸收， 具有增强免疫力， 延緩衰老， 恢复皮肤光泽弹性等多种功能。 本发明的寡聚透明质酸盐分子量小， 能够被人体肠道吸收， 增加机体 内组织中的透明质酸含量， 补充皮肤随年龄的增高所致的透明质酸減 少， 并且口服吸收的小分子透明质酸在体内可生成 高分子透明质酸， 使皮肤细嫩光滑， 关节灵活， 防止皱紋产生， 可用于食品领域。

2.酶切法制备的低分子透明质酸盐在保健食品� ��的功效研究 以一种主要功效成分为低分子透明质酸盐的保 健型口服液为例， 其中低分子透明质酸盐添加量为 0. 05% - 2%。 口服液配方： 1. 0%低分 子透明质酸盐（可以是实施例 19 - 26中任一实施例制备） ， 25%食用 糖或蜂蜜。 配制方法： 在洁净车间内配制， 室温下取纯水搅拌， 按照 比例加入低分子透明质酸盐， 再加入食用糖或蜂蜜搅拌至完全溶解， 补纯水至 100%。 溶解完全后釆用湿热灭菌， 灌入 10mL口服液瓶（经 高温或紫外线臭氧消毒后） 中， 扎盖密封， 以上操作均在洁净车间。 然后经产品质量检验后即得低分子透明质酸盐 口服液。 受试者年龄为

22 - 55岁， 分为 8组， 每组 32人， 每人每天服用 20mL低分子透明质 酸盐口服液， 连续服用一个月。 另有对照组 30人， 每天服用只含有 食用糖或蜂蜜的溶液。

服用前后， 由专人使用皮肤水分测定仪对受试者皮肤水分 含量和 水分流失量进行测定， 前后令测定时测定部位和室内温度湿度保持一 致。 人体皮肤水分测试结果如表 8所示。

表 8: 皮肤水分含量测定结果

样品 水分流失量（％ ) 实施例 服用前 28.86 ±1.55 9.23± 0.85

19 服用后 39.77 ± 1.94 6.51 + 0.64 实施例 服用前 27.54 ±1.51 9.15 ±0.80

20 服用后 36.72 ±1.75 6.92 ±0.55 实施例 服用前 25.69 ±1.68 9.86 ±0.81

21 服用后 33.78 ±1.54 6.67 ±0.51 实施例 服用前 28.27 ±1.55 10.06 ±0.78

22 服用后 37.82 ±1.75 7.39 ±0.58 实施例 服用前 25.26 ±1.55 9.93± 0.75

23 服用后 35.30 ±1.94 7.58 ±0.52 实施例 服用前 22.47 ±1.58 10.43± 0.87

24 服用后 32.56 ±1.83 7.01士 0.66 实施例 服用前 24.78 ±1.48 10.03± 0.82

25 服用后 35.43 ±1.94 7.35 ±0.44 实施例 服用前 22.16 ±1.44 9.83± 0.79

26 服用后 33.72 ±1.85 6.71士 0.67

服用前 29.11±1.78 9.45 ±0.75

对照组

服用后 28.65 ±1.66 8.89 ±0.81 从表 8可知，受试组连续服用低分子透明质酸盐口� �液 1个月后， 皮肤水分含量比服用前明显提高， 水分流失量情况也明显改善。 观察 可知， 受试组人员的皮肤光泽度、 紧致性、 弹性均较对照组要好。 因 此， 口服低分子透明质酸盐易于吸收， 保水补水效果好， 而且能够活 化皮肤细胞， 具有抗衰老的功效。

因此， 口服寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐后， 均可使受试 者皮肤光泽度、 弹性等得到改善， 可用于保健食品及普通食品中。 实验例 9 : 酶切法制备的寡聚透明质酸盐促血管生成作用 研究 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC , 山东省医学科学院提供）培养实 验和鸡胚绒毛尿嚢 （CAM )模型实验（种蛋购自山东省农业科学院家 禽研究所）来研究酶切法制备的寡聚透明质酸 盐 （实施例 1 3 - 18 中 任一实施例制备）是否能够促进血管生成。 而 VEC增殖效果和 CAM血 管生成结果见表 9。 实验步骤可以参考， 例如王彦厚， 王凤山， 郭学 平.低相对分子量质量透明质酸的制备及其促� �管生成作用.中国生 化药物杂志， 2007, 28 (2) : 1 07-1 09。

表 9 : 寡聚透明质酸钠促血管生成结果 分子量 浓度 鸡胚数 CAM血管数 HUVEC增殖 组别

( kDa ) ( μ g/mL ) (枚） (条） (OD570nm) 空白对照 /

― ― 10 10. 33 士 3· 67 0. 402 士 0· 012 生理盐水

10 10 13. 75 ± 4· 83 0. 412 士 0· 011 实施例 1 3 8. 6

40 10 22. 79 ± 4. 52 0. 435 ± 0· 006

10 10 18. 71 ± 4. 67 0. 410士 0· 010 实施例 14 3. 2

40 10 28. 31 ± 4· 56 0. 455 + 0. 007

10 10 17. 32 士 5· 64 0. 408 士 0· 013 实施例 15 6. 2

40 10 25. 89 士 3· 51 0. 447 + 0. 009 10 10 17. 23 士 3· 42 0. 413 士 0· 014 实施例 16 5. 6k

40 10 26. 58 ± 4. 68 0. 450士 0· 004

10 10 15. 99 士 5· 04 0. 402 士 0· Oi l 实施例 17 7. 6k

40 10 23. 24 士 3· 65 0. 438 + 0. 005

10 10 12. 89 ± 4. 61 0. 409 士 0· 010 实施例 18 9. Ik

40 10 22. 48 + 4. 74 0. 442 + 0. 007 阳性对照

― 40IU/ml 10 25. 74 士 3· 67 0. 475 士 0· 014 ( bFGF* )

由实验结果可知， 寡聚透明质酸钠具有明显的促血管生成活性， 在体内能促进 CAM的血管生成， 在体外能促进 HUVEC细胞增殖， 可用 于创伤愈合等医药领域。 实验例 10: 透明质酸盐的晒后修复及防晒作用研究

日光中的紫外线（主要为 UVA和 UVB)是导致皮肤日晒伤、 光老化 及皮肤癌的重要因素。 皮肤主体的三大细胞： 角质形成细胞、 成纤维 细胞及黑素细胞均对紫外线敏感。 UVA损伤主要是引起皮肤成纤维细 胞 DNA的氧化性损伤， 可导致 DNA突变及皮肤癌的发生。 本实验以一 定剂量的 UVA照射小鼠成纤维细胞 L929 (购买自中国科学院典型培养 物保藏委员会细胞库） ， 然后以透明质酸盐处理细胞， 研究透明质酸 盐的降解方法及不同分子量透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照后的影 响；以透明质酸盐作用于小鼠成纤维细胞株 L929 , 然后以一定剂量的 UVA 照射细胞， 研究透明质酸盐的降解方法及不同分子量透明 质酸盐 对 L929细胞 UVA辐照的防护作用。

所用试剂和细胞株：

纤维细胞株 L929 :购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细� � 库；

不同分子量的透明质酸盐：

酶切寡聚透明质酸盐： 实施例 1 3 - 18制备； 化学法制备的寡聚透明质酸盐： 按照比较例 1-2制备； 酶切低分子透明质酸盐： 实施例 19-26制备；

化学法制备的低分子透明质酸盐： 比较例 3-7制备；

高分子透明质酸钠 （分子量 161万， HA-1610k) ： 华熙福瑞达生 物医药有限公司生产。

1.透明质酸盐的紫外修复作用研究

探讨不同制备方法以及不同分子量的透明质酸 盐对 L929 小鼠成 纤维细胞经 UVA照射后的修复作用。

取处于对数生长期的 L929 细胞， 胰酶消化后， 调细胞密度 2 χ lOVmL, 接种于 96孔细胞培养板， 每孔 100 细胞悬液， 置二氧化碳 培养箱 37°C、 5% C0 ₂ 常规培养过夜。 96孔板中弃去培养液， 每孔加入 100 μ L PBS。除阴性对照组不进行照射外，其余试验组 采用 7.2J/cm ² UVA 照射 L929细胞。 照射后弃去 PBS, 按下面操作处理细胞：

未照射组（阴性对照组） ： 加入 100 μ L完全培养基；

照射组（阳性对照组） ： 加入 100 完全培养基；

照射 +透明质酸盐：加入含 0.0625%透明质酸盐的 100 完全培养 基；

继续培养 24h后， 每孔加入 20 L MTT, 放入细胞培养箱中继续孵 育 4h。 弃去培养液，每孔加入 150 LDMSO，避光震荡 10min， 于 570體 波长处用酶标仪测定光吸收值。 按照以下公式计算细胞相对增殖率 (RGR) ：

式中 表示实验组的吸收值， 4。表示阴性对照组的吸收值。

结果如 Fig.6 (A) 、 Fig.6 (B)所示， 不同方法制备的寡聚透明 质酸盐及不同分子量的透明质酸盐都具有 UVA 辐照后修复细胞损伤的 作用，但是酶切法制备的寡聚透明质酸盐的晒 后修复作用最好，化学法 制备的寡聚透明质酸盐的效果次之， 并且随着透明质酸盐分子量的降 低， 其修复效果越好。酶切法制备的寡聚透明质酸 盐及低分子量透明质 酸盐的晒后修复效果要好于高分子量透明质酸 盐。

2.透明质酸盐的防紫外作用研究

探讨不同制备方法制备的寡聚透明质酸盐及不 同分子量的透明质 酸盐对 L929小鼠成纤维细胞对 UVA照射的防护作用。

本实验以不同分子量透明质酸盐作用于小鼠成 纤维细胞株 L929 , 然后以一定剂量的 UVA照射细胞，研究不同分子量透明质酸盐和不 同制 备方法制备的寡聚透明质酸盐对 L929细胞 UVA辐照的防护作用。

取处于对数生长期的细胞， 胰酶消化后， 调细胞密度 2 x l 0 ⁴ /mL， 接种于 96孔细胞培养板， 每孔 100 细胞悬液， 置二氧化碳培养箱 37 °C、 5% C0 ₂ 常规培养过夜。 过夜后弃去培养液， 按下面分组处理细胞， 放入细胞培养箱中孵育 12h。

未照射组（阴性对照组） ： 加入 100 μ L完全培养基；

照射组（阳性对照组） ： 加入 100 完全培养基；

照射 +透明质酸盐：加入含 0. 0625%透明质酸盐的 100 完全培养 基；

96孔板中弃去培养液， 每孔加入 l OO L PBS。 除无照射组外， 其 余试验组釆用 7. 2J/cm ² UVA照射 L929细胞。 照射后弃去 PBS, 每孔加 入 20 L MTT， 放入细胞培养箱中继续孵育 4h。 弃去培养液， 每孔加入 150 DMS0, 避光震荡 10min， 于 570nm波长处用酶标仪测定光吸收 值。 按照以下公式计算细胞相对增殖率 （RGR ) ： 腦 械=—-^ it» 式中 表示实验组的吸收值， 4。表示阴性对照组的吸收值。

结果如 Fig. 6 ( C ) 、 Fig. 6 ( D )所示， 不同制备方法制备的寡聚 透质酸盐及不同分子量的透明质酸盐都具有防 UVA辐照的作用。酶切法 制备的寡聚透明质酸盐对 UVA辐照的预防效果最好，其次是酶切低分子 量透明质酸盐，化学法制备的寡聚透明质酸盐 及高分子量透明质酸盐的 预防效果最差。

综上所述，酶切法制备的寡聚透明质酸盐及低 分子量透明质酸盐都 具有紫外修复及防紫外作用，其中酶切法制备 的寡聚透明质酸盐的紫外 修复及防紫外效果最好； 低分子量透明质酸盐的防紫外效果较好， 紫外 修复效果不如化学法制备的寡聚透明质酸盐， 但均高于高分子量透明质 酸盐。因此酶切法制备的寡聚透明质酸盐及低 分子量透明质酸盐可用于 防晒及晒后修复的化妆品中。

综上可见， 根据本发明所述的制备方法得到的寡聚透明质 酸盐及 低分子透明质酸盐，外用时可渗入皮肤表皮层 ，供给皮肤营养和水分， 防止皮肤老化， 还能防止紫外线的伤害， 修复晒伤的皮肤细胞， 可用 于化妆品中； 口服时易于吸收， 不仅可以清除自由基， 活化皮肤细胞， 保持表皮湿润， 同时具有良好的增强免疫功能和抗衰老功能， 可用于 食品和保健品中； 另外， 还具有促血管生成、 细胞免疫活化和促进骨 生成的作用， 对治疗细菌性角膜溃疡具也有良好的疗效， 可用于医药 领域。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的 描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。