本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦 禾谷孢囊线虫病中的 应用。

背景技术

禾谷孢囊线虫又名燕麦孢囊线虫 He terodera avenae Wol len-weber 1924， Cereal Cyst Nematodes , 简称 CCN) ， 为世界性禾谷类作物的病原 线虫， 现已对我国 1 1 个省市 （自治区、 直辖市） 的小麦造成危害， 而且 逐年加重， 成为小麦生产上的主要病害。 目前对小麦禾谷孢囊线虫病的防 治主要是化学防治和抗病品种的利用。 具有较好防效的化学杀线剂 如铁 灭克（Temik)、 呋喃丹 （Furadan) 等， 属于高毒农药， 存在毒性大、 成本 高、 污染环境、 危害人类徤康等问题， 在生产上不能得到推广应用。 选育 抗禾谷孢囊线虫新品种是防治根线虫病最为有 效的方法， 但是已鉴定的抗 禾谷孢囊线虫基因普遍存在于小麦近源属 （如大麦属、 燕麦属、 山羊草属 等） 中， 来源于六倍体小麦的抗禾谷孢囊线虫基因十分 有限， 使得抗病育 种进展缓慢。 禾谷孢囊线虫种内存在严重致病型分化现象， 抗性基因对不 同致病型的禾谷孢囊线虫具有不同抗性，： 导致品种抗性分布不稳定， 很容 易造成抗性品种抗性的丢失。 目前我国种植的小麦品种中还没有发现对禾 谷孢囊线虫完全免疫的品种。

源于对环境友好、 绿色无公害、 有利于人类健康， 生物防治在植物病 害防治研究中一直处于热点。 虽然国内外在植物寄生线虫生防细菌的种 类、 筛选、 防治效果和土壤添加剂等方面也有了一些研究 ， 但生产上还没 有应用效果稳定的生防制剂。

发明公开

本发明的目的是提供一株短小芽孢杆菌及其在 防治小麦禾谷孢囊线 虫病中的应用。

本发明提供的菌株属于短小芽孢杆菌（ Bacillus pumilm：)，命名为 B202， 已于 2012年 03月 02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普� ��微生物中 心 （简称 C:GMCC， 地址为： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏号为 CGMCC No.5838 ₀ 短小芽孢杆菌 B Ulus p腿 U ) B202 CGMCG No.5838 简称短小芽孢杆菌 B2 _: 02。

本发明还保护短小芽孢杆菌 B202.在制备小麦禾谷孢囊线虫生防制剂 中的应用。

本发明还保护一种小麦禾谷孢囊线虫生防制剂 ， 其活性成分为如下

(a) 、 (b) 、 (c) 和 (d) 中的至少一种: (a) 短小芽孢杆菌 B202的 发酵培养物 （包括发酵上清和菌体) _; (b) 短小芽孢杆菌 B202; (c) 短 小芽孢杆菌 Β2Ό2 的芽孢； （d) 短小芽孢杆菌 B2.02的发酵上清。 所述短 小芽孢杆菌 B202 的发酵培养物具体按照如下方法制备： 将短小芽孢杆菌 B202接种到 NA改良培养基中， 振荡培养得到 0 。。^4.0的发酵培养物。 所述短小芽孢杆菌 B202 的发酵上清具体按照如下方法制备： 将所述发酵 培养物 4000rpm离心 30min， 收集上清液， 即为发酵上清。

本发明还保护一种防治植物发生小麦禾谷孢囊 线虫病的方法， 包括在 播种前将待测植物种子进行如下处理的步骤： 用短小芽孢杆菌 B202 的芽 孢悬浮液对待测植物的种子进行浸种处理。 所述待测植物具体可为小麦 (如小麦品种 "温麦 19" ) 。 所述短小芽孢杆菌 B202的芽孢悬浮液的具 体制备方法如下： 将短小芽抱杆菌 B202 的芽孢悬浮于无菌水， 得到芽孢 浓度为 8X10 ⁸ 个 /ml的芽孢悬浮液。 所述浸种的时间具体可为 1小时。

本发明还保护另一种防治植物发生小麦禾谷孢 囊线虫病的方法， 包括 将待测种子进行如下处理的歩骤: C1) 将待测植物种子用短小芽孢杆菌 B202 的菌体浸种； (2) 将完成步骤 (1) 的种子催芽， 得到幼苗 _; (3) 将步骤 （2) 得到的幼苗用短小芽抱杆菌 B202的发酵上清灌根。 所述待测 植物具体可为小麦 （如小麦品种 "温麦 1.9"：) 。 所述发酵上清具体按照如 下方法制备： （1) 将短小芽孢杆菌 Β202接种到 ΝΑ改良培养基中， 振荡 培养得到 OD _S 。。™=4.0的发酵培养物； （2) 将步骤 （1) 得到的发酵培养物 4000rpra离心 30min.， 收集上清液， 即为发酵上清。

NA改良培养基 （pH7 ） 由溶剂和溶质组成; 所述溶剂为水; 所述溶 质及其浓度如下： 3g/L牛肉膏、 5g/L蛋白胨和 3g/L葡萄糖。

附图说明

图 1为 B202菌株的形态（10倍放大的照片）。

图 2为 B202菌株的形态 (40倍放大的照片)。

图 3为 B202菌株的形态（100倍放大的照片）。 实施发明的最佳方式

以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施 例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试 验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。

小麦禾谷孢囊线虫 3 £?)： Yuan, H. X. , Sun, J. W. ,

Yang, W. X. , Xing, X， P.， Wang, Z. Y. , Ri ley, L. T.， and Li , H. L. New pathotypes of Heterodera a venae (cereal cyst nematode) from winter wheat in Zhengzhou, Henan, China [J] . Australas ian Plant Patho logy 2010, 39 : 107-1 11。

小麦品种 "温麦 19 " (小麦禾谷孢囊线虫病感病品种） ： 由河南省农 业科学院植保所提供； 袁虹霞，年高磊，邢小萍，付博，张鹏，李洪 连.鲁豫皖 交界地区四个小麦禾谷孢囊线虫群体致病型鉴 定， 植物保护学 报' 201 1, 38 (5) : 408-412。 实施例 1、 短小芽孢杆菌 B202菌株的获得和鉴定

一、 短小芽孢杆菌 B202菌株的获得

从中国中部平原小麦主产区河南省、 河北省和陕西省地区小麦禾谷孢 囊线虫发病严重的地块挖取重病小麦和健康小 麦， 保留根部土壤。 小心去 掉小麦植株根部土壤， 随机剪取新生主根和毛细根， 置于 50ml 含玻璃珠 的无菌水中， 充分摇动。 将根取出， 获得土壤悬液。 取出的根系先用无菌 水冲洗， 然后用 1%次氯酸钠消毒 8分钟， 再用无菌水漂洗 4次， 冲净残余 次氯酸钠， 将 2克根和 10ml无菌水并适当加少量石英砂于无菌研钵中� � 磨， 获得根系悬液。 将各个悬液摇匀， 取 lml加入装有 9ml无菌水的试管 中， 混合均匀后梯度稀释至 10— ⁶ 浓度， 将 10— ⁴ 、 10— ⁵ 、 10— ⁶ 浓度的稀释液在 80Ό的水浴中保持 30min以杀死大部分的非芽孢细菌， 取 100 μ 1涂布牛 肉膏平板， 每个稀释度涂平板 3个， 30°C保存培养。 培养 3天后， 挑取不 同的单菌落， 进行转管并在 4°C下保存备用。

共获得 293株芽孢杆菌， 其中根内生芽孢杆菌 74株， 根际土壤芽孢 杆菌 219株， 根际土壤的芽孢杆菌数量明显多于根内生芽孢 杆菌数量。 将 其中 1个纯培养的菌株命名为 B202菌株。

二、 B202菌株的形态特征和分子鉴定结果

B202菌株的形态见图 1 (10倍放大的照片）、 图 2 (40倍放大的照片） 和图 3 (100 倍放大的照片）。 B202 菌株的菌株形态为呈短杆状，菌体大小 0.54X2. Sum, 具内生芽孢。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上 37 培养 48小 时后， 菌落突起， 菌落呈圆形， 表面光滑， 边缘光滑细腻， 菌落不透明， 颜色为乳白色， 直径 L3 2. lmm。 革兰氏染色阳性。

提取 B202菌株的总 DNA， 对 16S rDNA进行扩增， 将扩增产物进行测 序（见序列表的序列 1)， 将测序结果在 NCBI的 GENBA魔比对， 结论如下： 菌株 B202.和 Bacillus pumilm相似度最高， 为 99%。 通过 Bio log GENIII 系统鉴定， S頂等于 0.674， 大于 0.5 _P

根据以上鉴定结果， 菌株 B202 属于短小芽孢杆菌 Ba.eiU-iis pumilm)

短小芽孢杆菌 .Bacillus pundlus) B202已于 2012年 03月 02日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心 （简称 CGMCC， 地址为： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏号为 CGMCC No.5838。 短小芽孢 杆菌 .Bacillus pumili ) B202 CGMCC No.5838简称短小芽孢杆菌 B202 实施例 2、 短小芽孢杆菌 B202的培养

1、 将短小芽孢杆菌 B202单菌落接种到 NA改良培养基 （溶剂为水， 含有 3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、3g/L葡萄糖; pH7.0)中， 30C 180rpm/min 振荡培养 48小时， 得到 0 „ _m =4.0的发酵体系悬液。

1、将步骤 1得到的发酵体系悬液 4000rpm离心 30min， 分别收集上清 液和菌体沉淀。

3、 将步骤 2得到的菌体沉淀悬浮于无菌水， 得到芽孢浓度为 8X10 ⁸ 个 /ml的芽孢悬浮液。 实施例 3、室内条件下短小芽孢杆菌 B202对小麦禾谷孢囊线虫活性影 响

将小麦禾谷孢囊线.虫二龄幼虫用无菌水悬浮� �

2、 分组处理如下：

实验组： 将 250μ 1歩骤 1得到的悬浮液 （含 100±5条小麦禾谷孢囊 线虫二龄幼虫）与 250 μ ]_实施例 得到的发酵体系悬液混合， 常温培养 24小时。

对照组： 将 250μ 1步骤 1得到的悬浮液 （含 100±5条小麦禾谷孢囊 线虫二龄幼虫） 与 250 μ 1无菌水混合， 常温培养 24小时。

3、 在歩骤 2. 的各个培养体系中各加入 lmol/L NaOH水溶液 （在碱性 刺激下存活的幼虫会动， 不动的幼虫计为死亡幼虫） ， 统计小麦禾谷孢囊 线虫二龄幼虫的死亡率。

死亡率 （％) ： 死亡线虫数 /供试线虫数 X 100%。

校正死亡率 （％) = (实验组的死亡率 -对照组的死亡率） 对照组 的死亡率） X 100%。

进行三次重复实验，每次重复实验设置 3个重复处理，结果取平均值。 实验组的死亡率为 100%， 对照组的^ E亡率为 0%， 校正死亡率为 100%。 结果表明， 短小芽孢杆菌 B202可以使小麦禾谷孢囊线虫幼虫死亡。 实施例 4、温室盆栽条件下短小芽孢杆菌 B202对小麦禾谷孢囊线虫病 的防治

1、 从北京地区延庆县玉米田中取表层士， 将 10体积份表层土、 3体 积份蛭石、 2体积份草炭和 1体积份腐熟鸡粪混合， 然后 180 C干热灭菌 3 小肘， 得到培养基质。

2、 将小麦品种 "温麦 19" 的种子用实施例 2得到的菌体沉淀浸种 1 小时， 然后进行催芽。

3、 取 l OcmX I Ocm的培养钵， 每个培养钵放入 45Og培养基质， 轻轻 压实， 然后放置完成步骤 2的种子， 每个培养钵 5粒种子， 然后在种子上 覆盖 2cnr的培养基质， 将培养钵放在塑料托盘中， 从盘中浇透水后放在 15 - 2(TC培养室中培养， 种子岀苗后， 用实施例 2得到的上清液灌根， 每 株 10mL

4、 步骤 3中的种子出苗 7天后， 用玻璃棒在培养钵中的小麦幼苗的 根部附近插入 3-6cm深的小洞， 灌注用无菌水制备的小麦禾谷抱囊线虫二 齡幼虫的悬浮液（200条幼虫 /株） ， 用培养基质封上小洞， 每隔 3天釆用 相同的步骤接种小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫一 次， 共接种 3次。

设置不用菌体沉淀浸种且不用上清液灌根的空 白对照。

设置不用菌体沉淀浸种， 而改用 1. 8%阿维菌素乳油的 1000倍稀释液 代替实施例 2的上清液进行灌根的阳性对照。

从第一次接种小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫开始 计天数， 60天后调査小 麦根部根结形成情况， 将植株连根挖出 （尽可能保持根系完整） ， 用自来 水洗干净， 放在盛有清水的塑料盘中进行病情调査， 计算防治效果。

病情分级标准如下： 0级： 根部无根结； 1级： 每株根部有 1-5个根 结； 2级： 每株根部有 6-10个根结； 3级： 大部分根上有根结， 单株 10 个根结以上； 4级： 根结相连成须根团， 难以计数。

病情指数 （％) =∑ (级数 X同级株数） I (总株数 X 4) X 100%。

防治效果 （％) = (空白对照组病情指数 -实验组或阳性对照组病情指 数） /空白对照组病情指数 X 100%。

进行三次重复实验， 每次重复实验设置 30 株植株作为重复处理， 结 果取平均值。

实验组的病情指数为 37. 50%， 空白对照组的病情指数为 91. 67%， 阳 性对照组的病情指数为 50%。 实验组的防治效果为 59. 09%， 阳性对照组的 防治效果为 45. 45%。 实施例 5、 田间条件下短小芽孢杆菌 B202对小麦禾谷孢囊线虫病的防治

2010年试验： 地点为中国农业大学上庄试验站， 播种时间为 2010年 10月 22 日。 2011年实验： 地点为河南省许昌市河街乡黄庄村， 播种时间为 2011年 10月 21日。

一、 实验方法

1、 将短小芽孢杆菌 B202接种于 NA改良培养基， 30。C、 180rpm/min 振荡培养 48小时， 4000rpm离心 30min， 收集菌体， 悬浮于无菌水， 得到 芽孢浓度为 8 X 10 ⁸ 个 /ml的芽孢悬浮液。

2、 分组处理如下：

实验组： 将小麦品种 "温麦 19 "的种子用步骤 1得到的芽孢悬浮液浸 种 1小时；

空白对照组： 将小麦品种 "温麦 19 " 的种子用无菌水浸种 1小时； 阳性对照组： 将小麦品种 "温麦 19" 的种子用 1. 8%阿维菌素乳油的 1000倍稀释液浸种 1小时。

3、 将农田中， 随机划分 9个区域 （每个区域 60m ² ) ， 将完成步骤 2 的种子每组种子播种 3个区域， 各区域四周设置保护行。 小麦灌桨期调查小麦孢囊线虫发病情况。 每个小区随机三点取样调 査， 每点取 10 株， 用铁鍬连同植株根系土壤挖出， 带回室内调査小麦根 部调查孢囊数，进行分级，计算病情指数和防 洽效果。对病情指数使用 SPSS 进行方差分析和显著性检验。

分级标准： 0级: 根部无孢囊， 无病； 1级： 感染极轻微 （1-5个孢囊 /单株) ： 2级: 轻度发生 （6- 20个抱囊 /单株） _; 3级: 中度发生 ( 20 -40 个孢囊 /单株） ； 4级： 严重发生 （单株孢囊在 40个以上) 。

病情指数 （％) =∑ (级数 X同级株数) / (总株数 X 4) X 100%。

防治效果 （％) = (空白对照组病情指数-实验组或阳性对照组病� ��指 数） /空白对照组病情指数 X 100%。

结果见表 1和表 2。

结果表明， 短小芽孢杆菌 B202对小麦禾谷孢囊线虫在田间都具有显著 防治效果， 两年试验结果防效比较稳定。

工业应用

釆用芽孢杆菌进行生物防洽具有如下优势：适 应性广；作用机制多样， 不易产生抗药性； 发酵周期短， 生产成本低; 形成芽孢、 易储运; 环境友 好， 对人畜安全。 本发明提供了一株短小芽孢杆菌 B202， 通过室内杀线活 性、 温室盆栽和田间试验筛选证明其对小麦禾谷孢 囊线虫病具有稳定防治 效果， 为小麦禾谷孢囊线虫生防制剂的研发奠定了基 础。