La présente invention concerne un biosenseur bactérien de la dégradation du bois.

La bio-dégradation du bois est un phénomène primordial des écosystèmes forestiers car il permet le recyclage de la matière organique et le bon fonctionnement de la forêt. Cette dégradation est en très grande partie due à des microorganismes et est généralement initiée par des champignons lignolytiques. Toutefois, cette primodégradation permet rapidement l'installation de communautés bactériennes plus ou moins complexes qui tirent profit des composés lignocellulosiques devenus accessibles suite à cette attaque fongique. Au niveau économique, l'exploitation des capacités de dégradation de ces consortia microbiens représente actuellement un intérêt évident pour la chimie verte et les biotechnologies de l'environnement, avec notamment la dégradation des éléments lignocellulosiques récalcitrants de la biomasse. En revanche, la biodégradation du bois constitue un problème économique considérable quand elle concerne le bois utilisé ou conservé en tant que matériaux de construction, tel que le bois utilisé pour les charpentes, les cloisons ou les mobiliers. A cause de la biodégradation lors de son stockage, environ 13 à 30% des grumes deviennent ainsi impropres à la commercialisation après 6 mois de stockage. Le coût de cette biodégradation est donc considérable.

Actuellement, l'attaque par les champignons est constatée par des tests décrits dans la norme européenne EN113/A1 (Août/2004) intitulée «Produits de préservation du bois - Méthode d'essai pour déterminer l'efficacité protectrice vis-à-vis des champignons basidiomycétes lignivores Détermination du seuil d'efficacité ». Selon ces tests normatifs, l'attaque fongique est révélée par la différence de masse entre des échantillons de bois à analyser et un échantillon de bois non dégradé en tant que contrôle. Par exemple, pour déterminer l'efficacité d'une méthode ou d'un produit de protection du bois, des échantillons de bois sont traités par différentes concentrations d'agents protecteurs du bois et exposés à des champignons appartenant à des genres différents. Après 16 semaines d'exposition, ces échantillons sont lavés, séchés puis pesés. La différence de perte de masse entre un échantillon traité et un échantillon non-traité permet de conclure sur la qualité de la protection du matériau.

La durée du temps de ce test est très longue pour les industries qui ont besoin de savoir rapidement si le bois a subi une bio-dégradation ou si une mesure de protection a fonctionné.

Il existe par conséquent un besoin de développer des outils permettant de détecter rapidement l'attaque biologique du bois et d'évaluer rapidement l'efficacité d'un traitement de protection du bois.

La présente invention a pour objectif de développer un outil et une méthodologie permettant de diagnostiquer rapidement, spécifiquement et avec une haute sensibilité l'attaque fongique du bois.

L'invention concerne l'utilisation de certains microorganismes du sol, plus particulièrement les bactéries saprophytes du genre Streptomyces, qui sont incapables d'initier la dégradation du bois, mais qui en revanche sont prompts à reconnaître et à utiliser certains composés spécifiques libérés par tous les types de bois lors des premières étapes de l'attaque fongique, tels que les dérivés de cellulose, hémicelluloses, lignines, cello-oligosaccharides, cellobioses.

Les bactéries du genre Streptomyces peuvent coloniser le bois en décomposition et possèdent des enzymes leur permettant de dégrader et de métaboliser les sucres complexes libérés lors de l'attaque fongique. Les études in silico ont également révélé qu'une grande partie des gènes codant ces enzymes cellulolytiques étaient sous la dépendance d'un système de régulation désigné « CebR », constitué par une protéine CebR et une région de 10 à 20 nucléotides, nommée « CebR-box », située dans les régions promotrices de ces gènes.

La protéine CebR est une protéine très conservée au sein des bactéries du genre Streptomyces. Des protéines ayant des séquences d'acides aminés et une fonction très similaires existent aussi chez d'autres genres de bactéries, tels que Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999, J. Biol. Chem. , 274: 13127-13132), Actinosynnema mirum (Anderson et al ., 2012, PLoS ONE 7(6) :e39331), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), ou Streptosporangium roseum (Anderson et al. 2012). La protéine CebR est un régulateur majeur du catabolisme de cellulose/cellooligosaccharides chez Streptomyces. Elle peut réprimer la transcription de ses gènes ciblés, regroupés dans l'opéron ceb, en se fixant sur la région « CebR-box », située dans les régions promotrices de ces gènes.

La région « CebR-box » est également une région très conservée au sein des bactéries du genre Streptomyces. Des régions d'ADN ayant une séquence nucléique et une fonction similaire sont également présentes chez d'autre genre de bactéries, telles que Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999), Actinosynnema mirum (Anderson et al., 2012), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), ou Streptosporangium roseum (Anderson et al., 2012).

Les composés de la dégradation du bois, tels que les cello- oligosaccharides, notamment la cellobiose, peuvent également se lier à la protéine CebR et ainsi empêcher ce dernier de se fixer sur la région « CebR- box ». En conséquence, en se liant à la protéine CebR, ces composés peuvent lever la répression transcriptionnelle de cette protéine vis-à-vis des gènes sous le contrôle de la région « CebR-box » et aboutir à l'expression de ces enzymes cellulolytiques.

L'invention repose sur l'utilisation des bactéries du genre Streptomyces génétiquement modifiées, dans lesquelles est introduite une combinaison d'ADN de la région « CebR-box » avec un gène rapporteur. La protéine CebR à l'aide de la région « CebR-box » permet effectivement de contrôler également l'expression d'un gène exogène, tel qu'un gène rapporteur exogène.

L'invention porte sur des bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant stablement un vecteur d'expression comprenant :

(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de fixer la protéine CebR, et

(ii) un gène rapporteur,

ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque la protéine CebR est fixée sur ledit acide nucléique.

En l'absence de composés cello-oligosaccharides, l'expression d'un gène rapporteur dans ces bactéries est réprimée par la protéine CebR qui se fixe sur la région « CebR-box ». Au contact des composés cello-oligosaccharides, qui peuvent être les produits libérés lors d'une attaque fongique de la dégradation du bois, cette répression est levée et le gène rapporteur est exprimé pour donner un signal détectable.

On entend par vecteur d'expression, une molécule d'ADN à double-brins circulaire ou linéaire, comportant les éléments nécessaires pour la réplication de ladite molécule et l'expression des gènes portés par ce vecteur dans une bactérie du genre Streptomyces.

Ces éléments sont par exemple une origine de réplication, un promoteur, un site de fixation ribosomique, un codon d'initiation de la traduction, un codon-stop de la traduction, un terminateur de transcription. Ledit vecteur d'expression peut comporter en outre un enhancer, un marqueur de sélection, et au moins un site de restriction.

Chacun de ces éléments peut être choisi parmi ceux utilisés conventionnellement dans un vecteur d'expression pour les Streptomyces.

Le susdit vecteur d'expression peut être soit intégré, par exemple par recombinaison site-spécifique, dans le chromosome de bactérie, soit indépendant de ce dernier.

Lorsque ledit vecteur d'expression est intégré par recombinaison site- spécifique dans le génome de bactérie, ledit vecteur peut comporter deux sites de recombinaison, tels que les sites « att ».

On entend par vecteur « stablement » intégré dans une bactérie, un vecteur qui est répliqué au sein de ladite bactérie et peut transmettre une copie aux générations descendantes de ladite bactérie.

Ledit vecteur peut être introduit dans une bactérie du genre Streptomyces par les méthodes conventionnelles, telles que la transformation, par exemple par choc thermique, ou la conjugaison intergénérique.

On entend par « bactérie génétiquement modifiée », une bactérie dont le patrimoine génétique a été modifié par génie génétique par rapport à celui de la même bactérie présente dans la nature.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention porte sur des bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant stablement un vecteur d'expression comprenant :

(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de fixer la protéine CebR, (ii) un gène rapporteur, et

(iii) un promoteur constitutif.

On entend par « promoteur constitutif », un promoteur qui est actif dans toutes les circonstances chez les Streptomyces et n'est pas, lui-même soumis, à un système de régulation.

Ces promoteurs constitutifs peuvent être choisis parmi les promoteurs constitutifs utilisés conventionnellement chez les Streptomyces, tels que le promoteur permE*( Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics : John Innés Foundation) ou galP2 (Fornwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987; 84(8) : 2130-2134).

Dans un mode de réalisation plus particulier, le promoteur utilisé dans ce vecteur pour la mise en œuvre de l'invention est le promoteur permE*, qui est un promoteur fort chez les Streptomyces.

La séquence nucléique d'une région « CebR-box » de 10 à 20 nucléotides peut être déterminée par une étude in silico des génomes des bactéries, notamment ceux du genre Streptomyces, en comparaison avec une séquence SEQ ID NO : 1, qui est la séquence consensus de la région « CebR-box » de Streptomyces griseus. La recherche d'homologie de séquences peut être effectuée, par exemple à l'aide du logiciel PREDETECTOR (Hiard et al., Biochem Biophys Res Commun. , 2007, 357(4) : 861-4).

Le susdit acide nucléique « CebR-box » peut être placé en amont du promoteur ou entre le promoteur et le gène rapporteur.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides est représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, plus particulièrement 95%, d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

Plus particulièrement, ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides est un acide nucléique d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2- 10.

De préférence, ledit acide nucléique « CebR-Box » est un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 2.

Conformément à l'invention, le gène rapporteur dans un tel vecteur d'expression est un gène sélectionnable ou détectable par des méthodes biochimiques, biologiques ou physiques, notamment un gène codant ou permettant d'activer une molécule indicatrice. Ledit gène rapporteur peut être un gène codant une enzyme dégradant un substrat coloré ou aboutissant à la production d'un composé coloré, notamment xylE de Pseudomonas putida, redD de Streptomyces coelicolor, melC de Streptomyces glaucescens.

Ledit gène rapporteur peut être aussi un gène codant une protéine fluorescente ou chimioluminescente choisie dans le groupe comprenant GFP, eGFP, RFP, luxA, luxB, ou un gène de résistance à au moins un antibiotique. A titre d'exemple, un tel gène de résistance aux antibiotiques peut être le gène nptll qui confère aux bactéries une résistance à la kanamycine, néomycine ou le gène ampR qui confère aux bactéries une résistance à l'ampicilline.

Les séquences nucléiques de ces susdits gènes rapporteurs sont déjà décrites dans l'art antérieur et disponibles dans les bases des données spécifiques, telles que la base des données « Genbank » ou « EMBL ».

Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant un vecteur d'expression comprenant :

(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10, et

(ii) le gène rapporteur xylE.

Le gène xylE code la dioxygénase de catéchol, une enzyme qui convertit le catéchol, substrat incolore, en un produit de couleur jaune foncé (2- hydroxymuconic semialdehyde). Dans ce mode de réalisation de l'invention, l'expression du gène xylE dans la bactérie est sous le contrôle de la région « CebR-box » et des composés cello-oligosaccharides par l'intermédiaire de la protéine CebR. En l'absence de ces composés, l'expression du gène xylE est réprimée par la protéine CebR en se fixant sur la région « CebR-box ». Cette répression est levée par les composés cello-oligosaccharides, qui peuvent être libérés lors de la dégradation fongique du bois.

Un mode de réalisation plus particulier de l'invention concerne les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant un vecteur d'expression comprenant :

(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10,

(ii) le gène rapporteur xylE, et (iii) le promoteur pErmE*.

Dans un autre mode de réalisation particulier, les bactéries génétiquement modifiées de l'invention appartiennent à l'espèce Streptomyces ambofaciens ou Streptomyces coelicolor.

L'invention concerne plus particulièrement une souche de Streptomyces spp. génétiquement modifiée, ladite souche étant enregistrée sous le numéro CNCM 1-4930 le 17 décembre 2014 et comportant un vecteur d'expression obtenu à partir du vecteur pIB139 dans lequel sont insérés l'acide nucléique « CebR-box » de séquence SEQ ID NO : 2 et le gène rapporteur xylE de Pseudomonas putida.

La présente invention concerne également un vecteur d'expression destiné à être introduit stablement dans les bactéries du genre Streptomyces ou toute autre bactérie comportant des sites de recombinaison, permettant une insertion spécifique.

Ledit vecteur comprend :

(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de se fixer à la protéine CebR,

(ii) un gène rapporteur, et

(iii) un promoteur,

ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque ladite protéine CebR est fixée au dit acide nucléique.

Ledit vecteur comprend également tous les éléments nécessaires pour la réplication de ladite molécule et l'expression des gènes portés par ce vecteur dans une bactérie dans laquelle il doit être introduit.

Lorsque ce vecteur est un vecteur à intégrer dans un génome bactérien, il comprend également les sites de recombinaison spécifique, tels que les sites « att ».

Dans un mode de réalisation particulier, ledit vecteur comprend :

(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences

SEQ ID NO : 2-10,

(ii) le gène rapporteur xylE, et

(iii) un promoteur.

Dans un mode réalisation plus particulier, ledit vecteur comprend : (i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10,

(ii) le gène rapporteur xylE, et

(iii) le promoteur pErmE*.

Un autre objectif de l'invention est de mettre à disposition un biosenseur bactérien de la bio-dégradation du bois.

Contrairement à la méthode classique décrite dans la norme européenne EN113/A1 (Août/2004), qui nécessite au moins 16 semaines d'expérience pour indiquer la présence ou pas de la bio-dégradation du bois, un biosenseur de l'invention est capable d'indiquer la présence ou pas de ces résidus en 24 heures.

Un biosenseur selon la présente invention permet d'indiquer la biodégradation du bois, notamment due à une attaque d'au moins un champignon lignivore, par la détection de la présence des composés de dégradation, notamment les cello-oligosaccarides, libérés par cette attaque fongique.

On entend par « champignon lignivore » un champignon qui se nourrit de matière organique carbonée et azotée en provenance du bois et cause par conséquent la dégradation du bois.

Selon leurs modes d'attaque, les champignons lignivores peuvent être regroupés en trois groupes principaux : les champignons à pourritures brunes, les champignons à pourritures blanches, et les champignons à pourritures molles.

A titre d'exemple, nous pouvons citer Serpula poria, Coniophora puteana, Antrodia vaillantii, ou Lenzites betulinus comme les champignons à pourritures brunes ; les Phanerochaete, Donkiopera expansa, Heterobasidion annosum, Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, Asterostroma cervicolor et Trametes versicolor comme les champignons à pourritures blanches ; les Chaetomium, les Phialophora et les Humicola comme les champignons à pourritures molles.

La notion de biosenseur est définie, selon les critères de l'IUPAC (Nagel et al., Pure & Appl. Chem. , Vol. 64, No. 1, pp. 143-168, 1992.), comme un « dispositif petit et compact qui utilise des réactions spécifiques induites par des enzymes, des immunosystèmes, des tissus, des organelles ou des cellules entières en réponse à la détection des composés ». Le biosenseur de la présente invention comprend une souche de bactéries génétiquement modifiées telles que décrites ci-dessus et détecte la présence des composés libérés par une attaque fongique à l'aide de l'expression du gène rapporteur, qui est sous le contrôle du système de régulation « CebR ».

Un biosenseur de l'invention peut notamment indiquer la bio-dégradation du bois par la détection des cello-oligosaccarides libérés par attaque fongique.

Un biosenseur de la présente invention peut comprendre en outre des éléments accessoires, par exemple des éléments permettant le maintien en vie des bactéries, tels qu'un milieu de culture, un support physique, ou un substrat qui collabore avec la protéine exprimée par le gène rapporteur pour indiquer la présence des composés issus de la dégradation du bois.

Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un biosenseur bactérien de la bio-dégradation du bois constitué par une souche des bactéries génétiquement modifiées conformes à l'invention.

Un mode plus particulier de l'invention concerne un biosenseur de biodégradation du bois comprenant ou constitué par une souche de Streptomyces spp. génétiquement modifiée enregistrée sous le numéro CNCM 1-4930.

Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biosenseur tel que décrit ci-dessus pour détecter la bio-dégradation du bois due à une attaque fongique, notamment due à une attaque d'au moins un champignon lignivore.

L'expression du gène rapporteur, visualisée par un changement de couleur ou tout autre signal détectable de manière optique (à l'œil ou par lecture spectrophotométrique dans le visible) et supérieur au témoin négatif, signifie la présence des composés, notamment des cello-oligosaccarides, libérés par la dégradation du bois et indique par conséquent la bio-dégradation du bois.

L'utilisation d'un biosenseur de l'invention permet de détecter rapidement la bio-dégradation du bois, car en présence des composés levant la répression transcriptionnelle du gène rapporteur, l'expression de ce gène devient visualisable seulement après 24H de culture des bactéries.

Le biosenseur de l'invention est apte à la détection de la bio-dégradation de différentes essences de bois, par différents agents de pourriture, ou après différents temps de dégradation. Dans un mode réalisation plus particulier, un biosenseur de l'invention tel que décrit ci-dessus peut être utilisé pour détecter la bio-dégradation du bois préalablement traité contre le pourrissement.

Un tel traitement peut être n'importe quel traitement anti-pourrissement conventionnellement utilisé pour le stockage et la conservation du bois. Parmi ces méthodes, on peut citer des méthodes par traitement chimique, telles que l'imprégnation du bois par des produits chimiques, notamment des produits comprenant de l'arsenic, du zinc ou du cuivre, la modification de la structure du bois par traitement chimique, ou des méthodes par traitement physique, tel que l'autoclavage.

Dans un mode de réalisation de l'invention, un biosenseur de l'invention tel que décrit ci-dessus peut être utilisé pour indiquer l'efficacité d'un traitement anti-pourrissement du bois.

L'invention concerne plus particulièrement les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces telles que décrites précédemment et qui sont résistantes à l'arsenic, au zinc ou au cuivre, et leur utilisation pour détecter la bio-dégradation du bois préalablement traité par des produits comprenant de l'arsenic, du zinc ou du cuivre.

Les susdites bactéries sont obtenues par transformation d'une souche naturellement résistante à l'arsenic, au zinc ou au cuivre avec un vecteur conforme à la présente invention.

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de détection de la bio-dégradation du bois.

Ledit procédé comprend les étapes suivantes :

- récupérer les lixiviats d'un bois dont la dégradation éventuelle est à détecter,

- incuber les bactéries génétiquement modifiées conformes à l'invention dans un milieu contenant les lixiviats récupérés et

- révéler chez lesdites bactéries éventuellement lysées, l'expression du gène rapporteur contenu dans lesdites bactéries.

Dans ce procédé, lesdites bactéries sont incubées selon les conditions classiques de culture.

Lorsque les bactéries sont lysées pour révéler l'expression du gène rapporteur, la lyse des bactéries a lieu au moins après 24 H de culture. L'invention est illustrée ci-après plus en détail par les figures et les exemples.

Les figures 1A et 1B illustrent le mécanisme de régulation du système CebR en conditions naturelles. Les figures 1C et 1 D montrent le mécanisme d'action d'un biosenseur de l'invention.

Figure 1A : En l'absence de composés de dégradation du bois, la protéine CebR se fixe sur la région « CebR box » située dans la région promotrice des gènes qu'elle régule et en inactive l'expression.

Figure 1B : Des composés de la dégradation du bois, lorsqu'ils sont présents, sont en compétition avec la région « CebR box » pour la fixation de la protéine CebR, levant ainsi la répression des gènes régulés et conduisant à son expression.

Figure 1C : La fixation de CebR sur la région « CebR box » empêche l'expression constitutive du gène rapporteur et l'activation de la molécule indicatrice.

Figure 1D : En présence de composés de dégradation du bois, la levée de l'inhibition de la transcription du gène rapporteur permet d'activer la molécule indicatrice et révèle, par conséquent, la présence de ces composés.

Figure 2 : Schéma de développement du vecteur intégratif contenant la construction « CebR box-ι- gène rapporteur ».

Les figures 3A et 3B illustrent le changement de couleur, en l'absence ou en présence de la cellobiose, d'une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur de la bio-dégradation du bois.

Figure 3A : Les bactéries de l'invention ont été striées et incubées sur un milieu riche avec du mannitol comme seule source de carbone.

Figure 3B : Les bactéries de l'invention ont été striées sur le même milieu, mais supplémenté avec de la cellobiose (5g/L), molécule signal de la dégradation du bois. Après 2 jours de croissance, les boîtes ont été vaporisées avec du catéchol (révélateur). Après 30 minutes, la souche biosenseur en présence de cellobiose a transformé le catéchol en un composé jaune, appréciable à l'œil nu et nettement supérieur au faible bruit de fond observé en l'absence de cellobiose. Figure 4A : elle illustre le résultat du test de sensibilité d'une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur de la bio-dégradation du bois. La souche bactérienne de l'invention a été incubée de 18 à 20 H en milieu liquide (milieu HT modifié) complémenté avec 15xl0 ³ , 300, 15 ou 1,5 μΜ de cellobiose et comparée avec la même souche incubée dans un milieu ne contenant pas de cellobiose. L'axe des ordonnées représente l'oxydation du cathécol par le produit du gène rapporteur (xylE), suivie par spectrométrie à 375nm et rapportée à la quantité de protéines totales afin de standardiser les expériences (axe des ordonnées). Après 10 minutes de réaction, une activité du gène rapporteur significativement supérieure est observable pour des concentrations en cellobiose de 15xl0 ³ , 300 et 15 μΜ, traduisant une détection de la cellobiose par ladite souche bactérienne en tant que biosenseur. Les expériences de sensibilité ont été répétées deux fois. La significativité des résultats a été évaluée à l'aide d'un test de t-student (p>0,05).

Figure 4B : elle illustre le résultat du test de détection de l'attaque fongique du bois par une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur. La souche bactérienne a été incubée en milieu liquide (milieu HT modifié) supplémenté avec soit un lixiviat d'épicéa non dégradé (contrôle), soit avec un lixiviat d'épicéa en cours de dégradation depuis 7 semaines par Poria placenta. L'axe des ordonnées représente l'oxydation du cathécol par le produit du gène rapporteur (xylE), suivie par spectrométrie à 375nm. Les expériences avec les lixiviats de bois ont été réalisées trois fois. La significativité des résultats a été évaluée à l'aide d'un test de t-student (p>0,05).

Exemples

1. Matériels et méthodes

1.1. Construction du vecteur d'expression

La région de fixation de la protéine CebR a été identifiée, isolée et clonée entre un promoteur fort (permE*), un site de traduction (RBS) et un gène rapporteur (xylE). Le gène xylE est amplifié à partir des amorces Biosens_F (SEQ ID NO : 11) et Biosens_R (SEQ ID NO : 12), l'amorce Biosens_F contenant les séquences de la région « CebR box », ainsi que le site d'initiation de la traduction (RBS, Ribosome binding site). Cette construction a été obtenue par PCR puis clonage dans le vecteur pIB139 (Fig . 2).

1.2. Obtention de la souche CNCM 1-4930

La préparation de cellules E.coli électrocompétentes et l'électroporation (transformation par choc électrique) du vecteur dans lesdites cellules sont réalisées selon le protocole de Sambrook & Russell (2001, Molecular cloning: a laboratory manual. 1 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Ledit vecteur est ensuite transféré dans une souche de Streptomyces par conjugaison intergénérique et intégrée de façon stable au génome de la bactérie réceptrice.

1.3 Culture de bactéries

Les Streptomyces sont cultivés dans le milieu SFM (Soy flour médium) pour les expériences de génie génétique.

Ce milieu de culture contient 8g de farine de soja, 8g de bacto agar et 8g de mannitol pour un volume de 400 ml.

Le milieu utilisé pour les tests des Streptomyces en milieu de culture solide (boite de Pétri) ou en milieu liquide est le milieu HT (Hickey-Tresner médium) modifié, qui contient 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de bœuf, 5 g de mannitol, 2 g de bacto-tryptone et 0,02g de COC pour un volume de IL. Ce milieu est ajusté à pH 7,3. Lorsque ce milieu est un milieu solide, il contient en outre 20 g de bacto agar.

2. Validation des constructions biosenseurs de l'invention

2.1. Tests sur boîte

Des tests de détection visuelle par strie des souches sur milieu gélosé supplémenté ou non avec de la cellobiose (5g/l) ou de l'Avicel® (5g/l) comme molécules potentiellement inductrices ont été réalisés. La cellobiose est un dimère de glucose constituant de base de la cellulose et présent dans les zones de dégradation du bois. L'Avicel® est une forme cristalline de cellulose. Des contrôles ont été réalisés en parallèle en striant les souches biosenseurs ou sauvages sur des milieux contenant ou non des composés inducteurs. Après 2 jours de croissance à 30°C, les boites ont été vaporisées avec le cathécol à 0,5M en tant que révélateur. La dégradation de ce substrat par le gène rapporteur xylE contenu dans le biosenseur conduit à une coloration jaune des colonies et/ou du milieu si le gène est exprimé (Fig . 3A, 3B). Cette coloration peut être observée visuellement. Les stries réalisées avec les souches sauvages sont restés incolores, indiquant l'absence d'activité catéchol dioxygénase endogène chez les Streptomyces. Les contrôles biosenseurs non induits ont parfois présenté un faible bruit de fond, suggérant une légère fuite de la construction. Toutefois l'intensité du signal était suffisamment faible pour ne pas générer de faux positifs dans l'interprétation des résultats. En présence d'Avicel®, les souches biosenseurs n'ont pas donné de signal significatif, indiquant que la cellulose cristalline est peu ou pas inductrice du biosenseur. Ce résultat suggère que le bois natif non attaqué ne serait pas susceptible d'induire de faux positifs. Les souches biosenseurs ont en revanche présenté une coloration jaune importante et significative sur milieu cellobiose (Fig . 3B), indiquant une reconnaissance de ce composé par le biosenseur.

2.2. Tests en culture liquide

Afin de s'affranchir du caractère potentiellement subjectif de l'estimation visuelle de la coloration du milieu par le biosenseur dans les tests sur boites, un protocole de quantification de l'indicateur coloré a été mis au point en utilisant des cultures liquides. Les suspensions cellulaires obtenues après 18- 22 heures de croissance en présence ou non de composés inducteurs ont été lysées par sonication. Le lysat cellulaire est ensuite mis en contact avec un tampon de réaction contenant du catéchol, le substrat du gène xylE. L'intensité de la réaction a ensuite été mesurée par une mesure de densité optique à 375 nm et pondérée entre les différentes expériences par la quantité de protéine présente dans le lysat cellulaire (test de Bradford). Ce protocole a notamment été optimisé en microplaque, permettant le traitement d'un grand nombre d'échantillons à la fois. Des cinétiques de temps de réaction permettent de déterminer que la réaction de détection est stable et mesurable dans le temps sur près d'une heure.

2.3. Test de spécificité Des tests de spécificité ont été réalisés en culture liquide en faisant croître les souches bactériennes en tant que biosenseurs et les souches sauvages en présence ou non de lixiviats d'épicéa non attaqué par des champignons. Aucun bruit de fond n'a été détecté avec les souches sauvages suite à l'ajout de catéchol dans les lysats cellulaires, confirmant l'absence d'activité catéchol dioxygénase endogène dans ces souches. Un léger bruit de fond a été mesuré avec les souches biosenseurs en l'absence ou en présence de lixiviat de bois non dégradé. Ce résultat suggère une fuite constitutive de notre construction non inhérente à la présence de bois sain,

Cette fuite est en revanche suffisamment faible et constante pour ne pas gêner l'interprétation des résultats réalisés par la suite avec des lixiviats de bois dégradé et ne génère donc pas de faux positifs.

2.4. Détection de l'attaque fongique du bois

La détection de l'attaque fongique du bois est effectuée dans un contexte similaire à celui utilisé dans la norme EN113/A1 (août/2004). Les tests ont été réalisés pour la souche CNCM 1-4930 utilisée en tant que biosenseur en présence de lixiviats de bois dégradé. Les lixiviats ont été récupérés par infiltration sous vide de tampon acétate d'éprouvettes d'épicéa attaqué par le champignon lignivore Poria Placenta pendant sept semaines. L'activité du gène rapporteur en présence de lixiviats de bois dégradé est deux fois supérieure au bruit de fond observé avec un lixiviat de bois non dégradé (fig 4B). Ces résultats permettent de détecter sans ambiguïté et de façon reproductible la dégradation du bois par rapport au bois sain et démontrent la validité de la souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur dans ce contexte.

Imprimé (original sous forme électronique)

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du mandataire WOBI15UHPFOB

1 Les indications ci-dessous ont trait

au micro-organisme ou autre matériel

biologique visé dans la description :

1-1 page 9

1-2 ligne 17

1-3 Identification du dépôt

1 -3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)

1 -3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur

Roux, 75724 Paris Cédex 15, France

1 -3-3 Date du dépôt 17 décembre 2014 (17.12.2014)

1 -3-4 Numéro d'ordre CNCM 1-4930

1-5 Etats désignés pour lesquels les

indications sont données De toutes les désignations

RÉSERVÉ À L'OFFICE RÉCEPTEUR

0-4 Cette feuille a été reçue en même

temps que la demande internationale

oui

(oui ou non)

0-4-1 Fonctionnaire autorisé

Kuiper-Cristina, Nathalie

RÉSERVÉ AU BUREAU INTERNATIONAL

0-5 Cette feuille est parvenue au Bureau

international le :

0-5-1 Fonctionnaire autorisé