本发明涉及生物技术领域，尤其涉及产 L-丙氨酸且耐受自来水的菌株 及构建方法。

背景技术

L-丙氨酸作为人体非必需氨基酸， 在生物体内由甘氨酸的氨基转移至 丙酮酸而成。 L-丙氨酸是一种白色结晶或结晶性粉末， 带有甜味， 易溶于 水， 在食品及医药工业领域具有广泛的用途。 在食品工业领域， L-丙氨酸 可提高食品的营养价值，加入 L-丙氨酸后能够明显提高食品及饮料中蛋白 质利用率。 L-丙氨酸能够改善人工合成甜味剂的味感， 使其如同天然甜味 剂。 另外， L-丙氨酸还能够改善有机酸的酸味， 使其更接近自然味道。 在 医药领域， L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养药， 同时 L-丙氨酸也是制造维 生素 B6、 合成泛酸钙和其他有机化合物的重要原料。

目前， L-丙氨酸的生产方法主要有化学合成法和生物� ��成法。 其中化 学合成法主要有丙酸氯化氨化法、 ex-溴丙酸氯化法和氰醇法。 这些方法都 需要石油基原材料， 如丙酸、 ex-溴丙酸、 乙醛和氢氰酸等， 因此成本受困 于原油价格。 随着石油价格的提升， 成本会越来越高。 另外， 这些方法都 是经过复杂的化学催化完成的， 污染重， 分离提取成本高， 不适合可持续 发展的需要。

生物法生产 L-丙氨酸目前主要是以 L-天冬氨酸为原料， 在天冬氨酸 -β-脱羧酶的催化下进行脱羧反应生产 L-丙氨酸。 该方法是目前国内 L-丙 氨酸生产厂家主要使用的生产技术。 但是由于该方法中的原材料天冬氨酸 的生产是以顺酐为原料的， 因此 L-丙氨酸的生产成本依旧依赖于石油价 格。 随着石油资源的匮乏和价格的提升， 顺酐资源的紧张和价格上涨将导 致天冬氨酸的供给存在巨大的隐患， 从而会影响到 L-丙氨酸的生产及成 本。

随着合成生物学和代谢工程的发展， 近年来使用微生物发酵法生产 L- 丙氨酸的研究越来越受到重视。 微生物发酵法能够实现以葡萄糖等糖类为 原料生产 L-丙氨酸。 葡萄糖属于可再生的生物质资源， 可以通过广泛存在 于自然界中的木质纤维素降解获得。 因此， 使用其作为原材料， 能够使 L- 丙氨酸的生产成本保持在稳定的水平， 具有长远的经济优势。 目前， 已经 有多株能够生产 L-丙氨酸的菌株的报道。 Smi th 等构建了一株 E. coli ALS929 (pTrc99A-a^^)菌株， 其中在质粒中表达的丙氨酸脱氢酶 AlaD能 够将胞内生成的丙酮酸转化为 L-丙氨酸， 该菌株经过 48小时发酵后， 能 够生产 88 g/L 的 L-丙氨酸。 Lee 等构建了一株 A coli ALA887 (pTrc99A-a^^)菌株， 发酵生产时能够在 27小时内生产 32 g/L的 L-丙氨 酸。 在这些菌株中， 丙氨酸脱氢酶是生产 L-丙氨酸的关键步骤， 在报道的 菌株中， 编码该蛋白的基因一般是通过高拷贝质粒进行 表达的。 在进行菌 株培养基发酵过程中， 需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传。 这些因素 将导致发酵过程工艺复杂并提高 L-丙氨酸生产的成本。 因此， 随着合成生 物学和代谢工程的发展，构建遗传稳定的 L-丙氨酸生产菌株并经过微生物 发酵法生产 L-丙氨酸将是未来的发展趋势。

目前菌株发酵生产 L-丙氨酸使用的都是由蒸馏水配置的培养基， 蒸馏 水在工业生产中提高了生产的成本。 开发能够直接使用自来水配置的培养 基进行发酵生产 L-丙氨酸的菌株并用于生产， 将极大的降低 L-丙氨酸的生 产成本。 但是相对于蒸馏水， 自来水中存在大量的离子并且浓度较高。 为 了获得能够直接使用自来水配置的培养基进行 发酵的菌株， 需要提高菌株 对高离子浓度的耐受力。

发明公开

本发明的一个目的是提供产 L-丙氨酸且耐受自来水的菌株的构建方 法。

本发明提供的构建重组菌 （XZ-A45 ) 的方法， 包括如下步骤： 将出发 菌染色体上的 c lpA蛋白编码基因替换为 c lpA*蛋白的编码基因，得到的重 组菌；

所述 c lpA*蛋白的氨基酸序列为将所述 c lpA蛋白氨基酸序列的第 632 位异亮氨酸 I突变为丝氨酸 S。

上述方法中，所述 c lpA*蛋白为由序列表中序列 2自 5 ' 末端第 1 -2272 位核苷酸编码的蛋白。

上述方法中，所述 c lpA*蛋白编码基因为将所述 c lpA蛋白编码基因核 苷酸序列第 1895位的碱基为 T突变为 G得到的基因。 上述方法中， 所述 c lpA*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序� � 2 自 5 ' 末端第 1-2272位核苷酸。

上述方法中， 所述将出发菌染色体上的 clpA 蛋白编码基因替换为 clpA*蛋白编码基因为将含有所述 clpA*蛋白编码基因的匪片段 II同源重 组到所述出发菌中。

上述方法中， 所述 DNA片段 II的核苷酸序列为序列表中序列 2。

上述方法中，所述出发菌为通过将嗜热脂肪地 芽孢杆菌染色体上的 L- 丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌 ATCC8739 染色体的乳酸脱氢酶处， 再 依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂 解酶基因、 乙醇脱氢酶基 因、 乙酸激酶基因、 富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因， 然后在发酵 罐中连续传代培养而得的基因工程菌；

所述出发菌具体为大肠杆菌 XZ-A26 CGMCC No. 4036。

上述同源重组具体通过两步进行：

1 ) 将薩片段 I导入带有 pKD46的大肠杆菌工程菌株 XZ-A26中， 进 行第一次同源重组， 得到中间菌 XZ-A44;

2 ) 将 DNA片段 II导入所述中间菌 XZ-A44中， 进行第二次同源重组， 得到重组菌 XZ-A45。

由上述的方法制备的重组菌也是本发明保护的 范围。

上述的重组菌在产生和 /或提高 L-丙氨酸中的应用也是本发明保护的 范围。

上述应用中， 所述产生和 /或提高 L-丙氨酸为将权利要求 7所述的重 组菌在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发 酵生成。

本发明的另一个目是提供一种产生 L-丙氨酸的方法。

本发明提供的方法， 包括如下步骤： 在自来水作为溶剂配制的发酵培 养基中发酵上述的重组菌， 收集发酵产物， 即得到 L-丙氨酸。

自来水作为溶剂配制的发酵培养基为实施例中 的发酵培养基 I I。 上述自来水为取自首创自来水公司山海关分公 司， 具有如下特征：硬 度： 2- 3mmol/L、pH=6. 5-7· 5、电导率： 400- 600 μ s/cm、氯化物 100- 250mg/L、 硫酸盐 100- 250mg/L。

实施发明的最佳方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径 得到。

大肠杆菌工程菌 XZ- A26 CGMCC No. 4036， 于 2010年 7月 26日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（简称 CGMCC , 地址为： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号） ， 保藏编号为 CGMCC NO. 4036， 分类命 名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。 该菌株能够在无机盐培养基中发酵生 产 L-丙氨酸。

下述实施例中的自来水取自首创自来水公司山 海关分公司 （硬度： 2- 3mmol/L、 pH=6. 5- 7. 5、 电导率： 400- 600 μ s/cm、 氯化物 100- 250mg/L、 硫酸盐 100-250mg/L ) 。

下述实施例中的蒸馏水 （硬度 0、 pH=7. 0-8. 0、 电导率： 5 s/cm ) 实施例 1、 用自来水配置的培养基筛选产 L-丙氨酸且耐自来水菌株

1、 对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌 工程菌 XZ-A26发酵 生产 L-丙氨酸的影响

大肠杆菌工程菌 XZ-A26 CGMCC No. 4036 (具体特征见表 1 ) ， 能够 在蒸馏水配置的无机盐培养基中发酵葡萄糖生 产 L-丙氨酸。然而， 由于工 业发酵中使用蒸馏水成本太高， 因此希望能直接使用自来水配置培养基。

因此，对比了蒸馏水和自来水配置的培养基对 大肠杆菌工程菌 XZ-A26 发酵生产 L-丙氨酸的影响。

表 1生产 L-丙氨酸的重组大肠杆菌

相关特征

XZ- -A26 E. coliATCC 8739 (ApflB, A frd, A adM, A ackA, A gsA, dadl, ldhA :： alaD rov^ G. Stearothermophilus)， CGMCC No.

4036

XZ- -A41 XZ-A26经过 820代进化后获得的菌株

XZ- -A45 XZ-A26,把野生型 替换为来自 XZ-A41菌株中含有基因突 变 ( T 1895G ) 的 cJp * 具体步骤如下:

种子培养基： 将如下溶质溶解在溶剂蒸馏水中， 得到种子培养基， 给 出的浓度为终浓度：

葡萄糖 120g/L， 氯化铵 5g/L， NaH ₂ P0 ₄ 5g/L, Na ₂ HP0 ₄ 5g/L, MgS0 ₄ · 7¾0 lg/L, CaCl ₂ 2H ₂ 0 0. lg/L, 微量无机盐 5ml/L， 培养基 pH6. 5。

微量无机盐组成为： FeCl ₃ · 6H ₂ 01. 5mg， CoCl ₂ · 6H ₂ 0 0. lmg， CuCl ₂ · 2H ₂ 0 0. lmg， ZnCl ₂ 0. lmg， Na ₂ Mo0 ₄ · 2H ₂ 0 0. lmg， MnCl ₂ · 4H ₂ 0 0. 2mg， 蒸馏水定 容至 1L， 过滤除菌。

发酵培养基 I的组成为： 同种子培养基。

发酵培养基 Π 的组成为： 同种子培养基， 只是用自来水替代蒸馏水 作为溶剂。

250ml三角瓶中种子培养基为 150 ml , 121 °C灭菌 15min。 冷却后接入

XZ-A26, 在 30°C， 摇床转速为 50 rpm， 培养 18 h， 用于发酵培养基接种。

3L发酵罐中发酵培养基体积为 2 . 4 L， 121 °C灭菌 15min。 接种量为 0. 1% (V/V) 。 发酵温度为 30°C， 搅拌转速为 100 rpm， 发酵 48 h。 中和 剂为氨水， 使发酵罐的 pH控制在 6. 5。

分析方法： 使用安捷伦 （Agi lent-1200) 高效液相色谱对发酵液中的 组分进行测定。 发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度采用伯乐 （Biorad ) 公司 的 Aminex HPX-87H有机酸分析柱。 L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛 璐 （Daciel ) 公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱 （Chiralpak MA (+) ) 。

结果见表 2， 菌株 XZ-A26在蒸馏水配置的发酵培养基 I中发酵 48小 时， L-丙氨酸产量达到 115 g/L。 在自来水配置的发酵培养基 II 中发酵 48小时， L-丙氨酸产量达 80 g/L， 产量降低了 30%。

表 2 重组大肠杆菌发酵生产 L-丙氨酸

培养基条件 L-丙氨酸 L-丙氨酸的相对

XZ-A26 蒸馏水配置的发酵培养基 I 115 143. 75

自来水配置的发酵培养基 80 100

II

XZ-A41 自来水配置的发酵培养基 114 142. 5 II

XZ-A45 自来水配置的发酵培养基 102 127. 5

II

XZ-A45 蒸馏水配置的发酵培养基 I 114 142_5

a使用 3 L的发酵罐， 发酵培养基为 2. 4 L。 使用的中和剂为氨水， 使 发酵罐的 pH控制在 6. 5。

b以 XZ-A26菌株在自来水配置的发酵培养基 II中 L-丙氨酸产量定义 为 100%。

2、 采用适应进化提高工程菌耐受自来水的能力

采用适应进化技术，在自来水配置的培养基中 连续传代工程菌 XZ-A26, 以提高其耐受自来水的能力。

进化代谢所使用的发酵培养基同上述 1中所述发酵培养基 I I的成分相 同。进化代谢过程使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基 II的体积为 250 ml , 121 °C灭菌 15min， 冷却后接入 XZ-A26, 接种量为 0. 1% (V/V) 。 发酵温度 为 30°C， 搅拌转速为 100 rpm。 发酵过程中使用氨水为中和剂， 使发酵罐 的 pH控制在 6. 5。 在发酵罐中连续传代培养工程菌， 每 24小时将发酵罐 中的菌液按照 1 : 1000的比例转接到一个新的发酵罐中。 经过 820代转接， 最终获得菌株 XZ-A41 (表 1 ) 。

使用同上述 1 中所述的方法， 在用自来水配置的发酵培养基 II 中发 酵获得的工程菌 XZ-A41 , 48小时后 L-丙氨酸产量达 114 g/L， 和在蒸馏 水配置的培养基中发酵产量基本一样 （表 2 ) 。

上述结果表明， 工程菌 XZ-A41不仅可以高产 L-丙氨酸， 而且耐受自 来水。 因此， 为了研究其耐受性是否是由基因突变引起的， 对其基因组进 行测序。

3、 工程菌 XZ-A41的基因组测序

(1) 发酵培养与基因组制备

挑取工程菌株 XZ-A41 的单克隆接种到 4 ml 的 LB液体培养基中， 在 培养温度为 37°C，转速为 250 rpm的条件下震荡培养过夜，设定三个平行。 将培养好的三个平行中的细胞混匀并收集细胞 ，使用 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (promega)抽提细菌基因组 DNA。 DNA浓度的检测通过 Qubi t Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳定量完成。

(2) 基因组重测序

基因组重测序由深圳华大基因科技有限公司完 成。 采用全基因组鸟枪 法， 构建 Paired-End片段库进行测序， 整体测序深度在 100倍以上， 期 望数据量为 500Mbp。 测序采用的技术方法和路线为： DNA样品制备一一上 机测序一一数据处理一生物信息分析。序列分 析的参考序列为 E. coli隱 8739 的 基 因 组 序 列

( http : //www. ncbi . nlm. nih. gov/ nuccore/NC_010468. 1 ) 。

结果： 对工程菌 XZ-A41基因组重测序结果进行分析发现， ^基因 (编码 ATP依赖型分子伴侣蛋白 ClpA， GenBank No. ADT74495. 1 ) 的核苷 酸序列第 1895位的 T突变为 G， 其对应的氨基酸第 632位的 I突变成 S， 将该基因命名为 _c ^^*， 编码的蛋白为 clpA*。

另外， 发现 Ion 基因 （编码 ATP 依赖型蛋白酶 La， GenBank No. AFH10177. 1 )核苷酸序列第 1310位的 C突变为 A， 其对应的氨基酸序列第 437位的 A突变成 D。 将该基因命名为 M*， 编码的蛋白为 lon*。

因此， 认为耐自来水性可能是由于 基因或 M基因突变引起的， 下一步对出发菌的 ^基因进行突变， 从而获得耐自来水菌株。

实施例 2、 基因突变获得产 L-丙氨酸且耐自来水菌株 XZ-A45 为了验证 clpA基因突变 （T1895G) 对工程菌株耐受自来水能力的影 响， 将 ^/^*通过两步同源重组的方法引入 XZ-A26替换原来 基因， 获得 XZ-A45 (表 1 ) 。 具体步骤如下：

第一步， 以 pXZ- CS质粒（Tan et al.， Appl Environ Microbiol. 2013, 79 : 4838-4844； 公众可从安徽华恒生物科技术股份有限公司获 得； ） 匪 为模板， 使用引物 XZ-clpA*cat-up / XZ-c lpA*sacB- down扩增出 2719 bp 的 DNA片段 I (序列 1 ) 。

扩增体系为： NewEngland Biolabs Phus ion 5X缓冲液 10 μ 1、 dNTP (每 种 dNTP各 10 mM) 1 μ 1、 DNA模板 20 ng、 弓 |物（10 μ M)各 2 μ 1、 Phus ion High- Fidel i ty DNA聚合酶 （2· 5 υ/ μ 1) 0. 5 μ 1、 蒸馏水 33· 5 μ 1， 总 体积为 50 μ 1。

扩增条件为 98 °C预变性 2分钟（1个循环）； 98°C变性 10秒、 56°C退 火 10秒、 72°C延伸 30秒（30个循环）； 72°C延伸 5分钟（1个循环）。

DNA片段 I包含 cl _P A基因上游同源臂 50个碱基 （序列 1 自 5' 末端 第 1-50位核苷酸）、 ca -^ 基因 DNA片段（序列 1 自 5' 末端第 51-2669 位核苷酸） 及 clpA 基因下游同源臂 50 个碱基 （序列 1 自 5' 末端第 2670-2719位核苷酸） 。

将 DNA片段 I用于第一次同源重组， 首先将 pKD46质粒 （来源于合肥 百迈生物技术有限公司） 通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌工程菌株 XZ-A26, 得到带有 pKD46的大肠杆菌工程菌株 XZ-A26, 然后将 DNA片段 I 电转至带有 PKD46的大肠杆菌工程菌株 XZ-A26。

电转条件为： 首先准备带有 PKD46 质粒的大肠杆菌工程菌株 XZ-A26 的电转化感受态细胞； 将 50μ 1感受态细胞置于冰上， 加入 50ngDNA片段 I， 冰上放置 2分钟， 转移至 0.2 cm的 Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司）电穿孔仪， 电击参数为电压 2.5kv。 电击后迅速将 lml LB 培养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75转， 3CTC孵育 2小 时。 取 200 μ 1菌液涂在含有氯霉素 （终浓度为 17ug/ml) 的 LB平板上， 37°C过夜培养后， 挑选 5个单菌落进行 PCR验证， 使用引物 XZ-clpA*-up /XZ- _C lpA*-down进行验证， 正确的菌落扩增产物为 3419bp的片段。 挑选 一个正确的单菌落， 将其命名为 XZ-A44。

第二步， 以实施例 1得到的工程菌株 XZ-A41 的基因组 DNA为模板， 使用引物 XZ- clpA*- up I XZ- clpA*- down进行 PCR扩增， 获得 2272 bp 的 的 DNA片段 II (其核苷酸序列为序列表中的序列 2) ， DNA片段 II用于第 二次同源重组。 首先将 PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至 XZ-A44, 得到 带有 pKD46的大肠杆菌工程菌株 XZ-A44, 然后将 DNA片段 II电转化至带 有 pKD46质粒的 XZ-A44。

DNA片段 II包含 ^/^*基因， ^/^*基因的核苷酸序列为序列 2 自 5' 末端第 1-2272位， c^^*基因为 基因的第 1895位 T突变为 G， clpA* 基因编码的蛋白为将 基因编码的蛋白的第 632位异亮氨酸 I突变为 丝氨酸 S。

电转条件为： 首先准备带有 PKD46 质粒的大肠杆菌工程菌株 XZ-A44 的电转化感受态细胞； 将 50μ 1感受态细胞置于冰上， 加入 50ngDNA片段 I I，冰上放置 2分钟，转移至 0. 2 cm的 Bi o-Rad电击杯。使用 MicroPulser ( Bio-Rad公司）电穿孔仪， 电击参数为电压 2. 5kv。 电击后迅速将 lml LB 培养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75转， 3CTC孵育 4小 时。 将菌液转移至含有 10%蔗糖的没有氯化钠的 LB液体培养基 （250ml烧 瓶中装 50ml培养基） ， 培养 24小时后在含有 6%蔗糖的没有氯化钠的 LB 固体培养基上划线培养。 经过 PCR 验证， 所用引物为 XZ-clpA*-up / XZ-clpA*-down, 正确的菌落扩增产物为 2272bp的片段。 挑选一个正确的 单菌落， 将其命名为 XZ-A45。

上述所用引物序列见表 3。

使用同实施例 1 中所述的方法， 在用自来水配置的发酵培养基 I I 中 发酵获得的工程菌 XZ-A45 , 48小时后 L-丙氨酸产量达 102 g/L， 相对出发 菌株 XZ- A26提高了 28%。

表 3 本发明中所使用的引物

实施例 3、 对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌 工程菌

XZ-A45发酵生产 L-丙氨酸的影响

使用同实施例 1中所述方法， 分别在用蒸馏水和自来水配置的发酵培 养基中发酵 XZ-A45菌株。

结果发现， 经过 48 h的发酵后， XZ-A45菌株在蒸馏水配置的发酵培 养基 I 中能够生产 114 g/L 的 L-丙氨酸， 而在使用自来水配置的培养基 I I中发酵时能够生产 102 g/L的 L-丙氨酸。 XZ-A45菌株和 XZ-A26相比在 使用自来水配置的培养基 Π中发酵时， L-丙氨酸产量提高了 27. 5%。 工业应用

本发明的实验证明， 本发明通过将大肠杆菌工程菌 XZ-A26中的 ^基 因进行突变， 得到的重组菌 XZ-A45 , 不仅能够提高 L-丙氨酸产量， 而且还可 以在自来水配置的发酵培养基中高产 L-丙氨酸， 采用自来水配置可以节约成 本。