ESTADO DEL ARTE La acidificación espontánea de la leche puede llevar en ocasiones a la obtención de un producto final de características no uniformes o con defectos o alteraciones no deseadas.

Por otra parte, la posible presencia en la leche de microorganismos patógenos contaminantes, ha llevado a la utilización generalizada del tratamiento térmico de pasterización con el fin de reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. En ambos casos, con o sin tratamiento térmico, la adición de cultivos iniciadores a la leche ha dado buenos resultados, al restaurar o potenciar el desarrollo de la microbiota beneficiosa y proporcionar productos higiénicamente aceptables y de calidad uniforme.

En nuestro laboratorio se han abordado estudios bioquímicos y microbiológicos de quesos semiduros de cabra artesanales e industriales destacándose las bacterias lácticas como la microbiota predominante en estos quesos [GOMEZ, R. ; Peláez, C.; De la Torre, E. (1989) Microbiological study of semi-hard goat s milk cheese (Majorero) Int.

J. Food Sci. Technol. 24,147-151 ; FONTECHA, J.; Peláez, C.; Juárez, M.; Requena, T.; Gómez, R.; Ramos, M. (1990) Biochemical and microbiological characteristics of artisanal hard goat's cheese. J. Dairy Sci. 73,1150-1157; REQUENA, T.; Peláez, C.; Desmazeaud, M. J. (1991) Characterization of lactococci and lactobacilli isolated from semi-hard goat's cheese. J. Dairy Res. 58,137-145]. Además, se ha desarrollado un cultivo iniciador para la elaboración de queso semiduro que proporciona quesos de buenas características organolépticas [REQUENA, T.; De la Fuente, M. A ; Fernández de Palencia, P.; Juárez, M.; Peláez, C. (1992) Evaluation of a specific starter for the production of semi-hard goat's milk cheese. Lait 72,437-448] y se ha estudiado el sistema proteolítico de algunas de las cepas integrantes del mismo [FERNANDEZ DE PALENCIA, P. ; Peláez, C.; Romero, C.; Martín-Hernández, M. C. (1997) Purification and

characterization of the cell wall proteinase of Lactobacillus casei subsp. casei IFPL731 isolated from raw goat's milk cheese. J. Agric. Food Chem. 45,3401-3405; FERNANDEZ DE PALENCIA, P. ; Peláez, C.; Martín-Hernández, M. C. (1997) Characterization of the aminopeptidase system from Lactobacillus casei subsp. casei IFPL731. J. Agric. Food Chem. 45, 3778-3781]. El microorganismo Lactococus lactis CECT 4478 integrante del cultivo iniciador se ha patentado (Patente de Invención n°ES9302713).

Durante la maduración del queso, las bacterias lácticas del cultivo iniciador desempeñan un papel primordial ya que contribuyen directamente al desarrollo de las características del queso mediante reacciones de glicolisis, proteolisis y lipolisis y la transformación de los productos finales en compuestos responsables del aroma. Ahora bien, el proceso de maduración es relativamente largo por lo que su reducción en el tiempo conlleva indudables ventajas económicas. Muchos de los estudios realizados en este sentido se han centrado sobre la proteolisis, al ser éste el proceso fundamental que ocurre en la maduración de la mayoría de los quesos.

La proteolisis que implica la hidrólisis de la caseína, por la acción concertada del cuajo y las proteinasas y peptidasas de las bacterias lácticas, proporciona péptidos de bajo y medio peso molecular y aminoácidos libres que intervienen directamente en el sabor básico del queso y son precursores de otros compuestos responsables del aroma [FOX P. F.; Wallace, J. M. (1997) Formation of flavour compounds in cheese. En : Advances in Applied Microbiology. Vol 45, pp. 17-85 (Ed. Academic Press). New York, USA]. Si bien es cierto que la conversión de aminoácidos en compuestos volátiles es fundamental para el desarrollo de las características típicas del queso y es en definitiv su factor limitante, el aumento en la concentración de estos precursores incide indirectamente en el resultado final. Por ello, los procedimientos basados en el aumento de proteolisis están generalmente encaminados a acelerar la formación del aroma y sabor del queso mediante el aumento en el contenido de aminoácidos libres. La forma en que estos procedimientos afectan a las reacciones finales de formación de volátiles a partir de los aminoácidos, es un tema de investigación sobre el que existen pocos datos todavía.

Los procedimientos descritos hasta el momento para acelerar la proteolisis del queso se basan en el aumento del nivel de enzimas implicadas en los distintos procesos bioquímicos, o bien en crear las condiciones más favorables para su actuación. La

localización intracelular de las peptidasas [TAN, P. S. T.; Chapot-Chartier, M. P.; Pos, K. M.; Rousseau, M.; Boguein, C. Y.; Gripon, J. C.; Konings, W. N. (1992) Localization of peptidases in lactococci. Appl. Environ. Microbiol. 29,807-813] sugiere que la lisis bacteriana, al favorecer el acceso de las enzimas a sus sustratos puede ser de gran importancia en la formación de compuestos que intervienen en el desarrollo de las características organolépticas del queso [CHAPOT-CHARTIER, M.-P.; Deniel, C. ; Rousseau, M.; Vassal, L.; Gripon, J.-C. (1994) Autolysis of two strains of Lactococciis lactis during cheese ripening. Int. Dairy J. 4,251-269; WILKINSON, M. G.; Guinee, T. P.; O'Callaghan, D. M.; Fox, P. F. (1994) Autolysis and proteolysis in different strains of starter bacteria during Cheddar cheese ripening. J. Dairy Res 61,249-262]. En este sentido, la investigación se ha centrado en el empleo de cepas con elevada actividad autolítica como cultivos iniciadores o adjuntos y en el desarrollo de métodos que provoquen la lisis celular, como permeabilización de membranas con lisozima, choques térmicos, pulsos eléctricos y altas presiones [FOX, P. F.; Wallace, J. M.; Morgan, S. ; Lynch, C. M.; Niland, E. J.; Tobin, J. (1996) Acceleration of cheese ripening. Antonie van Leeuwenhoek. 70,271-297].

Otros estudios de aceleración de la maduración se dirigen a provocar la lisis celular por otros procedimientos como termoinducción, inducción de profagos en cepas lisogénicas, y más recientemente, por expresión controlada de genes líticos de bacteriófagos y empleo de bacteriocinas [DE RUYTER, P. G.; Kuipers, O. P.; Meijer, W. C.; de Vos, W. M. (1997) Food-grade controlled lysis of Lactococcus lactis for accelerated cheese ripening. Nat. Biotechnol. 15,976-979]. Durante la última década, los estudios sobre la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas se han referido casi exclusivamente a su aplicación industrial como inhibidores del crecimiento de microorganismos patógenos [Patente US 5.877.272, Vandenbergh, et al, 2 de Marzo de 1999, Bacteriocin from Lactococcus Lactis]. En los últimos años se ha comenzado a prestar atención a su potencial capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos alterantes [FENELON, M. A ; Ryan, M. P.; Rea, M. C.; Guinee, T. P.; Ross, RP. ; Hill, C. ; Harrington, D. (1999) Elevated temperature ripening of reduced fat Cheddar made with or without Lacticin 3147-producing starter culture. J. Dairy Sci. 82,10-22] o de provocar lisis bacteriana con la consiguiente aceleración de la proteolisis del queso [MORGAN,

S. ; Ross, R. P.; and Hill, C. (1997) Increasing starter cell lysis in Cheddar cheese using a bacteriocin-producing adjunct. J. Dairy Scí. 80,1-10 ; MARTINEZ-CUESTA M. C.; Fernández de Palencia, P. ; Requena, T.; Peláez, C. (1998) Enhancement of proteolysis by a Lactococcus lactis bacteriocin producer in a cheese model system. J. Agric. Food Chem. 46,3863-3867]. No obstante, la utilización en la industria quesera de bacteriocinas o de los microorganismos que las producen como adjuntos, puede originar alteraciones durante el proceso de fabricación : Se ha descrito retraso en la acidificación de la cuajada, con el consiguiente exceso de lactosa residual en el queso [MORGAN, S.; Ross, R. P.; Hill, C. (1995) Bacteriolytic activity caused by the presence of a novel lactococcal plasmid encoding lactococcins A, B, and M. Appl. Environ. Microbiol. 61, 2995-3001 ; GARDE, S.; Gaya, P.; Medina, M.; Nuñez, M. (1997) Acceleration of flavour formation in cheese by a bacteriocin-producing adjunct lactic culture.

Biotechnol. Lett. 19,1011-1014]. Esto ocurre habitualmente al poseer las bacteriocinas actividad antimicrobiana frente a bacterias lácticas del cultivo iniciador. Por ello, es importante disponer de un cultivo iniciador que sea inmune a la bacteriocina.

En el Departamento de Ciencia y Tecnología de Productos Lácteos deI Instituto del Frío (CSIC), se ha aislado el microorganismo Lactococcus lactis IFPL105 de queso de cabra que produce una bacteriocina. Esta bacteriocina identificada como lacticina 3147 [DOUGHERTY, B. A. ; Hill, C.; Weidman, J. F.; Richardson, D. R. ; Venter, J. C.; Ross, R. P. (1998) Sequence and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocin- producing plasmid pMRCO1 from Lactococcus lactis DPC3147. Mol. Microbiol. 29, 1029-1038] se caracteriza por poseer un amplio espectro de acción, que incluye tanto bacterias lácticas como microorganismos patógenos de los géneros Clostridium, Bacillus y Listeria [CASLA, D.; Requena, T.; Gómez, R. (1996) Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from goat's milk and artisanal cheeses : characterisitcs of a bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus IFPLI05. J. Appl. Bacteriol. 81,35- 41]. Se ha purificado y caracterizado a nivel molecular la región genética que codifica la biosíntesis de la bacteriocina y que reside en un plásmido de 46 kb (pBAC105) no conjugable, resultando ser el primer lantibiótico descrito en Lactococcus lactis que requiere la acción complementaria de dos péptidos para ejercer su acción inhibitoria [MARTÍNEZ-CUESTA M. C. ; Buist, G. ; Kok, J.; Hildeng Hauge, H.; Nissen-Meyer, J.; Peláez, C; Requena, T. (2000) Biological and molecular characterization of a two-

peptide lantibiotic produced by Lactococcus lactis IFPL105. J. Appl. Microbiol. 89,249- 260]. La bacteriocina presenta un efecto lítico que se manifiesta por la inducción del sistema autolítico de bacterias sensibles [MARTÍNEZ-CUESTA, M. C.; Peláez, C.; Juárez, M.; Requena, T. (1997). Autolysis of Lactococclxs lactis ssp. lactis and Lactobacillus casei ssp. casei. Cell lysis induced by a crude bacteriocin. Int. J. Food Microbiol. 38,125-131; MARTÍNEZ-CUESTAM. C.; Kok, J.; Herranz, E.; Peláez, C.; Requena, T. ; Buist, G. (2000) Requirement of autolytic activity for bacteriocin induced lysis Appl. Environ. Microbiol. 66,3174-3179] por lo que presenta la potencialidad para acelerar maduración del queso. Se ha establecido el papel que la bacteriocina ejerce en la aceleración de la proteolisis, utilizando el microorganismo productor Lactococcus lactis IFPL105 como adjunto al cultivo iniciador en un sistema modelo de queso, con resultados positivos [MARTÍNEZ-CUESTA M. C.; Fernández de Palencia, P.; Requena, T.; Peláez, C. (1998) Enhancement of proteolysis by a Lactococcus lactis bacteriocin producer in a cheese model system. J. Agric. Food Chem. 46,3863-3867].

DESCRIPCION DE LA INVENCION Descripción Breve La presente invención describe un procedimiento de producción de transconjugantes de Lactococcus lactis (se describe en detalle el Lactococcus lactis CECT5367) productores de bacteriocina y por tanto inmune a ella. Este microorganismo y otros similares pueden utilizarse como cultivos iniciadores para la elaboración de queso semiduro produciendo quesos de buena calidad organoléptica y sin alteración del proceso de acidificación de la cuajada. El procedimiento de obtención de microorganismos con estas características a partir de otras cepas iniciadoras de la maduración de quesos forma parte de la presente invención así como estos microorganismos forman parte de la presente invención.

Descripción detallada En la presente invención se ha desarrollado un microorganismo modifl^cado genéticamente partir de un microorganismo utilizado como cultivo iniciador de quesos, tomando como ejemplo de este el Lactococcus lactis CECT4478. La modificación consiste en la transmisión a la cepa parental del plásmido no conjugable de 46kb (pBAC105) presente en Lactococcus lactis IFL105. Este plásmido codifica la producción e inmunidad de la bacteriocina lacticina 3147, de amplio espectro antimicrobiano de acción frente a patógenos y efecto lítico sobre bacterias lácticas sensibles. La transmisión del plásmido pBAC105 se ha llevado a cabo por conjugación utilizando como donante Lactococcus lactis MG1363 y como receptor Lactococcus lactis CECT 4478 (Lac+). Lactococcus lactis MG1363 es portador del plásmido pBAC105 y del elemento movilizable pMV158 (5.5 kb), transferidos ambos por electroporación. Cualquier otro procedimiento de transformación de células, distinto de la electroporación, y que son ampliamente conocidos en el estado de la técnica de la ingeniería genética puede ser utilizado como objeto de la presente invención y forma parte de la misma. Los transconjugantes obtenidos (Lac+, Bac+, Ism') se aislaron como colonias amarillas en placas selectivas (púrpura de bromocresol conteniendo bacteriocina) identificándose por ser lactosa positivos (un rasgo asociado a la cepa receptora) y por su capacidad de producir bacteriocina. Durante esta selección no se observó resistencia espontánea a la bacteriocina.

Con el objeto de confirmar que las colonias aisladas eran realmente transconjugantes, se analizaron sus perfiles plasmídicos. En todos los casos se constató la presencia del plásmido pBAC105 por la aparición de una banda de 46 kb en el perfil plasmídico de los transconjugantes. No obstante, y debido a la existencia en la cepa parental de un plásmido de similar tamaño (45 kb), la presencia de pBAC105 se confirmó mediante análisis de hibridación Southern. En este análisis se empleó como sonda un fragment de 271 bp obtenido por amplificación de una región interna localizada entre los genes estructurales de la lacticina 3147 [Dougherty et al, 1998; Martinez-Cuesta et al, 2000]. En esta invención se pone así de manifiesto que los determinantes genéticos Bac+ Imm+ de la lacticina 3147 producida por L. lactis IFPL 105 pueden ser fácilmente transferidos a otras cepas de características industriales relevantes, las cuales forman parte de la presente invención.

De todos los transconjugantes y para estudios posteriores se seleccionó aquella cepa capaz de inhibir el crecimiento del microorganismo indicador (L. 7actis CECT4478) en mayor medida. La cepa obtenida L. lactis IFPL3593 (Lac+, Bac+), depositada en la CECT con el número CECT5367 es la que forma parte de la presente invención.

Los resultados descritos en la presente invención demuestran que el uso de este transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) como iniciador en la maduración de quesos permite el desarrollo de un método apropiado para provocar la lisis controlada de adjuntos de elevado potencial peptidásico y un aumento de proteolisis y desarrollo de características organolépticas, mediante la producción de bacteriocina. Además, la utilización de este iniciador no interfere con la correcta acidificación de los quesos. En la presente invención se describe el uso de este transconjugante en conjunción con otros cultivos adjuntos en la elaboración de quesos, Lactococcus lactis ssp. lactis CECT4595 y Lactobacillus casei ssp. casei CECT4598, y forma parte de la presente invención. El interés del empleo de este microorganismo productor de bacteriocina se ve aumentado por el amplio espectro de inhibición de esta bacteriocina frente a microorganismos alterantes y patógenos, lo que le hace idóneo para su empleo como agente conservador. El uso de este transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT 5367), así como cualquier otro microorganismo de características similares obtenido según la presente invención, como iniciador de la maduración de quesos forma parte de la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1.-Caracterización del transconjugante L. Lactis IFPL3593 (CECT 5367)(Bac4) Capacidad de acidificación, producción de lacticina 3147 y espectro de acción frente a patógenos En un proceso previo a la elaboración de quesos, se estudió la capacidad de acidificación y la viabilidad del transconjugante Lactococcus lactis CECT5367 en relación con la cepa parental L. lactis IFPL359 (CECT4478) así como su capacidad de

producción de lacticina 3147 y su espectro de acción frente a patógenos en relación con L. Iactis lFPL105.

En estudios llevados a cabo en leche descremada se observó como un inóculo (4%) de L. lactis IFPL3593 originaba un descenso del pH a las 8 h de incubación de 6.4 a 4.7, similar al obtenido con un inóculo de L. lactis IFPL359 en las mismas condiciones. Además ambos microorganismos presentaron la misma viabilidad celular durante su crecimiento en leche, detectándose únicamente presencia de bacteriocina en la leche inoculada con el transconjugante IFPL3593. También se estudió la capacidad de producción de bacteriocina del transconjugante en caldo MRS (inóculo 4%) en relación con L. Iactis IFPL105, observándose en ambos casos producción de bacteriocina desde el principio de la fase exponencial de crecimiento con un máximo a las 7 horas (400 UA/ml).

Por otra parte, se llevaron a cabo estudios de inhibición durante el crecimiento conjunto en leche de L. lactis IFPL3593 y los adjuntos L. lactis CECT y L. casei IFPL731 (CECT4598) empleados como adjuntos en la elaboración de quesos. Se utilizaron como controles, los crecimientos conjuntos con la cepa parental, L. lactis IFPL359. La presencia de bacteriocina en leche se empezó a detectar durante la fase exponencial de crecimiento de IFPL3593, provocando un descenso de viabilidad de L. casei IFPL731 de 2 unidades log cfu/ml a las 6 horas de detección de la bacteriocina. La pérdida de viabilidad en ambos casos estuvo acompañada de un descenso de D. 0.4ionm de 0.92 unidades para L. lactis CECT4595 y 1.29 para L. casei IFPL73 1, así como por una mayor liberación de actividad intracelular PepX (0.825 y 0.582 respectivamente) en relación con el control.

El espectro de acción de la bacteriocina producida por Lactococcus lactis IFPL3593 frente a patógenos, se estudió utilizando los géneros Clostridium y Listeria como microorganismos indicadores. El estudio de sensibilidad se llevó a cabo midiendo halos de inhibición en placa y disminución de viabilidad durante el crecimiento conjunto en leche de los indicadores con el transconjugante. Al igual que en los estudios realizados con la bacteriocina procedente de Lactococcus lactis IFPL105 [CASLA, D.; Requena, T.; Gómez, R. (1996) Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from goat's milk and artisanal cheeses : characterisitcs of a bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus IFPL105. J. Appl. Bacteriol. 81,35-41], ambas especies patógenas resultaron

sensibles a la bacteriocina, siendo la sensibilidad mayor para listerias que para clostridios. Se utilizó también como microorganismo indicador Staphylococcus atreus cuya sensibilidad no había sido ensayada previamente, resultando ser no sensible a la bacteriocina.

Ejemplo 2.-Elaboración de queso, composición y microbiología Se realizaron por duplicado dos elaboraciones de queso para evaluar el empleo como iniciador del microorganismo transconjugante productor de bacteriocina (CECT 5367), con la finalidad de obtener la lisis celular temprana de adjuntos de elevada actividad peptidásica y, con ello, acelerar la proteolisis sin alterar el proceso.

El cultivo iniciador utilizado en la elaboración de quesos, es el propuesto en la presente invención, compuesto por el transconjugante Lactococcus lactis CECT5367 en una concentración de 0. 8% en la cuba de leche. Se utilizan como adjuntos a este cultivo iniciador, Lactobacillus casei IFPL731 (0.5%) y Lactococcus lactis CECT 4595 desarrollado hasta la mitad de la fase exponencial de crecimiento y añadido junto con el cuajo y el cloruro cálcico en una concentración de 8 log ufc/ml (lote B) Las cepas conservadas en congelación se propagaron en medios específicos inoculados al 1% e incubados a 30° C durante 16 h antes de ser añadidos a la cuba.

Lactococcus lactis CECT5367 se creció en leche en polvo desnatada y reconstituida al 10% ; En el caso de Lactobacillus casei IFPL731 (CECT4598) la leche así reconstituida se suplementó con 1% caseitona, 20 mg/1 sulfato de manganeso y 40 mg/1 formiato sódico. Por su parte, Lactococcus lactis CECT4595 se creció en M-17 con 0.5% glucosa (inóculo 4%) recogiéndose las células una vez alcanzada la fase exponencial (D. O. coo "", = 1) mediante centrifugación a 10.000 x g durante 10 min y a 4° C.

La materia prima utilizada para la fabricación de los quesos a nivel de laboratorio fue leche comercial pasterizada de vaca (10 litros). Después de la coagulación de la leche a 30°C, se procedió al corte de la cuajada con calentamiento a 37°C y se colocó en moldes cilíndricos donde se sometió al proceso de prensado.

Después del salado, los quesos se maduraron a 12°C durante 42 días realizando toma de muestras por triplicado a los 0, 7,18,27 y 42 días. La elaboración de quesos se realizó por duplicado. Se fabricaron quesos control añadiendo el microorganismo parental Lactococcus lactis CECT4478 no productor de bacteriocina como cultivo iniciador (lote A). Los resultados se analizaron estadísticamente.

Composición global Los resultados mostraron que el lote B, en el que se empleó como iniciador el transconjugante productor de la bacteriocina (CECT5367), alcanzó un valor de pH después del prensado (5.3) y a lo largo de todo el período de maduración igual al medido en el control (lote A). Un retraso en la acidificación de la cuajada, con el consiguiente exceso de lactosa residual en el queso, es una de las alteraciones más frecuentes descritas como consecuencia del empleo de bacteriocinas o bien de los microorganismos productores de las mismas como adjuntos [FOX, P. F. ; Wallace, J. M.; Morgan, S. ; Lynch, C. M.; Niland, E. J.; Tobin, J. (1996) Acceleration of cheese ripening.

Antonie van Leeuwenhoek. 70,271-297; MORGAN, S.; Ross, RP.; and Hill, C. (1997) Increasing starter cell lysis in Cheddar cheese using a bacteriocin-producing adjunct. J.

Dairy Sci. 80,1-10; GARDE, S.; Gaya, P.; Medina, M.; Nuñez, M. (1997). Acceleration of flavour formation in cheese by a bacteriocin-producing adjunct lactic culture.

Biotechnol. Lett. 19,1011-1014]. En el presente trabajo, al ser el propio microorganismo encargado de acidificar el que produce la bacteriocina y a la vez es inmune a la misma (Bac+ Imm+), no se observa ningún problema de acidificación.

Por otra parte, la composición química de ambos lotes de quesos no varió significativamente, obteniéndose en el día 0, los siguientes valores medios (expresados como % de muestra) de : materia seca 47.72 (1. 02) y proteína 38.98 (1. 25) (expresados como % de muestra).

Características microbiológicas La Figura 1 muestra los recuentos obtenidos de L. lactis CECT4595 (a) y L. casei IFPL731 (b) en los lotes A y B durante el período de maduración. La viabilidad celular de ambos microorganismos fue significativamente inferior en el lote B (Bac+) durante todo el período estudiado. Esta diferencia en eI día 0 fue de 0.51 unidades log para L. lactis CECT4595 y de 0.96 unidades log para L. casei IFPL731, continuando los recuentos de L. lactis CECT4595 descendiendo acusadamente (0.83 unidades log) hasta el día 7. La mayor pérdida de viabilidad de L. lactis CECT4595 se explicaría por el hecho de haber sido adicionado a la cuba en la fase de máxima sensibilidad a la bacteriocina (fase exponencial de crecimiento). El inóculo inicial del iniciador en los dos lotes fue aproximadamente de 8.2 log cfu/g, y mientras que los recuentos de L.

lactis CECT4478 (lote A) se mantuvieron constantes, los de L. lactis CECT5367 (lote B) descendieron ligeramente durante el período en estudio (7.47 log ufc/g a los 42~días).

Lisis celalar La liberación de actividad intracelular se considera un parámetro indicador de lisis celular [CHAPOT-CHARTIER, M.-P.; Deniel, C.; Rousseau, M.; Vassal, L.; Gripon, J.-C. (1994) Autolysis of two strains of Lactococcus lactis during cheese ripening. Int.

Dairy J. 4,251-2691. En este estudio se analizó la actividad X-prolil dipeptidil aminopeptidasa (PepX) durante el período de maduración. Los resultados se muestran en la Figura 2. Los valores obtenidos fueron significativamente (p< 0.05) superiores en los quesos en los que se empleó como iniciador el transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) (lote B) detectándose material intracelular desde el inicio de la maduración. La mayor actividad se detectó en los días 18 y 27 con un descenso posterior debido posiblemente a la inactivación enzimática descrita por diversos autores [WILKINSON, M. G. ; Guinee, T. P.; O'Callaghan, D. M. ; Fox, P. F. (1994) Autolysis and proteolysis in different strains of starter bacteria during Cheddar cheese ripening. J. Dairy Res 61,249-262]. La detección de actividad intracelular fue simultánea a la pérdida de viabilidad, especialmente para L. lactis CECT4595.

Proteolisis En este trabajo se ha estudiado la evolución de la proteolisis, como índice del proceso de maduración. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para las fracciones nitrogenadas, nitrógeno no caseínico (NNC), nitrógeno no proteico (NNP) y nitrógeno amínico (NA) expresados como % del nitrógeno total (NT) durante el período de maduración estudiado. No se encontraron diferencias significativas, a excepción del día 0, en el contenido en NNC entre los dos lotes a lo largo de la maduración. Esto se explica ya que el principal agente responsable de la hidrólisis inicial de la caseína en el queso es el cuajo y este factor no varía entre ambos lotes.

El contenido en NNP y NA fue superior en el lote B, encontrándose diferencias significativas (p< 0.05) entre ambos lotes a los 18,27 y 42 días de maduración. Al final del período de maduración el contenido en nitrógeno amínico del Lote B fue un 16% superior al del lote control (A). Las-diferencias encontradas respecto al lote control en el contenido en NNP y NA son coincidentes con la mayor actividad intracelular detectada en el lote B al mismo tiempo de maduración, hecho que responde a un efecto lítico de la

bacteriocina producida por el transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) sobre los microorganismos adjuntos sensibles.

Tabla 1.-. Valores NNC, NNP y NA (% NT) en quesos elaborados con L. lactis CECT4478 (Lote A), o con su transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) (Lote B, Bac+) como iniciador durante el periodo de maduración.

Período de maduración 0 días 7 días 18 días 27 días 42 días NNC A 6.29'0.42 9. 19 ~ 0. 55 12. 97 ~ 0. 77 15.11 +0.95 23.81 ~ 1. 33 B 8. 15 ~ 0. 61 10. 41 ~ 0. 44 15.451.11 16.811.00 25.76 0.33 NNP A 2. 87* ~ 0. 74 4. 76 ~ 0. 18 6.58'0.31 8. 32* ~ 0.71 11.07* ~ 0. 77 B 3. 49 ~ 0. 11 5.09 0.25 8. 59 ~ 0. 48 12. 10 ~ 1. 28 14.95 0. 72 NA A 0.28+0. 01 0.67 0.09 1.42'0.02 1. 98* ~ 0. 02 2.52* 0.04 B 0. 28 ~ 0. 07 0.71 ~ 0. 01 1.61 ~ 0. 01 2. 28 ~ 0. 03 3. 04 ~ 0. 06 Los valores son la media de seis medidas independientes en los dos ensayos independientes. Un asterisco indica una diferencia significativa (P< 0.05) entre los lotes A y B en el mismo periodo de maduración.

La lisis bacteriana producida por la bacteriocina favorece el acceso de las peptidasas intracelulares a sus sustratos siendo la responsable del incremento de las fracciones nitrogenadas de bajo peso molecular. Estas fracciones compuestas mayoritariamente por péptidos y aminoácidos, intervienen en el sabor básico del queso y son precursores de otros compuestos responsables del aroma [FOX P. F.; Wallace, J. M. (1997) Formation of flavour compounds in cheese. En : Advances in Applied Microbiology. Vol 45, pp. 17-85 (Ed. Academic Press). New York, USA; MCSWEENY, P. L. H.; Sousa, M. J. (2000) Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening : A review. Lait 80, 293-324.] por lo que inciden en el desarrollo de las características organolépticas del producto final.

Análisissensorial Se evaluaron las dos propiedades más significativas en relación a la proteolisis secundaria. Los resultados del análisis sensorial a los 27 y 42 dias de maduración, se muestran en la Tabla 2. El empleo como iniciador del transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) productor de bacteriocina, aumentó de forma significativa (p< 0.05) el sabor de los quesos a los 27 días de maduración. Este desarrollo más rápido del sabor básico del queso coincidió con el aumento de NNP y NA en los quesos elaborados con el transconjugante.

No obstante, el aumento en el sabor del queso no fue acompañado de un incremento significativo en la intensidad del aroma hasta los 42 días de maduración, tiempo necesario para que se produzcan las reacciones de conversión de aminoácidos en compuestos responsables del aroma como ácidos orgánicos, aminas, aldehídos ó alcoholes. Las enzimas responsables de estas transformaciones son intracelulares y por el momento no está claro cual es el papel que juega la lisis bacteriana en su actividad.

Por ello, para lograr un correcto control de la maduración del queso, es necesario obtener un balance de células enteras-células lisadas que permita equilibrar el desarrollo del sabor y aroma del mismo [URBACH, G. (1995) Contribution of lactic acid bacteria to flavour compound formation in dairy products. Int. Dairy. J. 5, 877-903] Tabla 2.-Evaluación sensorial de quesos elaborados con L. lactis CECT4478 (Lote A), o con su transconjugante L lactis IFPL3593 (CECT5367) (Lote B, Bac+) como iniciador.

Período de maduración 27 días 42 días A B A B Intensidad aroma 4.93 0. 402 4.93 t 0. 381 3.63 0.664 5.36 0. 337 Sabor a queso 3.45 +0.637 5.27 0.406 3. 55* ~ 0. 412 5. 44 ~ 0. 529 Los valores son la media de seis medidas independientes en los dos ensayos independientes. Un asterisco indica una diferencia significativa (P< 0.05) entre los lotes A y B en el mismo periodo de maduración.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1.-Viabilidad celular de L. lactis ssp lactis CECT4595 (Lac Prt) (a) y L. casei ssp. casei IFPL 731 (CECT4598) (b) en los quesos elaborados empleando como cultivo iniciador L. lactis ssp. lactis CECT4478 (A, ), o su transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) (pBAC105) (B, #). Los recuentos se realizaron por triplicado mostrándose las barras de error standard (p< 0.05).

Figura 2.-Liberación de la actividad PepX, expresada como mU/ml (µmol/min/ml x 103), en los quesos elaborados empleando como cultivo iniciador L. lactis ssp. lactis CECT4478 (A, barra blanca), o su transconjugante L. lactis IFPL3593 (CECT5367) (pBAC105) (B, barra rallada) Las medidas de la actividad PepX se realizaron por triplicado, indicándose en la figura el error standard (p<0.05).