DOMAINE DE L’INVENTION

[0001] La présente invention concerne de nouvelles protéines de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique à la bactérie Staphylococcus aureus et leurs utilisations dans la capture, la détection ou la quantification de bactéries spécifiques de l’espèce Staphylococcus aureus dans un échantillon. En particulier, lesdites protéines RBP selon la présente invention reconnaissent au moins 90% des souches de Staphylococcus aureus testées dans un test ELISA direct et ne reconnaissent pas des souches de Staphylocoques non aureus.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE

[0002] Les infections bactériennes sont responsables de nombreuses pathologies. De plus, l’émergence de bactéries multirésistantes pour lesquelles les traitements antibiotiques se montrent parfois peu efficaces incitent à la recherche de nouvelles solutions pour détecter mais aussi traiter les infections bactériennes, que ce soit en médecine humaine ou en médecine vétérinaire.

[0003] Dans le milieu d’élevage, il est essentiel de développer des méthodes de détection rapide afin de traiter et prévenir les infections bactériennes. Cependant, à ce jour, aucune méthode de détection n’est pleinement satisfaisante.

[0004] Par exemple, les dispositifs de diagnostic présents sur le marché, notamment, les dispositifs de détection de la mammite sont principalement basés sur le dépistage des cellules somatiques qu’on retrouve dans le lait. Or, cette méthode ne permet pas d’identifier la ou les bactérie(s) responsable(s) de l’infection. D’autre part ces dernières peuvent constituer une trace d’une infection plus ou moins ancienne et donc constituer un indicateur non-spécifique d’une infection en cours. Cela conduit donc les éleveurs à utiliser des antibiothérapies de façon massive et non ciblée. [0005] D’autres méthodes de détection des bactéries peuvent être utilisées telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou la méthode de culture. Toutefois, celles-ci nécessitent d’envoyer les échantillons au laboratoire et donc l’intervention de personnes qualifiées pour mettre en œuvre la méthode de détection et pour analyser les résultats. [0006] De plus, l’utilisation de la méthode de culture nécessite un temps d’incubation de

24h à 48h, ce qui représente une attente trop longue des résultats, compte tenu des enjeux du secteur. Concernant l’approche par la biologie moléculaire (PCR et/ou PCR quantitative), bien que plus rapide et plus spécifique, celle-ci est bien plus onéreuse. De plus, la technique de PCR détecte seulement la présence d’ADN des bactéries et non la présence de bactéries viables, ce qui peut entraîner la détection de faux positifs (bactéries mortes et déjà prises en charge par le système immunitaire de l’hôte).

[0007] Ces méthodes ont donc pour inconvénients d’être longues, fastidieuses, de mettre en œuvre des composés chimiques souvent toxiques pour le manipulateur et pour l’environnement, de nécessiter des matériels coûteux, tels que des hottes aspirantes, des centrifugeuses, l’appareil de la PCR en temps réel etc., et d’être mises en œuvre dans des locaux adaptés, tels que des laboratoires. Elles ne répondent pas aux besoins des utilisateurs de terrain, notamment des éleveurs.

[0008] Il existe donc un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries rapide, peu coûteuse, peu nocive pour le manipulateur et pour l’environnement, et ne nécessitant pas la contrainte d’une mise en œuvre dans un laboratoire dédié.

[0009] Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection « universelle » de bactéries, quelle que soit la nature de l’échantillon d’origine contenant lesdites bactéries. [0010] Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection spécifique et sensible d’un large spectre de bactéries de l’espèce Staphylococcus aureus (S. aureus ), en particulier qui ne reconnaissent pas les autres espèces du genre Staphylococcus . [0011 ] Une telle méthode de détection de bactéries pourra également être appliquée dans différents domaines comme par exemple dans la sécurité alimentaire, le contrôle des eaux ou en santé humaine.

[0012] L’utilisation des protéines de phages, en particulier des protéines de liaison au récepteur de phage (RBP), apparaît comme une solution prometteuse. En effet, les RBP assurent le contact initial avec le récepteur sur l'enveloppe de la cellule hôte, et participent donc à la reconnaissance spécifique d’un phage.

RÉSUMÉ

[0013] Dans un premier aspect, la présente divulgation a pour objet une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0014] Les inventeurs ont en effet identifié une famille de protéines RBP, présentant toute une séquence consensus SEQ ID NO :3 et au moins 87%, voire au moins 89% d’identité avec la séquence de RBP du phage Phi5 de séquence SEQ ID NO : 1, ayant la particularité avantageuse de reconnaître spécifiquement une majorité de souches de bactéries de l’espèce Staphylococcus aureus , typiquement au moins 80% des souches testés, par exemple au moins 90% des souches testés, avec une haute sensibilité et un excellente spécificité. [0015] Aussi, dans un aspect particulier, une RBP selon la présente divulgation comprend la séquence TNAVMQSFW (SEQ ID NO : 3). Dans un mode de réalisation plus particulier, une RBP selon la présente divulgation comprend la séquence TNAVMQSFW (SEQ ID NO :3) et présente au moins 87% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1. [0016] Dans un aspect particulier, qui peut être combiné avec les aspects précédents, une

RBP selon la présente divulgation comprend une séquence ayant au moins 92%, préférentiellement au moins 95%, préférentiellement au moins 97%, plus préférentiellement au moins 99% avec la séquence SEQ ID NO : 1, ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0017] Dans un aspect particulier, qui peut être combiné avec les aspects précédents, une RBP selon la présente divulgation comprend une séquence ayant au moins 92%, préférentiellement au moins 95%, préférentiellement au moins 97%, plus préférentiellement au moins 99% avec l’une au moins des séquences SEQ ID NO : 5, 6, 7 ou 8, et, de préférence elle comprend en outre la séquence consensus SEQ ID NO :3.

[0018] La présente divulgation concerne également l’utilisation de la RBP pour la capture de la bactérie S. aureus dans un échantillon, en particulier une RBP comme décrit précédemment.

[0019] Dans un aspect particulier, la présente divulgation concerne l’utilisation d’une RBP couplée à une autre molécule notamment pour la capture, la détection et/ou la quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon, et notamment de différentes souches de bactéries de l’espèce S. aureus. [0020] Dans un autre aspect, la présente divulgation concerne un procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon, comprenant les étapes de mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec un dispositif d’immuno-détection, sur lequel est fixé un ligand (A) reconnaissant la bactérie, optionnellement, l’élimination des bactéries non liées au ligand (A), la détection des bactéries liées au ligand (A) à l’aide d’une solution comprenant un composé (B) qui peut être un ligand reconnaissant la bactérie ou une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie, dans lequel l’un au moins du ligand (A) ou composé (B) reconnaît spécifiquement la bactérie S. aureus , et dans lequel le ligand (A) et composé (B) sont respectivement : soit (i) une RBP telle que décrite ci-dessus et un ligand reconnaissant la bactérie S. aureus, spécifiquement ou non, par exemple un anticorps monoclonal ou polyclonal, (ii) une RBP telle que décrite ci-dessus et une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie, (iii) un ligand spécifique de la bactérie S. aureus et une RBP telle que décrite ci-dessus, ou (iv) une RBP telle que décrite ci-dessus, identiques ou différents pour le ligand (A) et le composé (B). [0021] Dans un aspect plus particulier, le procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus met en œuvre le composé (B) qui est couplé directement à un marqueur.

[0022] Dans un aspect plus particulier, le procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus met en œuvre le composé (B) qui est couplé indirectement à un marqueur à l’aide d’une ou plusieurs molécule(s).

[0023] Dans un aspect plus particulier, le procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus met en œuvre le ligand (A) qui est une RBP immobilisée sur le dispositif d’immuno-détection en présence d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine. [0024] Dans un aspect plus particulier, le procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus met en œuvre le ligand (A) qui est une RBP couplée directement ou indirectement à un marqueur et le composé (B) est un anticorps immobilisé sur le dispositif d’immuno-détection.

[0025] Dans une mise en œuvre particulière, ladite solution dudit procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus comprend une protéine qui est une protéine de lait en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine de sérum, plus particulièrement de sérum de poulet ou un anticorps.

[0026] Dans une mise en œuvre particulière, ladite solution dudit procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus comprend un cation qui est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation tri valent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , Fe ²⁺ , Fe ³⁺ , K ⁺ , Zn ⁺ , Au ³⁺ , Cu ⁺ , carbocation, Mn ⁺ , Ag ⁺ , MgSCri, NaiSCri, MgCh, CaCh, CaSCri, K2SO4, KC1 ouNaCl.

[0027] Dans une mise en œuvre particulière, ladite solution dudit procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus a une concentration en cation, en particulier NaCl, dans la solution qui est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et une concentration en protéine, en particulier en BSA, dans la solution qui est comprise entre 5 pg/mL et 5 mg/mL de façon inclusive. [0028] Dans une mise en œuvre particulière, le procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus est mis en œuvre dans un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration.

[0029] Dans un autre aspect, la présente divulgation a pour objet un dispositif choisi parmi une plaque de microtitration ou une bandelette comprenant un support solide sur lequel est fixée la RBP selon la présente divulgation, le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium.

[0030] Dans un autre aspect, la présente divulgation a pour objet l’utilisation du dispositif selon l’invention, pour la détection et/ou la quantification de la bactérie S. aureus.

DÉFINITIONS

[0031] Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : [0032] “Bandelette” : désigne un dispositif de détection par chromatographie à flux latéral, également connu sous le nom d’immunochromatographie à flux latéral. C’est une méthode reposant sur le mouvement d’un échantillon liquide par capillarité à travers une bandelette. Elle a précédemment été décrite pour la détection immunologique d’un analyte d’intérêt dans un échantillon liquide, grâce à un anticorps primaire et un anticorps secondaire (EP1086372B1). Ce sont de simples dispositifs à base de papier destinés à détecter la présence (ou l'absence) d'un analyte cible dans un échantillon liquide (matrice).

[0033] Par « protéine », on entend toute chaîne d’acides aminés, peptide, polypeptide ou protéine, ou des complexes de chaînes d’acides aminés notamment liés par des interactions non-covalentes ou covalentes. Cela comprend des protéines naturelles, qui sont produites naturellement par un organisme non modifié par l’homme, ou artificielle (par exemple protéine recombinante ou protéine de fusion). Le terme « protéine » inclut également d’éventuelles modifications chimiques naturelles (par exemple modifications post-traductionnelles) ou non-naturelles, telles que la glycosylation ou la pégylation de ces protéines, ou la conjugaison de ces protéines à un groupement chimique non protéique, par exemple en vue de son marquage.

[0034] “Protéine de liaison au récepteur (RBP) (Receptor Binding Protein) d’un bactériophage” : concerne les protéines qui assurent le contact initial avec le récepteur sur l'enveloppe de la cellule hôte. En effet, celles-ci sont capables de reconnaître des motifs cibles à la surface des bactéries. Au sens de la présente demande, une RBP d’un bactériophage spécifique d’une bactérie est une RBP capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode ELISA telle que décrite dans la présente demande. [0035] Les protéines RBP sont différentes des domaines de liaison à la paroi cellulaire

(CBD, Cell Binding Domain). Les RBP sont impliquées dans la première étape du cycle d’infection des phages, alors que les CBD sont impliquées en fin du cycle d’infection. Les CDB sont des domaines protéiques retrouvés dans des enzymes lytiques produites par les phages, qui permettent la reconnaissance des peptidoglycanes dans les parois cellulaires. Par exemple, l’endolysine est une enzyme produite au stade final du cycle lytique pour cliver la paroi cellulaire bactérienne et libérer le virion descendant. Les endolysines ciblant les bactéries Gram-positives ont généralement une structure modulaire comprenant un domaine enzymatiquement actif (EAD) pour l'hydrolyse et un domaine de liaison à la paroi cellulaire (CBD) pour la reconnaissance des peptidoglycanes.

[0036] “Phage” ou “bactériophage” : concerne des virus infectant les bactéries. Ils sont abondants dans la nature. Les phages sont connus pour leur spécificité : c’est-à-dire qu’un phage ne peut infecter toutes les bactéries, mais il peut infecter certaines souches bactériennes au sein de la même espèce. [0037] « Phage 5 » ou « Phi5 » ou « Phil5 » ou « F5 » : sont utilisés indifféremment dans le cadre de la présente invention pour désigner le phage spécifique de la bactérie S. aureus déposé auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 sous le numéro CNCM 1-5680 par la société VETOPHAGE SAS. [0038] “Plaque de microtitration” : désigne un dispositif comprenant un ensemble de puits, il s’agit d’un outil standard dans la recherche et l'analyse clinique des tests de diagnostic des laboratoires. Leur utilisation est très fréquente dans l'Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). [0039] « Fixation », « immobilisation » ou « capture » : sont utilisés indifféremment.

L'immobilisation peut être réalisée par exemple par adsorption ou par liaison covalente. Ce qui est important à cet égard, c'est l'immobilisation fonctionnelle, c'est-à-dire que les RBP aient des structures accessibles aux bactéries, malgré la liaison au matériau de support. [0040] « Couplé » ou « conjugué » : sont utilisés indifféremment lorsqu’il s’agit d’un élément (protéine, bactérie, molécule). Pour les applications de détection, la conjugaison avec une autre molécule peut être détectée visuellement ou à l’aide d’un appareil. Le marqueur (i.e. élément qui permet la détection) est utilisé pour marquer une bactérie ou une molécule ou protéine comme une RBP. Dans le cadre de la présente invention, le couplage peut être réalisé par la fixation directe ou indirecte d’une molécule de détection sur la RBP. Les RBP selon la présente divulgation peuvent également être conjuguées ou couplées avec d’autres molécules comme des molécules thérapeutiques. Les RPB peuvent éventuellement être sous la forme de protéines recombinantes lors de la production de la protéine ; elles sont fusionnées à un Tag (étiquette), par exemple un Histidine-Tag ou GST (Glutathion S-transférase).

[0041] “Spécifique de la bactérie Staphylococcus aureus (S. aureus) ” : signifie que la protéine de phage ou le phage reconnaît (i.e. ne se lie) uniquement des bactéries ou une proportion majeure (par exemple au moins 80% voire au moins 90% des souches testées) de l’espèce Staphylococcus aureus (S. aureus) et ne reconnaît pas d’autres bactéries d’autres genres ou, notamment d’autres bactéries du genre Staphylococcus d’autres espèces (i.e. Staphylococcus non aureus).

[0042] “ Identique” ou “ Identité” : lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences d'acides aminés, ce terme fait référence au degré de parenté de séquence entre les séquences d'acides aminés, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux ou plusieurs résidus d'acides aminés. L'identité mesure le pourcentage de correspondances identiques entre les plus petites séquences de deux ou plusieurs séquences, dont les alignements « à trous » (le cas échéant) sont traités par un modèle mathématique ou un programme informatique particulier (c'est-à-dire des "algorithmes"). L'identité de séquences d'acides aminés apparentées peut être facilement calculée par des méthodes connues par l’Homme du métier. Les méthodes préférées pour déterminer l'identité de séquences sont conçues pour donner la plus grande correspondance entre les séquences testées. Les méthodes de détermination de l'identité entre séquences sont décrites dans des programmes informatiques accessibles au public. A titre d’exemple, on pourra utiliser l’algorithme de comparaison de séquences d’acides aminés fourni avec le logiciel Clustal Oméga (http ://www. clustal . org / oméga/).

[0043] “ Immuno-détection” : est entendue comme toute technique d'analyse par réaction entre antigènes et ligand où des enzymes ou des radio-isotopes sont utilisés comme marqueurs, l’antigène étant une bactérie ou une protéine de bactérie et le ligand étant une protéine de phage. Les techniques d’ immuno-détection les plus communément utilisés sont des bandelettes pour une détection de flux latérale (LFA) ou la technique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE Protéine de liaison au récepteur (RBP)

[0044] Un premier aspect de la présente divulgation concerne une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% d’identité, par exemple au moins 87 % ou 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et leurs utilisations comme décrites dans les prochaines sections.

[0045] Selon un mode de réalisation, ladite protéine RBP comprend la séquence SEQ ID NO :3. [0046] Selon un mode de réalisation, ladite RBP comprend une séquence ayant au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :8, et de préférence au moins 87% ou 89% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1. [0047] Selon un mode de réalisation, ladite RBP comprend une séquence ayant au moins

70, 80, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :8, de préférence au moins 87% ou 89% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1, et elle comprend en outre la séquence SEQ ID NO :3. [0048] Selon un mode de réalisation, ladite RBP comprend une séquence ayant au moins

91%, préférentiellement au moins 95%, préférentiellement au moins 97%, plus préférentiellement au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 et, de préférence, elle comprend la séquence SEQ ID NO :3.

[0049] Selon un mode de réalisation, ladite RBP comprend une séquence ayant au moins 95% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. Selon un mode de réalisation, ladite

RBP comprend une séquence ayant au moins 95, 97 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, et de préférence, elle comprend la séquence SEQ ID NO :3.

[0050] Selon un mode de réalisation, ladite RBP consiste en la séquence SEQ ID NO : 1 [0051] Selon un mode de réalisation, ladite RBP consiste en la séquence SEQ ID NO :

5. Selon un mode de réalisation, ladite RBP consiste en la séquence SEQ ID NO : 6. Selon un mode de réalisation, ladite RBP consiste en la séquence SEQ ID NO : 7. Selon un mode de réalisation, ladite RBP consiste en la séquence SEQ ID NO :8.

[0052] Selon un mode de réalisation, ladite RBP est spécifique de la bactérie S. aureus. [0053] Selon un mode de réalisation, ladite RBP reconnaît au moins une souche de S. aureus sélectionnée dans le groupe comprenant ou consistant en 79, 3, 81, 5396, 7918, 8537, 14Cal, lDa2, 4FC, 50D, 5Sd, 8M, 9La, a, C24b, FIA, F2A, F2B, F4F, F6D, F 8 A, F8D, G6B, Lia, Lca, Moq, 0215, Q12b, Q14b, R8C1, SI, U4ab etZ12c2b. [0054] Selon un mode de réalisation, ladite RBP ne reconnaît pas la bactérie S. agnetis, la bactérie S. epidermis , la bactérie S. saprophyticus , la bactérie S. haemolyticus , la bactérie S.chromogenes, la bactérie E. coli et/ou la bactérie Streptococcus uberis.

[0055] Selon un mode de réalisation, ladite RBP est couplée à une molécule. [0056] Selon un mode de réalisation, ladite RBP est couplé avec un marqueur tel que défini ci-dessous. Selon un mode de réalisation, ladite RBP est couplée ou fusionnée à une étiquette (TAG), par exemple un Histidine-TAG ou GST (Glutathion S-transférase).

[0057] Dans un aspect particulier, la RBP selon la présente divulgation est caractérisée par la présence de son site actif défini par SEQ ID NO : 3. En effet, toute modification de ce site conduit à une modification de la fonctionnalité de la protéine et notamment à la suppression de la liaison spécifique du phage avec la bactérie. Ainsi, selon un mode de réalisation, ladite RBP comprend la séquence TNAVMQSFW (SEQ ID NO : 3).

[0058] Des exemples représentatifs de ces protéines RBP notamment pour les utilisations selon la présente divulgation sont décrits dans le tableau 1 ci-dessous, ainsi que dans les exemples :

[0059] Tableau 1 : Protéines RBP de référence

[0060] La présente divulgation comprends en outre des variants fonctionnels de l’une des protéines RBP de référence de séquence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :8, ces variants fonctionnels se distinguant des protéines RBP de référence par une ou plusieurs mutations d’acides aminés, par délétion, addition et/ou substitution d’acides aminés, de préférence par substitution d’un ou plusieurs acides aminés en comparaison avec l’une des protéines RBP de référence, par exemple substitution d’au plus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés par rapport à la séquence de la protéine de référence. En particulier, les modifications sont choisies parmi les résidus qui ne sont pas conservés entre les protéines SEQ ID NO :1, SEQ ID NO ; 5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :8. Les résidus conservés entre les 5 protéines de références sont signalés par une astérisque ‘*’ sur la figure 15 présentant G alignement des séquences des 5 protéines RBP de référence. De préférence, le variant comprend uniquement des substitutions conservatrices d’acides aminés, c’est à dire la substitution d’un acide aminé par un acide aminé de même classe. Dans le contexte de la présente divulgation, les classes d’acides aminés peuvent être comme suit :

[0061] Résidus aliphatiques : I, L, V et M,

[0062] Résidus associés à des cylco-alkényles : F, H, W and Y,

[0063] Les résidus hydrophobiques : A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, et Y,

[0064] Les résidus polaires : C, D, E, H, K, N, Q, R, S et T,

[0065] Les résidus chargés positivement : H, K, et R,

[0066] Les petits résidus : A, C, D, G, N, P, S, T et V,

[0067] Les très petits résidus : A, G et S,

[0068] Les résidus flexibles : Q, T, K, S, G, P, D, E et R.

[0069] Par variant fonctionnel, on entend une protéine RBP présentant une séquence d’acides aminés différentes des protéines RBP de référence de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8, et qui maintient la capacité de reconnaissance spécifique de S .aureus avec une spécificité de reconnaissance des souches de l’espèce S. aureus au moins identique à la protéine de référence de SEQ ID NO : 1, 5, 6, 7 ou 8, par exemple tel que mesuré avec un test ELISA et/ou appliqué à des souches de S. aureus comme décrit en Exemple.

[0070] Dans un mode de réalisation particulier, un variant fonctionnel reconnaît au moins les souches 79, 3, 81, 5396, 7918, 8537, 14Cal, lDa2, 4FC, 50D, 5Sd, 8M, 9La, a, C24b, FIA, F2A, F2B, F4F, F6D, F8A, F8D, G6B, Lia, Lca, Moq, 0215, Q12b, Q14b, R8C1, SI, U4ab et Z12c2b de l’espèce S. aureus, en particulier avec un test ELIS A comme décrit en exemple.

[0071] Selon un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec le précédent, un variant fonctionnel ne reconnaît pas la bactérie S. agnetis , la bactérie S. epidermis , la bactérie S. saprophyticus , la bactérie S. haemolyticus , la bactérie S.chromogenes, la bactérie E. coli et/ou la bactérie Streptococcus uberis.

[0072] Dans un mode de réalisation, un variant fonctionnel de l’une des protéines RBP de référence est un variant qui ne comprends que des mutations par substitution conservatrice par rapport à la séquence d’une protéine de référence RBP telles que figurant dans l’alignement de la figure 15 par le symbole « : ».

[0073] Les protéines RBP selon la présente divulgation peuvent être le cas échéant sous la forme de protéine de fusion, par exemple en fusion avec une séquence peptidique de purification de type Histidine-Tag ou GST. La protéine RBP peut comprendre en outre une séquence signal pour la sécrétion de la protéine RBP après son expression dans un système d’expression procary ote ou eucaryote, de préférence procary ote, par exemple bactérien, type Escherichia coli.

[0074] La présente divulgation porte également sur les acides nucléiques comprenant une séquence codant une protéine RBP selon la présente divulgation, et en particulier une séquence codant une protéine RBP de séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8, ou l’une de ses variantes fonctionnelles. Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites séquences d’acide nucléique codant une protéine RBP selon la présente divulgation, sont choisies parmi les séquences SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 ou SEQ ID NO :12. Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites séquences d’acide nucléique codant une protéine RBP selon la présente divulgation, présente au moins 70%, de préférence au moins 80%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou encore au moins 99% d’identité avec l’une au moins des séquences SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO :12. [0075] La présente divulgation porte également sur des vecteurs d’expression, par exemple, plasmide, pour l’expression de protéines RBP selon la présente divulgation, ledit vecteur d’expression comprenant au moins une séquence codant une protéine RBP selon la présente divulgation comme décrit ici, sous contrôle d’un promoteur adapté au système de production. La présente divulgation concerne un système de production, en particulier une bactérie, type Escherichia coli , comprenant un vecteur d’expression, pour la production de la protéine RBP selon la présente divulgation.

Utilisation de la protéine de liaison au récepteur (RBP)

[0076] La présente divulgation concerne l’utilisation de la protéine RBP, notamment l’utilisation de l’une des protéines RBP de référence reconnaissant spécifiquement Staphylococcus aureus, et les variantes fonctionnelles de ces protéines RBP de référence, telles que décrites précédemment.

[0077] La RBP peut être utilisée de différentes façons :

[0078] Ainsi, la RBP peut être utilisée selon la présente divulgation pour la capture d’une bactérie du genre Staphylococcus , et notamment la capture spécifique de bactéries de souches de l’espèce S. aureus, notamment lorsqu’elles sont présentes dans un échantillon. Dans une mise en œuvre particulière, la RBP selon la présente divulgation est utilisée pour la capture d’une bactérie du genre Staphylococcus, notamment la capture spécifique de souches de bactéries de l’espèce S. aureus sur un support (Figure 1 A). [0079] Par exemple, la RBP peut être couplée à une autre molécule, comme un anticorps ou une molécule permettant sa détection, l’ensemble étant utilisé pour la capture ou la liaison d’une bactérie du genre S. aureus (Figure IB).

[0080] Dans un autre exemple d’utilisation (Figure IC), une RBP peut être utilisée pour la capture d’une bactérie du genre Staphylococcus, notamment pour la capture de souches de bactéries spécifiques de l ’ espèce S. aureus sur un support et une seconde protéine RBP (couplée à une autre molécule (substrat, enzyme ou autre molécule)) permet une détection de la RBP. [0081] Ainsi, la présente divulgation a pour objet rutilisation de la RBP pour la capture de la bactérie S. aureus dans un échantillon, en particulier la capture spécifique de souches de G espèce S. aureus.

[0082] Ainsi, la présente divulgation a pour objet rutilisation de la RBP couplée à une autre molécule notamment pour la détection et/ou la quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon, en particulier la capture spécifique de souches de l’espèce S. aureus.

[0083] Dans certains modes de réalisation particuliers, la RBP peut être conjuguée avec une molécule qui permet la détection de la bactérie liée avec la RBP, on pourra citer à titre d’exemple des anticorps ou les molécules utilisées comme marqueurs tels que décrits ci-dessous.

[0084] Les protéines RBP de référence et leurs variantes fonctionnelles telles que décrites dans les paragraphes précédents sont avantageusement sélectionnées en vue des utilisations décrites ici.

[0085] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1, 5, 6, 7 ou 8, et, de préférence, comprenant en outre la séquence SEQ ID NO :3.

[0086] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP, notamment une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, 5, 6, 7, ou 8, et, de préférence, elle comprend en outre la séquence SEQ ID NO :3.

[0087] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et de préférence, comprenant en outre la séquence SEQ ID NO :3. [0088] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP, notamment d’un bactériophage spécifique de S. aureus , pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, et de préférence, comprenant en outre la séquence SEQ ID NO :3.

[0089] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP, notamment d’un bactériophage spécifique de S. aureus , pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, 5, 6, 7 ou 8, et, de préférence elle comprend en outre la séquence SEQ ID NO :3.

[0090] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP, notamment d’un bactériophage spécifique de S. aureus , pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 1, 5, 6, 7 ou 8, et de préférence elle comprend en outre la séquence SEQ ID NO :3. Capture de la bactérie

[0091] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP telle que décrite précédemment, pour la capture de la bactérie S. aureus.

[0092] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0093] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0094] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0095] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0096] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0097] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :1 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0098] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :5 ou l’un de ses variants fonctionnels, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, pour la capture de S. aureus.

[0099] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :6 ou l’un de ses variants fonctionnels, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, pour la capture de S. aureus.

[0100] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :7 ou l’un de ses variants fonctionnels, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7, pour la capture de S. aureus.

[0101] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :8 ou l’un de ses variants fonctionnels, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8, pour la capture de S. aureus.

[0102] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 1, pour la capture de S. aureus.

[0103] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, pour la capture de S. aureus.

[0104] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, pour la capture de S. aureus.

[0105] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 7, pour la capture de S. aureus. [0106] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, pour la capture de S. aureus.

[0107] Selon un mode de réalisation, la bactérie S. aureus est capturée sur un support solide. [0108] Selon un mode de réalisation, la RBP telle que décrite précédemment est immobilisée sur un support solide, permettant ainsi la capture de la bactérie sur ledit support. [0109] L'immobilisation, ou liaison de la RBP est un des aspects de la présente divulgation. Ce qui est important à cet égard, c'est l'immobilisation fonctionnelle, c'est-à- dire que les RBP aient des structures accessibles aux bactéries, malgré la liaison au matériau de support. [0110] Pour supprimer une réaction non spécifique des bactéries à étudier avec le matériau du support, il est possible de mettre en œuvre notamment préalablement au couplage ou postérieurement au couplage de la RBP sur un support solide, un blocage avec une protéine, notamment de l’albumine de sérum bovin ou des substances similaires connues, comme par exemple du lait en poudre ou encore un anticorps non spécifique de la bactérie.

[0111] L'immobilisation peut être obtenue sur un support nu ou sur un support enduit avec une protéine et notamment l’albumine ou un anticorps.

[0112] Ces supports peuvent être produits, préalablement à leur utilisation et être stockés en vue de leur utilisation. [0113] Selon un mode de réalisation, ledit support est une plaque de microtitration, une bandelette, une lame, une plaquette, un matériau filtrant ou une chambre cellulaire à flux continu. Selon un mode de réalisation, ledit support solide est constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium. Selon un mode de réalisation, ledit support est préalablement enduit d’une protéine, préférentiellement l’albumine ou un anticorps.

Détection

[0114] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une protéine RBP telle que décrite précédemment, pour la détection et/ou la quantification de la bactérie S. aureus. [0115] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus. [0116] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0117] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus. [0118] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0119] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0120] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :1 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0121] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :5 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus. [0122] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :6 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0123] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :7 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0124] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :8 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0125] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 1, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0126] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0127] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus. [0128] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 7, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus. [0129] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, pour la détection et/ou la quantification de S. aureus.

[0130] Selon un mode de réalisation, la RBP telle que décrite précédemment est couplée à une autre molécule, par exemple un marqueur tel que décrit ci-dessous, pour détecter et/ou quantifier la bactérie S. aureus.

[0131] Selon un mode de réalisation, la RBP telle que décrite précédemment est couplée à la HRP via un complexe biotine-streptavidine, permettant ainsi de détecter et/ou quantifier la bactérie en présence du substrat de la HRP (par exemple TMB). Dispositif d ’immuno-détection

[0132] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP telle que décrite précédemment, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0133] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1, dans un dispositif d’immuno- détection.

[0134] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID

NO : 1 dans un dispositif d’immuno-détection.

[0135] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% avec la séquence SEQ ID NO : 1 dans un dispositif d’immuno- détection.

[0136] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 dans un dispositif d’immuno-détection.

[0137] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 dans un dispositif d’immuno-détection.

[0138] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :1 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0139] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :5 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0140] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :6 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0141] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :7 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0142] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus de séquence SEQ ID NO :8 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0143] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 dans un dispositif d’immuno-détection.

[0144] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, dans un dispositif d’immuno-détection. [0145] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0146] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 7, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0147] La présente divulgation concerne également l’utilisation d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, dans un dispositif d’immuno-détection.

[0148] Selon un mode de réalisation, la RBP telle que décrite précédemment est utilisée dans un dispositif d’immuno-détection pour détecter et/ou quantifier la bactérie S. aureus.

[0149] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif d’immuno-détection est une bandelette ou une plaque de microtitration, de préférence une plaque de microtitration pour un test ELISA.

[0150] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif est un dispositif tel que décrit ci- dessous. [0151] La présente divulgation concerne également utilisation d’une RBP telle que décrite précédemment dans un test ELISA. Selon un mode de réalisation, ledit test est un test tel que décrit ci-dessous.

[0152] Selon un premier mode de réalisation, un anticorps S. aureus couplé avec un marqueur (directement ou indirectement via une autre molécule) est utilisé pour marquer la bactérie et une RBP telle que décrite précédemment est utilisée pour capturer la bactérie.

[0153] Selon un deuxième mode de réalisation, une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur est utilisée pour marquer la bactérie et un anticorps S. aureus est utilisée pour la capture de la bactérie.

[0154] Selon un troisième mode de réalisation, une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur est utilisée pour marquer la bactérie et une RBP telle que décrite précédemment est utilisé pour capturer la bactérie.

Dispositif [0155] La présente divulgation concerne également un dispositif d’immuno-détection comprenant la RBP telle que décrite précédemment, et en particulier l’une des protéines RBP de référence de séquence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :8 ou leurs variantes fonctionnelles. Selon un mode de réalisation, ledit dispositif est utilisé pour détecter et/ou quantifier la bactérie S. aureus. [0156] La présente divulgation concerne également un dispositif d’immuno-détection comprenant une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1. Ladite protéine RBP est ainsi utilisée avantageusement comme moyen pour la détection spécifique de bactérie de l’espèce Staphylococcus aureus.

[0157] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1

[0158] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0159] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. [0160] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0161] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend un variant fonctionnel d’une protéine RBP de référence, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0162] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend un variant fonctionnel d’une protéine RBP de référence, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5.

[0163] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend un variant fonctionnel d’une protéine RBP de référence, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6. [0164] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend un variant fonctionnel d’une protéine RBP de référence, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7. [0165] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend un variant fonctionnel d’une protéine RBP de référence, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8. [0166] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 1.

[0167] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 5.

[0168] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 6.

[0169] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 7.

[0170] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif comprend une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , consistant en la séquence SEQ ID NO : 8. [0171] Selon un mode de réalisation, ladite RBP est fixée sur un support solide dudit dispositif. Selon un mode de réalisation, le support est une plaque de microtitration, une bandelette, une lame, une plaquette, un matériau filtrant ou une chambre cellulaire à flux continu. Selon un mode de réalisation, le support est préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium.

Système LFA (bandelette)

[0172] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du dispositif d’immuno- détection comme décrit précédemment, ledit dispositif est une bandelette. Selon un mode de réalisation, ladite bandelette est pour détecter la présence de la bactérie S. aureus dans un échantillon. [0173] Ainsi, la présente divulgation concerne l’utilisation de protéines RBP spécifique S. aureus dans un dispositif d’immuno-détection de type bandelette, encore appelé système LFA.

[0174] Selon un mode de réalisation, ladite bandelette comprend dans l’ordre au moins 3 parties : une partie de marquage (conjugate ou conjuguée pad) dans laquelle un ligand (éventuellement conjugué à un marqueur) spécifique de l’analyte est déposé. Dans certains systèmes, le conjugate PAD peut être utilisé comme un Sample PAD et Conjugate PAD, - une partie de détection (détection pad) comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt, la zone de détection peut éventuellement comprendre une ligne de contrôle. une partie absorbante (absorption PAD) pour absorber l’excès des réactifs ou des solutions. [0175] Selon un mode de réalisation, ladite bandelette comprend dans l’ordre au moins

4 parties : une partie de contact (sample pad) comprenant une zone de contact avec l’échantillon; une partie de marquage (conjugate ou conjuguée pad) dans laquelle un ligand (éventuellement conjugué à un marqueur) spécifique de l’analyte est déposé. Dans certains systèmes, le conjugate PAD peut être utilisé comme un Sample PAD et Conjugate PAD, une partie de détection (détection pad) comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt, la zone de détection peut éventuellement comprendre une ligne de contrôle. une partie absorbante (absorption PAD) pour absorber l’excès des réactifs ou des solutions.

[0176] Selon un mode de réalisation, ladite bandelette comprend en outre une partie de marquage. [0177] La partie de contact (sample pad) comprend une zone de contact destinée à être mise en contact avec échantillon. Sa fonction est de répartir uniformément l'échantillon pour que la migration de l’échantillon par capillarité vers les parties suivantes soit lisse, continue et homogène. La partie de contact et la zone de contact sont une matrice capillaire. Par exemple, la partie de contact et la zone de contact sont en cellulose ou de fibres de verre.

[0178] La partie de marquage (conjugate ou conjuguée pad) comprend une zone de marquage où les bactéries sont couplées avec un marqueur lorsque le flux d’échantillon à analyser la traverse. Leur rôle est de maintenir le marqueur jusqu’à utilisation de la bandelette et de libérer le marqueur lorsqu’il y a reconnaissance entre le marqueur et une bactérie, au passage du flux d’échantillon. Par exemple la partie de marquage et la zone de marquage sont en fibres de verre, cellulose ou polyesters.

[0179] La partie de détection (détection pad) comprend une zone de détection où la bactérie d’intérêt, si elle est présente dans l’échantillon analysé, est captée sur la bandelette grâce à un ligand spécifique de celle-ci qui y est immobilisé. Le rôle de la partie de détection est donc de fournir un bon support et une bonne liaison pour l’immobilisation des ligands spécifiques, tout en limitant les adsorptions non spécifiques. Par exemple, la partie de détection et la zone de détection sont une membrane de nitrocellulose. [0180] La partie absorbante (absorbent pad) a un rôle d’absorption. Elle contribue ainsi à maintenir le débit du flux au travers de la bandelette et permet de récupérer les excédents d’échantillon et de réactifs, évitant ainsi le reflux d’échantillon. Par exemple, la partie absorbante est en coton.

[0181] Au sens de la présente demande, « dans l’ordre » signifie l’ordre dans lequel les différentes parties qui composent la bandelette vont être traversées par le flux contenant l’échantillon, mais ce terme ne signifie pas que ces parties sont forcément contiguës.

[0182] Différents modes de réalisation de bandelette de chromatographie à flux latéral (système LFA) sont décrits dans les Figures 4, 6 et 8 et représentent des modes de réalisation particulièrement préférés. [0183] Selon un premier mode de réalisation de la bandelette, ladite bandelette comprend un anticorps anti- S. aureus couplé avec un marqueur dans la partie de marquage et une RBP telle que décrite précédemment dans la partie de détection.

[0184] Selon un deuxième mode de réalisation de la bandelette, ladite bandelette comprend une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur dans la partie de marquage et un anticorps anti-ri. aureus dans la partie de détection.

[0185] Selon un troisième mode de réalisation de la bandelette, ladite bandelette comprend une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur dans la partie de marquage et une RBP telle que décrite précédemment dans la partie de détection. [0186] Selon un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition, et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont distinctes les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition.

[0187] Selon un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante.

[0188] Selon un mode de réalisation plus particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une deuxième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition. [0189] Selon un mode de réalisation, la zone de détection est placée après la zone de dépôt de échantillon (sample pad) et après la zone de conjugaison (conjugate pad) si elle est présente, ou si elle est absente avant la zone d’adsorption

[0190] Selon un mode de réalisation, la zone de détection se confond avec la zone de conjugaison (conjugate pad). ELI SA

[0191] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif est une plaque de microtitration. Ainsi, selon un mode de réalisation, ladite plaque de microtitration comprend ladite RBP telle que décrite précédemment fixée à sa surface (i.e., surface du support solide).

[0192] Selon un mode de réalisation, ledit dispositif est une plaque de microtitration pour un test ELIS A.

[0193] Ainsi, la présente divulgation concerne également un test ELISA utilisant une RBP telle que décrite précédemment, et en particulier une RBP de référence de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8, ou leurs variantes fonctionnelles. Selon un mode de réalisation, ledit test est pour détecter et/ou quantifier la bactérie S. aureus dans un échantillon.

[0194] Le principe de l’ELISA consiste à piéger, entre un « anticorps (ou tout autre ligand) de capture » et un « anticorps (ou tout autre ligand) de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc...). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par une RBP telle que décrite précédemment. [0195] Ainsi, selon un mode de réalisation, ledit test est un test ELIS A dans lequel un ou les deux anticorps (ou autre ligand) sont remplacées par une RBP telle que décrite précédemment.

[0196] Selon un mode de réalisation, ledit test est un test ELIS A dans lequel un ou les deux anticorps sont remplacées par une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0197] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence

SEQ ID NO : 1.

[0198] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1. [0199] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0200] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0201] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO : 1 et qui comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. [0202] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :5 et qui comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5. [0203] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :6 et qui comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6. [0204] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :7 et qui comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7.

[0205] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :8 et qui comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8.

[0206] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test consiste en la séquence SEQ ID NO : 1. [0207] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test consiste en la séquence SEQ

ID NO : 5.

[0208] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test consiste en la séquence SEQ ID NO : 6.

[0209] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test consiste en la séquence SEQ ID NO : 7.

[0210] Selon un mode de réalisation, ladite RBP dudit test consiste en la séquence SEQ ID NO : 8.

[0211] Selon un mode de réalisation, l’anticorps (ou autre ligand) couplé avec un marqueur est remplacé par une RBP telle que décrite précédemment couplée directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde). [0212] Selon un premier mode de réalisation du test ELISA, un anticorps anti-A aureus est utilisé pour la capture de la bactérie et une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur est utilisée pour détecter la bactérie.

[0213] Selon un deuxième mode de réalisation du test ELISA, une RBP telle que décrite précédemment est utilisée pour la capture de la bactérie et un anticorps anti-A aureus couplé avec un marqueur est utilisé pour détecter la bactérie.

[0214] Selon un troisième mode de réalisation du test ELISA, une RBP telle que décrite précédemment est utilisée pour la capture de la bactérie, un anticorps anti-A aureus est utilisé et un anticorps spécifique de l’anticorps anti A aureus est utilisé pour détecter la bactérie. Dans le deuxième et troisième mode de réalisation, l’anticorps utilisé n’est pas nécessairement spécifique de A aureus au sens de la présente divulgation, il peut reconnaître la bactérie A aureus mais également d’autres bactéries dès lors que la spécificité de reconnaissance vis-à-vis de l’espèce A aureus est assurée par la protéine RBP. Pour l’ensemble des 3 modes de réalisation, on pourra également choisir des ligands autres que des anticorps, dès lors qu’ils présentent une affinité pour la bactérie A aureus.

[0215] Selon un quatrième mode de réalisation du test ELISA, une RBP telle que décrite précédemment est utilisée pour la capture de la bactérie et une RBP telle que décrite précédemment couplée avec un marqueur est utilisée pour détecter la bactérie.

Marquage [0216] Selon un mode de réalisation, différents types de marqueurs peuvent être utilisés pour le marquage dans le dispositif bandelette et le test ELISA tels que décrit précédemment.

[0217] Selon un mode de réalisation, le marqueur peut être tout marqueur apte à révéler la présence de la bactérie. Ces marqueurs sont bien connus de l’Homme du métier. [0218] Selon un mode de réalisation, un marqueur conjugué est un marqueur qui est lié à un ligand pour marquer la bactérie. En particulier, le marqueur conjugué est un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique (RBP ou anticorps) de la bactérie d’intérêt. [0219] Selon un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé directement au ligand pour marquer la bactérie. Selon un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé indirectement au ligand via une ou plusieurs molécule(s).

[0220] Dans la présente demande, les marqueurs utilisés peuvent être des molécules colloïdales, en particulier les nanoparticules d’ or (AuNP). A titre d’ exemple, il peut s’ agir de nanosphères d’or ou de nanobâtonnets d’or. L’agrégation des nanoparticules d’or entraîne l’apparition d’une couleur, en particulier d’une couleur rose, détectable dans le visible, en raison de la longueur d’onde d’absorbance des nanoparticules d’or.

[0221] Les marqueurs utilisés peuvent également être une protéine qui réagit avec un substrat. A titre d’exemple, il peut s’agir de la peroxydase de raifort (HRP), qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimioluminescents. Des exemples de tels substrats, incluent, de façon non limitative, l'ABTS, l'OPD, le DAB, l'AEC ou encore le TMB (3, 3', 5,5'- Tétraméthylbenzidine). Le marquage peut être réalisé par une liaison intermédiaire par un complexe biotine/streptavidine qui est couplé à HRP ou à une molécule colloïdale, en particulier l’or.

[0222] La présente divulgation concerne également une sonde de détection comprenant une RBP telle que décrite précédemment conjuguée, fusionnée, ou couplée à un marqueur tel que décrit précédemment. Modes de réalisation particuliers

[0223] La présente divulgation concerne également une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage, qui comprend un anticorps anti-A aureus couplé à une nanoparticule d’or; une partie de détection comprenant une zone de détection de A aureus, qui comprend une RBP telle que décrite précédemment; et notamment une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, une partie absorbante.

[0224] La présente divulgation concerne également une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; - une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend une RBP telle que décrite précédemment; et notamment une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8 ou l’une de ses variantes fonctionnelles, une partie absorbante, et dans laquelle l’échantillon comprend un ligand spécifique de la bactérie marqué, en particulier un anticorps anti- S. aureus marqué (par exemple avec de l’or ou une autre sonde) ou une RBP telle que décrite précédemment marquée, pour marquer les bactéries.

[0225] La présente divulgation concerne également une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : - une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage, qui comprend une RBP telle que décrite précédemment couplée à la HRP via le complexe streptavidine-biotine; et notamment une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8 ou l’une de ses variants fonctionnelles, - une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend un anticorps anti-N aureus ; une partie absorbante.

[0226] La présente divulgation concerne également une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : - une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage, qui comprend une RBP telle que décrite précédemment couplée à la HRP via le complexe streptavidine-biotine; et notamment une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8 ou l’une de ses variants fonctionnelles, une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend une RBP telle que décrite précédemment; une partie absorbante.

[0227] La présente divulgation concerne également une plaque de microtitration pour la mise en œuvre d’un test ELISA pour détecter et/ou quantifier S. aureus dans un échantillon, comprenant une RBP telle que décrite précédemment fixée au fond des puits de ladite plaque pour la capture de la bactérie.

[0228] La présente divulgation concerne également un test ELISA pour détecter la présence de S. aureus dans un échantillon, comprenant la fixation d’une RPB telle que décrite précédemment au fond des puits de ladite plaque pour la capture de la bactérie et l’ajout d’un anticorps û-S. aureus couplé à HRP pour révéler la présence de la bactérie, via la réaction de ladite HRP avec un substrat tel que le TMB.

Procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon

[0229] La présente divulgation concerne également un procédé de détection et/ou quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon, mettant en œuvre une RBP telle que décrite précédemment, et notamment une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :1, 5, 6, 7 ou 8 ou l’une de ses variantes fonctionnelles.

[0230] Au sens de la présente divulgation, on entend par échantillon, tout échantillon susceptible de contenir une bactérie S. aureus. Cela peut être en particulier, un échantillon de matière organique, un échantillon biologique provenant d’une biopsie (cellules, tissus ou fragment d’organes) d’un animal ou d’un humain, en particulier un extrait de cellules prélevées à la surface de la peau, ou comprenant un fluide biologique. L’échantillon biologique peut être préalablement obtenu d’un animal humain ou non humain, en particulier d’un mammifère humain ou non-humain, et notamment d’un bovin (par exemple vache en vue de la détection de mammite).

[0231] L’échantillon préalablement prélevé peut être un échantillon de sang, de plasma, fèces, eaux, de lait ou d’urine, de l’environnement (air, terre, etc...) ou de surface (par exemple, surface de matériel utilisé pour la traite, ou tout matériel de travail, par exemple dans la salle de traite, ateliers de transformation ou usine).

[0232] L’échantillon peut également être un échantillon alimentaire, notamment lors de la préparation de produits laitiers, fromages ou tout autre produits alimentaire, pour la détection de bactérie en vue de la sécurité alimentaire), ou provenant d’eaux usées ou d’eaux de circuits industriels (circuits de refroidissement par exemple) en vue du contrôle des eaux utilisées dans un procédé industriel.

[0233] La présente divulgation concerne également un procédé de détection et/ou de quantification de la bactérie S. aureus dans un échantillon, mettant en œuvre une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus , comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et de préférence comprenant la séquence SEQ ID NO :3.

[0234] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 70, 71, 72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0235] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 87% ou au moins 89% avec la séquence SEQ ID NO : 1. [0236] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0237] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 97, 98 ou 99 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0238] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé est une variante fonctionnelle de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO : 1, et comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

[0239] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé est une variante fonctionnelle d’une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :5, et comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5.

[0240] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé est une variante fonctionnelle d’une protéine RBP de séquence SEQ ID NO ;6, et comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6.

[0241] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé est une variante fonctionnelle d’une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :7, et comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7. [0242] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé est une variante fonctionnelle d’une protéine RBP de séquence SEQ ID NO :8, comprenant une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8.

[0243] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO : 1.

[0244] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO : 5.

[0245] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO : 6. [0246] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO : 7. [0247] Selon un mode de réalisation, ladite RBP mise en œuvre dans ledit procédé comprend une séquence consistant en la séquence SEQ ID NO : 8.

[0248] Selon un mode de réalisation, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

- mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec un dispositif d’immuno-détection, sur lequel est fixé un ligand (A) reconnaissant la bactérie,

- optionnellement, l’élimination des bactéries non liées au ligand (A),

- la détection des bactéries liées au ligand (A) à l’aide d’une solution comprenant un composé (B) qui peut être un ligand reconnaissant la bactérie ou une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie, dans lequel l’un au moins du ligand (A) ou composé (B) reconnaît spécifiquement la bactérie S. aureus , et dans lequel le ligand (A) et composé (B) sont respectivement :

(i) une RBP telle que décrite ci-dessus et un ligand reconnaissant la bactérie S. aureus, spécifiquement ou non, par exemple un anticorps monoclonal ou polyclonal ;

(ii) une RBP telle que décrite ci-dessus et une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie ;

(iii) un ligand spécifique de la bactérie S. aureus et une RBP telle que décrite ci-dessus, ou

(iv) une RBP telle que décrite ci-dessus, identiques ou différents pour le ligand (A) et le composé (B).

[0249] Selon un mode de réalisation, le ligand (A) est une RBP immobilisée sur le dispositif d’immuno-détection en présence d’une solution comprenant un cation et/ou une protéine.

[0250] A cette fin, ladite solution est appliquée sur le support. Après adsorption, par exemple à 4-20°C pendant la nuit ou à 30-65°C pendant 2-4 heures, la solution est éliminée et la structure de support est séchée. [0251] Selon un mode de réalisation, ladite protéine, est une protéine de lait en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine de sérum, plus particulièrement de sérum de poulet ou un anticorps.

[0252] Selon un mode de réalisation, ledit cation est un cation monovalent, bivalent ou trivalent, de préférence bivalent. Des exemples de tels cations incluent, de façon non limitative, Mg ² +, Ca ² +, Na ⁺ , K ⁺ , Fe ²⁺ , Fe ³⁺ , K ⁺ , Zn ⁺ , Au ³⁺ , Cu ⁺ , carbocation, Mn ⁺ , Ag ⁺ . Selon un mode de réalisation, le cation est choisi parmi les sels MgSCri, Na ₂ S0 ₄ , MgCh, CaCl ₂ , CaS0 ₄ , K ₂ S0 ₄ , KC1 ouNaCl.

[0253] Selon un mode de réalisation, la concentration en cation, en particulier NaCl, dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive.

[0254] Selon un mode de réalisation, la concentration en protéine, en particulier en BSA, dans la solution est comprise entre 5 pg/mL et 5 mg/mL de façon inclusive.

[0255] Selon un mode de réalisation, la concentration en cation, en particulier NaCl, dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive et la concentration en protéine, en particulier en BSA, dans la solution est comprise entre 5 pg/mL et 5 mg/mL de façon inclusive.

[0256] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre un agent stabilisant, comme le glycérol et/ou un sucre, par exemple du sorbitol et/ou du sucrose. [0257] Selon un mode de réalisation, le composé (B) est un ligand ou enzyme couplé directement au marqueur, i.e. à une molécule permettant la détection dudit ligand (B). A titre d’exemple, le composé (B) est un anticorps anti-A aureus couplé à une nanoparticule d’or.

[0258] Selon un autre mode de réalisation, le composé (B) est couplé indirectement à un marqueur à l’aide d’une ou plusieurs molécule(s).

[0259] Selon un mode de réalisation, le composé (B) est un ligand et la liaison du ligand (B) à la bactérie est détectée à l’aide d’une première molécule de détection spécifique du ligand (B), cette molécule étant elle-même couplée à un marqueur. A titre d’exemple, le ligand (B) est un anticorps anti-A aureus , le second anticorps étant un anticorps dirigé contre le premier et couplé une nanoparticule d’or.

[0260] A titre d’ exemple, le composé (B) est un une RBP telle que décrite précédemment liée à HRP via un complexe biotine-streptavidine.

[0261] Selon un mode de réalisation, ledit procédé est mis en œuvre dans un dispositif d’immuno-détection, telle qu’une bandelette ou une plaque de microtitration pour un test ELISA. Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé est mis en œuvre dans une bandelette, une plaque de microtitration ou un test ELISA tel que décrit précédemment.

[0262] Selon un mode de réalisation, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

- mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec une bandelette pour détecter A aureus dans un échantillon au niveau de la partie de contact, et dans laquelle est fixé un ligand (A) reconnaissant la bactérie,

- détection des bactéries liées au ligand (A à l’aide d’une solution comprenant un composé (B) reconnaissant la bactérie couplé avec un marqueur, au niveau de la partie de détection, et dans lequel l’un au moins des ligand (A) et composé (B) reconnaît spécifiquement A aureus et les ligands (A) et composé (B) sont respectivement :

(i) une RBP telle que décrite ci-dessus et un ligand reconnaissant la bactérie A aureus, spécifiquement ou non, par exemple un anticorps monoclonal ou polyclonal,

(ii) une RBP telle que décrite ci-dessus et une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie ,

(iii) un ligand spécifique de la bactérie A aureus et une RBP telle que décrite ci-dessus, ou

(iv) une RBP telle que décrite ci-dessus, identiques ou différents pour le ligand (A) et le composé (B). [0263] Selon un mode de réalisation, le ligand (A) est une RBP telle que décrite précédemment et le composé (B) est un anticorps anti-A aureus couplé à une nanoparticule d’or.

[0264] Selon un mode de réalisation, le ligand (A) est un anticorps anti-A aureus et le composé (B) une RBP telle que décrite précédemment.

[0265] Selon un mode de réalisation, le ligand (A) est une RBP telle que décrite précédemment et le ligand (B) est une RBP telle que décrite précédemment couplée à la HRP via le complexe streptavidine-biotine.

[0266] Selon un mode de réalisation, ledit procédé comprend les étapes suivantes : mise en contact de l’échantillon susceptible de contenir des bactéries avec le puits d’une plaque de microtitration, dans lequel est fixé un ligand (A) spécifique de la bactérie, élimination des bactéries non liées au ligand (A) spécifique de la bactérie, détection des bactéries liées au ligand (A) reconnaissant la bactérie à l’aide d’une solution comprenant un composé (B) reconnaissant la bactérie couplé avec un marqueur, et dans lequel l’un au moins du ligand (A) ou composé (B) reconnaît spécifiquement la bactérie A aureus , et dans lequel le ligand (A) et composé (B) sont respectivement : i) une RBP telle que décrite ci-dessus et un ligand reconnaissant la bactérie A aureus, spécifiquement ou non, par exemple un anticorps monoclonal ou polyclonal, ii) une RBP telle que décrite ci-dessus et une enzyme présentant une activité détectable sur la bactérie, iii) un ligand spécifique de la bactérie A aureus et une RBP telle que décrite ci-dessus, ou iv) une RBP telle que décrite ci-dessus, identiques ou différents pour le ligand (A) et le composé (B).

[0267] Selon un mode de réalisation, le ligand (A) est une RBP telle que décrite précédemment et le ligand (B) est un anticorps û-S. aureus couplé à HRP. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

[0268] Figure 1 est un schéma montrant différentes utilisations de la protéine phi5 ou d’autres protéines RBP de bactériophages spécifiques de S. aureus selon la présente divulgation. Figure IA montre rutilisation de phi5 ou autres protéines RBP spécifiques de S. aureus pour capter des bactéries S. aureus sur un support. Figure IB montre le couplage de phi5 ou autres protéines RBP spécifiques de S. aureus avec une autre molécule (par exemple, substrat ou enzyme) pour lier la bactérie S. aureus. Figure IC montre rutilisation de phi5 ou autres protéines RBP spécifiques de S. aureus pour capter des bactéries S. aureus sur un support, et son couplage avec une autre molécule pour lier la bactérie.

[0269] Figure 2 est un graphique montrant la spécificité des protéines des phages phi5 (< 5-biotinylé) en comparaison avec une protéine phil (phage K, FI-biotinylé) par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect. [0270] Figure 3 est un schéma montrant les différentes parties d’une bandelette pour son utilisation avec une protéine RBP de bactériophage spécifique de S. aureus selon la présente divulgation.

[0271] Figure 4 est un schéma montrant le principe de la bandelette de type « Latéral Flow Assay » en utilisant les protéines de phages RBP selon la présente divulgation pour la capture et/ou la détection des bactéries S. aureus.

[0272] Figure 5 est un schéma montrant un exemple de l’utilisation de la bandelette avec la protéine du phage phi5 (F5) ou une autre protéine RBP de bactériophage spécifique de S. aureus selon la présente divulgation.

[0273] Figure 6 est un schéma montrant le principe de la bandelette de type « Latéral Flow Assay » en utilisant les protéines RBP de phages selon la présente divulgation couplées à une autre molécule pour la détection des bactéries S. aureus. [0274] Figure 7 est une combination d’une photographie et d’un schéma montrant que les protéines RBP de phage selon la présente divulgation couplées à une autre molécule peuvent être utilisées pour la détection des bactéries S. aureus. L’exemple utilisé ici montre l’utilisation des protéines du phage phi5 couplée à HRP via le complexe biotine- streptavidine.

[0275] Figure 8 est un schéma montrant le principe de la bandelette de type « Latéral Flow Assay » en utilisant les protéines RBP de phages selon la présente divulgation pour la capture et pour la détection des bactéries S. aureus (elles sont alors couplées à une autre molécule). [0276] Figure 9 est une combination d’une photographie et d’un schéma montrant que les protéines RBP de phage selon la présente divulgation peuvent être utilisées pour la capture et la détection des bactéries S. aureus (elles sont alors couplées à la HRP pour la détection via le complexe streptavidine-biotine). L’exemple ici montre l’utilisation des protéines de phage phi5 pour la capture et la détection de la bactérie S. aureus. [0277] Figure 10 est un graphique montrant la détection par la protéine de phage phi5

(F5) (par mesure de la densité optique en ordonnée) de différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée) dans un système ELISA.

[0278] Figure 11 est un graphique montrant la spécificité des protéines du phage phi5 (cf>5-biotinylé) et de l’anticorps anti S. aureus par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect

[0279] La Figure 12 est une photographie du test de bandelette de type « Latéral Flow Assay » en utilisant un anticorps anti S. aureus couplé à l’or pour la détection des bactéries et des protéines de phages (RBP) modifiée à gauche et non modifiée à droite (RBP définie par SEQ ID NO : 1) pour la capture.

[0280] La Figure 13 est une photographie montrant que l’expression des protéines RBP du phage 5 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel. [0281] La Figure 14 est un graphe représentant le profil de reconnaissance des protéines Phi5 et Phi 18 en Elisa indirect testé sur des souches de S. aureus ou des souches de Staphylococcus non aureus.

[0282] La Figure 15 est un alignement effectué avec l’algorithme Clustal des séquences des 5 protéines RBP de référence, décrites en exemple.

EXEMPLES

[0283] La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.

Exemple 1 : Evaluation de la spécificité de la RBP du phage phi5 1 Isolement de la protéine RPB du phage 5

[0284] Le phage 5 a été isolé à partir d’un échantillon provenant d’une ferme laitière en France. Ce phage est spécifique à la bactérie Staphylococcus aureus (S. aureus). Le phage a été déposé auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 sous le numéro CNCM 1-5680. Le génome de ce phage a été séquencé et la protéine de liaison au récepteur (RBP) du phage phi5 a été identifiée (ci-dessous).

[0285] La séquence protéique de la protéine RBP du phage 5 est SEQ ID NO : 1.

[0286] La séquence nucléique a également été établie (SEQ ID NO : 2).

2 Production de la protéine RPB du phage 5 [0287] Les protéines de phage 5 ont été reproduites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse par la bactérie hôte de protéines en utilisant la fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST).

[0288] Les protéines GST-P1 et GST-P2 sont exprimées dans un plasmide pDEST15 avec une souche Escherichia coli BL21 star (Invitrogen, C601003) dans un milieu LB (BD, 240230) contenant 100 mg/L d’ampicilline (Fisher bioreagent, BP1760-25). Une culture bactérienne est ensemencée à DO 0.05 dans le même milieu et incubée à 37°C et 140 rpm jusqu’à DO 0.5. Les cultures sont ensuite induites avec 0.1 mM d’IPTG (Invitrogen, 15529-019) et incubées à 25°C et 140 rpm pendant une nuit. Les cellules sont ensuite centrifugées à 5000 g et les culots sont repris dans un tampon de lyse contenant de l’Hepes 50 mM (Fisher bioreagent , BP310-500) pH 8, , Glycerol 10 % (Carlo Erba, 453751),) et soniquées 4x 1 minute. Les lysats sont ensuite centrifugés à 14000 g pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré et incubé une nuit avec la résine Glutathione Sepharose 4B (Cytiva, 17-0756-01). La résine est ensuite récupérée à l’aide d’une colonne avec un verre fritté, lavée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, , Glycerol 10 %, NP40 0.1% ; équilibrée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, et éluée dans le tampon HEPES 50 mM pH8, 20 mM glutathion oxydé. Les protéines sont ensuite conservées à -80°C.

[0289] L’expression des protéines RBP du phage 5 a été vérifiée sur gel (Figure 13). La taille de RBP du phage 5 est de 100 kDa.

3 Evaluation de la spécificité de la protéine RPB du phage 5

[0290] LELISA (enzyme-linked immunosorbent assay,) est un dosage immuno enzymatique sur support solide, basé sur la réaction spécifique antigène-anticorps. Le principe d’un ELIS A indirect est de mettre sur une micro-plaque un antigène et ajouter un anticorps primaire dirigé contre cet antigène. Un anticorps secondaire reconnaissant les chaînes lourdes du premier anticorps, couplé à une enzyme, est ensuite ajouté. L’ajout du substrat de l’enzyme permet d’obtenir une réaction colorée dosable par absorbance.

[0291] Pour déterminer la spécificité de la protéine RPB du phage phi5, le principe ELISA a été adapté comme suit. [0292] Les protéines de phages sont préalablement biotinylées (greffage avec la biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). Les bactéries sont fixées au fond des puits d’une micro-plaque (ELISA) à 10 ⁷ UFC/mL pendant lh30 à 37°C. Une étape de saturation par une solution contenant de la BSA à 3% et le Tween à 0,05 % est réalisée, puis la solution de BSA est éliminée. Les protéines de phage, après avoir été couplées avec la biotine, sont déposées dans chaque puits de 10 pg/mL (la concentration peut être modifiée dans l’intervalle de 5 pg/mL à 50 pg/mL) dans un tampon PBS (1% BSA ; 0,05% Tween). Une incubation pendant lh à 37°C est ensuite réalisée. Les puits sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant le Tween à 0,05%. Une étape d’incubation avec la streptavidine couplée à HRP (Invitrogene, ref, 434323) à 0,25 pg/mL, solution dans tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20 pendant 1 h à 37°C, puis la streptavidine est éliminée. Les puits sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant le Tween à 0,05%.

[0293] Pour la détection, 100 pl d’une solution de TMB sont ajoutés et incubés de 15 à 30 minutes à température ambiante. Puis, 50pl d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La plaque est ensuite lue à 540nm.

[0294] L’affinité de la protéine à la bactérie est exprimée par la quantité de protéines retenues par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplée à HRP. [0295] Différentes souches ont été testés par le système ELISA indirect avec la protéine

RBP du phage 5 (SEQ ID NO :1) biotinylée. La protéine RBP du phage 1 (phage K) biotinylée est utilisée à titre de comparatif (ne fait pas partie de l’invention). En particulier, la protéine RBP du phage 1 présente moins de 21% d’identité avec la protéine Phi5 et ne comprends pas la séquence SEQ ID NO :3. [0296] Les résultats sont présentés dans le tableau 1 pour les souches S. aureus et les souches non S. aureus (D : détection, ND : pas de détection) et dans la Figure 2.

[0297] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND). [0298] Tableau 2

[0299] Les résultats obtenus démontrent que la protéine de phage phi5 reconnaît 100% des souches de S. aureus testées, ce qui démontre une excellente sensibilité. Elle ne reconnaît pas les souches de Staphylocoques non aureus et les autres types de bactéries, ce qui démontre une spécificité du test remarquable pour la détection de G espèce Staphylococcus aureus. Au contraire, avec la protéine phil (exemple comparatif), de nombreuses souches de S. aureus ne sont pas détectées.

Exemple 2 : Utilisation de la RPB du phage phi5 ou autres protéines RBP selon la présente divulgation dans un système LFA (bandelette)

[0300] Les dosages par flux latéral (LFA), également connus sous le nom de dosages immuno-chromatographiques à flux latéral, sont des dispositifs en papier simples destinés à détecter la présence (ou l'absence) d'un analyte cible dans un échantillon liquide (matrice).

[0301] Le dispositif ou bandelette se compose de 4 parties (Figure 3) : · Un Sample PAD : partie en contact avec la solution à analyser. Cette partie est facultative.

• Un Conjugate PAD : endroit où un anticorps spécifique à l’analyte (conjugué à un marqueur) est déposé. Dans certains systèmes, le Conjugate PAD peut être utilisé comme un Sample PAD et un Conjugate PAD. · Une membrane de nitrocellulose où des antigènes (ou anticorps), sont immobilisés pour former la ligne de test ou la ligne de contrôle. Pour les tests utilisés ici, la ligne de contrôle n’est pas utilisée.

• Un absorption PAD, papier absorbant pour absorber l’excès des réactifs ou des solutions, permettant la migration. 1 Utilisation des protéines de phases pour la capture des bactéries dans un système LFA

[0302] Dans un premier système présenté en Figure 4, la protéine RBP du phage phi5 a été fixée à la membrane. Elle a été déposée à une concentration de 1 mg/mL, en présence de BSA (albumine de sérum bovin) à 1 mg/mL afin d’augmenter la fixation des protéines et de minimiser les interactions non spécifiques. L’anticorps utilisé est un anticorps anti Staphylococcus aureus (anticorps polyclonal de lapin), couplé avec des particules d’or. Il est également possible de fixer d’autres protéines RBP selon la présente divulgation, et notamment les protéines RBP de séquence SEQ ID NO :5, 6, 7 ou 8, selon le même protocole.

[0303] La bandelette est ensuite trempée dans l’échantillon pour détecter la présence de bactéries S.aureus. Selon le type de matrice, une dilution de celle-ci dans un volume de tampon contenant du Tween 20 afin de favoriser la migration. Par exemple, pour la détection de bactéries dans l’urine ou le lait, l’échantillon est recueilli et dilué au 1/10 dans le tampon d’extraction contenant le Tween 20 avant de tremper la bandelette (Figure

5)· [0304] Les bandelettes ainsi montées ont été utilisées pour détecter, dans le lait cru, la présence de différentes souches de S.aureus ou non S. aureus.

[0305] Les résultats sont présentés dans le tableau 3 pour les souches S. aureus et le tableau 4 pour les souches non S. aureus (D : détection, ND : pas de détection) : Tableau 3

Tableau 4

[0306] Ces résultats montrent qu’il est possible de réaliser un système de bandelette en utilisant des protéines RBP issues des phages pour détecter les bactéries. Le système de détection est très spécifique à la bactérie S.aureus. En effet, lorsque la solution contient des bactéries autres que S.aureus , il n’y a pas de signal de détection. Ainsi, la protéine RPB du phage 5 a permis d’avoir une détection estimée à 90 % pour les souches S. aureus testées par les bandelettes.

2 Utilisation des protéines de phages pour la détection des bactéries dans un système

LFA [0307] Dans un second système présenté en Figure 6, 2 pL d’anticorps anti -S. aureus à 1 mg/mL sont fixés sur la membrane. Les protéines RBP du phage phi5 sont biotinylées préalablement (greffage avec la biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). Elles sont mélangées avec de la Streptavidine couplée à HRP avant d’être déposées sur le Conjugate PAD : 10 pL d’une solution à 50 pg/mL de protéines couplées avec un marqueur et une solution de Streptavidine HRP à 5 pg/mL sont déposés sur le Conjugate PAD.

[0308] La bandelette est ensuite trempée dans un échantillon contenant la bactérie S. aureus à la concentration de 10 ⁷ UFC/mL dans du PB S. Les bactéries migrent tout d’abord vers le Conjugate PAD où les protéines RBP du phage phi5 se lient aux bactéries. Ce complexe continue de migrer sur la membrane nitrocellulose jusqu’à l’endroit où l’anticorps û-S. aureus est fixé. Les bactéries vont ainsi se fixer aux anticorps anti -A aureus.

[0309] Dans le cas où la protéine de phage est couplée à la biotine, la streptavidine couplée à HRP est ajoutée après fixation sur la ligne de détection. La présence de la bactérie est révélée par la présence d’une couleur bleue en présence du substrat de la HRP.

[0310] Les résultats sont présentés dans la Figure 7.

[0311] Ces résultats démontrent que la protéine RBP de phage phi5 ou d’ autres protéines RBP selon la présente divulgation peuvent être utilisés pour la détection de la bactérie S. aureus , via un couplage avec une autre molécule, dans un système LFA. 3 Utilisation des protéines de phages pour la capture et la détection des bactéries dans un système LFA

[0312] Dans un troisième système présenté en Figure 8, les protéines RBP du phage phi5 sont utilisées pour la capture et la détection des bactéries, via un couplage avec une autre molécule. 2 pL de protéine à 1 mg/mL sont fixés sur la membrane pour la ligne de détection. Les protéines RBP du phage phi5 sontbiotinylées préalablement (greffage avec la biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). Elles sont mélangées avec de la Streptavidine couplée à HRP avant d’être déposées sur le Conjugate PAD : 10 pL d’une solution à 50 pg/mL de protéines couplées avec un marqueur et à 5 pg/mL de Streptavidine HRP sont déposés sur le Conjugate PAD.

[0313] Les bandelettes sont trempées dans un échantillon comprenant des bactéries S. aureus à la concentration de 10 ⁷ UFC/mL dans une solution de PB S.

[0314] Les résultats sont présentés dans la Figure 9.

[0315] Ces résultats démontrent que la protéine RBP de phage phi5 ou d’ autres protéines RBP selon la présente divulgation peuvent être utilisés pour la capture et la détection de la bactérie S. aureus (via un couplage avec une autre molécule) dans un système LFA. Exemple 3 : Comparaison de la spécificité de la RBP de phi5 avec l’anticorps anti Staphylococcus

[0316] Un protocole identique à celui de l’exemple 1 a été utilisé pour la fixation des bactéries et pour la réalisation du test ELIS A avec la RBP de phi5.

[0317] Pour déterminer la spécificité de l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1-7246), le protocole est le suivant : Les bactéries sont fixées au fond des puits d’une micro-plaque (ELISA) à 10 ⁷ UFC/mL pendant lh30 à 37°C. Une étape de saturation par une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween à 0,05 % est réalisée, puis la solution de BSA est éliminée.

[0318] Parallèlement, dans une autre microplaque, l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1 -7246) est déposé dans chaque puits à 9 pg/mL (la concentration peut être modifiée dans l’intervalle de 5 pg/mL à 50 pg/mL) dans un tampon PBS (1% BSA ; 0,05% Tween). Une incubation pendant lh à 37°C est ensuite réalisée. [0319] Les puits des deux types de plaques sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant du Tween à 0,05%. Une étape d’incubation avec l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) couplé à HRP (ThermoFischer, ref Al 6096) à 1 mg/mL est réalisées. Les puits sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant du Tween à 0,05%. Pour la détection, 100 mΐ d’une solution de TMB sont ajoutés et incubés de 15 à 30 minutes à température ambiante. Puis, 50m1 d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La plaque est ensuite lue à 540nm.

[0320] Les résultats sont présentés dans la Figure 11.

[0321] L’affinité de la protéine pour la bactérie est exprimée par la quantité de protéines ou d’anticorps retenue par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplé à HRP pour les protéines de phage et à l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) pour l’anticorps.

[0322] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND).

[0323] Les résultats montrent que les protéines de phages sont plus spécifiques que l’anticorps. En particulier, elles ne reconnaissent pas les souches de Staphylocoques non- aureus et les autres espèces bactériennes alors que l’anticorps anti Staphylococcus reconnaît Staphylococcus saprophyticus et Staphyoloccus epidermidis. [0324] Cette protéine est donc spécifique de l’espèce S. aureus. Elle peut donc être utilisée pour la détection spécifique de S. aureus.

Exemple 4 : Utilisation de la RPB du phage 5 dans le système ELISA

[0325] Le principe d’un ELISA sandwich indirect est de doser sur une micro-plaque un antigène avec trois anticorps. Le premier est fixé sur la micro-plaque et accroche l’antigène, le second reconnaît ce même antigène mais sur un autre épitope, et enfin le troisième est couplé à une enzyme et reconnaît les chaînes lourdes de l’anticorps primaire. L’ajout du substrat de l’enzyme permet d’obtenir une réaction colorée dosable par absorbance. [0326] Pour détecter et/ou quantifier la présence de S. aureus dans un échantillon, ce principe a été adapté comme suit. Les protéines RBP du phage phi 5 sont fixées au fond des puits d’une plaque. Les solutions ou échantillons contenant les bactéries sont ensuite incubés et une étape de lavage est réalisée pour enlever les bactéries non fixées. Une étape d’incubation avec un anticorps û-S. aureus couplé à HRP ou un autre substrat est alors réalisé pour révéler la présence de la bactérie.

[0327] Le protocole utilisé est le suivant : 50 pL d’une solution à 10 pg/mL de protéines du phage phi 5 dans du PB S sont déposés par puits et incubés une nuit à température ambiante. La solution est ensuite enlevée. 200 pL d’un tampon de saturation (PB S IX - 3% BSA - 0,05% Tween 20) sont ajoutés et incubés pendant 2 heures à 37°C. Le tampon de saturation est enlevé, et 100 pL d’une suspension bactérienne à 10 ⁷ UFC/mL dans du PB S sont déposés par puits. Les puits sont recouverts et incubés pendant 1 heure à 37°C, puis le tampon est enlevé. Les puits sont ensuite lavés avec 5 lavages avec 200 pL de tampon de lavage (PBS IX (pH7) -0,05%Tween 20). L’anticorps anti -Staphilococcus HRP dilué 1/10000 dans une solution PBS 1% BSA 0,05% Tween est ensuite ajouté. Les puits sont recouverts et incubés pendant 1 heure à 37°C, puis la solution est éliminée. 5 lavages sont réalisés avec 200 pL de tampon de lavage, puis le tampon est retiré. lOOpL de solution TMB sont ajoutés, et incubés 15 à 30 minutes à température ambiante. 50pl d’acide sulfurique 2 M sont ensuite ajoutés pour stopper la réaction. La plaque est lue à 540nm.

[0328] Les résultats du test ELISA effectué avec la RBP du bactériophage phi 5 avec les différentes bactéries sont présentés dans la Figure 10.

[0329] La protéine RPB du phage 5 a notamment permis d’avoir une détection de 31 souches sur 31 souches de S. aureus testées, soit 100% par le système ELISA (sandwich) et les souches non aureus ne sont pas détectées.

[0330] Les protéines du phage K (phage de référence) ont été utilisées pour comparaison. La protéine RBP du phage K a moins de 21% d’identité avec la protéine RBP du phage 5 et ne comprends pas la séquence de reconnaissance SEQ ID NO :3 présente dans la protéine du phage 5. [0331] Les résultats sont décrits dans le tableau 5.

Tableau 5

BLANC* : absence de protéine de phage [0332] Le seuil de détection est fixé à partir de la valeur de densité optique mesurée pour les échantillons « BLANC » (sans RBP) : une souche est considérée comme détectée (D) si la valeur de densité optique est au moins égale à 2 fois la valeur mesurée pour le "BLANC".

[0333] Les résultats démontrent qu’il est possible de réaliser un système ELISA en utilisant des protéines RBP du phage phi5 pour détecter les bactéries.

[0334] Les résultats démontrent qu’il est possible de réaliser un système ELISA en utilisant des protéines de phages pour détecter les bactéries dans un échantillon. De plus, la protéine du phage 5 permet de détecter une large majorité de souches différentes de bactéries de G espèce S. aureus contrairement à la protéine de phage K.

Exemple 5 : Modification du site actif

[0335] Deux protéines RPB ont été reproduites par la technique de clonage en utilisant un vecteur bactérien permettant la synthèse des protéines par la bactérie hôte E. coli BL21. La production des protéines a été réalisée en utilisant rétiquette Glutathione-S- Transférase (GST). Les protéines, après la purification, ont été ensuite utilisées pour différents tests.

[0336] Les deux protéines sont : une protéine RBP telle que définie par SEQ ID NO : 1 et dont le site actif est défini par SEQ ID NO : 3 (TNAVMQSFW) et une protéine dont le site actif a été modifiée (TNAAAAAAW, SEQ ID NO : 4).

[0337] Les deux protéines ont été testées dans un dispositif de type LFA tel que décrit dans la Figure 4 en présence de deux souches de bactéries S. aureus.

[0338] La Figure 12 à gauche montre que la protéine dont le site actif a été modifié a perdu sa capacité de liaison avec les deux souches de bactéries alors que la RBP définie par la séquence SEQ ID NO : 1, testée de la même façon se lie aux deux souches de bactérie S. aureus (Figure 12 à droite).

Exemple 6 : Evaluation de la spécificité des protéines RBP de référence des phages Phi5, Phil8 et Phil9 1. Méthode : ELISA indirect

[0339] LELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) est un dosage immuno enzymatique sur support solide, basé sur la réaction spécifique antigène-anticorps.

[0340] Le principe d’un ELISA indirect est de mettre sur une micro-plaque un antigène et revenir avec un anticorps primaire dirigé contre cet antigène. Un anticorps secondaire dirigé contre les chaînes lourdes de l’anticorps primaire, et couplé à une enzyme, est ensuite ajouté. L’ajout du substrat de l’enzyme permet d’obtenir une réaction colorée dosable par absorbance.

[0341] Pour déterminer la spécificité des protéines RBP, ce principe a été adapté comme suit :

[0342] Les protéines sont biotinylées préalablement (greffage de biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). On fixe au fond des puits d’une micro-plaque (ELISA) les bactéries à 107 UFC/mL pendant lh30 à 37°C. Les puits sont saturés après avoir enlevé la suspension bactérienne par une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween20 à 0,05 %. On élimine la solution de saturation. On ajoute ensuite une solution contenant les protéines biotinylées à 10pg/ml dans tampon PBS 1%BSA, 0,05% Tween20. Après incubation lheure à 37°C , on lave 5 fois avec du tampon PBS -Tween de 0,05%, on ajoute la streptavidine couplée à HRP (Invitrogene, ref, 434323) à 0,25 pg/mL, dans une solution tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20 pendant 1 h à 37°C. Après un lavage 5 fois avec un tampon PBS -Tween de 0,05%, on ajouter IOOmI solution TMB. On incube 15 à 30 min à température ambiante. On ajoute 50m1 d’acide sulfurique 2 M pour stopper la réaction.

[0343] La péroxidase « Horseradish » (HRP) va permettre l’oxydation du substrat TMB, entraînant une coloration détectable par spectrophotométrie. On lit ainsi les plaques à 540 nm.

[0344] Pour déterminer la spécificité de l’anticorps (Thermofisscher, ref, PA1 -7246), ce principe décrit ci-dessus a été utilisé en utilisant un anticorps anti S.aureus qui est fixé au fonds des puits d’une plaque (ELISA) à une concentration de 0,9 pg/ml. Il est utilisé avec l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) couplé à HRP (Thermofischer, ref Al 6096) à 1 mg/mL.

2. Résultats [0345] L’affinité des protéines RBP testés à la bactérie est exprimée par la quantité de protéines ou d’anticorps retenue par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplé à HRP pour les protéines et à l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) pour l’anticorps. [0346] Par recherche dans les bases de données, différentes séquences présentant au moins 70% d’identité, voire au moins 87% d’identité, avec la séquence de la protéine RBP du phage Phi5 (cf le tableau 5 ci-dessous et la figure 14) et comprenant la séquence SEQ ID NO :3 ont été identifiées par les inventeurs. Il s’agit notamment de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :5 (issue du phage StauST398-l) ; de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :6 (issue du phage 3MRA, également appelé Phi 18); de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :7 (issue du phage 96); et de la protéine RBP de séquence SEQ ID NO :8 (issue du phage 11, également appelé Phi 11).

[0347] Un alignement des 5 séquences de protéines RBP est présenté à la figure 15.

[0348] Les séquences des bactériophages de Vetophage et identifiées à partir du site NCBI ont été regroupées dans une base de données. L’alignement des séquences a été réalisé grâce au logiciel Clustal Oméga (http://www.clustal.org/omega/). Les pourcentages d'identités entre chaque protéine sont obtenus et calculés automatiquement à partir de ce même logiciel. L'alignement des séquences protéiques par Clustal Oméga a permis par la suite de déterminer dans les séquences, les régions conservées.

[0349] Le pourcentage d’identité tel qu’identifié par l’algorithme Clustal2.1 est représenté ci-après dans le tableau 6: Tableau 6

[0350] De manière remarquable, toutes ces protéines testées avec le test Elisa reconnaissent l’ensemble des souches de S. aureus testées et ne reconnaissent pas des souches d’autres espèces de Staphylocoques (non aureus) ou d’autres genres de bactéries. Ces résultats confirment les avantages des protéines présentant au moins 70% d’identité, voire au moins 87% d’identité pour la capture, la détection et/ou la quantification spécifique de bactéries S. aureus.

[0351] La figure 14 montre la similarité du profil de reconnaissance en ELISA indirect des deux protéines Phi5 (SEQ ID NO :1) et Phi 18 (SEQ ID NO : 6). Le tableau 7 suivant indique les noms des souches testées en Elisa indirect dont les résultats sont présentés en Figure 14.

Tableau 7

[0352] Des profils similaires ont été obtenus avec les autres protéines RBP testés de séquence SEQ ID NO :5, 6, 7 ou 8.