БАКТЕРИОРОДОПСИНА

Область техники

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно, к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений.

Предшествующий уровень техники

Из уровня техники известны различные штаммы - продуценты бактериородопсина. В частности, самым изученным и приближенным к практическому использованию является бактериородопсин - ретиналь, содержащий трансмембранный белок пурпурных мембран галофильных бактерий рода Halobacterium, описанный в источнике информации «Rosa Margesin, Franz Schinner, Extremophiles, 5, (2001), pp.73-83». Кроме того, известен штамм Halobacterium salinarum D96N (ВКПМ B-9026), раскрытый в источнике информации «Миронова Е.В. «Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина», автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 2002», который синтезирует бактериородопсин в количестве до 47 мг/л (2,Змкмоль/л) культуральной жидкости.

Недостатками данных штаммов являются низкие параметры микробиологической продуктивности, такие как количество биомассы и бактериородопсина.

Наиболее близким к заявленному изобретению является штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В- 10425 - продуцент бактериородопсина, раскрытый в патенте RU 2416634, опубликованном 20.04.2011, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) штаммы бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 и Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025. Недостатками данного штамма являются низкие параметры микробиологического роста по основным показателям, таким как количество биомассы и бактериородопсина.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, - получение штамма Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза биомассы и бактериородопсина.

Указанная задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953.

Заявляемый штамм получен путём многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-9026, без предварительной обработки химическими реагентами.

Штамм ВКПМ В-11953 имеет следующие характеристики:

Культуралъно-морфологические признаки.

Величина клеток трехсуточной культуры 2-5 х 0,5-0,9 мкм, одиночные палочки, иногда объединены по 2-3 палочки.

Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.

Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлёй. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Хорошо растёт при 36-40оС, в солевой жидкой среде, имеющей состав (мас.%.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgS04 - 2, КС1 - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаС12 - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2 - 7,4. а также солевой агаризованной среде, имеющей состав (мас.%.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgS04 - 2, КС1 - 0,2, цитрат натрия - 0,3, СаС12 - 0,02, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,2 - 7,4.

Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40оС, оптимальная температура

38 о С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 7,2 - 7,4, оптимум рН-7,3. Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растёт на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16 S рРНК, штамм наиболее близок к видам Halobacterium salinarum (98%).

Как и все представители рода Halobacterium заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности Nel (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Хранение штамма: Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в колбах.

Заявленный штамм ВКПМ В- 11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425 выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», Germany) до стационарной стадии роста (6 суток) на круговой качалке при 37оС и встряхивании 100 об/мин. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgS04 - 2, KCI - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0, 1 , СаС12 - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2 - 7,4.

Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.

Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве равном объему среды выращивания и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 часов.

Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

С= D.Mr.Vp-pa.VKK>B/E6p.Vnpo6bi, где:

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм; Mr- молекулярная масса бактериородопсина (26700);

Vp-pa- общий объем раствора бактериородопсина;

VKK>B- объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете; Ебр- коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М-1см-1); V пробы- объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый штамм ВКПМ В- 11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425. по количеству биомассы и по концентрации бактериородопсина в культуральной среде.

ПРИМЕР 2. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в плоской кювете.

Заявленный штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425 выращивали в плоских кюветах объемом 15 л с заполнением 10 литров при освещении люминесцентными лампами дневного света, непрерывной подачи воздуха в кюветы (скорость подачи воздуха 1,5 л/мин) для аэрации и перемешивания до стационарной стадии роста в среде выращивания, как в примере 1.

Далее осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и к осадку приливали дистиллированную воду в количестве равном объему среды выращивания, инкубировали и определяли содержание бактериородопсина, как в примере 1.

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что и при выращивании в плоских кюветах заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425 по концентрации бактериородопсина в культуральной среде и биомассе выращенной культуры.

Таблица 2.

ПРИМЕР 3. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в ферментере.

Заявленный штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425 выращивали в в ферментере Anglicon (Anglicon, USA) в объеме среды выращивания 1500 мл. В качестве среды выращивания использовали среду как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37 °С, перемешивание: первые 24 часа 400 об./мин, на вторые сутки 600 об/мин на 3 сутки 800 об/мин на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации - 0,75 л/л.мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания, как в примере 1. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Как следует из результатов, приведенных в таблицах 1, 2 и 3, заявленный штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и наиболее близкий аналог ВКПМ В- 10425 по количеству синтезируемого при различных условиях культивирования бактериородопсина и биомассы.