POUR LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT D'UNE PERTE DE MASSE MUSCULAIRE PATHOLOGIQUE OU D'UNE MALADIE CARACTERISEE PAR UNE PERTE DE MASSE

MUSCULAIRE PATHOLOGIQUE

DOMAINE TECHNIQUE

L'invention concerne la préservation de la masse musculaire. En particulier l'invention se rapporte à des bactéries spécifiques du microbiote intestinal et des compositions en contenant pour la prévention et/ou le traitement d'une perte musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte musculaire pathologique.

ART ANTERIEUR

La perte de masse musculaire pathologique est bien connue de l'homme du métier et désigne une atrophie musculaire, une diminution du volume du muscle (Gordon et al. Therapeutic approaches for muscle wasting disorders. Pharmacol Ther. 2007 Mar;113(3):461-87). Cette perte musculaire concerne généralement les muscles striés squelettiques, qui sont les muscles sous contrôle volontaire. Plusieurs pathologies sont caractérisées par une perte de la masse musculaire, en particulier l'amyotrophie, la pré-sarcopénie, la sarcopénie, la rhabdomyolyse, la cachexie.

L'amyotrophie est une diminution du volume des muscles striés squelettiques et cardiaques, c'est-à-dire que le nombre de fibres composant ces muscles (longues cellules) diminue. La sarcopénie est un syndrome qui se caractérise par une diminution des muscles due à l'âge et qui peut conduire à une détérioration de la force musculaire et des performances physiques.

La rhabdomyolyse est une maladie dans laquelle des cellules des muscles squelettiques se dégradent rapidement et libèrent leur contenu dans la circulation sanguine. Certains de ces produits de dégradation des cellules musculaires endommagées sont nocifs pour les reins et peuvent conduire notamment à une insuffisance rénale. La maladie est caractérisée par plusieurs symptômes comme des douleurs musculaires, des vomissements et de la confusion et le pronostic vital peut être engagé dans certains cas. Certains animaux peuvent être touchés et en particulier les chevaux. La cachexie est un affaiblissement profond de l'organisme qui se caractérise par une perte de poids, de la fatigue et une atrophie musculaire notamment, lié à une dénutrition très importante.

L'atrophie musculaire peut être provoquée notamment par la synthèse de norleucine dans l'organisme. D'autres marqueurs de la fonte musculaire sont connus comme l'albumine, la pré-albumine, la protéine C réactive et la myoglobine.

La norleucine est un acide aminé non protéinogène qui, lorsqu'il est présent, prend la place d'un autre acide aminé, la méthionine, durant la synthèse protéique. Ce remplacement de la méthionine par la norleucine est toxique pour les cellules et en particulier il empêche le renouvellement des cellules musculaires, diminue la croissance des fibres musculaires et réduit le développement musculaire (Bogosian et al. Biosynthesis and Incorporation Into Protein of Norleucine by Escherichia Coli, J Biol Chem 1989 Jan 5;264(l):531-9. La norleucine affecte particulièrement les organes où le remplacement de protéines est important tels que les muscles. Ainsi, les muscles subissent la toxicité de la norleucine à faible dose. A titre d'exemple, Jeffery Escobar et al. 2010 a démontré que l'administration de leucine chez des porcelets a un effet positif sur la synthèse des protéines du muscle squelettique et que la norleucine n'a pas d'effet positif sur la synthèse protéique dans le muscle. Il montre également que la structure chimique de la leucine lui confère ces propriétés.

La norleucine peut être synthétisée par les bactéries dans la voie des produits secondaires de la voie de synthèse des acides aminés branchés à partir du pyruvate et alpha-ketobutyrate. Actuellement, la toxicité de la norleucine est très peu étudiée et aucun traitement de la perte de masse musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire pathologique ne repose sur une réduction de la toxicité de la norleucine malgré l'implication de cet acide aminé dans des voies métaboliques ubiquitaires. L'albumine est une protéine soluble qui est dosée pour vérifier la quantité de protéines dans le sang. Une concentration faible d'albumine est un marqueur de dénutrition qui est accompagné d'une perte importante de muscles.

La protéine C réactive est une protéine qui montre l'état inflammatoire du patient qui est observé lors de perte musculaire due à une cachexie notamment. Une concentration élevée de protéine C réactive est un marqueur de cachexie qui est accompagné d'une perte importante de muscles.

La myoglobine est une protéine capable de transporter l'oxygène vers les muscles, donc indispensable au travail et au développement des muscles. Une concentration élevée de myoglobine plasmatique est un marqueur d'atteinte musculaire ou rhabdomyolyse lors de polytraumatismes, maladies infectieuses, dystrophie musculaire, myopathie.

En outre, les traitements existants de la perte de masse musculaire pathologique ou des maladies caractérisées par une perte de masse musculaire pathologique ne sont pas efficaces. En effet, ceux-ci consistent essentiellement en des exercices physiques lors de séances répétées plusieurs fois par semaine, un apport protéique optimal pour stimuler la synthèse de protéines, la pose d'une perfusion contenant une solution saline, une alcalinisation des urines, une dialyse, une chirurgie de la région lésée ce qui ne permet pas d'obtenir un résultat satisfaisant. En outre, les traitements sont souvent lourds comme pour le traitement de la rhabdomyolyse qui consiste en des perfusions intraveineuses abondantes, et qui peut nécessiter une dialyse ou une hémofiltration dans les cas plus graves.

Un article a porté sur l'étude du microbiote intestinal chez des patients atteints de sarcopénie primaire et notamment les effets d'une activité physique sur le microbiote. Il a également été discuté des effets de l'administration de probiotiques tels que FOS et inuline pour améliorer les symptômes de faiblesse musculaire et de la sarcopénie et ce même s'il n'y a pas de preuve d'un microbiote intestinal distinct chez les patients souffrant de sarcopénie (Andrea Ticinesi et al. Aging gut microbiota at the cross-road between nutrition, physical frailty, and sarcopenia: Is there a gut-muscle axis?. 2017). Toutefois, l'étude ne montre pas d'intérêt particulier pour certaines souches, ni d'utilisation de bactéries selon l'invention. Ainsi, il existe un besoin important pour un traitement efficace de la perte de masse musculaire pathologique et des maladies caractérisées par une perte de masse musculaire pathologique, qui soit capable d'agir sur les différents marqueurs à l'origine de la maladie et en particulier sur la synthèse de la norleucine, qui soit facile à administrer, et qui ne présente pas d'effets secondaires.

EXPOSE DE L'INVENTION

C'est l'objectif de la présente invention, qui, pour y répondre, vise l'utilisation de bactéries particulières du microbiote intestinal humain, à savoir des bactéries de la famille des Christensenellacées.

Des bactéries de la famille des Christensenellacées, notamment du genre Christensenella, ont déjà été étudiées et décrites. C'est le cas en particulier de Christensenella minuta, Christensenella massiliensis et Christensenella timonensis. Christensenella minuta en particulier a été décrite pour la première fois en 2012. En 2014, une étude a montré qu'il s'agissait du taxon le plus héritable dans une cohorte de jumeaux britanniques et que leur présence est associée à un indice de masse corporel faible. Cette corrélation entre Christensenella minuta et l'indice de masse corporel faible a ensuite été observée dans une dizaine d'études parues depuis 2014 dans des populations géographiquement diverses. Enfin, la demande de brevet WO/2018/162738 décrit l'utilisation des bactéries de la famille des Christensenellacées dans le traitement de l'obésité et du surpoids

De façon surprenante, selon l'invention, les bactéries de la famille des Christensenellacées, lorsqu'elles sont administrées à l'homme ou à l'animal, sont capables d'agir sur les marqueurs de la perte de masse musculaire pathologique pour prévenir ou traiter cette maladie ou les maladies caractérisées par une perte de masse musculaire telles que l'amyotrophie, la sarcopénie, la pré-sarcopénie, la rhabdomyolyse, la cachexie.

C'est pourquoi, l'invention a pour objet une bactérie de la famille des Christensenellacées, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l'atrophie musculaire chez l'être humain ou l'animal, en particulier. Avantageusement, une telle bactérie, lorsqu'elle est administrée à un être humain ou un animal présentant une perte de masse musculaire pathologique ou une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire, est capable d'agir sur les molécules produites en excès lors de cet état pathologique comme en particulier la norleucine, et également éventuellement contre l'albumine et/ou la pré-albumine et/ou la protéine C et/ou la myoglobine permettant une augmentation de la synthèse protéique et de la production de cellules musculaires pour retrouver la masse musculaire perdue.

En outre, il s'agit d'une bactérie naturellement présente dans le microbiote intestinal et dont l'administration ne provoque pas d'effets secondaires. Préférentiellement les bactéries pour leur utilisation selon l'invention sont administrées au sein de compositions. Aussi, l'invention a également pour objet les compositions comprenant au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une perte de masse musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire chez l'être humain ou l'animal. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails de l'invention qui va suivre.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Définitions Par « perte de masse musculaire pathologique» ou « perte de masse musculaire » ou « perte musculaire pathologique » au sens de l'invention on entend une diminution anormale, pathologique, de la masse musculaire due à une diminution de la synthèse protéique, notamment de la masse musculaire squelettique.

Par « maladie caractérisée par une perte de masse musculaire pathologique » ou « maladie caractérisée par une perte de masse musculaire » au sens de l'invention on entend une maladie dont l'un des symptômes est une perte de la masse musculaire. Il peut s'agir notamment de l'amyotrophie, la sarcopénie, la pré-sarcopénie, de la rhabdomyolyse ou de la cachexie.

Par « marqueur » d'une maladie au sens de l'invention on entend une molécule ou une substance dont le dosage permet de suivre l'évolution de ladite maladie.

Bactéries selon l'invention

L'invention a pour objet l'utilisation pour prévenir et/ou traiter une perte de masse musculaire pathologique ou une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire, chez l'être humain ou l'animal, d'au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées. L'invention vise donc une bactérie de la famille des Christensenellacées pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement chez l'être humain ou l'animal d'une perte de masse musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire notamment choisie parmi l'amyotrophie, la sarcopénie, la pré-sarcopénie, la rhabdomyolyse et la cachexie, en particulier chez des personnes ou des animaux présentant une perte de masse musculaire pathologique ou une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire pathologique avec une synthèse d'au moins la norleucine et/ou d'au moins un marqueur choisi parmi : l'albumine et/ou la pré-albumine et/ou la protéine C réactive et/ou la myoglobine.

Selon l'invention, les bactéries de la famille des Christensenellacées, lorsqu'elles sont administrées à un être humain ou un animal présentant une perte de la masse musculaire ou une maladie caractérisée par une perte de la masse musculaire, sont capables d'agir sur les molécules produites en excès lors de cet état pathologique, en particulier sur la production de la norleucine et/ou d'au moins un marqueur choisi parmi : l'albumine et/ou la pré albumine et/ou la protéine C réactive et/ou la myoglobine. Dans le cas d'une perte de masse musculaire pathologique en particulier dans les maladies caractérisées par une perte de masse musculaire qui présentent une synthèse de norleucine, et/ou une synthèse d'au moins un marqueur choisi parmi : l'albumine et/ou la pré-albumine et/ou la protéine C réactive et/ou la myoglobine, leur diminution est le signe d'une augmentation de la synthèse protéique et de l'augmentation de la production de cellules musculaires.

Lorsque la perte de masse musculaire pathologique ou la maladie caractérisée par une perte de masse musculaire pathologique présente une hyperproduction de la norleucine, sa diminution est le signe de la réduction des voies de synthèse des produits secondaires des acides aminés branchés, c'est-à-dire que cette production est moins stimulée. Dès lors, la production de norleucine excessive en cause de sa toxicité est ralentie et le système retourne progressivement à la norme. Le mécanisme physiologique de synthèse des muscles se normalise et le développement musculaire augmente.

Les bactéries utiles selon l'invention sont administrées à des êtres humains ou des animaux dans une quantité efficace pour une action sur au moins l'un de ces marqueurs de d'une perte de masse musculaire pathologique, c'est-à-dire pour diminuer la production d'au moins un de ces marqueurs dans l'organisme.

Selon un mode de réalisation adapté, la ou les bactéries sont administrées à raison d'une dose de 10 ⁹ à 10 ¹² unités formant des colonies (CFU) par jour, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Préférentiellement il s'agit d'une dose unique, c'est-à-dire administrée en une seule fois ou une dose avant chaque repas soit trois fois par jour.

Les bactéries utiles selon l'invention sont des bactéries de la famille des Christensenellacées, préférentiellement du genre Christensenella. Il peut s'agir en particulier de Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et/ou Christensenella minuta. Selon une variante particulièrement adaptée, il s'agit de Christensenella minuta.

Ces bactéries peuvent être isolées à partir de selles humaines par exemple selon les protocoles publiés par Morotomi et al. 2012 (Morotomi, M., Nagai, F. & Watanabe, Y. Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales, and proposai of Christensenellaceae fam. nov. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY 62, 144-149 (2012)) et NDongo et al. 2016 (Ndongo, S., Dubourg, G., Khelaifia, S., Fournier, P. E. & Raoult, D. Christensenella timonensis, a new bacterial species isolated from the human gut. New Microbes and New Infections 13, 32-33 (2016)). Ces documents décrivent également les méthodes de culture des bactéries utiles selon l'invention. Compositions

Les bactéries utiles selon l'invention, sont préférentiellement administrées à l'être humain ou l'animal dans une composition.

Ainsi, l'invention a également pour objet une composition comprenant au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une perte de masse musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire, chez l'être humain ou l'animal, notamment chez des personnes ou des animaux présentant une synthèse de norleucine et/ou d'au moins un marqueur choisi parmi : l'albumine et/ou la pré-albumine et/ou la protéine C et/ou la myoglobine.

Les bactéries sont présentes en une quantité efficace dans la composition permettant un effet sur la perte de masse musculaire dont sont atteints les personnes ou les animaux traités. Préférentiellement, la composition utile selon l'invention comprend 10 ⁶ à 10 ¹² unités formant des colonies (CFU) de bactéries de la famille des Christensenellacées par dose quotidienne à administrer de composition. Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose quotidienne est administrée en une seule fois.

La composition utile selon l'invention peut être sous forme liquide. Elle peut notamment comprendre des bactéries de la famille des Christensenellacées et un milieu de culture desdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de mouton, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.

Lorsque les compositions sont sous forme liquide, elles sont préférentiellement congelées, maintenues à -20°C dans un sachet hermétique.

Selon une variante, la composition utile selon l'invention peut se présenter sous forme solide. Dans ce cas les bactéries peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et les compositions peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcrystalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stéarate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le sorbitol et/ou le glycérol.

Les compositions utiles selon l'invention peuvent se présenter en particulier sous forme de poudre, de poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension ou de suppositoire. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, elles peuvent se présenter sous une forme gastro-résistante, telles qu'un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées.

Lorsque les compositions sont sous forme solide, elles sont préférentiellement conditionnées dans des capsules ou dans un enrobage hermétique à la lumière et à l'oxygène maintenu à une température ambiante comprise entre 15°C et 40°C et un taux d'humidité compris entre 3% et 70%.

Les bactéries peuvent être utilisées vivantes ou inactivées par exemple par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux rayons gamma ou à la mise sous haute pression.

Elles peuvent être toutes vivantes ou toutes inactivées.

Préférentiellement, au moins une partie est constituée par des bactéries sont vivantes, en particulier au moins 50% (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 90% (en nombre).

Ainsi, selon un mode de réalisation adapté, les bactéries présentes dans la composition utile selon l'invention sont pour au moins 50% des bactéries vivantes (en nombre), préférentiellement pour au moins 90% des bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement toutes vivantes.

Les bactéries utiles selon l'invention, et en particulier les compositions l'incluant, peuvent être administrées par voie orale, topique, respiratoire (inhalation) ou rectale.

Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles selon l'invention peuvent comprendre d'autres composés, tels que :

- au moins un probiotique, et/ou

- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des microorganismes de la famille des Methanobacteriaceae et/ou

- au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Verrucomicrobia, et/ou

- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries de l'ordre des Clostridales, des Verrucomicrobiales, des Aeromonadales, des Alteromonadales, ML615J-28, RF32, YS2, de la famille des Clostridiacées, des Lachnospiracées, des Erysipelotrichacées, des Ruminococcacées, des Bacteroidacées, des Enterococcacées, des Rikenéllacées, des Dehalobactériacées, des Veillonellacées et/ou

- au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Faecalibacterium, Akkermansia, Eubacterium, Turicibacter et Oscillospira telle que par exemple Faecalibacterium prausnitzii, Akkermansia muciniphila, Eubacterium halii, Turicibacter sanguinis, Oscillospiraguilliermondii, et/ou

- au moins un prébiotique tel que par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylans, les béta- glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines, et/ou

- au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempferol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan-3-ols (comme les catéchines), les flavanones (comme la narinénine), les isoflavones, les anthocyanidines, les proanthocyanidines, et/ou

- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou

- au moins un principe actif pharmaceutique présentant un effet dans la prévention et/ou le traitement d'une perte de masse musculaire pathologique et/ou d'une maladie associée à une perte de masse musculaire tel que par exemple des inhibiteurs d'autophagie, notamment dans le cas de la cachexie, le nusinersen, la flunarizine, le riluzole, notamment dans le cas de l'amyotrophie, la vitamine D, le sévélamer, le sulfonate de polystyrène, le calcium, les calcimétiques (notamment cinacalcet), la darbopoïétine, l'érythropoïétine, la furosémide, l'hydrochlorothiazide notamment dans le cas d'une rhabdomyolyse L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d'essais démontrant l'efficacité des bactéries de la famille des Christensenellacées sur une perte de masse musculaire pathologique et les maladies associées à une perte de masse musculaire pathologique.

EXEMPLES

Exemple 1 : Christensenella minuta

Les bactéries Christensenella minuta peuvent-être cultivées selon le protocole opératoire décrit en suivant.

1/ Dissoudre un milieu RCM ("Reinforced Clostridial Medium" milieu clostridiale renforcé) déshydraté dans de l'eau distillée

2/ Ajouter 0,5 mL/L de solution de résazurine-Na (0,1% p/v)

B/Porter à ébullition et refroidir à température ambiante tout en injectant un mélange gazeux à 80% de N ₂ et à 20% de C0 ₂

4/Etaler le milieu sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungate anoxiques ou dans des flacons de sérum puis autoclaver

5/Avant utilisation, ajoutez 1,0 g de carbonate de sodium par litre à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée avec un mélange gazeux à 80% de N ₂ et à 20% de C0 ₂

6/ Vérifier le pH du milieu après autoclavage et ajuster le pH entre 7,3 et 7,5, en utilisant une solution mère anoxique stérile de bicarbonate de sodium (5% p / v) préparée dans une atmosphère gazeuse à 80% de N ₂ et à 20% de C0 ₂ .

Exemple 2 : Christensenella massiliensis

Les bactéries Christensenella massiliensis peuvent-être cultivées selon le protocole opératoire décrit en suivant.

1/Préparer un milieu carboxyméthylcellulose (N ₂ / C0 ₂ ) en suivant les instructions suivantes fournies par DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell- kulturen), présentées dans le Tableau 1. [Tableau 1]

2/Dissoudre les différents constituants listés dans le tableau ci-dessus, sauf la cystéine, les carbohydrates et le carbonate.

B/Faire bouillir le milieu pendant 1 min, puis le laisser refroidir à la température ambiante sous une atmosphère gazeuse à 80% de ISh et à 20% de CO2.

4/ Ajouter 0,5 g/L de L-cystéine-HCI x H2O et le verser sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungate (pour les souches exigeant des particules de viande, introduire celles-ci en premier dans le tube, utiliser 1 partie de particules de viande pour 4 ou 5 parties de liquide).

5/ Autoclavage à 121°C pendant 20 min.

6/ Après autoclavage, ajouter le glucose, le cellobiose, le maltose et l'amidon provenant de solutions mères anoxiques stériles préparées à 100% de gaz N2 et de carbonate à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée sous des mélanges gazeux à 80% de N2 et 20% de C0 .

7/ Ajuster le pH du milieu à 7, si nécessaire.

La composition du filtrat de viande est présentée dans le Tableau 2. [Tableau 2]

Le filtrat de viande est préparé comme suit.

a/Utiliser du bœuf maigre ou de la viande de cheval.

b/Enlever la graisse et le tissu conjonctif avant de hacher.

c/ Mélanger la viande, l'eau et NaOH, puis faire bouillir pendant 15 min sous agitation.

d/ Laisser refroidir à la température ambiante, retirer la graisse de la surface et filtrer, en retenant les particules de viande et le filtrat.

e/Ajouter au filtrat de l'eau jusqu'à un volume final de 1000,0 ml.

Les bactéries doivent être cultivées en condition anaérobie à 37°C.

Exemple 3 : Christensenella timonensis

Les bactéries Christensenella timonensis peuvent-être cultivées selon le même protocole opératoire que celui décrit à l'exemple 2 pour Christensenella massiliensis.

Exemple 4 : Composition utile selon l'invention sous forme liquide

Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme liquide est une composition comprenant Christensenella minuta 10 ⁹ CFU/mL dans le milieu de culture RCM anaérobie décrit ci-dessus modifié pour ne contenir aucun produit d'origine animale et enrichi en glycérol 5%.

La composition de l'exemple 4 est obtenue à partir d'une RCB («research cell bank » banque de cellules de recherche) préparée à base de Christensenella minuta 10 ¹⁰ CFU/ mL puis conservée congelée à -20°C dans un sachet hermétique à l'oxygène.

La composition congelée doit être réchauffée à température ambiante jusqu'à retrouver une forme liquide avant utilisation.

Exemple 5 : Composition utile selon l'invention sous forme solide

Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme lyophilisée peut être obtenu par lyophilisation de la composition de l'exemple 4 à l'état congelé.

Essai in vitro démontrant l'effet de l'invention sur la synthèse de norleucine L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet de bactéries de la famille des Christensenellacées sur la norleucine in vitro. L'étude a été réalisée sur la norleucine, responsable de la toxicité à l'origine de la fonte musculaire.

La norleucine est un acide aminé non protéinogène qui remplace la méthionine au cours de la synthèse des protéines. Ce remplacement est toxique : il a été démontré qu'il entraîne une diminution de la stabilité du cytochrome P450 (Cirino, P. C., Tang, Y., Takahashi, K., Tirrell, D. A. & Arnold, F. H. Global incorporation of norleucine in place of méthionine in cytochrome P450 BM-3 heme domain increases peroxygenase activity. Biotechnol. Bioeng. (2003). doi:10.1002/bit.10718) et un manque de stimulation de la synthèse musculaire chez le porc (Escobar, J. et al. Leucine and alpha-ketoisocaproic acid, but not norleucine, stimulate skeletal muscle protein synthesis in néonatal pigs. J. Nutr. 140, 1418-24 (2010)).

Cet acide aminé non protéinogène peut être synthétisé par différentes voies bactériennes dont la voie de synthèse des acides aminés à chaîne ramifiée à partir de pyruvate et d'alpha- cétobutyrate où la norleucine est un sous-produit. Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.

1/ Protocole de fermentation à partir de fèces d'origine humaine contenant du Christensenella spp :

- Les donneurs ne devaient pas avoir pris d'antibiotiques durant les six mois précédents l'expérience et n'avoir aucun historique de désordres gastro-intestinaux. Les donneurs étaient âgés entre 18 et 60 ans.

- La collecte des échantillons frais de leur fèces est obtenue dans des contenants stériles en plastique, conservés dans des flacons anaérobies contenant un sachet de 2,51 d'AnaeroGenTM d'OxoidTM (02 <0.1%; CO2: 7-15%). Ces échantillons ont été apportés au laboratoire dans les deux heures après leur production. - Les échantillons de fèces ont été dilués au 1/5 (poids/volumes) dans une solution saline tamponnée au phosphate (IM) (PBS), pH 7,4. La suspension a été homogénéisée dans un stomacher pendant 120 secondes. - Milieu nutritif de base: le milieu nutritif de base a été préparé à partir de 2g/L de bouillon de tryptone de soja, 2g/L d'extrait de levure, 0,lg/L de NaCI, 0,04g/L de K2 HP04, 0,01g/L de MgS0 ₃ .7 H ₂ 0, 0,01g/L de CaCI ₂ .6H ₂ 0, 2g/L NaHCOs, 0,5g/L de L-cystine HCl, 2m L/L de tween 80, 10pL/L de vitamine Kl, 0,05g/L d'hème, 0,05g/L de sels biliaires, 4ml/L de résazarin (pH7)

- Fermentation en biofermenteur : Les biofermenteurs de 20mL de contenance contenaient 18mL de milieu nutritif de base autoclavé (121°C pendant 15 minutes) et versé aseptiquement dans les biofermenteurs stériles. Ce système a été laissé au repos toute la nuit avec un bullage d'azote sans oxygène à travers le milieu à un taux de 2mL/min. Le pH était maintenu entre 6,7 et 6,9 en utilisant du HCl ou NaOH (0,5M). La température de chaque biofermenteur était contrôlée à 37°C et le contenu du récipient homogénéisé avec un mélangeur magnétique

- un mélange de protéines prédigérées (0,35g) a été ajouté dans les récipients avant l'inoculation avec 2mL d'inocula fécal à T0. Les protéines prédigérées ont été obtenues selon le protocole de digestion gastro-intestinale adapté de celui de Ver- santvoort et al (2005).

- les échantillons ont été collectés avant la fermentation (T0) et après 48 heures de fermentation (T48), et congelés à -80°C jusqu'aux analyses.

2/ Quantification de la norleucine

- 50 pL d'échantillons collectés et conservés à -80°C ont été mélangés avec 20 pL d'eau Milli- Q contenant des standards internes.

- Le mélange a été mélangé et filtré à travers un filtre de seuil 5-kDa pour retirer les macromolécules.

- Les métabolites ont été détectés par analyses en électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse à temps de vol (CE-TOFMS). La limite de détection des pics a été déterminée sur la base du ratio signal/bruit, S/N=3.

Aire relative du pic = (aire du pic d'un métabolite)/(aire du pic du standard interne x quantité d'échantillon).

3/ Quantification de Christensenella spp. - L'ADN contenu dans les échantillons a été extrait en utilisant le kit NucleoSpin ^® 96 Soil de Macherey-Nagel selon les instructions du fabricant.

- L'ADN extrait total a ensuite été fragmenté aléatoirement en fragments de 350 bp puis utilisé pour construire une librairie en utilisant le kit NEBNext Ultra II par New England Biolabs selon les instructions du fabricant.

- La librairie a ensuite été séquencée en utilisant du séquençage paired-end de 2 x 150 bp sur une plateforme Illumina HiSeq.

- L'abondance des bactéries a été mesurée en créant un catalogue d'espèces métagénomiques (MGS) à partir d'un catalogue de référence contenant 22M de gènes. Ces MGS ont ensuite été associées à un niveau taxonomique adapté. Dans le cas des Christensenella, celles-ci ont été détectées au niveau du genre et sont donc référencées dans cette expérience par Christensenella spp.

La quantité relative de norleucine et l'abondance relative de Christensenella spp ont été analysées et corrélées, obtenant une régression linéaire de R=-0,45 (n=18). Les résultats sont présentés dans le Tableau 3.

[Tableau B]

On constate une corrélation négative entre les bactéries de la famille des Christensenellacées et la norleucine, ce qui démontre un effet protecteur des bactéries de la famille des Christensenellacées notamment contre la toxicité de la norleucine dans les réactions enzymatiques catalysées par le cytochrome P450 et l'inhibition de la synthèse musculaire. Ainsi les bactéries de la famille des Christensenellacées sont capables d'agir en diminuant la production de marqueurs d'une perte de masse musculaire pathologique ou d'une maladie caractérisée par une perte de masse musculaire pathologique, notamment de norleucine. Elles peuvent donc être utilisées pour prévenir et/ou traiter une perte de masse musculaire pathologique ou les maladies caractérisées par une perte de masse musculaire.