Muíante de BAK, método asociado para ia identificación de sustancias moduladoras de BAK y péptido inhibidor de la actividad BAK La presente invención se refiere a unos polipéptidos derivados de BAK y a unos métodos que los emplean para analizar la activación o inhibición funcional de BAK asociada a membrana. Estos métodos son útiles para identificar compuestos de potencial aplicación terapéutica que modulan la actividad proapoptótica de BAK.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La familia de proteínas BCL2 (B-cell lymphoma 2), de la cual forma parte BAK {BCL2 antagonist/killer 1), constituye el principal componente regulador de la maquinaría apoptótica intracelular {Youle y Strasser 2008, Nature Rev Mol Cell Biol 9:47-59). Estas proteínas actúan en el punto de "no-retorno" del proceso apoptótico, modulando la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MME) que posibilita la salida de diversos factores letales desde el interior de la mitocondría hasta el citosol celular. Dada su crucial importancia para la viabilidad celular, los desarreglos en la función de las proteínas de la familia BCL2 han sido asociados con una amplia variedad de patologías humanas, entre las que destacan el cáncer y diversas enfermedades degenerativas e infecciosas. En los últimos años, las proteínas de la familia BCL2 se han convertido en prometedoras dianas terapéuticas. Prueba de ello es que en la actualidad existen varios compuestos contra BCL2 en fases avanzadas de evaluación clínica (G. Lessene y cois. 2008, Nature Rev Drug Discovery 7: 989-1000).

Atendiendo tanto a la presencia de dominios de homología conservados (dominios BH, de "Bcl2 Homolog ) como a criterios funcionales, los miembros de la familia BCL2 pueden ser clasificados en tres grandes subgrupos: 1 ) proteínas proapoptóticas tipo BAK/BAX {BCL2-associated X protein), las cuales contienen los dominios BH1 -BH3, y una vez activadas, inducen directamente la permeabilízación de la MME; 2) proteínas proapoptóticas "sólo-BH3" (tBID (truncated BH3 interacting domain death agonist) y otras), las cuales contienen únicamente el dominio BH3 y actúan a modo de ligandos activadores de BAK/BAX, y 3) proteínas antiapoptóticas tipo BCL2 (BCL2, BCL-X _L {BCL2-like 1), MCL1 [myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)), las cuales contienen los dominios BH1 -BH4 y actúan a modo de ligandos inhibidores de BAK/BAX. Además, algunos miembros de la familia BCL2 incluyendo a BAK, contienen un dominio transmembrana conservado que actúa a modo de punto de anclaje para estas proteínas en la MME.

A pesar de compartir propiedades comunes, distintos miembros dentro de un mismo subgrupo de la familia BCL2 pueden desempeñar funciones fisiológicas no equivalentes. Para el caso de BAK y BAX, se ha demostrado que BAK desempeña un papel fundamental y exclusivo (no compartido por BAX) en la resistencia celular a la apoptosis inducida por múltiples drogas anticancerígenas (Wang y cois 2001 , J Bíol Chem 276: 34307-34317; Gillissen y cois. 2010, J. Cell Biol. 188:851 -862), así como en la inducción prematura o excesiva de la apoptosis asociada con ciertos procesos neurodegenerativos y con la infección por diversos patógenos (Someya 2009, Proc Nati Acad Sci USA 106:19432-19437; Pardo y cois. 2006, J Cell Biol 174: 509-519; Du y cois 2010, Mol Cell Biol 30: 3444- 3452).

Por tanto, existe interés terapéutico por identificar compuestos capaces de modular la actividad proapoptótica de BAK de forma selectiva. Cabe esperar que estos compuestos dirigidos específicamente contra BAK no causen una toxicidad elevada en el organismo, debido a que no alteran la función de otros miembros de la familia BCL2. Resulta extremadamente difícil analizar de forma individualizada y precisa la actividad proapoptótica de BAK en su entorno natural (Basañez y Hardwick 2008, PLOS Biol. 6:1 148-1 151 ). Esto se debe a la extensa y dinámica red de interacciones que establece BAK con múltiples lígandos celulares tanto dentro la familia BCL2 (por ejemplo tBID, MCL1 , y BCL-X _L ) como fuera de ella (por ejemplo, DLP1 /Drp1 (dynamin 1-like protein) (Montessuít y cois. 2010, Cell 142:889-891 ). Además, la activación funcional de BAK es un proceso especialmente complejo, dado que conlleva profundos cambios estructurales en la proteína que ocurren en un entorno de membrana. Es bien conocido que las proteínas de membrana presentan dificultades añadidas para su estudio en comparación con las proteínas hidrosolubles/citosólicas. En este sentido, conviene resaltar que BAK es una proteína integral de la MME, mientras que BAX y la mayor parte de los miembros antiapoptoticos de la familia BCL2 son proteínas anfitrópicas que se localizan tanto en la MME como en el citosol.

Como se ha resaltado anteriormente, una actividad biológica fundamental de las proteínas de la familia BCL2 es la de establecer interacciones proteína-proteína. Estudios estructurales realizados con formas hidrosolubles y purificadas de miembros anfitrópicos de la familia BCL2 han identificado cavidades hidrofóbicas en la superficie de estas moléculas que actúan a modo de sitios de unión para ligandos específicos. Basándose en éstas y otras observaciones, se han desarrollado diversos métodos para cuantificar interacciones entre miembros concretos de la familia BCL2 y sus respectivos ligandos en un entorno acuoso, utilizando sistemas de composición definida (WO2009042237, WO2002040530). Asimismo, utilizando estos métodos para analizar interacciones proteína-proteína en medio acuoso se han identificado péptidos y otros compuestos de potencial aplicación terapéutica dirigidos selectivamente contra miembros anfitrópicos específicos de la familia BCL2 (WO2010068684, WO2010065865). Sin embargo, para el caso de BAK, los estudios estructurales realizados con formas hidrosolubles y purificadas de la proteína no han revelado la existencia de ninguna cavidad hidrofóbica en la superficie de esta molécula que pudiera actuar como sitio de unión para lígandos específicos (Moldoveanu, 2006 Mol Cell 24:677-688). Además, aún no ha sido descrito ningún método que posibilite cuantifícar la interacción entre BAK y sus ligandos en medio acuoso, utilizando sistemas de composición definida. Conviene destacar que todas las investigaciones realizadas hasta la fecha han empleado formas de BAK que no contienen su dominio transmembrana, aparentemente debido a problemas para expresar y/o purificar la forma completa (silvestre) de la proteína. Sin embargo, los estudios realizados en sistemas celulares demuestran que la eliminación del dominio transmembrana de BAK no sólo elimina la localización de la proteína en la MME sino también su actividad proapoptótica (Dewson y cois. 2009, Mol Cell 25:696-703). Estas observaciones sugieren que BAK necesita la presencia de su dominio transmembrana y/o un entorno lipídico apropiado para adoptar una conformación activa. De hecho, se conocen numerosas proteínas integrales de membrana que únicamente adoptan la conformación necesaria para interaccionar con sus ligandos y/o auto-ensamblarse cuando se encuentran correctamente asociadas a una membrana de composición iipídica definida.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un muíante de deleción de la proteína BAK humana (SEQ ID NO: 1 ) que conserva el segmento transmembrana y la función y puede purificarse de manera altamente eficiente debido a su presencia mayoritaria en la fracción soluble resultante del lisado de las células donde se produce. Este muíante carece de entre 4 y 6 aminoácidos de su extremo carboxilo terminal, lo que no afecta a la función de la proteína y sin embargo favorece la purificación de la misma. Además, los autores de la presente invención han desarrollado métodos para examinar de forma controlada la activación funcional de este mutante de BAK, localizado en un entorno lipídico adecuado, con el objetivo de identificar compuestos capaces de modular específicamente la actividad proapoptótica de BAK asociada a membrana. Estos métodos y compuestos son de utilidad en la investigación farmacéutica y clínica de enfermedades asociadas a desarreglos funcionales de BAK.

En la presente invención se describen métodos para analizar la activación funcional de BAK asociada a membrana utilizando sistemas de composición definida, así como la utilización de estos métodos para identificar compuestos que modulan la función proapoptótica de BAK y tienen una potencial aplicación terapéutica. Los autores de la presente invención demuestran que la proteína BAK nativa no puede producirse eficazmente para emplearse en ensayos de screening (cribado) de moléculas que modulen su actividad apoptótica, y la proteína BAK truncada que carece de dos aminoácidos en su extremo carboxilo terminal, tampoco, dado que ambas son tóxicas para las células que las producen y se localizan mayoritariamente en el precipitado del lisado celular. Sin embargo, los autores han encontrado que las proteínas truncadas que carecen de 4 o de 6 aminoácidos de su extremo carboxilo terminal, no son tóxicas y sí pueden purificarse de manera eficaz, puesto que se presentan mayoritariamente en la fracción soluble del lisado celular de las células que las producen.

El hecho de que la proteína BAK sólo carezca de 4 a 6 aminoácidos de su extremo carboxilo terminal implica que es muy similar a la proteína nativa ya que contiene su dominio transmembrana, lo que aumenta enormemente las posibilidades de que las sustancias que demuestren una capacidad para modular la actividad de BAK in vitro, lo hagan también in vivo, y sean, por tanto, buenos candidatos para su uso en la preparación de medicamentos.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un mutante derivado de la proteína BAK humana, el cual contiene su dominio transmembrana y preserva rasgos funcionales básicos de la proteína silvestre pero carece de 4 a 6 aminoácidos de su extremo carboxílo terminal.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método que permite analizar la activación funcional de este mutante de BAK unido a membranas modelo de composición lipídica definida.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a la utilización del método del segundo aspecto de la invención para identificar sustancias que modulan la activación funcional de BAK.

Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido con actividad inhibidora de BAK, así como a una composición que lo comprenda y al uso del péptido o la composición para la fabricación de un medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende la proteína BAK truncada del primer aspecto de la invención.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptído donde la secuencia aminoacídica es la de la proteína BAK humana truncada de manera que se eliminan de cuatro a seis aminoácidos de su extremo carboxílo terminal o una variante bioequivalente. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, se eliminan cuatro aminoácidos del extremo carboxílo terminal. En una realización más preferida, la secuencia aminoacídica del polipéptído es SEO ID NO: 3. El término "variante bioequivalente", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una molécula con la misma función que la molécula descrita, que puede presentar ligeras variaciones con respecto a la molécula descrita sin que dichas variaciones aporten ningún efecto técnico añadido a dicha molécula.

En una realización preferida, el polipéptido del primer aspecto de la invención se conjuga (se une mediante enlace covalente) a un marcador. Preferiblemente, dicho marcador es un fluoróforo. Más preferiblemente, el fluoróforo es 7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazoliletilenodiamina (NBD).

El término "marcador", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una molécula que facilita la detección de la molécula a la que se une y, por tanto, la marca. Existen multitud de moléculas marcadoras bien descritas y conocidas sobradamente por el experto en la materia. Un marcador puede ser una molécula que emite energía (radioactividad, luz, fluorescencia), una enzima capaz de generar un producto detectabie (coloreado, fluorescente, luminoso), una proteína o un epítopo fácilmente detectabie por métodos inmunológicos o basados en el reconocimiento y la afinidad de unión. Ejemplos de marcadores son isótopos radioactivos, la proteína luciferasa, proteínas fluorescentes o fluoróforos, enzimas como la peroxídasa o la fosfatasa alcalina, epítopos como myc o FLAG, proteínas como GST (glutatión S transferasa) o biotina, etc. Un fluoróforo es una sustancia que emite luz con una longitud de onda característica (longitud de onda de emisión (Aem)) cuando es excitada con una luz con una longitud de onda característica (longitud de onda de excitación (Aex)) y menor que la longitud de onda de emisión. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar sustancias que modulen la activación funcional de BAK asociada a membrana, que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto el polípéptido del primer aspecto de la invención con un sistema de membranas rico en lípídos mitocondriales para que formen un complejo,

(b) poner en contacto el producto resultante de la etapa (a) con la sustancia a ensayar,

(c) determinar la activación o inhibición funcional del polipéptído de (a).

En la presente memoria, se entiende por sustancias o compuestos que modulan la actividad de BAK, aquellos que cambian el estado de actividad de BAK, es decir, que activan o inhiben dicha proteína. Dado que BAK es una proteína proapoptótica, cuando se activa, induce la apoptósis, mientras que cuando se inhibe, inhibe la apoptósis. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el polipéptído descrito en la etapa (a) es NBD-SEQ ID NO: 3 (el polipéptído cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3 conjugado a NBD) o una variante bíoequivalente del mismo. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el sistema de membranas descrito en la etapa (a) es un conjunto de liposomas. En la presente invención, el termino "liposomas" indica un conjunto de vesículas puramente lipídicas de composición definida. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el lípido mitocondrial es cardiolipina. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la activación o inhibición funcional del polipéptído NBD-SEQ ID NO: 3 se mide medíante fluorescencia. Los autores de la presente invención han demostrado que los niveles de fluorescencia analizados con una Aex= 470 nm y analizados para una Aem= 530 nm permiten la medición de la activación o la inhibición de la actividad de BAK (Figs. 6B y 7A). Otro aspecto de la invención se refiere al uso de las sustancias identificadas medíante el método del segundo aspecto de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades relacionadas con la resistencia a la activación de BAK. Preferiblemente, la enfermedad es cáncer.

Se ha descrito que en el cáncer, la resistencia adquirida frente al tratamiento con diferentes fármacos antitumorales es debida, en parte, a un bloqueo de la activación de BAK (Youle y Strasser, Nature Rev Mol Cell Biol 2008. 9:47-59; Lessene y cois. Nature Reviews in Drug Discov. 2008. 7, 989-1000).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de las sustancias identificadas mediante el método del segundo aspecto de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades relacionadas con la hiperactivación de BAK. En estas enfermedades se produce una activación prematura o excesiva de BAK. Las enfermedades relacionadas con la hiperactivación de BAK pueden ser todas aquellas enfermedades relacionadas con una muerte apoptótica anómala. Algunos ejemplos no limitantes de estas enfermedades asociadas con una excesiva o prematura apoptosis dependiente de BAK, son la aspergílosis invasiva causada por la bacteria Aspergillus fumigatus (Pardo y cois. J Cell Biol. 2006; 1 74(4):509-19), la gonorrea causada por Neísseria gonorrheae (Kepp y cois. EMBO J. 2007;26{3):825-34), la artrosis causada por Pseudomonas aeruginosa (Du y cois. Mol Cell Biol. 2010; 30{14):3444-52), la encefalitis o la poliartritis causadas por virus del género Alphavirus (Urban y cois. Cell Death Differ. 2008 15(9): 1396-407), o un tipo de sordera denominada presbiacusia {Someya y cois. Proc Nati Acad Sci U S A. 2009; 106(46):19432-7). Otro aspecto de la invención se refiere a un fragmento del polipéptido del primer aspecto de la invención (en adelante llamado péptído de la invención) que consiste en los aminoácidos 164 a 185 de dicho polipéptido, un fragmento o un derivado del mismo. En una realización preferida, la secuencia de dicho fragmento o péptido es SEQ ID NO: 7

Los autores de la presente invención han demostrado que el péptido de SEQ ID NO: 7 (BAK ^164"185 ) inhibe BAK (Fig. 7) y presenta además una baja IC50 (tabla 1 ), menor que la IC50 de los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 8 (BAK ⁶⁸ "), SEQ ID NO: 9 BAK ^120"146 , SEQ ID NO: 10 (BAK ^{167" 181} ), SEQ ID NO: 1 (vBAK ^{164" 85} ', variante de BAK o variante artificial) y SEQ ID NO: 12 (BAX ^{146" 66} ). SEQ ID NO: 10 (BAK ^167"181 ) es un fragmento de SEQ ID NO: 7 y también inhibe BAK aunque con una IC50 mayor. En el contexto de la presente invención, el término "variante de BAK" se refiere a un péptido obtenido por sustitución o eliminación de uno a tres residuos de aminoácido en el correspondiente péptido la proteína BAK humana nativa. Por otro lado, se entiende por el termino "derivado" un producto obtenido a partir del péptido original por cualquier reacción química sintética o natural. Por último, el término "fragmento" significa moléculas obtenidas del péptido original eliminando secuencias de entre cuatro y diez aminoácidos

Estos péptidos, o preferiblemente una composición farmacológicamente aceptable de los mismos, pueden encontrar aplicación en el tratamiento y/o prevención de patologías humanas relacionadas con la activación prematura o excesiva de BAK.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición (en adelante llamada composición de la invención) que comprende el péptido de la invención. Preferiblemente, la composición es una composición farmacéutica. Más preferiblemente, la composición comprende un vehículo o un excipiente.

El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprenda al menos el péptido de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones para el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con BAK.

Un "excipiente "es un componente de una composición farmacéutica que no es un compuesto activo sino un diluyente, un vehículo o un relleno, entre otros, que se considera farmacéuticamente aceptable cuando es seguro, no es tóxico y no presenta efectos adversos. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del compuesto, lo estabiliza o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término "farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, debe ser compatible con dichos componentes

El "vehículo" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

En otra realización aún más preferida, la composición farmacéutica además comprende otra sustancia activa. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "principio activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención o de la composición de la invención para la preparación de un medicamento. Preferiblemente, dicho uso es para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una hiperactivación de BAK. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit (en adelante llamado "kit de la invención") caracterizado porque comprende el polipéptido del primer aspecto de la invención. En una realización preferida, el kit de la invención comprende un conjunto de membranas ricas en lípidos mitocondriales. Preferiblemente, el kit comprende liposomas ricos en lípidos mitocondriales. Más preferiblemente, los liposomas son ricos en cardíolipina. En una realización preferida, el kit de la invención comprende un activador y/o un inhibidor de BAK. Los conjuntos de membrana, como por ejemplo los liposomas ricos en cardíolipina, pueden congelarse y almacenarse así para ser empleados cuando se necesiten. Además, pueden sufrir al menos dos ciclos de congelación/descongelación sin que su utilidad para llevar a acabo el método de la invención se vea perjudicada.

Según el método de la invención, un compuesto o sustancia se denomina "activador de BAK" cuando aumenta la relación de intensidades de fluorescencia del polipéptido de la invención unido a un marcador fluorescente en presencia de liposomas y en ausencia de liposomas. Por ejemplo, un activador de BAK es tBID o DLP1 . Además, el compuesto o sustancia ha de aumentar esta relación de forma dependiente de dosis y de forma saturable. Para cuantificar la potencia de un compuesto o sustancia activador de BAK, se analizan los resultados experimentales a una función no lineal utilizando ecuaciones matemáticas apropiadas y bien conocidas por el experto en la materia.

Según el método de la invención, un compuesto o sustancia se denomina "inhibidor de BAK" cuando disminuye la relación de intensidades de fluorescencia del polipéptido de la invención unido a un marcador fluorescente en presencia de liposomas y en ausencia de liposomas. Por ejemplo, un inhibidor de BAK es BCLXL o MCL1 . Además, el compuesto o sustancia ha de disminuir dicha relación de forma dependiente de dosis y saturable, incluso en presencia de un activador fisiológico de BAK como por ejemplo, pero sin limitarse, tBID. Para cuantificar la potencia de un compuesto os sustancia inhibidor de BAK, se analizan los resultados experimentales a una función no lineal utilizando ecuaciones matemáticas apropiadas y bien conocidas por el experto en la materia.

Los métodos descritos pueden ser utilizados para analizar una amplia variedad de sustancias, incluyendo, pero no limitándose, colecciones de biomoléculas o librerías de pequeños compuestos orgánicos o naturales de menos de 500 dalton. Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo en distintos formatos que se adapten al número de compuestos o sustancias a analizar. Los autores de la presente invención han demostrado la eficacia de los métodos de la invención llevados a cabo en microplacas de 96 pocilios, que facilitan la medida de la fluorescencia de manera robotízada.

Para mejorar la eficiencia del ensayo, pueden emplearse reactivos adicionales, como por ejemplo, pero sin limitarse, MgC y seroalbúmina bovina (BSA)

Los compuestos activadores o inhibidores de BAK identificados en estos ensayos pueden ser utilizados en la investigación farmacéutica y clínica de enfermedades asociadas con desarreglos funcionales de BAK, como componentes únicos o en mezclas complejas.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para la identificación de sustancias que modulan la activación de BAK.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema de la proteína BAK donde se indican las regiones oc- helicoidales y los dominios conservados BH1 , BH2, BH3 y transmembrana (TM) de la proteína. Asimismo, se indican las secuencias del extremo carboxilo terminal correspondientes a la proteína BAK humana de tipo silvestre (BAK), y a los mutantes de deleción BAKAC2, BAKAC4 y ΒΑΚΔ06.

Figura 2. La Figura 2A muestra ensayos por duplicado de SDS-PAGE e inmunoblot con anticuerpo anti-BAK para determinar la distribución de distintas formas recombinantes de BAK en el sobrenadante (S) y en el pellet (P) obtenidos tras centrifugar los lisados bacterianos. La Figura 2B muestra un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie conteniendo cantidades crecientes de BAKAC4 purificada por procedimientos cromatográficos a partir de la fracción soluble del lisado bacteriano.

Figura 3. La Figura 3A muestra ensayos por duplicado de SDS-PAGE e inmunoblot con anticuerpo anti-BAK para determinar la distribución de BAKAC4 en el sobrenadante (S) y en el petiet (P) obtenidos tras centrifugar la proteína ΒΑΚΔ04 incubada en presencia (+) o en ausencia (-) de mitocondrias aisladas. La Figura 3B representa el efecto que ejerce ΒΑΚΔ04, dos ligandos activadores naturales de BAK (tBID y DLP1 /Drp1 ), o combinaciones de ambos tipos de moléculas, sobre la permeabilización de la MME. Las concentraciones de proteína y mitocondrias fueron 0,4 μΜ y 1 mg proteína/ml, respectivamente. Se representan valores medios de 2 medidas individuales más los errores estándar. Figura 4. La Figura 4A representa ensayos por duplicado de SDS-PAGE e inmunoblot con anticuerpo anti-BAK para determinar la distribución de BAKAC4 en el sobrenadante (S) y en el pellet (P) obtenidos tras centrifugar ΒΑΚΔ04 incubada en presencia (+) o en ausencia (-) de liposomas enriquecidos en cardiolipina. La Figura 4B representa el efecto de ΒΑΚΔ04, dos ligandos activadores naturales de BAK (tBID y DLP1/Drp1 ), o combinaciones de ambos tipos de moléculas sobre la liberación de 1 , 3, 6-aminonaftaleno-tri-sulfonato (ANTS) encapsulado en liposomas enriquecidos en cardiolipina. En todos los casos, las concentraciones de proteína y lípido total fueron 0,1 μΜ y 0,2 mM, respectivamente. Se representan valores medios de 3 a 6 medidas individuales más los errores estándar.

Figura 5. Estructura de ΒΑΚΔ021 resuelta por cristalografía de rayos X, señalando las dos cisternas endógenas utilizadas para marcar BAKAC4 con el fluoróforo NBD (7-nítrobenz-2-oxa-1 ,3-diazolíletílenodiamina).

Figura 6. La Figura 6A representa espectros de la emisión de fluorescencia de NBD-BAKAC4 en distintas condiciones ( excitación=470 nm). La Figura 6B muestra el efecto de ligandos activadores (tBID, DLP1/Drp1 ) o inhibidores (MCL1 , BCLXL) de BAK sobre la relación de intensidades de fluorescencia de NBD-BAKAC4 en presencia y en ausencia de liposomas enriquecidos en cardiolipina (Aexcitación=470 nm, Aemisión=530nm). En todos los casos, las concentraciones de proteína y lípido total fueron 0,1 μΜ y 0,1 mM, respectivamente. Se representan valores medios de 3 a 9 medidas individuales más los errores estándar. F, fluorescencia.

Figura 7. La Figura 7A muestra el efecto que ejercen dosis crecientes de los péptidos BAK ^68"99 (SEQ ID NO:8), BAK ¹²⁰¹⁴⁶ (SEQ ID NO: 9) y BAK ^{164- 185} (SEQ ID NO: 7) sobre la fluorescencia relativa de NBD-BAKAC4 incubada con tBID en presencia (Fliposoma) y en ausencia (Fsolución) de líposomas enriquecidos en cardiolipina. Las concentraciones de NBD- BAKAC4, tBID y lípido fueron 0,1 μΜ, 0,05 μΜ, y 0,1 mM, respectivamente. Se representan valores medios de 3 a 6 medidas individuales más los errores estándar. La línea continua representa el ajuste de los datos experimentales a una función no lineal para obtener el valor IC50 ("half maximal inhibitory concentratiorí) correspondiente al péptido BAK ^164"185 . La Figura 7B representa el efecto de los tres péptidos sintéticos sobre la permeabilización de la MME inducida por ΒΑΚΔ04 activada por tBID. Las concentraciones de péptido, BAKAC4, tBID, y mitocondrias fueron respectivamente, 12 μΜ, 0,4 μΜ, 0,2 μΜ, y 1 mg proteína/ml. Se representan valores medios de al menos 2 medidas individuales más los errores estándar.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de la proteína mutante de la invención, así como del método de criba de identificación de moléculas capaces de modular la actividad de BAK.

EJEMPLO ^* ! : PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS BAK, BAKAC2, BAKAC4, y BAKAC6.

Para la expresión de la proteína BAK fusionada a la proteína 6HisLipoil se utilizó el vector pRSETHisüpoTEV (Weinberg y cois. 2004. J. Mol. Bíol. 342, 801 -81 1 ). Los plásmidos para expresar los mutantes de deleción BAKAC2 (SEQ ID NO: 2), ΒΑΚΔ04 (SEQ ID NO: 3), y BAKAC6 (SEO ID NO: 4) se prepararon por procedimientos de biología molecular conocidos por el experto en la materia, incluyendo pero no limitándose, a técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) estándares, digestión por enzimas de restricción, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada, ligación con una ligasa y confirmación de la secuencia. Para expresar las distintas formas recombínantes de BAK fusionadas a 6Hisl_ipoíl (BAK6hislipoil es SEQ ID NO: 5 y BAKAC4-6hislipoil es SEQ ID NO: 6) en E. coli se siguió un procedimiento similar al descrito en Sot y cois. 2007, J. Biol. Chem. 282:29193-29200. Se transforma la cepa bacteriana adecuada (preferentemente C41 pLys) con el plásmido de interés. Tras alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, se añade 0,5 mM isopropil-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para inducir la expresión de la proteína recombinante en la célula huésped. Tras incubar 15 horas a 20 ⁹ C, las bacterias se recogen, se resuspenden y se lisan utilizando una prensa de French. A continuación, se centrifuga el lisado durante 30 minutos a 30.0000 para obtener una fracción soluble o sobrenadante (S) y un precipitado (P). Sorprendentemente, en el caso de BAK y BAKAC2, la práctica totalidad de la proteína expresada se localizó en el precipitado del lisado bacteriano. Este hecho, unido a la elevada toxicidad de la expresión de BAK y BAKAC2 para las bacterias, imposibilitó purificar ambas proteínas recombínantes en condiciones nativas. Sin embargo, para el caso de BAKAC4 y ΒΑΚΔ06, la mayor parte de la proteína expresada se localizó en el sobrenadante del lisado bacteriano y no se observó una elevada toxicidad en las bacterias (Figura 2A).

EJEMPLO 2: OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA MUTANTE ΒΑΚΔ04.

En primer lugar, se obtiene un lisado bacteriano a partir de células que expresan 6HisLipo-BAKAC4 siguiendo el protocolo descrito en la sección anterior. A continuación, se carga la fracción soluble del lisado sobre una columna de Ni ²⁺ agarosa (Qiagen) equilibrada con tampón A (50mM Hepes, pH7.5, 500mM NaCI, 5mM imídazol, 1 mM TCEP, 10% glicerol). Para reducir el grado de contaminantes, se lava la columna con tampón A conteniendo imidazol 20 mM. Para eluír la proteína 6Hísl_ípo-BAKAC4 se lava la columna con tampón A conteniendo imidazol 500 mM. Para eliminar el fragmento 6HisLipoTEV, se trata la fracción eluida con proteasa 6HisTEV siguiendo indicaciones del fabricante (GE Healthcare), y se pasa la muestra sobre otra columna de Ní ²⁺ equilibrada con tampón A sin imidazol. Seguidamente, se recoge la fracción que no se ha unido a la columna conteniendo la proteína BAKAC4, y se concentra la proteína utilizando filtros Amicon Y10. Posteriormente, se pasa la muestra sobre una columna de gel filtración analítica (preferiblemente Superdex 75) equilibrada en tampón A sin imidazol, utilizando un sistema de cromatografía AKTA (GE Healthcare). Finalmente, se identifican las fracciones de elución correspondientes a BAKAC4 por SDS-PAGE e inmunoblot con anticuerpo anti-BAK, se concentra de nuevo la proteína, y se determina su concentración por espectroscopia de absorción de luz UV a 280 nm.

EJEMPLO 3: OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA NBD-BAKAC4.

Para producir NBD-BAKAC4 se utilizó un procedimiento similar al descrito en Saksena y cois. 2009, Cell 136:97-109 para el mareaje de proteínas con NBD. En primer lugar, se pasa 1 mg de ΒΑΚΔ04 por una columna de cromatografía de desalado tipo PD-10 (GE Healthcare) equilibrada en 100 mM KCI, 10 mM Hepes pH 7,5. A continuación, se añade el derivado iodoacetamida de NBD (IANBD, GE Healthcare) a una concentración 5 veces superior a BAKAC4, y se incuba la mezcla 2 horas a temperatura ambiente. Tras detener la reacción añadiendo 5 mM TCEP, tris(2- carboxyethyl)phosphine se vuelve a pasar la mezcla por una columna de desalado PD-10 equilibrada en tampón A sin imidazol para separar la proteína NBD-BAKAC4 marcada del IANBD libre. Finalmente, se determina la concentración de la proteína, se distribuye la muestra en alícuotas de 30-100 μΙ, se congela en N ₂ líquido y se almacena a -80 ^e C. Conviene señalar que no se han encontrado diferencias significativas entre NBD-BAKAC4 y BAKAC4 tanto en ensayos con liposomas como en ensayos con mitocondrías aisladas. Siguiendo este protocolo, se obtiene una preparación homogénea y pura de ΒΑΚΔ04, la cual preserva rasgos funcionales básicos de la proteína BAK de existencia natural (Figuras 2B Y 3).

EJEMPLO 4: Análisis de la capacidad de BAKAC4 para unirse a mitocondrías y permeabilizar la MME.

Para determinar si BAKAC4 preserva los rasgos funcionales básicos de la proteína BAK silvestre, se utilizaron procedimientos conocidos por el experto en la materia con mitocondrías aisladas de levadura las cuales carecen completamente de proteínas de la familia BCL2 (véase LJ Siskind y cois. 2002, J. Biol. Chem. 283:6622-6630). Por un lado, se comprobó la capacidad de BAKAC4 para asociarse con las mitocondrías (Figura 3A). Por otro lado, se verificó la capacidad de BAKAC4 para permeabilizar la MME en presencia de dos activadores fisiológicos de la proteína BAK silvestre (tBID y DLP1/Drp1 ) (Figura 3B).

EJEMPLO 5: Fabricación de liposomas, ensayos de unión de ΒΑΚΔ04 y liberación de ANTS.

Los ensayos en liposomas para desarrollar una búsqueda a gran escala de potenciales compuestos moduladores de BAK son mejores que los ensayos en mitocondrias debido a la menor estabilidad de las mitocondrías (entre 3 y 5 horas) respecto a los liposomas (varios días y hasta semanas), al mayor coste y duración de los ensayos con mitocondrias respecto a los ensayos con liposomas, y a la mayor ambigüedad en la interpretación de resultados obtenidos en ensayos con mitocondrias respecto a ensayos con liposomas, que por su complejidad composicional, estructural y dinámica aumentan la variabilidad de los resultados.

Los Iiposomas se fabricaron utilizando métodos bien conocidos en el campo, preferiblemente por extrusión a través de filtros de policarbonato de 0,2 μΜ (véase Terrones y cois. 2004 J. Biol. Chem. 279:30081 -30091 ). Se estableció la siguiente composición lipídica óptima para realizar los ensayos con Iiposomas descritos en esta invención: fosfatidilcolina de yema de huevo (20 %mol), fosfatidiletanolamína de yema de huevo (20 %mol), fosfatidilinositol de cerebro de rata (10 %mol) y cardiolipina de corazón de rata (50 %mol). Estos Iiposomas se denominan "Iiposomas enriquecidos en cardiolipina" en la presente invención. Cabe señalar que la cardiolipina es un lípido específico de la mítocondria cuyos niveles en la MME aumentan durante la apoptosis (Kagan y cois. 2005, Nat Chem Biol. 1 :223-232).

A continuación, comprobamos que BAKAC4 se une a Iiposomas enriquecido en cardiolipina pero no a Iiposomas sin cardiolipina (Figura 4A). Seguidamente, nos planteamos utilizar el método de liberación de ANTS (1 , 3, 6-aminonaftaleno-tri-sulfonato) encapsulado en Iiposomas (véase Terrones y cois. 2004 J. Biol. Chem. 279:30081 -30091 ) para evaluar la modulación funcional de BAKAC4 por diferentes compuestos. Sin embargo, comprobamos que este método no es apropiado para examinar la modulación funcional de BAKAC4 por moléculas de interés, tales como DLP1/Drp1 o el péptído sintético BAK ^64"185 (tabla 1 ) las cuales producen liberación de ANTS por sí solas (Figura 4B).

EJEMPLO 6: ENSAYOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS MODULADORES DE BAK A NIVEL DE MEMBRANA.

Se han desarrollado ensayos basados en cambios de la fluorescencia de la proteína NBD-BAKAC4 asociada a Iiposomas enriquecidos en cardiolipína para identificar, de forma controlada y cuantitativa, compuestos que modulan la función de BAK a nivel de membrana.

Tal y como muestra la Figura 5, BAK contiene dos residuos cisternas expuestos al solvente, los cuales pueden ser utilizadas para el mareaje de ΒΑΚΔ04 con el fluoróforo NBD (ver Ejemplo 3). Este fluoróforo ha sido utilizado para analizar cambios conformacionales en otras proteínas de membrana (Johnson 2005, Traffic 6: 1078-1092). En la Figura 6A se representan los espectros de fluorescencia de la proteína NBD-BAKAC4 tras ser incubada con el tampón de reacción, con tBID, o con tBID junto con liposomas enriquecidos en cardiolipína. Se observa que cuando NBD-BAKAC4 es incubada con tBID en ausencia de liposomas no se producen cambios significativos en el espectro de fluorescencia del NBD. Por el contrario, cuando NBD-BAKAC4 se incuba con tBID junto con liposomas se produce un aumento dramático de la intensidad de fluorescencia del NBD, acompañada por un desplazamiento hacia el azul de la longitud máxima de emisión del fluoróforo. Estos resultados demuestran que tBID provoca un profundo cambio en la estructura de NBD-BAKAC4 asociado a liposomas enriquecidos en cardiolipína, de manera análoga a lo observado durante la activación funcional de BAK en su entorno natural.

Se realizaron estudios adicionales para comprobar que varios lígandos activadores de BAK silvestre (tBID y DLP1 ) producen un aumento en la relación de intensidades de fluorescencia del NBD-BAKAC4 en presencia y en ausencia de liposomas, mientras que varios lígandos inhibidores de BAK silvestre (MCL1 y BCLXL) producen el efecto contrario (Figura 6B). Se emplearon los péptidos sintéticos descritos en la tabla 1 y se establecieron las siguientes etapas para la identificación de compuestos que modulan la función de BAK a nivel de membrana, así como para cuantificar su potencia:

-proporcionar una sustancia candidata,

-formar dos tipos de mezcla de reacción: NBD-BAKAC4 sin liposomas y NBD-BAKAC4 unida a liposomas enriquecidos en cardiolipina,

-medir la intensidad de fluorescencia de los dos tipos de mezclas de reacción (Aex= 70 nm, Aem=530 nm),

-añadir la sustancia candidata a los dos tipos de mezclas de reacción en dosis crecientes (preferiblemente desde 0 μΜ hasta 10-100 μΜ),

-incubar las muestras en condiciones suficientes para permitir que la sustancia candidata produzca la activación funcional de NBD- BAKAC4 unida a liposomas, y

-medir de nuevo la intensidad de fluorescencia de los dos tipos de mezclas de reacción (Aex=470 nm, Áem=530 nm) para determinar un aumento o disminución producido por la sustancia candidata en la relación de intensidades de fluorescencia del NBD-BAKAC4 en presencia de liposomas y en ausencia de liposomas.

EJEMPLO 7: IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE NBD- ΒΑΚΔ04 ASOCIADA A LIPOSOMAS. Analizamos el efecto sobre la activación funcional de NBD-BAKAC4 asociado a liposomas de tres péptidos sintéticos.

Se prepararon la proteína NBD-BAKAC4 y los liposomas enriquecidos en cardiolipina como se ha descrito anteriormente. La proteína tBID se preparó como se describe en Terrones y cois. 2004, J Biol Chem. 279:30081 -30091 . Los péptidos se obtuvieron de AMS Bíotechnology (Oxford, Reino Unido). Se prepararon 2 tipos de mezclas de reacción: por un lado, NBD-BAKAC4 (0,1 μΜ) sin liposomas; por otro lado, NBD-BAKAC4 (0,1 μΜ) con liposomas (0,1 mM). A cada mezcla de reacción se añadió una de las siguientes concentraciones de péptido: 0 μΜ, 0,25 μΜ, 0,5 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ, 4 μΜ, 8 μΜ, o 12 μΜ. Se incubaron las mezclas de reacción durante 5 minutos a 37 ^S C. Se añadió una concentración subóptima de tBID (0,5 μΜ) a todas las mezclas de reacción. Se incubaron de nuevo las mezclas de reacción durante 30 minutos a 37 ⁹ C. Los ensayos se realizaron en una microplaca de 96 pocilios con fondo translúcido y paredes opacas y las medidas de fluorescencia del NBD se realizaron en un lector de placas de fluorescencia convencional (Gemini EM, MDS Anal. Technologies), siendo Aex=470 nm y Aem=540 nm. El tampón de reacción fue 100 mM KCI, 10 mM Hepes pH 7,5, 1 mM TCEP. La temperatura de los ensayos fue 37 ^S C. Las medidas se realizaron por triplicado.

Para cada mezcla de reacción, se determinó la relación de intensidades de fluorescencia del NBD-BAKAC4 en presencia y en ausencia de liposomas (Fliposoma/Fsolución). Para determinar la potencia de inhibición del péptido BAK ^164"185 , se ajustaron los datos experimentales a una función no lineal utilizando ecuaciones estándares.

Como muestra la Figura 7A y la Tabla 1 , el péptido BAK ^164"185 , que incluye el dominio altamente conservado BH2 de BAK y un fragmento de éste, inhiben la activación funcional de NBD-BAKAC4 asociado a liposomas, mientras que los otros péptidos examinados no tienen un efecto significativo sobre este proceso. Tabla 1

La tabla 1 muestra los valores IC50 obtenidos para los péptidos BAK ^164"

185 _{> BAK} 167-181, _BAK 68-9 _{9j BAK} 120-14 _{6j QAK} ^5 _{y ΒΑ} χ146-166