紫珠总苷提取物及其制备方法和用途 技术领域

本发明涉及中医药领域， 具体涉及紫珠总苷提取物及其制备方法和用途 。 背景技术

紫珠是马鞭草科紫珠属植物的通称， 种类繁多， 在我国大约有 35种， 分 布较为广泛。 紫珠所含的成分主要为黄酮类、 萜类、 苯乙醇苷类以及挥发油类 等。 其中苯乙醇苷类是其含量较多的化学成分， 因结构中大多含有苯丙酰基苷 元， 因此也被称为苯丙素苷类化合物。 已有文献报道， 苯乙醇苷类成分具有止 痛抗菌消炎、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗氧化、 保肝护肝和碱基修复作用， 对于糖尿 病及相关疾病， 学习、 记忆能力低下等都具有明显的改善作用。 近年来， 随着 国内外对其研究的深入，越来越多的文献资料 表明苯乙醇苷类化合物具有防治 神经退行性疾病的作用， 尤其是在改善老年痴呆症、 帕金森病上效果明显。 中 国专利申请 CN200710040195.2报 ϋ ^肉苁蓉中制备肉苁蓉总苷（苯乙醇苷类 成分）提取物， 并报道了该提取物用于治疗帕金森病的用途。 中国专利 CN201010146367.6公开了 杷叶紫珠 Callicarpci kochi醒 )的地上部分中 制备以连翘酯苷 B和毛蕊花糖苷为主要特征成分的提取物，并� �开了该提取物 用于治疗老年痴呆药物中的应用。

然而， 肉苁蓉属于濒危名贵中药材， 产量有限， 枇杷叶紫珠以野生为主， 产量小， 并且该两种药材中苯乙醇苷类成分含量低， 因此以肉苁蓉和枇杷叶紫 珠为原料制备苯乙醇苷类成分， 生产成本高， 不适合持续性发展。 因此， 用资 源丰富、价格便宜、并且苯乙醇苷类物质含量 高的药材来制备治疗神经退行性 等疾病的药物有优越性及需求。 另外， 由于苯乙醇苷类物质药理活性广泛， 苯 乙醇苷类物质的新药效及治疗作用也值得深入 的开发。

或杜虹花 ( Callicarpa formosana Rolfe )的紫珠总苷提取物， 该提取物以苯乙 醇苷类成分毛蕊花糖苷和 Arenarioside为特征性活性成分，对于神经退行性 疾 病具有治疗功效。 另外， 该提取物还对湿疹或皮炎具有治疗功效。

本发明提供以下技术方案：

1、 紫珠总苷提取物， 以重量计， 其含有 18% ~ 45%毛蕊花糖苷和 15% ~ 40% Arenarioside, 所述提取物由华紫珠 ( Callicarpa cathayana H.T.Chang) 或杜虹花 ( Callicarpa formosana Rolfe )的叶（优选为干燥叶）制备。

2、 根据技术方案 1的紫珠总苷提取物， 以重量计， 其含有 28%45%毛 蕊花糖苷。

3、根据技术方案 1或 2的紫珠总苷提取物， 以重量计，其含有 28%~38% 毛蕊花糖苷。

4、 根据技术方案 1-3 中任一项的紫珠总苷提取物， 以重量计， 其含有 24%~40%Arenarioside。

5、 根据技术方案 1-4 中任一项的紫珠总苷提取物， 以重量计， 其含有 25%~35%Arenarioside„

6、技术方案 1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物的制备方法 ， 其包括以 下步骤：

( 1)将华紫珠 Callicarpa cathayana H.T.Chang )或杜虹花 ( Callicarpa formosana Rolfe )的叶（优选为干燥叶）粉碎， 用溶剂提取 1~3次， 所述溶 剂为水、 醇或者氷与醇的混合物；

( 2 )将各次提取液合并， 减压浓缩除去步驟（ 1 )所述的有机溶剂； 加入 0.5倍~2倍体积量的水， 静置过夜， 离心或过滤得到上清液；

( 3a )使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱� �用水和 /或稀醇水溶液 洗涤， 以除去杂质，然后以较高浓度的醇水溶液洗脱 ，收集洗脱液，减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物； 或者

(3b)用有机溶剂萃取上清液， 将有机相减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷 提取物。

7、 根据技术方案 6所述的制备方法， 其中步驟（1) 中， 提取方法选自 闪式提取法、 回流提取法、 微波提取法、 超声提取法和渗漉提取法。

8、根据技术方案 6或 7所述的制备方法， 其中步驟（ 3a )中， 所述树脂 填料选自大孔吸附树脂、 聚醜胺树脂和离子交换树脂。

9、 根据技术方案 6-8中任一项所述的制备方法， 其中步驟（3a)中， 所 述大孔吸附树脂填料为 HPD100、 HPD200、 D101、 AB-8、 SP825、 ADS-7型 等大孔吸附树脂。

10、 根据技术方案 6-9中任一项所述的制备方法， 其中步骤（3a) 中， 所述稀醇水溶液为 0~15体积。 /。的稀醇水溶液。 11、 根据技术方案 6-10中任一项所述的制备方法， 其中步驟（3a ) 中， 所述较高浓度的醇水溶液为 30% - 90体积％的醇水溶液。

12、 据技术方案 6-11中任一项所述的制备方法， 其中步骤（3b ) 中， 所 述有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。

13、 根据技术方案 6-12中任一项所述的制备方法， 其中步骤（3a ) 中， 减压浓缩洗脱液后， 一次或更多次进行以下操作： 用水溶解浓缩液， 使之通过 装填有树脂填料的色镨层析柱， 用水和 /或稀醇水溶液洗涤， 以除去杂质， 然 后以较高浓度的醇水溶液洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩。

14、 技术方案 1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于 治疗或辅 助治疗神经退行性疾病的食品、 保健品或药品中的用途。

15、 技术方案 1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于 治疗或辅 助治疗皮肤病的化妆品、 保健品或药品中的用途。

16、 技术方案 15所述的用途， 其中所述皮肤病为湿疹或皮炎。 附图说明

图 1为来自华紫珠叶的本发明紫珠总苷提取物的� �型的高效液相色谱（使 用 DAD检测器） 图。

图 2 为来自杜虹花叶提取物的本发明紫珠总苷提取 物的典型的高效液相 色谱（使用 DAD检测器） 图。

图 1和 2中， 线性关系： Y=16374*X+18.793, R=0.9997; 其中， Y为峰 面积， X为毛蕊花糖苷的浓度 ( mg/mL ), Arenarioside的含量以毛蕊花糖苷 为标准计。

图 3示出动态轴向压缩高压制备液相色谱图。

图 4示出毛蕊花糖苷单体的高压制备液相色谱图� �

图 5示出 Arenarioside单体的高压制备液相色谱图。

图 6示出了不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量� �定结果。

图 7示出了不同浓度的毛蕊花糖苷对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损 伤的保护作用， 其中 "&&"表示与空白对照组相比 <0.01, "*"表示与模型 组相比 p<0.05， 表示与模型组相比 p<0.01。

图 8示出了不同浓度的 Arenarioside对 MPP ⁺ 诱导的 SH-SY5Y神经细胞 损伤的保护作用， 其中 " &&"表示与空白对照组相比？<0.01， "*"表示与模 型组相比 p<0.05, 表示与模型组相比 p<0.01。 图 9示出了不同浓度的本发明实施例 5制备的紫珠总苷提取物对 MPP+诱 导的 SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用， 其中 "&&" 表示与空白对照组相 比 P<0.01， 表示与模型組相比 p<0.05， 表示与模型组相比 p<0.01。

图 10示出了不同浓度的本发明实施例 4、 6和 7制备的紫珠总苷提取物对 MPP ⁺ 诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用， 其中 "&&"表示与空白对 照组相比 P<0.01， "*"表示与模型组相比 p<0.05， 表示与模型组相比 p<0.01。

图 11 示出了苯乙醇苷类提取物对 MPTP致帕金森小鼠的自主活动的影 响， 其中 1: 空白对照组； 2: 模型组； 3: 肉苁蓉总苷组（400m _g /k _g ) ; 4: 本 发明实施例 6紫珠总苷提取物低剂量组（ 100mg/kg ); 5: 本发明实施例 6紫珠 总苷提取物高剂量組（ 300m _g /kg )； 6:本发明实施例 7紫珠总苷提取物低剂量 组（ 100mg/kg )； 7: 本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量组（300mg/kg );

"&&"表示与空白对照组相比 PO.01, 表示与模型组相比 p<0.05, 表示与模型组相比 ρθ.01, "#"表示与肉苁蓉总苷组相比 P<0.05。

图 12示出了苯乙醇苷类提取物对 MPTP致帕金森小鼠的滚筒行为的影 响， 其中 1: 空白对照組； 2: 模型組； 3: 肉苁蓉总苷组（400mg/kg ) ; 4: 本 发明实施例 6紫珠总苷提取物低剂量组（ 100m _g /k _g )； 5: 本发明实施例 6紫珠 总苷提取物高剂量组（ 300mg/kg )； 6:本发明实施例 7紫珠总苷提取物低剂量 组（ 100mg/kg )； 7: 本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量组（ 300mg/kg );

"&&"表示与空白对照组相比 P<0.01， 表示与模型组相比 p<0.05， 表示与模型組相比 p<0.01， "#"表示与肉苁蓉总苷組相比 Ρ<0.05。

图 13示出了紫珠总苷提取物对东莨菪碱致小鼠跳� ��潜伏期的影响， 其中 1: 空白对照组； 2: 模型组； 3: 枇杷叶紫珠总苷组（300mg/kg ) ;4: 本发明 实施例 6紫珠总苷提取物低剂量组（100m _g /k _g ); 5: 本发明实施例 6紫珠总苷 提取物高剂量组（300mg/kg ) ;6: 本发明实施例 7 紫珠总苷提取物低剂量组 ( 100mg/kg );7:本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量组（ 300mg/kg ); "&&" 表示与空白对照组相比 P<0.01， 表示与模型組相比 p<0.05， 表示 与模型组相比 ρθ.01, "#" 表示与枇杷叶紫珠总苷组相比？<0.05。

图 14示出了紫珠总苷提取物对东莨菪碱致小鼠跳� ��错误次数的影响， 其 中 1: 空白对照组； 2: 模型组； 3: 枇杷叶紫珠总苷组（300mg/k _g ) ;4: 本发 明实施例 6紫珠总苷提取物低剂量组（100mg/k _g ); 5: 本发明实施例 6紫珠总 苷提取物高剂量组（300m _g /k _g ) ;6: 本发明实施例 7紫珠总苷提取物低剂量组 ( 100mg/kg );7:本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量组（ 300mg/kg ); "&&" 表示与空白对照組相比 PO.01, 表示与模型組相比 p<0.05, 表示 与模型组相比 p<0.01, "#" 表示与枇杷叶紫珠总苷组相比？<0.05。

图 15 示出了本发明紫珠总苷提取物及阳性对照药在 不同给药时间对

DNCB致小鼠背部皮肤皮炎-湿疹模型的治疗作� ��。其中， A: 空白对照组； B: 模型组； C : 999 皮炎平阳性对照组（ 500mg 膏 /kg，相当于醋酸地塞米松 0.375mg/kg ); D: 本发明实施例 6紫珠总苷提取物组（ 250mg/kg ); E: 本发 明实施例 8紫珠总苷提物组（ 250m _g /kg )。

图 16示出了各组小鼠皮肤病理组织照片。 其中， A: 空白对照组； B: 模 型组； C : 999 皮炎平阳性对照组 （ 500mg 骨 /kg，相当于醋酸地塞米松 0.375mg/kg )； D: 本发明实施例 6紫珠总苷提取物组（ 250mg/kg )； E: 本发 明实施例 8紫珠总苷提物组（ 250mg/kg )。

图 17示出了本发明紫珠总苷提取物对皮炎-湿疹模 型小鼠真皮内炎性细胞 的影响。其中， A: 空白对照组； B:模型组； C: 999皮炎平阳性对照组（500mg 骨 /kg，相当于醋酸地塞米松 0.375m _g /kg ); D: 本发明实施例 6紫珠总苷提取物 组（ 250mg/kg )； E: 本发明实施例 8紫珠总苷提物组（ 250mg/kg )。 "&&"表 示与空白对照组相比 P<0.01， 表示与模型组相比 p<0.01。

图 18示出了本发明紫珠总苷提取物对皮炎-湿疹模 型小鼠血清中 IL-2 ( a ) 及 TNF-a ( b )的影响。 其中， A: 空白对照组； B: 模型组； C: 999皮炎平 阳性对照組（ 500mg膏 /kg，相当于醋酸地塞米松 0.375mg/kg ); D: 本发明实施 例 6 紫珠总苷提取物组（250m _g /k _g ); E: 本发明实施例 8 紫珠总苷提物组 (250mg/kg)。 "&"表示与空白对照组相比 P<0.05， "&&" 表示与空白对照组 相比 P<0.01, "*"表示与模型组相比 p<0.05, 表示与模型组相比 p<0.01。 具体实施方式

一方面，本发明提供紫珠总苷提取物， 以重量计，其含有 18% ~ 45%毛蕊 花糖苷和 15% ~ 40%Arenarioside。 本发明提取物由华紫珠（ C /ft ¾w ^ cathayana H.T.Chang )或杜 iL¾ ( Callicarpa formosana Rolfe )的叶 (优选干 燥叶 )制备。

毛蕊花糖苷和 Arenarioside的结构式如下：

毛, 花糖苷 Arenarioside 以重量计，本发明紫珠提取物中毛蕊花糖苷的 含量为 18%~45%,优选为 28%45%, 优选为 28%〜38%。 以重量计， 本发明紫珠提取物中 Arenarioside 的含量为 15% ~ 40%， 优选为 24%~40%， 优选为 25%~35%， 优选为 25%40%。

本发明紫珠提取物提取自华紫珠 Callicarpa cathayana H.T.Chang 或杜 iL¾ ( Callicarpa formosana Rolfe )。

华紫珠 ( Callicarpa cathayana H.T.Chang )和杜虹花 ( Callicarpa formosana RW/e)是紫珠属中较为常见的两个种，分布于贵� ��、浙江、江西、福建、广东、 江苏、 湖北、 广西、 云南等地， 并有大规模的人工种植， 是当地重要的经济收 入来源。经过本发明人的研究表明，以重量计 ，这两种紫珠叶中含有大约 2%~ 6%毛蕊花糖苷以及 1% ~ 4%Arenarioside ₀

本发明人通过以下色傳方法对不同紫珠药材中 苯乙醇苷类的含量进行了 分析：

1.测试样品的制备方法：

精密称取测试紫珠药材的干燥叶粉末（过三号 筛） 0.25g, 向其中加入 70 (v/v) %甲醇水溶液 25mL, 称重， 超声提取 20min后， 放冷， 用 70%甲醇 (v/v) %曱醇水溶液补重， 取上清液， 过滤， 取滤液， 备用。

2. 色傅^ ：

色讲柱： Cholester色讲柱（ 4.6*250mm， 5μπι ); 柱温： 40Ό; 检测器： 紫 外检测器（例如 VWD或者 DAD ); 检测波长： 332nm; 流速： F=1.0ml/min; 进样量： ΙΟμΙ;

流动相 Α: 0.1 (v/v) %甲酸 -水， B: 乙腈； 洗脱梯度:

时间 （min ) A ( v/v % ) B ( v/v % )

0 90 10

40 80 20 45 0 100 50 0 100

DAD检测器） 色谱图参见图 1和 2。

不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量（以重量 计）测定结果见表 1和图 6。

表 1 不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量测定结果 金石蚕苷 连翘脂苷 毛 'ϋ花糖 Arenarioside 总苷含量 药材种类 产地

( % ) B ( % ) 苷（％ ) ( % ) ( % ) 华紫珠 贵州 ― ― 4.96 4.32 9.28 大叶紫珠 湖南 ― ― 0.25 0.43 0.68 杜虹花 贵州 ― ― 3.64 2.02 5.66 广东紫珠 湖南 0.68 0.52 0.30 0.00 1.50 小叶紫珠 江西 ― ― 2.33 0.95 3.28 棵花紫珠 海南 ― ― 3.07 0.06 3.13 枇杷叶紫珠 广州 ― 2.2 1.08 ― 3.28 从表 1和图 6可以看出， 华紫珠叶和杜虹花叶中总苷（苯乙醇苷类）含 量 很高， 是其它种属紫珠叶含量的 3~15倍， 高含量的紫珠药材为苯乙醇苷类的 富集纯化带来了巨大的便利。

下表 2列出了现有技术报道的不同药材中苯乙醇苷� �成分的含量。

表 2不同来源药材中笨乙醇苷成分的报道含量 来源 指标成分 文献报道含量 ( % ) 杜 马鞭草科紫珠属 毛蕊花糖苷 0.73-1.36 大叶紫珠 ² 马鞭草科紫珠属 毛蕊花糖苷 0.22-1.38 棵花紫珠 ³ 马鞭草科紫珠属 毛蕊花糖苷 0.04-0.43 肉苁蓉 ⁴ 列当科肉苁蓉属 松果菊苷 0.024-3.13

毛蕊花糖苷 0.032-1.98 地黄叶 ⁵ 玄参科地黄属 毛蕊花糖苷 0.40-2.62 独一味 ⁶ 唇形科独一味属 毛蕊花糖苷 0.02 - 0.80

连翘酯苷 B 0.03 ~ 1.90 红药 ⁷ 苦苣苔科柱苣苔属 车前草苷 D 0.31 - 0.61

毛蕊花糖苷 0.41 - 0.67 木通 ⁸ 木通科木通属 木通苯乙醇苷 B 0.02 ~ 0.80 輕苏 ⁹ 唇形科糙苏属 连翘酯苷 B 1.00 - 1.30

毛蕊花糖苷 0.06 - 0.80 异毛蕊花糖苷 0.01 ~ 0.03

¹ 邹国栋， 程艳阳， 方铁铮等. HPLC法测定紫珠叶中毛蕊花糖苷的含量 [J】. 药物分析杂志，

2010, 30 ( 1 ): 160 - 162;

² 周嵩煜，程艳阳， 方铁铮 . HPLC法测定大叶紫珠中毛蕊花糖苷的含量 [J】. 药物分析杂志， 2010, 30 ( 10 ): 1295 - 1297

³ 李才堂， 文萍， 郭琦丽， 虞金宝， HPLC测定棵花紫珠药材中毛蕊花糖苷的含量 [J】. 中国 实验方剂杂志， 2012， 18 ( 1 ): 84 ~ 86

⁴ 张恒， 李鑫， 热娜.卡斯木等， PR-HPLC测定不同寄主和不同产地肉苁蓉中松果� �苷和麦 角甾苦的含量 [J】. 药物分析杂志， 2003, 4 ( 23 ): 254 - 257；

5边宝林， 王宏浩， 杨健， 5种不同药材中毛蕊花糖苷的含量比较 [J1. 中国中药杂志， 2010, 35 ( 6 ): 739-740

⁶ 潘正， 高运玲， 张涛， 邓杰. HPLC法测定独一味根中环烯瞇萜苷和苯乙醇苷 [J1. 中草药，

2011 , 42 ( 2 ): 279-281;

⁷ 王满元， 樊媛洁， 张静， 龚慕辛 . PR-HPLC同时测定名族药红药中苯乙醇苷类化合� � plantainoside D和毛蕊花糖苷 [Jj. 中国中药杂志， 2010, 35 ( 23 ): 3188 ~ 3191

⁸ 高慧敏， 王智民， 曲莉， 付雪涛， 李琳. RP-HPLCc测定木通中木通苯乙醇苷 B的含量 [Jj, 中国中药杂志， 2007, 32 ( 6 ): 476-478;

⁹ 王争， 邓瑞雪，杨友亮等. HPLC法同时测定糙苏中 3个苯乙醇苷类化合物含量 [J】. 药物分 析杂志， 2011， 31 ( 4 ) :668-670 再一个方面， 本发明提供本发明紫珠总苷提取物在制备用于 治疗或辅助 治疗神经退行性疾病的食品、 保健品或药品中的用途。 如下文实施例所证明的，本发明紫珠总苷提取 物对神经细胞具有显著的保 护作用 ,对帕金森模型小鼠的行为障碍和老年痴呆模� �小鼠的记忆获得性障碍 具有明显的改善作用， 可有效治疗神经退行性疾病。可将本发明紫珠 总苷提取 物与药学上可接受的辅助添加剂或食品上可接 受的辅助添加剂组合，从而制成 用于治疗或辅助治疗神经退行性疾病的产品， 该产品可以为食品、保健品或药 品等。 根据需要， 可将所述产品制成颗粒剂、 片剂、 胶嚢剂、 口服液、 固体饮 料、 袋泡茶、 散剂等形式。 又一个方面，本发明提供本发明紫珠总苷提取 物在制备用于治疗或辅助治 疗皮肤病的化妆品、保健品或药品中的用途。 所述皮肤病选自但不限于皮炎和 湿疹。 如下文实施例所证明的， 本发明紫珠总苷提取物对 DNCB致小鼠的皮炎- 湿疹症状具有良好的治疗和改善作用。可有效 地治疗诸如皮炎或湿疹相关的疾 病。 可将本方面紫珠总苷提取物与药学或食品、化 妆品上可接受的辅料添加剂 组合， 从而制成用于治疗和 /或改善皮炎或湿疹疾病的外用产品， 该产品可以 为化妆品、 保健品及药品等。 根据需要， 可将所述产品制成 sr剂、 乳膏剂、 凝 胶剂、 贴剂、 搽剂、 喷雾剂等形式。

适用于本发明组合物中的药学上可接受的辅助 添加剂或食品、化妆品上可 接受的辅助添加剂包括但不限于粘合剂、润滑 剂、崩解剂、矫味剂、抗氧化剂、 乳化剂、 增稠剂、 防腐剂等。

上述粘合剂包括但不限于羟丙基纤维素、 玉米淀粉、预胶化淀粉、 改性玉 米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基曱基纤维素 、乳糖、 阿拉伯胶、 乙基纤维素、 醋酸纤维素等。

上述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸锌 、硬脂酸钙、滑石、硬脂酸、 胶体二氧化硅、 棕榈酸等。

上述崩解剂包括但不限于交联羧曱基纤维素钠 、 交联聚乙烯吡咯烷酮、淀 粉、 马铃薯淀粉、 预胶化淀粉、 玉米淀粉、 淀粉羟乙酸钠、 微晶纤维素、 羟丙 基纤维素等。

上述矫味剂包括但不限于水果香精、 阿斯巴甜、 甜菊糖苷等。

上述抗氧化剂包括但不限于抗丁羟茴醚（BHA )、 丁羟曱苯（BHT )、 没 食子酸丙酯（PG )、 抗坏血酸、 a -生育酚等。

上述乳化剂包括但不限于阿拉伯胶、 烷基苯磺酸钠、 硬脂酰乳酸钠等。 上述增稠剂包括但不限于曱基纤维素、羧曱基 纤维素、 羟丙基纤维素、 琼 脂、 海藻酸钠、 明胶等。

上述防腐剂包括但不限于山梨酸钟、 苯甲酸钠、 尼泊金酯类等。

另一方面，本发明提供紫珠总苷提取物的制备 方法。本发明紫珠总苷提取 物通过水提取或醇提取或水、醇混合提取方法 ，从华紫珠叶和杜虹花叶中制备。 具体地， 本发明提供紫珠总苷提取物的制备方法， 其包括以下步骤：

( 1 )将华紫珠或杜虹花的叶粉碎， 用溶剂提取 1 ~ 3次， 所述溶剂为水、 醇或者水与醇的混合物；

( 2 )将各次提取液合并， 减压浓缩除去步骤（1 )所述的溶剂； 加入 0.5 倍〜 2倍体积量的水， 静置过夜， 离心或过滤得到上清液；

( 3a )使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱� �用水和 /或稀醇水溶液 洗涤， 以除去杂质， 然后以较高浓度的醇水溶液洗脱，收集洗脱液 ，减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物； 或者

( 3b )用有机溶剂萃取上清液， 将有机相减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷 提取物。

在上述方法中， 步驟（1 ) 中的提取方法选自闪式提取法、 回流提取法、 微波提取法、超声提取法和渗漉提取法， 其中优选闪式提取法、 回流提取法或 渗漉提取法， 更优选闪式提取法。

在上述方法中， 步骤（1 )中的华紫珠或杜虹花的叶优选为干燥叶。 通常 将华紫珠或杜虹花的叶粉碎成《中国药典 2010版》凡例中定义的粗粉或最粗 粉。

在上迷方法中， 步骤（1 )中的醇优选为乙醇或曱醇， 最优选为乙醇， 优 选为 60% - 90体积％的醇水溶液，更优选为 60% ~ 90体积％的乙醇或曱醇水 溶液。

在上述方法中，步骤（ 1 )中的溶剂的用量为药材的 5~20倍量（即， 5~20ml 溶剂 /g药材）， 优选为 8~12倍量 (即， 8~12ml熔剂 /g药材）。

在上述方法中， 步骤（3a ) 中， 在减压浓缩洗脱液之后， 任选一次或更 多次进行以下操作：用水溶解浓缩液，使之通 过装填有树脂填料的色讲层析柱， 用水和 /或稀醇水溶液洗涤， 以除去杂质， 然后以较高浓度的醇水溶液洗脱， 收集洗脱液， 减压浓缩。

在上迷方法中， 步驟（3a ) 中的所迷树脂填料选自但不限于大孔吸附树 脂、 聚酰胺树脂和离子交换树脂。 一种实施方案中， 所述树脂填料优选为

HPD100, HPD200, D101、 AB-8、 SP825, ADS-7型大孔吸附树脂， 更优选 为 D101、 AB-8型大孔吸附树脂。

在上述方法中， 步骤（3a ) 中所述的稀醇水溶液为 0 ~ 15体积。 /。的稀醇 水溶液， 优选 0 ~ 10体积％。 其用量为树脂柱床层体积的 3〜8倍， 优选为树 脂柱床层体积的 6倍。 树脂柱床层体积根据实际待处理的上清液的量 而变化， 例如树脂柱床层体积与待处理的上清液体积的 比率可为约 1:0.5~2。 一种实施 方案中， 所述醇优选为乙醇或者曱醇， 最优选为乙醇。

在上述方法中， 步骤（ 3a )中所述的较高浓度的醇水溶液为 30% ~ 90体 积％的醇水溶液，优选为 30 - 50体积％的醇水溶液， 更优选为 30 - 40体积％ 的醇水溶液。 其用量为树脂柱床层体积的 2 倍， 优选为树脂柱床层体积的

3〜4倍。 树脂柱床层体积根据实际待处理的上清液的量 而变化， 例如树脂柱床 层体积与待处理的上清液体积的比率可为约 1:0.5 2。 一种实施方案中， 所述 醇优选为乙醇或者曱醇， 最优选为乙醇。

在上述方法中， 步骤（3b ) 中的有机溶剂优选为正丁醇或乙酸乙酯。 其 用量为上清液体积的 1~3倍， 优选为 2倍。 一种实施方案中， 所迷有机溶剂为 水饱和正丁醇溶液。 有益效果

本发明紫珠总苷提取物含有较高量的活性成分 毛蕊花糖苷和 Arenarioside, 该提取物对神经细胞具有显著的保护作用， 对帕金森模型小鼠 的行为障碍和老年痴呆模型小鼠的记忆获得性 障碍具有明显的改善作用，可用 于制备治疗或辅助治疗神经退行性疾病的食品 、保健食品或药品。本发明紫珠 总苷提取物对 DNCB致小鼠的皮炎-湿疹症状具有良好的治疗和� ��善作用。 可 有效地治疗皮炎或湿疹相关的疾病，可用于制 备治疗或辅助治疗皮肤病的外用 化妆品、 保健品或药品。

本发明提供的紫珠总苷提取物制备方法工艺简 单， 适合工业化生产， 毛 蕊花糖苷和 Arenarioside的得率高。本发明方法只采用水或醇 为提取溶剂， 减 少污染， 所用的树脂均可再生重复利用， 成本低， 制得的高纯度紫珠总苷提取 物中含有 18% - 45% ( w/w ) 的毛蕊花糖苷及 15% ~ 40%的 Arenarioside ( w/w ), 工艺稳定， 质量可控。 实施例

以下通过实施例对本发明进行举例说明，以下 实施例不以任何方式对本发 明进行限制。

以下实施例中， 华紫珠、 杜红花和小叶紫珠的产地为湖北， 棵花紫珠的产 地为海南， 各药材的干燥叶粉碎至最粗粉（其定义参见中 国药典 2010版第二 部凡例）。 提取所用闪式提取器为 JHBE-50型， 购自河南金鼐科技 有限公 司， 闪式提取 2次，每次 3min。 D101、 AB-8大孔吸附树脂均购自河北沧州宝 恩化工有限公司。 聚酰胺树脂 (80〜120目）， 购自国药集团化学试剂有限公司。

除非另有说明， 以下实施例中的乙醇溶液指的是乙醇水溶液， 且以体积百 分比计。

除非另有说明， 以下实施例中术语 "浓缩液体积与药材量相当"指浓缩液 体的量（以 ml计）与原始药材的量（以 g计）相等； 树脂柱床层体积为待处 理的上清液体积的 2-0.5倍。

以下实施例中， 离心条件为 5000rpm， 约 10分钟；

实施例 1

将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加 12倍量（即， 12ml/g华紫珠干燥叶） 的 90%乙醇， 闪式提取 3min, 提取次数为 2次， 合并两次提取物， 减压浓缩 提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材量相当。 加一倍体积量的水， 静置过 夜， 离心得到上清液。 使上清液通过 D101大孔吸附树脂柱， 以 6倍树脂柱床 层体积量的水洗涤，接着用 6倍树脂柱床层体积量的 10%乙醇进行洗涤，弃去 水洗液及 10%乙醇洗涤液， 用 3倍树脂柱床层体积量的 40%乙醇进行洗脱， 收集洗脱液。 将洗脱液减压浓缩， 除去乙醇。 用水将浓缩液稀释至初始上清液 体积， 然后通过聚酰胺层析柱， 以 2倍树脂柱床层体积量的水洗涤， 弃去水洗 液，接着用 3倍树脂柱床层体积量的 30%乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减 压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物。

用大叶紫珠、杜虹花、 小叶紫珠或棵花紫珠代替华紫珠作为药材原料 ， 按 照上述方法制备各自的紫珠总苷提取物。

按照前文所述 HPLC测定方法， 对上述不同来源的紫珠药材的紫珠总苷 提取物进行分析， 结果如表 3所示： 表 3

上表中， 得率（％)的计算如下: γ = ^w? "4■ T½ ：膽 其中 M _P 为紫珠总苷提取物的重量， M _c 为药材重量。

回收率 ( % )的计算如下：

其中， Ρ,·为紫珠总苦提取物中某成分 的百分含量， C,为紫珠药材中某成分 的百分含量， M _P 为紫珠总苷提取物的重量， M _c 为紫珠药材的重量。

3可以看出， 相比于由大叶紫珠叶、 小叶紫珠叶和棵花紫珠叶得到的 紫珠总苷提取物，由华紫珠叶或杜虹花叶制备 的紫珠总苷提取物中毛蕊花糖苷 和 Arenarioside的含量明显较高。相比于由大叶紫珠 叶、 小叶紫珠叶和裸花紫 珠叶， 来自华紫珠叶或杜虹花叶的紫珠总苷提取物总 量明显较高。 实施例 2

将杜虹花的干燥叶粉碎至最粗粉，加 12倍量（即， 12ml/ _g 杜虹花干燥叶） 的 70%乙醇， 闪式提取 3min, 提取次数为 2次。 合并两次提取物， 减压浓缩 提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材量相当。 加一倍体积量的水， 静置过 夜， 离心得到上清液。 使上清液通过 D101大孔吸附树脂柱， 以 6倍树脂柱床 层体积量的水洗涤，弃去水洗液，用 4倍树脂柱床层体积量的 30%乙醇进行洗 脱， 收集洗脱液。 将洗脱液减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 3

将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加 10倍量（即， 10ml/ _g 华紫珠干燥叶） 的 90%乙醇， 回流（常压下加热至沸腾）煎煮 lh, 煎煮次数为 2次。 合并两 次煎煮提取液， 减压浓缩提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材量相当。 加 一倍体积量的水， 静置过夜， 离心得到上清液。 使上清液通过 D101大孔吸附 树脂柱， 以 3倍树脂柱床层体积量的氷洗涤， 然后用 3倍树脂柱床层体积量的 10%乙醇洗涤，弃去水洗液及 10%乙醇洗涤液，再以 3倍树脂柱床层体积量的 40%乙醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩 ，干燥，得到紫珠总苷提取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 4

将杜虹花的干燥叶粉碎至最粗粉，加 12倍量（即， 12ml/ _g ;M虹花干燥叶） 的 70%乙醇， 回流（常压下加热至沸腾）煎煮 lh, 煎煮次数为 2次。 合并两 次煎煮提取液（请确认）， 减压浓缩提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材 量相当。加一倍体积量的水,静置过夜，离心� �到上清液。使上清液通过 HPD100 大孔吸附树脂柱， 以 6倍树脂柱床层体积量的水洗涤， 弃去水洗液， 用 3倍树 脂柱床层体积量的 40%乙醇洗脱，收集洗脱液。减压浓缩洗脱液， 以除去乙醇。 用水将浓缩液稀释至初始上清液体积， 然后通过 ADS-7树脂柱， 以 3倍树脂 柱床层体积量的水洗涤，弃去水洗液，接着以 3倍树脂柱床层体积量的 50%溶 液进行洗脱， 收集洗脱液。 将洗脱液减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 5

将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，用 90%乙醇按每克华紫珠叶粗粉 lmL/h 的流速渗漉提取 10h。 收集渗漉液， 减压浓缩渗漉液， 以除去乙醇， 浓缩液体 积与药材量相当。 加一倍体积量的水， 静置过夜， 离心得到上清液。 使上清液 通过 D101大孔吸附树脂柱， 以 6倍树脂柱床层体积量的水洗涤杂质， 接着以 6倍树脂柱床层体积量的 10%乙醇洗涤，弃去水洗液和 10%乙醇洗涤液，然后 以 3倍树脂柱床层体积量的 40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压 浓 缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 6 将华紫珠的干燥叶粉碎至粗粉， 用 90%乙醇 克华紫珠叶粗粉 lmL/h 的流速渗漉提取 10h。 收集渗漉液， 减压浓缩渗漉液， 以除去乙醇， 浓缩液体 积与药材量相当。 加一倍体积量的水， 静置过夜， 离心得到上清液。 使上清液 通过 D101大孔吸附树脂柱， 以 6倍树脂柱床层体积量的氷洗涤杂质， 接着以 6倍树脂柱床层体积量的 10%乙醇洗涤，弃去水洗液和 10%乙醇洗涤液，然后 以 3倍树脂柱床层体积量的 40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液。减压浓缩洗脱 液， 以除去乙醇。 用水将浓缩液稀释至初始上清液体积， 然后通过聚酰胺层析柱， 以 2倍树脂柱床层体积量的水洗涤， 弃去水洗液，接着用 3倍树脂柱床层体积 量的 30%乙醇洗脱， 收集洗脱液， 将洗脱液减压浓缩， 干燥，得到紫珠总苷提 取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 7

将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加 10倍量（即， 10ml/g华紫珠干燥叶） 的 90%乙醇， 回流（常压下加热至沸腾）煎煮 lh, 煎煮次数为 2次。 合并两 次煎煮提取液， 减压浓缩提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材量相当。 加 一倍体积量的水， 静置过夜， 离心得到上清液。 向上清液中加入等体积的水饱 和正丁醇溶液萃取 2次， 合并正丁醇相， 减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取 物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 实施例 8

将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加 10倍量（即， 10ml/g华紫珠干燥叶 ) 的 90%乙醇， 回流常压下加热至沸腾）煎煮 lh, 煎煮次数为 2次。 合并两次 煎煮提取液， 减压浓缩提取液， 以除去乙醇， 浓缩液体积与药材量相当， 加一 倍体积量的水， 静置过夜， 离心得到上清液。 向上清液中加入 2倍体积量的乙 酸乙酯萃取 2次， 合并乙酸乙酯相， 减压浓缩， 干燥， 得到紫珠总苷提取物， 经过前述 HPLC方法测定， 其结果见表 4。 表 4

实施例 9

本发明紫珠总苷提取物以及相关成分毛蕊花糖 苷和 Arenarioside对 MPP ⁺ 诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

1仪器与试剂

C0 ₂ 培养箱， 型号 MCO-18AIC, 购自日本三洋公司； 全自动酶标仪， 型 号 ELE800, 购自美国 Bio-tek公司； 动态轴向压缩高压制备液相色谱仪， 型 号 LC3000, 100mm X 650mm ( D X L )，购自北京创新通恒科技有限公司， C18 反向色谱: * ， ΙΟ μ πι, 购自苏州赛分科技有限公司。

SH-SY5Y神经细胞株购自 ATTC ( American Type Culture Collection,

Rockville, MD, U.S.A)。该细胞株用含有 10%胎牛血清、 2mM/L谷氨酰胺、 1%青霉素及链霉素双抗的 RPMI 1640培养基 ( hyclone公司产品）， 在 37。C, 5% C0 ₂ 培养箱中培养。

MPP+ ( 1-曱基 -4-苯基吡 ）、 MTT (噻唑蓝）、 DMSO (二曱基亚巩）均 购自 Sigma公司。

磷酸盐緩冲液（ PBS )为现配现用。其配置方法为用蒸馏水中溶解 8g NaCK 0.2g KC1、 1.44g Na ₂ HP0 ₄ 和 0.24g KH ₂ P0 ₄ , 用 HC1调节溶液的 pH值至 7.4, 加水定容至 1L。

其余试剂均为国产化学纯试剂。 2 实验方法

2.1 毛蕊花糖苷及 Arenarioside单体的制备

将实施例 6所制备的 20g紫珠总苷溶解于 lOOmL水中， 50mL/min的¾¾ 注入制备液相色谱柱中， 以乙腈： 水（0.1%TFA ) =13: 84为流动相， 等度洗 脱， 流速为 400mL/min， 紫外 323nm在线检测， 在线色讲图见图 3， 分别收 集含有毛蕊花糖苷和 Arenarioside的馏分， 减压浓缩， 冷冻干燥得到 4.52g毛 蕊花糖苷及 3.68gArenarioside, 按照前文所述 HPLC方法， 测定该两种单体 纯度大于 98% , 两种单体色谱图见图 4及图 5。

2.2本发明紫珠总苷提取物对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤的保 护作用

测试的本发明提取物为实施例 5制备的紫珠总苷提取物，其含有毛蕊花糖 苷 37.75重量％和 28.01重量。 /。Arenarioside。 用磷酸盐緩冲液（ PBS )分别溶 解配制实施例 5制备所得的紫珠总苷提取物、 以上 2.1中制备所得的毛蕊花糖 苷及 Arenarioside单体的母液。 试验时以 RPMI 1640培养基稀释至各试脸浓 度。 MPP+用 PBS溶解至 ImM, 试验时用培养基稀释至终浓度为 500 μ Μ。 ΜΤΤ用 PBS配制， 浓度为 0.5 mg/ml, 使用前用 0.22μπι的滤膜过滤除菌。

收集对数生长期的 SH-SY5Y神经细胞， 用细胞计数器计数， 细胞浓度为 4xl0 ⁴ 个 /ml培养基。 在 96孔板中每孔加入 200μ1细胞悬浮液（调整为 8 <10 ³ 个 /200μ1培养基）。在 37。C , 5% C0 ₂ 培养箱中贴壁培养 24小时。 实验分为 11 个组：①空白对照组：使用 RPMI 1640培养基，在 5%C0 ₂ ， 37°C下孵育 24h; ②模型组： 使用含 500μΜ MPP+的 RPMI 1640培养基在 5%C0 ₂ ， 37。C下孵 育 24h; ③本发明实施例 5提取物试验高剂量组（16 g/mL )、 中剂量组（1.6 g/mL ) 、 低剂量组（0.16 g/mL ) (分别相当于毛蕊花糖苷 10μΜ、 1μΜ、 Ο.ΙμΜ ) ;④上述制备的毛蕊花糖苷单体高剂量组（10μ� � )、中剂量组（1μΜ )、 低剂量组（Ο.ΙμΜ )； ⑤上述准备的 Arenarioside单体高剂量组 ( 10μΜ ) 、 中剂量组（ΙμΜ )、 低剂量组（Ο.ΙμΜ ) , 其中③、 ④、 ⑤各给药实验组中， 将待测药品的母液先用 RPMI 1640培养基稀释至设置的给药浓度后，取 lOO L 加入细胞中， 在 5%C0 ₂ , 37°C下预保护 24h后， 小心吸弃上清液， 再将待测 药品母液用预先配制好的含有 500μΜ ΜΡΡ+的 RPMI 1640培养基溶液稀释至 设置的给药浓度后，取 lQ0μL·加入细胞中，继续在 5%C0 ₂ ， 37°C下孵育 24h。 小心吸弃上清液， 倒扣在吸水纸上拍干。 空白组和模型组孵育 24h后， 同法操 作。 每组样品设置 5个平行孔。 以上各組每孔加入浓度为 0.5 mg/ml MTT， 在 5%C02 , 37。C下孵育 4h。 小心吸弃上清液， 倒扣在吸水纸上拍干。每孔各加 入 200 L的二曱基亚砜 (DMSO),振荡 300s。在 OD570nm处测定各孔吸光值， 细胞活力按下式计算： 细胞活力= #¾|¾ > 100%

空白组 O ₅₇ 。 统计学处理：所有数据采用均数 ±标准差 ( ±s)表示，组间比较采用 T-检验， 用方差分析确定差异的显著性， （/ 0.05为有差异， PO.01为有显著差异）。

3 实验结果

由图 7可知， 毛蕊花糖苷单体对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤具 有保护作用， 其中 0.1 μ M与 1 μ M浓度的毛蕊花糖苷组与模型组相比均具有 显著性差异（ ρ<0.01 )。

由图 8可知， Arenarioside单体对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤具 有保护作用， 其中 0.1 μ M与 1 μ M浓度的 Arenarioside组与模型组相比均具 有显著性差异（ p<0.01 )。

由图 9可知， 本发明实施例 5所制备的紫珠总苷提取物对 MPP+诱导的

SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用， 高、 中、 低三个浓度的本发明提取物 组与模型组相比均具有显著性差异（p<0.01 )。 实施例 10 本发明紫珠总苷提取物对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作 用

1仪器与试剂

同实施例 9, 但不使用毛蕊花糖苷单体和 Arenarioside单体。

2 实验方法

类似于实施例 9, 但测试的本发明提取物为实施例 4、 实施例 6及实施例 7制备的紫珠总苷提取物， 其分别含有 33.12重量％、 45.06重量％和 18.12重 量％的毛蕊花糖苷， 且分别含有 18.29重量％、 40.25重量％和 15.34重量％的 Arenarioside。

实验分为 8个组：①空白对照组：使用 RPMI 1640培养基在 5%C0 ₂ , 37°C 下孵育 24h;②模型组：使用含 500μΜ ΜΡΡ+的 RPMI 1640培养基在 5%C0 ₂ , 37°C下孵育 24h; ③本发明实施例 4、 6和 7制备所得紫珠总苷提取物高剂量 组（16 g/mL )和低剂量組（1.6 g/mL )。 处理方法类似于实施例 9。

实验结果

由图 10 可以看出， 本发明所制备的紫珠总苷提取物对 MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤具有的保护作用， 实施例 4制备的紫珠总苷提取物高 剂量组（ 16 _g /mL )与模型组比， 具有显著性差异（ p<0.01 ), 实施例 4制备的 紫珠总苷提取物低剂量組（1.6 _g /mL )与模型组相比， 具有差异（p<0.05 )， 实施例 6制备的紫珠总苷提取物高剂量組 ( 16Hg/mL )及低剂量组（ 1.6 _g /mL ) 与模型组相比， 都具有显著性差异（p<0.01 )， 而实施例 7制备的紫珠总苷提 取物高剂量组 ( 16 _g /mL )与模型组相比有差异（ p<0.05 )， 实施例 7制备的紫 珠总苷提取物低剂量组（ 1.6 g/mL )与模型组相比无统计学差异。 实施例 11

本发明紫珠总苷提取物对 MPTP所致帕金森小鼠模型的行为学影响

1材料与方法

1.1动物

7周龄雄性昆明种小鼠，体重 18~22 _g ， 由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。 合格证号： 2007000539123。

1.2 药物与试剂

本发明紫珠总苷提取物采用实施例 6及实施例 7所制备的提取物，其中实 施例 6 获得的紫珠提取物含有 45.06 重量％毛蕊花糖苷和 40.25 重量 %Arenarioside, 实施例 7获得的紫珠提取物含有 18.1 重量％毛蕊花糖苷和 15.34%重量％ 1131"1081(^。 MPTP ( 1-曱基 -4-苯基 -1,2,3,6-四氧吡啶）购自 Sigma公司。 肉苁蓉总苷： 按照中国专利申请 CN200710040195.2具体实施方 式中的制备方法 2来制备，通过 HPLC检测其含有松果菊苷 28.23重量。 /。， 毛 蕊花糖苷 4.18重量％、 异毛蕊花糖苷 5.30重量。 /。。 以上提取物以生理盐水配 成浓度为 10~30mg/mL的溶液。

1.3仪器

YLS-1A 型小鼠自主活动记录仪， 购自上海欣曼科教设备有限公司， RB-200B型小鼠滚筒运动测试仪， 购自北京新天地科技公司。

2动物模型建立与分组给药

将 70只小鼠随机分为 7组， 分别为空白对照組、 模型組、 肉苁蓉总苷组

(400m _g /kg)、 本发明实施例 6紫珠总苷提取物高剂量组 ( 300mg/kg ), 低剂量 组（100mg/k _g )和本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量（300m _g /k _g )组、 低剂量组（100mg/kg )。 按照上迷剂量设置， 对各药物试验组连续淮胃给药 14 天， 每次灌胃 0.25mL, 空白对照组和模型组则连续灌胃给予等体积的 生理盐 水 14天， 自第 11天开始连续 4天在灌胃前 lh对各药物试脸组和模型组小鼠 腹腔注射 MPTP (30 mg/kg) 0.25mL,空白对照组臆 注射的生理盐水 0.25mL, 最后 1次给药后 1天， 进行行为学指标测试。

3检测指标及方法

3.1一般行为学观察

观察小鼠在腹腔注射 MPTP造模后的一般行为表现， 有无异常反应， 比 较分析各组之间的差异。

3.2 自主活动实验

使用 YLS-1A型小鼠自主活动记录仪测定各实验组小鼠 自发活动并记数， 将小鼠波入自主活动箱中 (每次同时测定 5只小鼠，每个活动箱中 1只）由记录 仪自动记录小鼠活动， 测定每只小鼠 5min内的活动次数， 进行统计学处理。

3.3滚筒实验

使用 RB-200B型小鼠滚筒运动测试仪测试各实验组小� �的滚筒行为表现。 测试前连续训练 3天， 每天 2次， 转速为 12r/min, 训练时间 120s。 将各实验 组小鼠置于滚筒仪的滚筒上， 设置转速 35 r/min, 测试小鼠从滚筒开始旋转到 离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期，测试时 间为 120s。每只小鼠测 3次取平 均值。

统计学处理：所有数据采用均数 ±标准差 ( ±s)表示，組间比较采用 T_检验， 用方差分析确定差异的显著性，（ ρ<0.05为具有差异， PO.01为具有显著差异）。

4结果

4.1 一般行为学

腹腔注射 MPTP(30mg/kg)后 5min开始， 与空白对照组相比 MPTP模型 组小鼠的一般行为表现异常， 大多数出现下列变化： 举尾、 竖毛、 唾液分泌增 多、 呼吸加快、 肌张力减退、 对外环境刺激敏感以及牙颤等， 其持续时间一般 为 34h。 而本发明实施例 6和 7紫珠总苷提取物高剂量（300mg/kg )组、 低 剂量组（100mg/kg )及肉苁蓉总苷组 (400mg/kg)组小鼠的举尾、 竖毛、 唾液分 泌增多、 呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以 及牙颤等症状明显表现 较轻， 持续时间为约 lh左右。 4.2 自主活动实验

图 11所示结果表明， MPTP模型组与空白对照组相比活动次数明显减� � (PO.01), 用肉苁蓉总苷和本发明紫珠总苷提取物处理后 ， 和模型组相比能增 加其活动次数。 其中本发明实施例 6紫珠总苷提取物高剂量（300m _g /k _g )组、 低剂量组（100m _g /kg )与模型组相比具有显著差异（PO.01 ), 高浓度的本发 明实施例 7 紫珠总苷提取物組（ 300m _g /k _g ) 与模型组相比具有显著差异 ( P<0.01 ), 而低浓度的本发明实施例 7紫珠总苷提取物组（100m _g /kg )与模 型组相比具有差异（P<0.05 )。 高浓度的本发明实施例 6和 7紫珠总苷提取物 组 （ 300m _g /k _g ) 的效果均优于肉苁蓉总苷組（ 400m _g /k _g ), 并且具有差异 ( P<0.05 )。

4.3 滚筒实验

图 12所示结果表明， MPTP模型组与空白对照组相比， 运动潜伏期明显 缩短 (P<0.01)， 用肉苁蓉总苷和本发明紫珠总苷提取物处理后 ， 和模型组相比 都可以显著增加滚筒运动的潜伏期（P<0.01 )。 高浓度的本发明实施例 6和 7 紫珠总苷提取物组（ 300mg/kg )的效果均优于肉苁蓉总苷组（ 400mg/kg ), 并 且具有差异（ P<0.05 )。 实施例 12

本发明紫珠总苷提取物对东莨菪碱所致小鼠记 忆获得性障碍的改善作用 1 材料与方法

1.1动物

7周龄雄性昆明种小鼠，体重 18〜22g, 由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。 合格证号： 2007000539123。

1.2 药物与试剂

本发明紫珠提取物采用实施例 6及实施例 7所制备提取物， 其中实施例 6 获得的紫珠提取物含有 45.06重量％毛蕊花糖苷和 40.25重量％ 61131^(^€16， 实施例 7获得的紫珠提取物含有 18.1 重量％毛蕊花糖苷和 15.34%重量 %Arenarioside„ 氢溴酸东莨菪碱注射液， 北京双鹤药业股份有限公司生产。 枇杷叶紫 ^MI-取物： 按照中国专利 实施例 1方法制备， 通 过 HPLC检测其含有连翘酯苷 B 47.25重量％、 毛蕊花糖苷 17.26重量％。 以 上提取物以生理盐氷配成浓度为 10~30mg/mL的溶液。

1.3仪器 STT-2小鼠跳台仪， 购自上海欣曼科教设备有限公司。

2 动物分组与给药

将 70只小鼠随机分为 7組， 分别为空白对照組、 模型組、 枇杷叶紫珠总 苷组 (300mg/kg)、 本发明实施例 6紫珠总苷提取物高剂量（300mg/kg )组、 低 剂量组（100mg/kg )和本发明实施例 7紫珠总苷提取物高剂量（300mg/kg ) 组、 低剂量组（100m _g /k _g )。 按照上述剂量设置， 对各药物试验组连续灌胃给 药 30天，每次'灌胃 0.25mL, 空白对照组和模型组则连续璀胃给予等量的生 理 盐水 30天。

3 东茛菪碱致小鼠记忆获得障碍模型的建立及测 试

按上述分组情况， 于实验的第 29天进行跳台训练， 训练前 lh灌胃给药， 于训练前 15min除空白对照組外的各实验组腹腔注射东莨� ��碱 1 m _g /k _g ， 空白 对照组腹腔注射 1 m _g /k _g 生理盐水。训练时将各实验组小鼠放入跳 台仪的反应 箱内适应环境 3min， 然后立即通 36V交流电， 小鼠受电击后， 多数跳上跳台 逃避电击， 小鼠yj¾台跳下受到电击后又跳回跳台，训练 5min。 24h后进行测 试，将各实验组小鼠放于跳台上，记录小鼠第 一次跳下跳台的时间（潜伏期 T ) 和 5min内的受到电击的次数 (错误次数 N )。

统计学处理：所有数据釆用均数 ±标准差 ( ±s)表示，组间比较采用 T-检验， 用方差分析确定差异的显著性 , ( / 0.05为具有差异, P<0.01为具有显著差异）。

4结果

如图 13和 14所示， 与空白对照組比较，模型组小鼠跳台试验的测 试潜伏 期明显缩短（p<0.05 )， ^次数明显增多（p<0.05), 这说明小鼠的学习记忆获 得出现了障碍。 与模型组相比， 枇杷叶紫珠总苷組 (300m _g /k _g )可以提高小鼠的 测试潜伏期（P<0.05 ), 减少错误次数（ p<0.05 )， 本发明实施例 6紫珠总苷提 取物高剂量（300mg/kg )组、 低剂量组（100mg/kg )与模型组相比均可显著 提高小鼠的测试潜伏期（p<0.01 ), 显著减少错误次数（ P<0.01 )。 高剂量的本 发明实施例 7紫珠总苷提取物组（ 300m _g /k _g )与模型組相比可显著提高小鼠测 试潜伏期（ P<0.01 )， 并显著减少错误次数（ P<0.01 )， 低剂量的本发明实施例 7紫珠总苷提取物组（100mg/k _g )可提高小鼠测试伏期（p<0.05 )， 并减少错 误次数（P<0.05 )。 高剂量的本发明实施例 6紫珠总苷提取物组（300m _g /kg ) 的效果优于枇杷叶紫珠总苷组（ 300mg/kg ) ( P<0.05 )。 实施例 13 本发明紫珠总苷提取物对二硝基氯苯（ DNCB )致小鼠慢性皮炎-湿疹的治 疗作用

1材料与方法

1.1动物

雄性昆明种小鼠 7周龄，体重 18〜22 _g , 由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。 合格证号： 2007000539123。

1.2 药物与试剂

本发明紫珠总苷提取物采用实施例 6及实施例 8所制备提取物，其中实施 例 6 获得的紫珠总苷提取物含有 45.06 重量。 /。毛蕊花糖苷和 40.25 重量 %Arenarioside, 实施例 8获得的紫珠总苷提取物含有 19.23重量％毛蕊花糖 苷和 15.95重量。 /。Arenarioside。 分别将实施例 6及实施例 8制备所得紫珠总 苷提取物加入热熔的凡士林中， 配成紫珠总苷提取物质量浓度为 10%待测样 品。 2,4-二硝基氯苯（（2，4-Dinitrochlorobenzene, DNCB ): 分析纯， 成都格雷 西亚化学技术有限公司， 201205147 )用丙酮配制成 7w/v%及 0.5 w/v %的溶液， 待用； 999皮炎平（三九医药公司， 批号 1 ² 030 ⁴⁴ H )。 白细胞介素 _ ² ( IL_ ² )及 瘤坏死因子- oc ( TNF- o ) ½试剂:^ (美国 Rapidbio(RB)公司，批号： ² 01 ² 10 )。 其他试剂均为国产化学纯。

1.3仪器

科德士宠物用电推剪（型号： CP-7800 ); 微量移液器（德国 eppendorf ); Bio-Tec酶标仪（美国 ELX-800 ); 二氧化破培养箱（SANYO, MCO-18AIC ( UV ) )； 日立离心机 ( HICATHI, CT15E );

2 二硝基氯苯致小鼠背部皮炎-湿疹模型的制备

将小鼠于实验前 1 d , 腹部刮毛， 选取约 2 cm 2 cm 范围皮肤备用。 实验笫 1 天，用微量移液器量取 7 w/v % DNCB丙酮溶液 25μ1涂抹于小鼠腹 部剪毛区致敏；实臉第 5天小鼠背部刮毛，鼠背左右各选取约 1 cm lcm范 围备用；第 6天开始，在实臉組小鼠背部左右两侧剪毛区� �抹 0.5 w/v %DNCB 溶液 20 μΐ背部激发， 每隔 3天 1次， 共 4次。 小鼠背部皮肤明显出现皮粗 糙、 增厚、 苔藓化、 潮红、 红斑、 角化、 破损等现象， 说明造模成功。

3动物分组与给药

将 40只小鼠随机取 8只为空白对照组，其余 32只小鼠用于制备小鼠皮炎

-湿疹模型， 造模成功后， 将 32只小鼠按严重与不严重平均分入各組， 其中 Β 为模型组（给予 250mg凡士林空白基质）， C为阳性对照 999皮炎平软骨组 ( 500m 膏 /kg,相当于醋酸地塞米松 0.375mg/k ), D为本发明实施例 6紫珠 总苷提取物組 （ 250m _g /k _g ) , E 为本发明实施例 8 紫珠总苷提取物组 ( 250mg/kg ), 每组 8只。 在造模成功的第 2d开始， 在各给药组小鼠背部左、 右两侧分别均匀涂抹药物， 经皮给药。 2次 /d, 连续 14天。

4检测指标及方法

4.1一般行为学状态的影响

在饲养过程中，观察模型制备前后， 药物治疗对小鼠体质量、毛色、饮食、 活动等一般状况有无影响。

4.2皮肤形态学变化

分别在造模成功后 24 h及治疗过程中，观察小鼠激发部位皮肤反应� �皮损 的形态变化，观察指标包括粗糙、增厚、 苔藓化、潮红、 红斑、 角化、破损等。

4.3组织病理学检查

在药物治疗结束后， 剪取各组小鼠皮损部位皮肤， 环钻取全层皮肤， 左右 背部皮损处取直径 0.3cm 圆形标本各一块， 制作石蜡切片， HE染色， 显微镜 下观察皮肤的組织病理学变化。 每组共 20个标本， 每个标本随机取 5个高倍 视野（ X 200 ), 用网型目镜计数单位视野真皮层炎性细胞浸润 的数量。

4.4对血清中细胞因子的影响

小鼠摘目 M^J6I，室温血液自然凝固 10-20min, 3000转 /min，离心 20min, 仔细收集上清。 严格按照 IL-2和 TNF- ot试剂盒说明书进行检测。

5结果

5.1对一般行为学状态的影响

在饲养过程中， 造模前后各组小鼠体质量的组间比较无统计学 差异， 毛色 饮食未见异常 实验组小鼠致敏及激发后经常搔抓患耳躁动， 观察期间无动物 死亡。

5.2皮肤形态学的影响

造 ， 小鼠背部出现湿疹样反应， 表现为不同程度的弥漫性红斑水肿、 抓痕伴血痂， 边界不清， 出现粗糙、 增厚、 苔藓化、 潮红、 红斑、 角化、 破损 等现象。 给药 7d后， 模型组无明显变化； 给药各组小鼠背部红斑缩小， 水肿 消退， 抓痕陈旧。 给药 14d后， 模型组小鼠无明显变化， 给药组红斑消退， 皮 肤恢复正常。 不同时期的小鼠背部变化情况见图 15。 5.3组织病理学检查

5.3.1对皮炎-湿疹模型小鼠皮肤病变的影响

模型組小鼠表皮出现中度角化， 局灶性角化不全和灶性表皮坏死， 表皮明 显增厚， 棘细胞层增加， 部分棘细胞肿胀， 海绵层水肿， 表皮至真皮炎性细胞 增多；各给药组及阳性对照组表皮角化、 棘细胞层增厚、 炎性细胞渗透等病理 表现均有不同程度改善。 见图 16。

5.3.2对皮炎-湿疹模型小鼠真皮内炎性细胞计数 的影响

由图 17可以看出， 模型組小鼠的真皮内炎性细胞数明显增加， 各给药组 真皮内炎性细胞数与模型组相比明显减少， 并且有显著性差异（PO.01 ), 紫 珠总苷提取物组与阳性对照组相比无显著性差 异。

5.4对血清中细胞因子的影响

由图 18可看出，模型组小鼠的血清中的 IL-2浓度水平与空白对照组相比， 明显降低（PO.05 ), 各给药组小鼠血清中的 IL-2水平较^ ^型组相比， 均有 提高，其中皮炎平组与本发明实施例 6制备所得紫珠总苷提取物组与模型组相 比， 有显著性差异（P<0.01 ), 本发明实施例 8制备所得紫珠总苷提取物组与 模型组相比无显著性差异。 而模型组小鼠的血清中的 TNF- oc浓度氷平与空白 对照组相比， 则是明显提高（P<0.01 )， 各给药组小鼠血清中的 IL-2水平较之 模型组相比， 均有降低， 其中皮炎平组与本发明实施例 6制备所得紫珠总苷提 取物组与模型組相比， 有显著性性差异（PO.01 ), 本发明实施例 8制备所得 紫珠总苷提取物组与模型组相比有差异（ PO.05 )。 本发明上述实施方式和实施例的描述仅出于阐 幹和说明的目的，并非以任 何方式限制本发明。很明显，本领域技术人员 根据本发明上下文的教导可进行 多种改动和变化。这些改动和变化均落在权利 要求所限定的本发明精神和范围 内。