001 A presente invenção se refere a moléculas ativas sobre o sistema nervoso central. Mais especificamente, as moléculas da presente invenção referem-se a derivados benziltiazolidinônicos úteis no tratamento da esquizofrenia ou de outras manifestações clínicas que requeiram o uso de antipsicóticos.

Antecedentes da Invenção

002 A esquizofrenia tem sido descrita como "a pior doença que afeta a humanidade", devido à multiplicidade de sintomas e a permanência dos mesmos ao longo da vida do paciente (TANDON et al, 2008). Ela é um transtorno psiquiátrico crónico e incapacitante, uma doença de natureza complexa, com manifestações múltiplas e quadros variados e a mais importante das psicoses. Cerca de 1% da população desenvolve esta doença ao longo da vida, sendo a incidência semelhante em homens e mulheres. É uma das formas mais importantes de doença psiquiátrica, uma vez que afeta pessoas jovens. Além disso, estudos mostram que pacientes esquizofrênicos apresentam uma taxa de mortalidade duas vezes maior do que a população em geral, pela maior prevalência e gravidade das condições clínicas (CRISMON E DORSON, 1997; GRAEFF et al, 1999; RANG et al, 2004; ELKIS et al, 2008).

003 Essa doença psiquiátrica com frequência começa na adolescência ou na vida adulta jovem, podendo seguir um curso de recidivas ou tornar-se crónica e progressiva, particularmente nos casos em que o início é tardio. A esquizofrenia crónica é usada para justificar a permanência de muitos pacientes em hospitais psiquiátricos por longo tempo. Nos Estados Unidos, são hospitalizados anualmente 87 mil pacientes para o tratamento de esquizofrenia. Essas hospitalizações incluem um total de aproximadamente 930 dias de hospitalização com um custo total de 806 milhões (RANG et al, 2004; MARCUS E OLFSON, 2008).

004 Geralmente, o transtorno tem início com um episódio agudo, caracterizado por manifestações psicóticas positivas (sintomas positivos), como delírios, alucinações, fala e comportamento desorganizados e agitação motora (GRAEFF et al, 1999; STAHL, 2000). 005 Com a progressão da doença tendem a surgir os sintomas negativos (embotamento afetivo, falta de iniciativa, isolamento social, pensamento estereotipado, anedonia, entre outros) e cognitivos (falta de atenção e concentração, problemas de memória e aprendizagem, fluência verbal comprometida). Neste estágio, quando não tratados, os pacientes ficam cada vez mais deteriorados, podendo desenvolver um quadro de demência grave (GRAEFF et ai, 1999; TSAI E COYLE, 2002).

Neurobiologia da esquizofrenia

Teorias neuroquímicas

Esquizofrenia e as hipóteses dopaminérgica e glutamatérgica

006 A teoria dopaminérgica foi proposta por Carlsson, ganhador do Prémio Nobel em 2000, com base na evidência farmacológica indireta em seres humanos e em animais de experimentação (RANG et ai, 2004). A hipótese dopaminérgica clássica da esquizofrenia postula que os sintomas positivos da doença sejam secundários a uma hiperatividade dopaminérgica subcortical ou, mais precisamente, mediados pelos receptores dopaminérgicos do tipo D ₂ da via dopaminérgica mesolímbica (LARUELLE et ai, 1996; ABI-DARGHAM et ai, 1998, 2000; ABI-DARGHAM, 2004; ABI- DARGHAM E LARUELLE, 2005). Esta hipótese é sustentada pelos fatos de agonistas dopaminérgicos do tipo D ₂ em uso continuado induzirem sintomas similares aos positivos esquizofrênicos e de que toda medicação efetiva como antipsicótica, necessariamente, bloqueia, em algum grau, esses receptores (ABI-DARGHAM, 2004; ABI-DARGHAM E LARUELLE, 2005). A hipótese dopaminérgica para a esquizofrenia atribui também um prejuízo na atividade da via dopaminérgica mesocortical (KNABLE E WEINBERGER, 1997; DAVIS et ai, 1991), havendo, neste caso, uma hipoatividade desta via envolvendo o receptor dopaminérgico do tipo D| no córtex pré-frontal (ABI-DARGHAM, 2004). Esta hipofunção dopaminérgica estaria relacionada com os sintomas negativos e cognitivos vistos na doença (KNABLE E WEINBERGER, 1997; DAVIS et al, 1991 ; GOLDMAN-RAKIC et ai, 2004), e tem sido corroborada por estudos em humanos e em animais mostrando que a depleção dopaminérgica no córtex pré-frontal causa sintomas semelhantes, bem como pela verificação de que os receptores dopaminérgicos Di encontram-se aumentados nessa região de pacientes esquizofrênicos (KNABLE E WEINBERGER, 1997; DAVIS et al, 1991 ; ABI-DARGHAM et al, 2002; GOLDMAN-RAKIC et al, 2004). Assim, acredita-se que um déficit de atividade dopaminérgica cortical e um aumento de atividade dopaminérgica subcortical coexistam na doença (ABI-DARGHAM, 2004; ABI-DARGHAM E LARUELLE, 2005). Esta coexistência é explicada pelo fato das transmissões dopaminérgica dos sistemas mesocortical e mesolímbico serem reguladas por circuitos neuronais complexos que incluem sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas, interagindo entre si indiretamente (ABI-DARGHAM, 2004). Tal interação é evidenciada por diversos estudos realizados em animais, mostrando que manipulações que diminuem a atividade dopaminérgica no córtex pré-frontal geram um aumento na atividade das vias dopaminérgicas subcorticais, tanto a espontânea quanto aquela induzida por anfetamina ou apomorfina (PYCOCK et ai, 1980; DAVIS et a , 1991). Contudo, diversos trabalhos têm oferecido evidências de que uma disfunção da transmissão glutamatérgica envolvendo os receptores NMDA está associada à esquizofrenia (BRESSAN E PILOWSKY, 2003; GOFF E COYLE, 2001 ; COYLE et ai, 2003; ABI-DARGHAM E LARUELLE, 2005).

007 De fato, é sabido que antagonistas de receptores NMDA, como a fenciclidina e a cetamina, são capazes de induzir tanto os sintomas positivos como os negativos e cognitivos da doença em sujeitos hígidos, bem como em pacientes esquizofrênicos (KRYSTAL et ai, 1994; LAHTI et ai, 1995).

008 Ainda, há evidências sugerindo que a desregulação dopaminérgica encontrada na esquizofrenia pode ser secundária a um déficit na função do receptor glutamatérgico do tipo NMDA (JENTSCH E ROTH 1999).

009 Antagonistas do receptor NMDA, como fenciclidina, produzem sintomas psicóticos (alucinações, distúrbios do pensamento) em seres humanos; foi também relatado haver redução das concentrações de glutamato e do número de receptores glutamatérgicos em cérebros postmortem de esquizofrênicos (RANG et ai, 2004). Novos antipsicóticos agonistas de receptores metabotrópicos pré-sinápticos de glutamato do tipo R2 e R3 (mGluR2/3) atuariam modulando diretamente a liberação de glutamato. O composto LY2140023, em ensaio clínico de fase II/III, foi comparada com olanzapina (Zyprexa®), demonstrando eficácia um pouco menor para reduzir os sintomas positivos, mas os pacientes não ganharam peso, ao contrário, perderam em média 0,5 kg, indicando que agonistas destes mGluRs podem representar um avanço na pesquisa por antipsicóticos com melhor tolerabilidade. O mecanismo de ação dos agonistas de mGluRs ainda não está completamente elucidado. Por um lado, agonistas mGluR2/3 inibem a liberação de dopamina, demonstrando haver uma interconectividade funcional das vias glutamatérgicas e dopaminérgicas, sendo portanto possível que agonistas mGluR2/3 tenham como alvo final o mecanismo convencional de antagonismo dos receptores dopaminérgicos do tipo D ₂ . Por outro lado, os receptores mGluR2/3 podem formar um complexo com receptores 5-HT ₂ A, sugerindo que a ativação destes receptores glutamatérgicos poderia regular a sinalização serotonérgica (SNYDER E MURPHY, 2008).

0010 Uma desregulação dopaminérgica também causa alterações na transmissão glutamatérgica, uma vez que aferências glutamatérgicas corticais e projeções dopaminérgicas convergem em sinapses envolvendo neurónios GABAérgicos no estriado (KOTTER, 1994; CEPEDA E LEVI E, 1998). De uma maneira geral, mostrou-se que os receptores D _\ e D ₂ apresentam papéis antagónicos em relação à transmissão glutamatérgica, via receptor NMDA, no estriado (CEPEDA E LEVINE, 1998; ABI-DARGHAM E LARUELLE, 2005). A estimulação dos receptores D ₂ inibe a transmissão glutamatérgica por receptor NMDA, enquanto que a dos receptores Di a favorece (CEPEDA E LEVINE, 1998; ABI-DARGHAM E LARUELLE, 2005). Assim, tanto as interações glutamato/dopamina quanto dopamina/glutamato parecem ser relevantes para a fisiopatologia da doença.

0011 As primeiras formas de tratamento da esquizofrenia introduzidas na prática médica foram o eletrochoque, a lobotomia e o choque insulínico, mas foram logo desacreditadas (SWAYZE, 1995; TANDON et ai, 2010). O tratamento farmacológico deste distúrbio teve início somente na década de 50, com a descoberta acidental dos efeitos da clorpromazina (TANDON et ai, 2010). Posteriormente, diversos outros compostos com propriedades farmacológicas semelhantes foram desenvolvidos, dando origem à classe dos neurolépticos, antipsicóticos típicos ou, ainda, antipsicóticos de primeira geração.

0012 Os antipsicóticos típicos podem ser divididos em três principais classes químicas: os fenotiazínicos (sendo a clorpromazina o principal fármaco), os tioxantênicos (clorprotixeno) e as butirofenonas (haloperidol). Três destes agentes (clorpromazina, flufenazina e haloperidol) ainda constam na lista de medicamentos essenciais da Organização Mundial da Saúde (WHO, 2009).

0013 Os antipsicóticos típicos diferem-se quanto à potência, farmacocinética e perfil de efeitos adversos. Centenas de ensaios clínicos demonstram que os antipsicóticos típicos suprimem ou atenuam manifestações psicóticas agudas e reduzem a frequência de recidivas. Em consequência, reduzem o número e o tempo de hospitalizações e viabilizam outras formas de tratamento. Embora úteis para aliviar os sintomas positivos da esquizofrenia, são pouco eficazes no alívio dos sintomas negativos e cognitivos, além de um percentual de pacientes (chamados refratários) responderem pouco ou nada a estes medicamentos (GRAEFF et ai, 1999; BALDESSARINI E TARAZI, 2001 ; GARDNER et ai, 2005).

0014 Além disso, estes antipsicóticos de primeira geração apresentam uma gama de importantes efeitos adversos. Os chamados efeitos extrapiramidais estão diretamente ligados ao excesso de bloqueio dos receptores dopaminérgicos D ₂ na via nigro estriatal. Os pacientes podem apresentar quadros de distonia muscular, acatisia, podendo desenvolver Parkinson farmacológico e, com a extensão do tratamento, discinesia tardia. O aparecimento destes sintomas é a principal causa de abandono do tratamento por parte dos pacientes. O bloqueio de receptores dopaminérgicos na via tuberoinfundibular acarreta num aumento dos níveis séricos de prolactina, com consequente aumento do tamanho e sensibilidade das glândulas mamárias, diminuição da libido, amenorréia e galactorréia (CRISMON E DORSON, 1997; GRAEFF et ai, 1999; BALDESSARINI E TARAZI, 2001 ; GARDNER et ai, 2005).

0015 A procura de substâncias que superassem as limitações dos fármacos típicos existentes no mercado conduziu ao desenvolvimento da clozapina, em 1971, primeiro fármaco dos chamados antipsicóticos atípicos ou de segunda geração para os quais não existe uma definição universal. A conceituação mais simples utiliza apenas um critério de inclusão: produzir o efeito antipsicótico na maioria dos pacientes em doses que não causam efeitos extrapiramidais importantes. Outros atributos que vêm sendo descritos incluem uma maior eficácia em relação aos sintomas negativos e a não alteração dos níveis séricos de prolactina e/ou um mecanismo de ação que envolveria mais de um receptor.

0016 Os principais representantes deste grupo são clozapina, olanzapina, quetiapina, risperidona, ziprasidona e aripiprazol. Todos eles se caracterizam por apresentar uma afinidade para vários receptores (mecanismo de ação multireceptor), envolvendo a ligação tanto a receptores dopaminérgicos (especialmente D ₂ ) quanto serotonérgicos (5- HT ₂ e/ou 5-HT _1A ) (CRISMON E DORSON, 1997; GRAEFF et ai, 1999; BALDESSARINI E TARAZI, 2001 ; HIROSE et ai, 2004; FARAH, 2005; GARDNER et ai, 2005; YAGCIOGLU, 2007).

0017 Na realidade, ainda não se sabe exatamente qual o mecanismo de ação responsável pela diferença clínica vista entre antipsicóticos típicos e atípicos. Há na literatura diversas teorias para tentar explicar o mecanismo responsável pela atipicalidade. Muitas destas teorias postulam que o perfil atípico é secundário a interações que estes fármacos exerceriam em outros receptores dopaminérgicos que não o D ₂ (isto é, em Di, D ₃ , D ₄ ), ou mesmo da relação de potência de bloqueio entre eles (por exemplo, D ₄ /D ₂ , D] D ₂ ) (SEEMAN et ai, 1997; STRANGE, 2001 ; TAUSCHER et ai, 2004). Outras teorias afirmam que o perfil atípico é secundário à ação dos fármacos em receptores não dopaminérgicos, em especial os receptores 5-HT ₂ A, OU mesmo dependeria de uma boa relação de potência para o bloqueio dos receptores 5-HT ₂ A/D ₂ (MELTZER et a , 2003). Há também teorias que afirmam que a atipicalidade é secundária a bloqueios dopaminérgicos seletivos no SNC, ou seja, alguns fármacos apresentariam maior propensão a bloquear zonas límbicas do que estriatais (PILOWSKY et ai, 1997; STRANGE, 2001 ; BRESSAN et ai, 2003). Outra teoria mantém o receptor D ₂ como alvo chave dos antipsicóticos sem precisar invocar atividade em outros receptores, sendo que a diferença entre atípicos e típicos se dá pelo fato dos primeiros se desligarem rapidamente do receptor (rápida dissociação). Desta forma, os antipsicóticos atípicos seriam facilmente deslocados dos receptores quando a dopamina endógena for liberada o que permitiria uma transmissão neuronal mais normal no cérebro de paciente (KAPUR E SEEMAN, 2001).

0018 Os antipsicóticos atípicos são, atualmente, preconizados como tratamento de primeira linha na esquizofrenia. Em função das grandes diferenças observadas no que diz respeito tanto à eficácia quanto aos efeitos adversos (LEUCHT et ai, 2009; TANDON et ai, 2008), estes fármacos devem ser avaliados individualmente na hora da prescrição e não como uma classe homogénea.

0019 A clozapina apresenta melhora tanto de sintomas positivos como negativos e 60% dos pacientes que não respondem ao tratamento com antipsicóticos típicos podem apresentar melhora com o seu uso, razão pela qual é o fármaco de escolha em caso de refratariedade aos tratamentos mais clássicos. Em relação ao seu mecanismo de ação, ainda discutido, a clozapina apresenta maior afinidade para os receptores serotonérgicos do tipo 5-HT ₂ do que para os receptores dopaminérgicos D ₂ -like, sendo que sua afinidade para o subtipo D ₄ é um pouco maior do que para o D ₂ . Entretanto, o maior problema com a utilização da clozapina é o aparecimento eventual de agranulocitose (cerca de 1 a 2% dos pacientes). Dada a gravidade e a potencial letalidade deste quadro (aproximadamente 1%), o uso deste fármaco é restrito na prática clínica a casos refratários aos tratamentos convencionais (CRISMON E DORSON, 1997; GRAEFF et ai, 1999; FARAH, 2005; GARDNER et ai, 2005; ELKIS E MELTZER, 2007).

0020 Os outros antipsicóticos atípicos também apresentam efeitos adversos limitantes de sua utilização terapêutica. A utilização crónica de olanzapina, quetiapina (e risperidona), assim como da clozapina, está associada ao aumento de peso e um aumento da propensão à indução de diabetes tipo II. Essas alterações metabólicas aumentam significativamente o risco de morte por doença cardiovascular, que já é a principal causa de mortalidade dos pacientes com esquizofrenia. Os distúrbios metabólicos associados aos antipsicóticos atípicos são, portanto, um desafio atual para os psiquiatras no dia-a-dia (ELKIS et ai, 2008). Já o tratamento com risperidona (+ ziprasidona e olanzapina) pode levar ao desenvolvimento de efeitos extrapiramidais com o aumento da dose (OWENS, 1996; FARAH, 2005).

0021 O aripiprazol, às vezes chamado de antipsicótico de terceira geração, possui um perfil de efeitos adversos caracterizado por menor ganho de peso quando comparado aos outros antipsicóticos (junto com a ziprasidona), pouca sedação e ausência de elevação de prolactina. A particularidade do seu mecanismo de ação residiria no fato de atuar como agonista parcial nos receptores D ₂ ou de apresentar seletividade funcional neste receptor (MAILMAN e MURTHY, 2010). Além disso, apresenta atividade agonista parcial nos receptores 5ΗΤΠ _Α e antagonismo em receptores 5HT ₂ A- Entretanto, seu custo elevado exige apoio governamental para que a população menos favorecida possa utilizá-lo (MAMO et ai, 2007).

0022 Uma das alternativas atualmente propostas para o tratamento da esquizofrenia são os agonistas de receptores metabotrópicos de glutamato do tipo R2/R3 (mGluR2/3) que, além de parecerem mais seguros que os antipsicóticos atípicos atuais, poderiam apresentar uma melhora de cognição e uma melhor tolerabilidade.

0023 Dados do estudo Clinicai Antipsychotic Trials of Intervention Effectiveness (CATIE) financiado pelo NIH indicam que 74% dos pacientes abandonam o tratamento em 18 meses quer seja em função da baixa tolerabilidade ou da eficácia incompleta (LIEBERMAN et al., 2005), uma das razões pela qual há necessidade de novos fármacos antipsicóticos.

Sumário da Invenção

0024 É um objeto da presente invenção compostos benziltiazolidinônicos de fórmula molecular (I)

(I) ativos em modelos animais preditivos de atividade antipsicótica: inibição de climbing induzido por apomorfina em camundongos e inibição da hiperlocomoção induzida por cetamina. E, portanto, um objeto da presente invenção proporcionar moléculas úteis no tratamento da esquizofrenia ou de outras manifestações clínicas que requeiram o uso de antipsicóticos e composições farmacêuticas contendo as mesmas.

0025 É um objeto da presente invenção, compostos benziltiazolidinônicos de fórmula molecular (I) não induziram catatonia em camundongos e não causarem comprometimento motor quando comparadas aos antipsicóticos típico, haloperidol, e atípico, clozapina. É, portanto, outro objeto da presente invenção proporcionar moléculas e composições farmacêuticas contendo as mesmas que não induzam efeitos extrapiramidais, comuns a outros antipsicóticos, especialmente os típicos.

0026 É um objeto da presente invenção, compostos benziltiazolidinônicos de fórmula molecular (I) que não potenciaram o tempo de sono barbitúrico, em camundongos. E, portanto, outro objeto da presente invenção proporcionar moléculas e composições farmacêuticas contendo as mesmas, que não acarretem nos efeitos sedativos típicos de outros neurolépticos, como o haloperidol, e atípicos, como a clozapina.

0027 E um objeto da presente invenção, compostos benziltiazolidinônicos de fórmula molecular (I) capazes de prevenir a hiperlocomoção induzida por cetamina, em doses que per si que não afetem a locomoção, e de prevenir prejuízo induzido pelo agonista serotonérgico (±)-DOI na inibição de sobressalto por pré-pulso, em camundongos. É, portanto, outro objeto da presente invenção proporcionar moléculas e composições farmacêuticas contendo as mesmas que apresentem um perfil de antipsicótico atípico.

0028 E um objeto da presente invenção, compostos benziltiazolidinônicos de fórmula molecular (I) não apresentarem toxicidade quando administradas a camundongos por 14 dias nas doses de 15 e 30 mg/kg, v.o.. É, portanto, outro objeto da presente invenção proporcionar moléculas e composições farmacêuticas contendo as mesmas que apresentem baixo potencial tóxico.

Breve Descrição das Figuras Figura 1 - mostra o efeito de FPT-2, FPT-4 e FPY-3 (30 mg/kg, n=10), no modelo de escalada induzido por apomorfina em camundongos. Tratamentos: HAL (haloperidol 0,5 mg/kg, v.o.); CLO (clozapine 15 mg/kg, v.o.); Veículo (solução salina + 1% polissorbato); Apomorfina (4 mg/kg, s.c). O parâmetro avaliado foi o índice de climbing. Resultados expressos em média ± erro padrão. ANOVA post hoc Student- Newman-Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Veículo **p<0,01 ***p<0,001. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Apomorfina ^# p<0,01 ; p<0,001.

Figura 2 - mostra o efeito de FPY-3 (5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) no modelo de escalada induzida por apomorfina em camundongos. O parâmetro observado foi o índice de climbing. Tratamentos v.o.: Veículo (salina + polissorbato 80 1% 1 mL/lOOg, n=10), HAL (haloperidol 0,5 mg/kg, n=10), CLO (clozapina 15 mg/kg, n=8). Tratamentos s.c: Veículo (salina + vitamina C lmg/mL), Apomorfina (apomorfina 4 mg/kg). Resultados expressos em média ± erro padrão. ANOVA post hoc Student Newman Keuls: Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Veículo *p<0,05 ***p<0,05. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Apomorfina p<0,05 ^### p<0,001.

Figura 3 - mostra o efeito de diferentes doses de FPY-3 (1, 5 e 15 mg/kg, v.o. no teste de hiperlocomoção induzida por cetamina, em camundongos. Tratamentos: HAL (haloperidol 0,01 mg/kg,v.o.), CLO (clozapine (1 mg/kg, v.o.), Cetamina (10 mg/kg, s.c). Resultados expressos em média ± erro padrão. ANOVA post hoc Student- Newman-Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Veículo **p<0,01; ***p<0,001. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Cetamina p<0,05 p<0,001.

Figura 4 - mostra o efeito de FPY-3 (15 mg/kg, v.o.) no teste de inibição de sobressalto por pré-pulso, em camundongos, onde os agentes inibidores deste processo são a apomorfina, o (±)-DOI e a cetamina. Tratamentos: HAL (haloperidol 0,5 mg/kg,v.o.), CLO (clozapine (15 mg/kg, v.o.), apomorfina (3 mg/kg, s.c), (±)-DOI (0,5 mg/kg, s.c), cetamina (30 mg/kg, s.c). Resultados expressos em média ± erro padrão. ANOVA post hoc Student-Newman-Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Veículo *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001. Diferença significativa em relação ao grupo Veículo+Apomorfina ou Veículo+DOI ou Veículo+Cetamina p<0,05 ^# p<0,01 #p<0,001.

Figura 5 - mostra o controle de ganho de massa corporal durante 14 dias dos camundongos tratados agudamente com FPY-3 (2000 mg/kg, v.o.) (n=3).

Figura 6 - mostra o controle de ganho de massa corporal durante 14 dias dos camundongos tratados diariamente com FPY-3 (15 e 30 mg/kg, v.o.) ou veículo (n=6). Diferença significativa em relação ao grupo Veículo *p<0,05.

Figura 7 - mostra a estrutura química dos compostos sintetizados: 3-(4-cloro-benzil)-5- [3-(4-cloro-fenil)-3H-[l,2,3]triazol-4-ilmetileno]-tiazolidi na-2,4-diona FPT-2, 3-(2- cloro-6-fluoro-benzil)-5-[3-(4-cloro-fenil)-3H-[l,2,3]triazo l-4-ilmetileno]-tiazolidina- 2,4-diona FPT-4 e 3-(2-cloro-6-fluoro-benzil)-5-(l-fenil-lH-pirazol-4-ilmetile no)- tiazolidina-2,4-diona FPY-3.

Esquema 1 - Esquema de doses para avaliação da toxicidade oral aguda, iniciando pela dose de 2000 mg/kg, segundo OECH.

Descrição Detalhada da Invenção

0029 Os exemplos descritos a seguir não têm a intenção de limitar o escopo da presente invenção, mas apenas de mostrar uma das formas de concretizá-la.

Preparação dos derivados

0030 O processo de obtenção dos derivados benziltiazolidinônicos e as características dos compostos obtidos envolveram o emprego das etapas descritas a seguir:

3-(4-Cloro-berizil)-5-[3-(4-cloro-fenil)-3H-[l,2,3]triazo l-4-ilmetileno]-tiazolidina-2,4 diona FPT-2

3-(2-Cloro-6-fluoro-benzil)-5-[3-(4-cloro-fenil)-3H-[l,2, 3]triazol-4-ilmetileno]- tiazolidina-2,4-diona FPT-4

3-(2-Cloro-6-fluoro-benzil)-5-(l-fenil-lH-pirazol-4-ilmet ileno)-tiazolidina-2,4-diona FPY-3. 0031 O processo de obtenção dos derivados benziltiazolidinônicos de fórmula (I)

em que: R: Cl, H; R : Cl, H; R ₂ : F, H; R ₃ : Cl, H; X: N, C; envolve o emprego das seguintes etapas: a) condensação de fenilidrazinas funcionalizadas com 1,3-tetrametoxipropano; b) obtenção do 1-fenilpirazol funcionalizado (II) obtido em a); c) diazotação e substituição nucleofílica aromática de anilinas funcionalizadas; d) cicloadição [2+3] das azidas (IV) com álcool propargílico; e) oxidação do álcool 1,2,3-triazólico (V) obtido na etapa d); f) condensação tipo Knoevenagel-Cope dos derivados tiazolidinônicos benzilados com os aldeídos correspondentes: l-fenil-4-formil-pirazólico ou 1,2,3-triazólicos.

0032 A etapa a) ocorre pela reação de condensação de fenilidrazinas /rara-substituídas com tetrametoxipropano em solução contendo um álcool e um ácido prótico, aquecida à temperatura de refluxo durante um período de 60 minutos (MENEGATTI et al, 2003). Ao término da condensação, o pH do meio reacional é ajustado e após extração com diclorometano e evaporação do solvente, os derivados 1-fenilpirazólicos, de formula geral (II), funcionalizados com diferentes grupamentos R são obtidos:

0033 A obtenção do 1-fenilpirazol (II), ocorre na etapa b), pela adição de (II) a uma mistura equimolar de dimetilformamida e oxicloreto de fósforo, a qual é mantida na temperatura de 80-85°C por 12 horas (MENEGATTI et ai, 2003).

0034 Ao término da formulação, o pH do meio reacional é ajustado e após extração com diclorometano e evaporação do solvente, os correspondentes derivados l-fenil-4- formil-pirazólicos, de formula geral (III), funcionalizados com diferentes grupamentos R são obtidos:

0035 Na etapa c), anilinas ara-substituídas são diazotadas após tratamento com uma solução aquosa de nitrito de sódio em meio ácido por 40 minutos a temperatura de 0°C. Em seguida, o correspondente sal de diazônio obtido como intermediário é tratado com uma solução aquosa de azida de sódio em meio básico, a temperatura ambiente por 120 minutos.

0036 Ao término da substituição nucleofílica aromática, as correspondentes arilazidas, de formula geral (IV), funcionalizados com diferentes grupamentos R são obtidos por filtração:

0037 Na etapa d), as arilazidas funcionalizadas (IV) são tratadas com álcool propargílico em solução de tolueno a temperatura de refluxo durante um período de tempo variando entre 3 a 5 horas (KOLB et al, 2001). Ao término da reação de cicloadição [2+3], os correspondentes álcoois 1,2,3 -triazólicos de formula geral (V), funcionalizados com diferentes grupamentos R são obtidos por filtração:

0038 A reação de oxidação ocorre na etapa e), através do tratamento dos álcoois 1 ,2,3- triazólicos funcionalizados (V) com dióxido de manganês em solução contendo solvente clorado, a temperatura ambiente por período de tempo que varia entre 60 a 180 minutos. Ao término da reação de oxidação e após a filtração do meio e evaporação do solvente, os correspondentes aldeídos 1,2,3 -triazólicos de formula geral (VI), funcionalizados com diferentes grupamentos R são obtidos:

0039 A última etapa da reação, f), corresponde a uma reação de condensação equimolar dos derivados 3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas funcionalizados com os aldeídos l-fenil-4-formil-pirazólico não substituído de fórmula geral (III) e com o derivado l-(4-cloro-fenil)-lH-[l,2,3]triazol-4-carbaldeido em presença de benzeno como solvente e piperidina como solvente. A mistura reacional foi aquecida por 48 horas e em seguida, colocada a baixa temperatura. O produto precipitado após filtração foi lavado com uma mistura de etanol/água e acetonitrila. Os derivados benziltiazolidinônicos FPT-2, FPT-4 e FPY-3 obtidos apresentaram um grau de pureza suficiente para as análises. Os derivados codificados FPT 3-(4-cloro-benzil)-5-[3-(4- cloro-fenil)-3H-[ 1 ,2,3]triazol-4-ilmetileno]-tiazolidina-2,4-diona FPT-2, C ₁₉ H ₁₂ C1N ₄ 0 ₂ S, apresentou um rendimento de 54 % e ponto de fusão de 165-166 °C e o 3-(2-cloro-6-fluoro-benzil)-5-[3-(4-cloro-fenil)-3H-[l,2,3]t riazol-4-ilmetileno]- tiazolidina-2,4-diona FPT-4, CigHuC^F^O^, apresentou rendimento de 29 % e ponto de fusão 145-146 °C. O composto 3-(2-Cloro-6-fluoro-benzil)-5-(l-fenil-lH- pirazol-4-ilmetileno)-tiazolidina-2,4-diona FPY-3 C20H13CIFN3O2S apresentou um rendimento de 53% e ponto de fusão 218-219 °C. A comprovação estrutural dos derivados sintetizados foi realizada pelos espectros no infravermelho registrados em aparelho IFS 66 Bruker, em pastilha de KBr, pelos espectros de ressonância magnética nuclear de prótons efetuados em um aparelho espectrômetro Bruker AC 300 P, utilizando o DMSOd ₆ como solvente e pelo espectro de massas, impacto eletrônico a 70eV registrados em um aparelho HP 5987. As características espectroscópicas no infravermelho notadamente as absorções na região da carbonila e da dupla ligação etilênica e no espectro de ressonância magnética nuclear de prótons observando-se o dublete CH ₂ benzílico, o singlete do grupamento etilênico além dos prótons aromáticos para os compostos FPT e FPY preparados estão de acordo com a estrutura proposta. Na espectrometria de massa as fragmentações observadas e a intensidade dos picos dos isótopos após impacto eletrônico encontram-se igualmente em acordo com as estruturas propostas.

Estudo Farmacológico

Ensaios in vitro

Preparação do tecido 0040 Ratos foram sacrificados por decapitação. O encéfalo foi imediatamente removido e colocado no gelo para dissecação das estruturas de interesse: estriado, hipocampo e córtex. Em seguida, foram pesados e estocados em nitrogénio líquido (- 70°C). Esse procedimento foi aprovado pelo Comité de Ética em Cuidados Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

0041 O estriado foi homogeneizado em Potter de Teflon a 4°C a 20 volumes por grama de tecido de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) contendo MgCl ₂ 8mM e EDTA 5 fflM. A suspensão resultante foi ultracentrifugada a 48000 g _av a 4°C por 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 20 volumes de tampão e incubado a 37°C por 10 minutos para remoção de neurotransmissores endógenos. Essa suspensão foi esfriada no gelo e ressuspendida em tampão, rendendo 1,5 mL/g de tecido e, por fim, estocada no nitrogénio líquido até seu uso.

0042 Hipocampo e córtex foram homogeneizados em Potter de Teflon a 4°C a 20 volumes (hipocampo) ou 10 volumes (córtex) de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) por grama de tecido. A suspensão resultante foi centrifugada duas vezes a 900 g _max a 4°C por 10 minutos. Os sobrenadantes resultantes foram juntados e ultracentrifugados a 48000 g _av por 10 minutos. O sedimento foi ressuspenso em tampão e incubado a 37°C por 10 minutos. Posteriormente, essa suspensão foi esfriada no gelo e ultracentrifugada duas vezes (48 000 g _av por 10 minutos a 4°C). O sedimento final foi ressuspenso em tampão na proporção de 1,5 mL/g de tecido e estocado em nitrogénio líquido.

0043 A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry et al (1951), utilizando-se como padrão albumina de soro bovino.

Ensaio de radioligação a receptores D ₂ -Hke (NIZNIK et ai, 1985; TERAI et ai, 1989 ; HAMDI et ai, 1992 ; ASSIÉ et ai, 1993)

0044 Para determinar a ligação dos compostos aos receptores de dopamina do tipo D ₂ - like, as preparações membranares da estrutura de interesse, corpo estriado, (50 μg proteína) foram incubados na presença do radioligante [ HJ-YM-09151-2 (0,1 nM) a 37°C, no escuro, por 60 minutos em uma solução contendo 120 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ , 1,5 mM CaCl ₂ , 1 mM EDTA e Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) em um volume final de 500 μΐ,. A ligação não específica foi determinada pela incubação na presença de 30 μΜ de (-)-sulpirida.

Ensaio de radioligação a receptores 5-HTIA (HALL et ai, 1985; PEROUTKA, 1986; MONGEAU 1992)

0045 Para determinar a ligação dos compostos aos receptores de serotonina 5-HTJA _, as preparações membranares da estrutura de interesse, hipocampo (50 μg de proteína), foram incubadas na presença do radioligante [ ³ H]-8-OH-DPAT (1 nM) a 37°C por 15 minutos em uma solução contendo 1 mM CaCl ₂ , 1 mM MnCl ₂ , 10 μΜ de pargilina e Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) em um volume final de 500 A ligação não específica foi determinada pela incubação na presença de 10 μΜ de serotonina.

Ensaio de radioligação a receptores 5-HT2A (LEYSEN et ai, 1982; NELSON et ai, 1993)

0046 Para determinar a ligação dos compostos aos receptores de serotonina 5-HT ₂ A, as preparações membranares da estrutura de interesse, córtex total (150 μg proteína), foram incubadas na presença do radioligante [ ³ H]-cetanserina (1 nM) a 37°C por 15 minutos em uma solução contendo 100 nM de prazosina e Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) em um volume final de 500 μΐ,. A ligação não específica foi determinada pela incubação na presença de 1 μΜ de cetanserina.

0047 Após a incubação, as amostras foram rapidamente lavadas em 4 mL de Tris-HCl 5 mM (3X) e imediatamente filtradas sobre filtros de fibra de vidro (GMF 3, Filtrak, Germany) previamente umedecidos em tampão Tris-HCl 5 mM ÇDi-Hke) ou polietilenoimina 0,5% (5-HT e 5-HT _2A ). Os filtros foram, então, secos e colocados em vials individuais contendo líquido de cintilação (POPOP (l,4-bis-[2-(5-feniloxazol)]- benzeno 0,1 g/L e POP (2,5-difeniloxazol) 4,0 g/L em tolueno). A radioatividade retida nos filtros foi contada em cintilômetro (Packard Tri-Carb 1600 TR) (Tabela 1).

Tabela 1. Afinidades de FPT-2, FPT-4 e FPY-3 por receptores do tipo O ₂ -like, 5-HT _1A e 5-HT ₂ A- Clozapina e aripiprazole foram usados como fármacos de referência. Ki (μΜ)

Composto

O ₂ -like 5-HT _1A 5-HT _2A

FPT-2 23,9

FPT-4

FPY-3 7,3

Clozapine 0,114 0,378 0,014

Aripiprazole 0,001 0,001 0,007

- Os compostos produziram menos de 15% de inibição da ligação do radioligante quando usados na concentração de screening (10 μΜ), impossibilitando a construção de uma curva de competição e o cálculo do seu K .

Testes comportamentais/ Testes in vivo

Animais

0048 Foram utilizados camundongos CF1, machos, adultos (20 - 30 g), provenientes da colónia da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS-RS). Antes dos experimentos, os animais foram ambientados por um período mínimo de 72 horas no biotério de passagem da Faculdade de Farmácia - UFRGS. Os camundongos foram mantidos em caixas plásticas de 17 x 28 x 13 cm com, no máximo, 8 animais por caixa e os ratos foram mantidos em caixas plásticas de 28 x 42 x 16 cm em grupos de, no máximo, 5 animais por caixa. Os animais foram mantidos sob ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura constante (23 ± 1 °C), sob sistema de exaustão e umidade monitorada. Os animais tiveram livre acesso à água e alimento (ração certificada Nuvital®). Nos experimentos realizados com administração das substâncias teste por via oral, os animais passaram por um período de 5 horas de jejum antes do teste. Bloqueio do comportamento de escalada (climbing) induzido por apomorfina (COSTALL et ai, 1978)

0049 A apomorfina é um agonista dopaminérgico e o bloqueio de seus efeitos comportamentais é uma resposta observada tanto para antipsicóticos típicos como atípicos.

0050 Camundongos foram tratados com a substância teste, veículo (lmL/lOOg, v.o.), haloperidol (0,5 mg/kg, v.o.) ou clozapina (15 mg/kg, v.o.). Em seguida, foram colocados individualmente em gaiolas de metal, onde permaneceram durante meia hora para adaptação. Transcorrido este período, os animais receberam uma injeção de apomorfina 4 mg/kg s.c. ou veículo; sendo imediatamente recolocados nas gaiolas, onde permaneceram por trinta minutos. Neste período, os animais foram observados a cada 5 minutos durante 1 minuto, registrando-se o maior número de patas na grade, presença de escalada contínua ou intermitente e presença ou ausência de estereotipia. Todos esses parâmetros contabilizados geram um índice de climbing: 0 ponto para nenhuma pata na grade e ausência de estereotipia, 1 ponto para nenhuma pata na grade mas presença de estereotipia, 2 pontos para uma, duas ou três patas na grade, 3 pontos para escalada intermitente e 4 pontos para escalada contínua. Esse índice é avaliado para fins estatísticos.

Indução de cat atonia (CARLINI, 1973)

0051 Este teste é utilizado para detecção do potencial de indução de efeitos extrapiramidais.

0052 Camundongos foram tratados com as substâncias teste FPT-2, FPT-4 e FPY-3 (30 mg/kg, v.o.), veículo (lmL/lOOg, v.o.), haloperidol (0,5 mg/kg, v.o.) ou clozapina (5 e 15 mg/kg, v.o.). Os animais foram delicadamente posicionados sobre uma barra de madeira elevada 6,5 cm do chão, apoiados apenas pelas patas dianteiras, 30, 60 e 90 minutos após o tratamento. Foi mensurado o tempo de permanência, em segundos, dos animais nesta posição incómoda nos intervalos descritos (Tabela 2). Tabela 2. Efeito de FPT-2, FPT-4 e FPY-3 (30 mg/kg, v.o.) no teste de indução de catatonia em camundongos. A avaliação foi feita 30 (T30), 60 (T60) e 90 (T90) minutos após o tratamento.

Tratamento Dose 30 minutos (T30) 60 minutos (T60) 90 minutos

(T90)

SAL 1 mL/lOOg 1,2 ± 0,6 1 ,4 ± 0,9 1,7 ± 0,9

Haloperidol 0,5 mg/kg U,5 ± 11,5* 19,2 ± 13,9*** 24,5 ± 9,9***

Clozapina 15 mg/kg 13,3 ± 12, 3** 1 1,9 ± 8,1 ** 3,5 ± 3,7

Clozapina 5 mg/kg 3, 1 ± 3,9 1,5 ± 0,9 1,6 ± 1,5

FPT-2 30 mg/kg 2,3 ± 2,4 7,4 ± 11 ,0 7,5 ± 6,2

FPT-4 30 mg/kg 2,5 ± 2,2 3,7 ± 5,2 5,9 ± 8,3

FPY-3 30 mg/kg 1,6 ± 1 ,4 1,5 ± 0,8 4,5 ± 4,7

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANO VA de duas vias com medidas repetidas post hoc Student Newman Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo SAL *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001.

Avaliação do efeito sobre a coordenação motora em aparelho de rota-rod (LÓPEZ- RUBALCAVA et ai, 2000)

0053 Camundongos foram habituados ao rota-rod 24 horas antes do teste (Dia 1). O experimento consistiu de duas exposições ao aparelho (5 rpm), denominadas seleção e sessão teste (Dia 2). Na seleção, apenas os animais que apresentaram tempo de permanência de no mínimo 90 segundos foram considerados aptos a continuar no teste. Imediatamente após esta sessão, os animais selecionados receberam o tratamento com as substâncias teste FPT-2, FPT-4 e FPY-3 (30 mg/kg, v.o.), veículo (lmL/lOOg, v.o.), haloperidol (0,5 mg/kg, v.o.) ou clozapina (5 e 15 mg/kg, v.o.) e 60 minutos após foram novamente colocados no aparelho (sessão teste). Os parâmetros avaliados foram maior tempo de permanência, em segundos, e número de quedas (Tabela 3). Tabela 3. Efeito de FPT-2, FPT-4 e FPY-3 (30 mg/kg, v.o.) no teste de avaliação da coordenação motora em aparelho de rota-rod, em camundongos. Parâmetros avaliados: maior tempo de permanência e número de quedas.

Tratamento Dose Permanência Quedas

TO T60 TO T60

SAL 1 mL/lOOg 224, 2± 59,7 224,6 ± 64,6 1,4 ± 1,6 1 , 1 ± 1,5

Haloperidol 0.5 mg/kg 238,9 ± 70,1 84,6 ± 62,8** 1,2 ± 1 ,6 15,2 ± 8,9***

Clozapine 15 mg/kg 238.3 ± 74.5 86.9 ± 89.8** 1,3 ± 1,4 21 ,3 ± 17,5***

Clozapine 5 mg/kg 249.6 ± 65.5 216.2 ± 74.5 0,9 ± 1, 1 1 ,0 ± 0,9

FPT-2 30 mg/kg 245,6 ± 92,3 250,0 ± 69,0 1,6 ± 2,7 4,5 ± 10,4

FPT-4 30 mg/kg 234,3 ± 68, 1 198,9 ± 82,4 1,8 ± 1 ,6 3,5 ± 4,9

FPY-3 30 mg/kg 228,4 ± 88,6 212, 7 ± 94,4 1,4 ± 2,3 1,7 ± 2,3

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANOVA de duas vias com medidas repetidas post hoc Student Newman Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo SAL em T60 **p<0,01 ***p<0,001.

Avaliação da Atividade Locomotora Espontânea - Teste de Exposição ao Campo Aberto (Open Field) (WILLIANSON et ai, 1996)

0054 Parâmetros de locomoção são comumente avaliados em roedores nas etapas iniciais da investigação de um provável efeito central de compostos, principalmente devido à sua simplicidade. A avaliação da atividade locomotora é capaz de demonstrar tanto efeitos depressores quanto estimulantes do sistema nervoso central, caracterizados por uma diminuição ou aumento da locomoção espontânea, respectivamente, o que pode ser visualizado neste teste.

0055 Camundongos foram tratados com o composto teste FPY-3 (30 mg/kg, v.o.), haloperidol (0,5 e 4 mg/kg, v.o.), clozapina (5 e 15 mg/kg, v.o.) ou veículo (1 mL/lOOg, v.o.) e, após 60 minutos, os animais foram colocados em uma caixa de acrílico transparente (45 x 30 x 30 cm), com o fundo preto dividido em 24 quadrantes iguais. Os animais foram ambientados por 5 minutos e, posteriormente, observados por 15 minutos, registrando-se manualmente o número de cruzamentos entre os quadrantes (crossings), o número de episódios em que os animais levantaram o corpo apoiados apenas pelas patas traseiras (rearings) e o número de comportamentos de auto-limpeza (groomings). Todo procedimento foi realizado em ambiente de penumbra (Tabela 4).

Tabela 4. Efeito de FPY-3 (30 mg/kg, v.o.) no teste de exposição ao campo aberto, em camundongos, em um período de observação de 15 minutos. Parâmetros avaliados: número de crossings, rearings e groomings.

Tratamento Dose Crossings Rearings Groomings

SAL 1 mL/lOOg 306,5 ± 179,1 98, 7 ± 42,7 20,3 ± 7,8

Haloperidol 4 mg/kg 71,0 ± 110,7** 6,8 ± 13,9*** 1 ,4 ± 2,6***

Haloperidol 0,5 mg/kg 151,1 ± 117,9 32,9 ± 30,4** 6,5 ± 2,8***

Clozapina 15 mg/kg 145,0 ± 71,5 25,6 ± 29,3** 2,8 ± 2,4***

Clozapina 5 mg/kg 183,4 ± 44,9 87,6 ± 24,2 1 1,7 ± 3,7**

FPY-3 30 mg/kg 315,4 ± 154,5 112,1 ± 56,6 18,1 ± 6,1

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANOVA post hoc Student Newman Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo SAL **p<0,01 ***p<0,001.

Teste de Potenciação do Sono Barbitúrico (WILLIANSON et ai, 1996)

0056 Este teste avalia uma atividade geral sobre o Sistema Nervoso Central. Camundongos foram tratados com o composto teste FPY-3 (30 mg/kg, v.o.), veículo (lmL/lOOg, v.o.), haloperidol (0,5 e 4 mg/kg, v.o.) ou clozapina (5 e 15 mg/kg, v.o.). Decorridos 60 minutos, uma solução de pentobarbital sódico (Cristália®, 40 mg/kg, i.p.) foi administrada a todos os grupos. Determinou-se, então, o tempo para indução (latência) e a duração do sono barbitúrico, em minutos, determinados pela perda e retomada do reflexo postural. Estabeleceu-se 240 minutos como valor máximo de duração do sono (Tabela 5). Tabela 5. Efeito de FPY-3 (30 mg/kg, v.o.) no teste de potenciação do sono barbitúrico, em camundongos. Parâmetros avaliados: latência para indução do sono e duração do sono.

Tratamento Dose Latência (min) Duração do sono (min)

SAL 1 mL/lOOg 4,4 ± 0,7 34,2 ± 14,3

Haloperidol 4 mg/kg 3,5 ± 1,0 86,2 ± 48,0***

Haloperidol 0,5 mg/kg 5,0 ± 2,8 29,5 ± 1 1,3

Clozapina 15 mg/kg 3,5 ± 1,3 71,8 ± 23,7**

Clozapina 5 mg/kg 4,7 ± 2,9 45,6 ± 29,5

FPY-3 30 mg kg 5,4 ± 3,9 29,4 ± 18,5

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANOVA post hoc Student-Newman- Keuls. Diferença significativa em relação ao grupo SAL *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001.

Hiperlocomoção induzida por antagonistas NMDA

0057 A administração aguda de antagonistas de receptores NMDA (fenciclidina, cetamina e MK-801) é capaz de produzir uma síndrome comportamental em roedores caracterizada pelo aumento da atividade locomotora. Este efeito tem sido amplamente utilizado como um modelo animal de esquizofrenia relacionado aos efeitos psicóticos induzidos pela administração destes compostos em seres humanos. Ao contrário do efeito induzido por agentes dopaminérgicos, a hiperlocomoção induzida por fenciclidina e análogos é bloqueada apenas por fármacos antipsicóticos atípicos, especialmente aqueles com grande afinidade por receptores 5-HT ₂ (JENTSCH E ROTH, 1999; GEYER E ELLENBROEK, 2003).

0058 Para verificar o perfil de atipicalidade das substâncias previamente selecionadas, foi realizado o teste de hiperlocomoção induzida por cetamina (10 mg/kg, s.c.) segundo Moreira e Guimarães (2005) e Satow e colaboradores (2009). Os animais foram tratados por via oral com o composto-teste e colocados na caixa de locomoção para ambientar por 30 min. Imediatamente após esse período, os animais receberam cetamina ou veículo por via s.c. e foram observados por 20 min em relação ao número de crossings. Modelo de inibição de sobressalto por pré-pulso

0059 Este modelo está baseado no fato de que pacientes esquizofrênicos possuem uma disfunção na inibição de pré-pulso, caracterizada pela manutenção da resposta motora ao pulso, ao contrário dos indivíduos normais, os quais não respondem mais a um estímulo relevante (pulso) quando, precedente a este, é fornecido um estímulo de menor intensidade (pré-pulso).

0060 Animais de laboratório podem ser condicionados a não mais responderem ao pulso frente à exposição a um pré-pulso. Este comportamento pode ser corrompido pela administração de diversos agentes farmacológicos, cujo mecanismo de ação leva à alteração de algum sistema neurotransmissor envolvido nas bases neuroquímicas da esquizofrenia (GEYER E ELLENBROEK, 2003; VAN DEN BUUSE et al, 2005).

0061 Os primeiros agentes utilizados foram os dopaminérgicos, como a apomorfina. O efeito dessa substância neste modelo é revertido por praticamente todos os antipsicóticos, não sendo uma ferramenta útil na diferenciação entre moléculas com perfil típico e atípico (GEYER E ELLENBROEK, 2003). Um segundo grupo de drogas utilizadas caracteriza-se pela estimulação da neurotransmissão serotonérgica. Para tanto, são utilizados agonistas de receptores 5-HT _2A ((±)-DOI) e indutores da liberação de serotonina (MDMA) (GEYER E ELLENBROEK, 2003; VAN DEN BUUSE et ai, 2005). A administração de antagonistas NMDA (fenciclidina, cetamina e MK-801) induz um robusto déficit na inibição de pré-pulso em ratos e camundongos. Estes dados caracterizam a inibição de pré-pulso como uma ferramenta capaz de identificar potenciais novos antipsicóticos com perfil multireceptor (JENTSCH E ROTH, 1999; GEYER E ELENBROEK, 2003).

0062 Através desse modelo foi feita uma investigação do envolvimento dos sistemas dopaminérgico, serotonérgico e glutamatérgico para as substâncias previamente selecionadas, utilizando apomorfina (3 mg/kg s.c), (±)-DOI (0,5 mg/kg s.c.) e cetamina (30 mg/kg s.c), respectivamente.

0063 Após a administração das substâncias, os camundongos foram colocados no equipamento de medida de resposta de sobressalto (Insight®) para ambientação com um ruído de fundo (65dB) por 5 minutos, o qual permaneceu durante todo o experimento. O ensaio consistiu de 55 sessões, divididas em pulso único (115 dB) e um pulso precedido de um pré-pulso de 80, 85 ou 90 dB.

Toxicidade Oral Aguda - Determinação da faixa de Dose Letal Mediana (DL50)

0064 Este teste avalia a toxicidade após exposição a uma dose única ou dose fracionada administrada no período de 24 horas e foi realizado segundo a instrução normativa 423 da OECD para avaliação da toxicidade oral aguda de agentes químicos, adaptadas às condições da Faculdade de Farmácia da UFRGS.

0065 Inicialmente, FPY-3 foi administrado na dose de 2000 mg/kg, v.o., a 3 camundongos machos. Os animais foram observados diariamente por 14 dias, e foi computada a frequência de mortes e sinais de toxicidade com ênfase nos intervalos de 1, 2, 6 e 24 horas após o tratamento. Os sinais de toxicidade avaliados foram piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais, locomoção, hipotermia (animais juntos no canto da caixa), tônus muscular, tremores, paralisia dos membros posteriores, salivação, secreção brônquica, convulsões. Foi realizado um controle de ganho de massa corporal.

0066 No caso de ocorrência de morte de 2 ou 3 camundongos, a dose seria diminuída, segundo uma sequencia decrescente de doses: 300, 50 e 5 mg/kg, conforme preconizado pela OECD (2001). Seria determinada, então, a faixa de DL ₅₀ das substâncias testadas segundo o Anexo 2 da OECD: "test guideline 423". A sequencia de execução desse experimento pode ser acompanhada no esquema 1.

Toxicidade doses repetidas

0067 Este teste avalia a toxicidade após a exposição a doses repetidas e foi realizado segundo a instrução normativa 407 da OECD (1995) para avaliação da toxicidade oral em doses repetidas de agentes químicos, adaptado às condições da Faculdade de Farmácia da UFRGS.

0068 Camundongos machos (n=10/grupo) foram tratados diariamente por 14 dias com solução salina (1 mL/100 g) e 2 diferentes doses de FPY-3: dose mínima efetiva no teste de atividade do tipo antipsicótica (15 mg/kg, v.o.) e uma dose duas vezes maior (30 mg/kg, v.o.).

0069 Durante todo o tratamento, os animais permaneceram no biotério da Faculdade de Farmácia. Foi feito também um controle de ganho de massa corporal durante os 14 dias de tratamento. No 15° dia, os animais foram eutanasiados com tiopental e tiveram sangue e órgãos retirados (Tabela 6).

Tabela 6. A massa relativa corporal dos órgãos rins, adrenais, baço, fígado, coração, pulmão e cérebro dos camundongos tratados por 14 dias com veículo ou FPY-3 (15 e 30 mg/kg, v.o).

Veículo FPY-3 FPY-3

Órgão (n=6) 15 mg/kg (n=6) 30 mg/kg (n=6)

Rins 1,8 ± 0,1 1,8 ± 0,3 1,8 ± 0,1

Adrenais 0,018 ± 0,001 0,019 ± 0,004 0,018 ± 0,004

Baço 0,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,2

Fígado 7,2 ± 0,4 7,0 ± 0,4 7,3 ± 0,9

Coração 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1

Pulmão 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1

Cérebro 1,3 ± 0,1 1,3 ± 0,1 1,2 ± 0,1

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANO VA.

0070 As análises bioquímicas e hematológicas foram realizadas As análises bioquímicas foram realizadas no equipamento LABMAX, (kits Labtest) (tabela 7). As análises hematológicas foram feitas no ABXMICROS60 (kits Sullab) (Tabela 8).

Tabela 7. Análises Bioquímicas após 14 dias de tratamento. AST (aspartato aminotransferase), ALT (alanina aminotransferase), CK (creatina fosfoquinase).

FPY-3 FPY-3

Veículo (n=6) 15 mg/kg (n mg/kg (n AST (U/L) 77,7 ± 7,6 61,8 ± 5,9* 71,3 ± 14,5

ALT (U/L) 71,8 ± 26,9 85,2 ± 22,8 68,2 ± 18,6

Fosfatase alcalina (U L) 2,2 ± 2,6 5,2 ± 3,2 2,3 ± 3,8

Uréia (mg/dL) 69,5 ± 5,7 65,8 ± 6,1 58,5 ± 8,7*

Glicose (mg/dL) 183,2 ± 25,5 273,0 ± 113,4 263,5 ± 47,9

Creatinina (mg/dL) 0,08 ± 0,07 0,13 ± 0,05 0,05 ± 0,04

CK (U/L) 148,8 ± 37,2 143,5 ± 25,6 113,0 ± 32,0

Proteínas totais (mg/dL) 5,0 ± 0,4 4,7 ± 0,2 4,7 ± 0,5

Colesterol (mg/dL) 126,2 ± 13,5 124,7 ±19,8 133,5 ± 17,6

Triglicerídeos (mg/dL) 128,0 ± 50,8 153,8 ± 55,5 92,3 ± 24,9

Ácido úrico (mg/dL) 4, 1 ± 3,8 4,2 ± 3, 1 3,0 ± 2,3

HDL (mg/dL) 52,0 ± 8,0 53,2 ± 6,2 56,0 ± 4,8

Resultados expressos em média ± desvio padr ão. ANOVA post hoc Dunnet. Diferença em relação ao grupo veiculo. *p<0,05.

Tabela 8. Análises Hematológicas após 14 dias de tratamento. VCM (volume corpuscular médio), HCM (hemoglobina corpuscular média), CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média), RDW (red cell distribution width).

FPY-3 FPY-3

Veículo (n=6) 15 mg/kg (n=6) 30 mg/kg (n=6)

Leucócitos (xlo mm ³ ) 3,7 ± 1,1 3,7 ± 0,9 5,0 ± 0,8*

Eritrócitos (xloVmm ³ ) 6,6 ± 0,5 7,2 ± 0,4 6,8 ± 0,7

Hemoglobina (g/dL) 12, 1 ± 0,8 13,4 ± 0,4** 12,0 ± 0,6

Hematócrito (%) 34,7 ± 2,4 38,2 ± 2,4 36,4 ± 3,0

Plaquetas (xloVmm ³ ) 1 ,0 ± 0,5 1 ,0 ± 0,2 1 ,0 ± 0,4

VCM (μηι ³ ) 52,7 ± 1,4 52,8 ± 1,5 53,2 ± 1,5 HCM(pg) 18,4 ±0,6 18,6 ±0,8 17,7± 1,1

CHCM (g/dL) 35,0 ± 1,5 35,2 ± 2,3 33,2 ± 1,3

RDW (%) 14,1 ± 1,0 13,7 ±0,2 14,0 ± 0,5

Diferencial

Eosinófilos 1±0 1 ±0 1 ±0

Neutrófilos 36,0 ±3,7 28,8 ±4,1 30,5 ± 8,1

Basófilos 0±0 0±0 0±0

Monócitos 1 ±0 1 ±0 1±0

Linfócitos 61,7 ±4.9 70,7 ± 4,3 67,7 ±8,1

Resultados expressos em média ± desvio padrão. ANO VA post hoc Dunnet. Diferença em relação ao grupo veiculo. *p<0,05.

Vantagens da presente invenção

0071 Os resultados apresentados demonstram que os derivados benziltiazolidinônicos são ativos nos modelos animais de sintomas positivos e cognitivos da esquizofrenia em doses que não apresentam uma tendência para causar catatonia, comprometimento motor ou sedação. Dessa forma, essas substâncias mostraram-se promissoras para o desenvolvimento de fármacos efetivos no tratamento da esquizofrenia. Além disso, podem ser uma perspectiva de fármacos antipsicóticos com alvo biológico distinto do sistema monoaminérgico, uma vez que não apresentaram uma alta afinidade pelos receptores D ₂ -/z ^' fe, 5-HT _1A e 5-HT _2A .