La présente invention concerne le domaine technique des membranes lipidiques attachées à un support d'analyse. En particulier, l'invention concerne un support porteur d'une bicouciie lipidique, la liaison entre le support et la bicoucbe lipidique étant établie par l ^' Intermédiaire d'un peptîde particulier, un procédé de préparation d'un tel support et son utilisation en tant que biopuce et: dans différentes techniques d'analyse.

Les protéines membranaîres jouent un rôle majeur dans chaque cellule vivante. Ces protéines sont les pivots du métabolisme cellulaire et de la transduction des signaux biologiques, A cause de leurs fonctions importantes, elles sont des cibles thérapeutiques privilégiées. Cependant, la reconstitution des protéines membranaîres reste un défi car elle nécessite un environnement memoranaire pour être fonctionnelle. Pour surmonter ce problème, les membranes biomimétiques correspondant à des biœuches lipidiques attachées sur un support sont considérées comme un modèle phare pour l'étude des membranes biologiques dans diverses branches de la recherche fondamentale. De nos jours, l'intégration de membranes biomimétiques incorporant des protéines transmembranaires au concept des biopuces reste un challenge important pour le criblage à haut débit de médicaments et le développement de tests de diagnostics rapides.

Les biopuces à membranes présentent donc un potentiel analytique intéressant, notamment pour deux applications principales. Après réinsertion de protéines membranaîres d'intérêt (notamment un récepteur transmembranaire) dans les membranes présentes sur les zones d'analyse (également nommées « plots ») d'une biopuce, il est possible :

soit d'étudier l'effet de différents ligands (notamment agoni stes/antagonistes) sur la fonctionnalité de la protéine réinsérée ; soit de cribler l'action d'une molécule thérapeutique sur différents récepteurs dans le cas où différents récepteurs ont été insérés sur les plots membranaîres de la puce. En dépit de ces applications et des performances analytiques qui pourraient être associées à l'utilisation de biopuces à membrane,, l'obstacle majeur à surmonter pour la reconstitution de protéines transmembranaires et pour le développement de biopuces à membranes réside dans la formation in vitro d'une bicouche lipidique robuste offrant la capacité d ^' insertion de protéines transmembranaires intégrales, sans altérer les propriétés Intrinsèques de telles protéines, La piupart des bicouches lipidiques reconstituées in vitro à la surface de supports, de type or notamment, sont en contact direct avec le support, c'est-à-dire que seule une fine couche d'eau de deux à trois nanomètres d'épaisseur sépare la bicouche lipidique du support Aussi, même si ces bicouches lipidiques dites supportées sont faciles à manipuler du fait qu'elles sont déposées sur un support solide, la présence de ce dernier à proximité,, avec un écart insuffisant, empêche la reconstitution fonctionnelle de protéines transmembranaires, du fait de la présence d'ectodomalnes extra-rnembranaires bien souvent volumineux rencontrés dans ces structures pretéiques, De plus, l'écart insuffisant entre la bicouche lipidique et le support engendre ie plus souvent une perte de la mobilité des protéines mernbrartaires réinsérées, qui peuvent interagir directement avec le support,

Pour contourner ce problème, différentes solutions ont été proposées dans l'art antérieur, visant à écarter la membrane lipidique du support et à obtenir des ensembles constitués d'une bicouche lipidique attachée au support solide par l'intermédiaire d'un bras espaceur moléculaire hydrophile.

Pour cela, il a été proposé de lier fa bicouche lipidique au support par {Intermédiaire! d'une couche moléculaire flexible et hydrophile assurant ainsi une séparation entre la bicouche lipidique et le support. Une telle couche intermédiaire agit également comme un réservoir aqueux entre le support et la membrane et fournit un espace suffisant pour augmenter la mobilité des protéines réinsérées,

Différentes techniques de fabrication de membranes et leur fixation sur des supports pour biopuce ont été proposées dans l'art antérieur. Des espaceurs du type polymères, thloafcanes, protéines, ont été envisagés, La publication de Coutab!e et ai 2014 décrit, par exemple, ^utilisation d'un PEG (poiyéthyiène glycol) pour établir le lien entre la bicouche lipidique et le support Cette technique utilise un lipide fonctionnalisé particulier qui est le

pyridyldithiopropionate (POP) permet la formation d'une liaison S-Au sur la surface d'or. Dans cet article, seul le POPC est utilisé en plus du lipide fonctionnalisé» De plus, le DSPE présente des chaînes hydrophobes saturées qui peuvent influencer la fluidité de la membrane lipidique obtenue. Le PEG semble également avoir un impact sur la réinsertion de ia protéine membranaire.

Parmi les stratégies proposées, l'utilisation de peptides polaires comme bras espaceurs est considérée comme la plus prometteuse, pour faciliter ensuite la réincorporation fonctionnelle de protéines membranaires. Ils offrent l'avantage de constituer un milieu biocompatible de même nature que la protéine à insérer et peuvent jouer le rôle de cytosquelette.

Typiquement, les attaches ou espaceurs peptidiques utilisés jusqu'à présent sont constitués : i) d'un groupe fonctionnel tel qu'une fonction thiol, un disuifîde ou un silane, qui peut se lier de manière covalente à un substrat approprié tel que l'or, 2) d'une partie peptidique qui Joue le rôle de bras espaceur hydrophile et, 3) d'une partie lipidique hydrophobe qui permet l'ancrage de la bicouche en formant le feuillet proximal de la membrane lipidique reconstituée.

Ce premier feuillet membranaire proximal est obtenu par autoassemblage sur le support d'une solution diluée de peptides espaceurs comportant une composante lipidique. La liaison covalente au support permet une attache stable de la couche proximale et donc de Sa bicouche. Le feuillet distal de la membrane est ensuite formé, soit par dépôt d'une monocouche de Langmuir par transfert de Langmuir-Blodgett, soit par fusion de liposomes, directement à la surface lipidique hydrophobe du feuillet proximal préalablement formé sur le support par auto-assemblage. La fusion des liposomes est, en particulier, sélectionnée pour obtenir la fusion directe de protéollposomes et favoriser, ensuite,, la reconstitution de protéines membranalres dans la blcouche suspendue attachée.

Les peptldes espaceurs utilisés comme attaches moléculaires sont préparés à partir de thiopeptides ou de thlolipopeptides naturels ou synthétiques. Dans Robelek et al 2007 ou Yildiz ai 2013, les peptldes sont attachés à un substrat d'or par l'Intermédiaire d'un acide lipoïque,, ou d'un groupement suifhydryle d'une cystéine en position M~termina!e et leur extrémité C-terminale est ensuite activée pour coupler chimiquement un phospholipide, qui correspond à une molécule de DMPE (OIMyristoyl- Phosphatldyl-Ethanolamine) via la fonction NH ₂ de la tête polaire de ce phospholipide. Pour cela, Se groupement -COOH terminai des thiopeptides est activé par EDC/NHS

pour former une liaison ester covaiente avec ia fonction NH2 de la DMPE, Cependant,, cette méthode Impose que le feuillet proximal de la blcouche soit principalement, voire uniquement composé de DMPE. Il n'est donc pas possible, dans ce cas,, de faire varier la composition lipidique de ce dernier,, ce qui peut être un inconvénient majeur lors de la reconstitution de la protéine membranaire d'intérêt. En effet, il est bien connu que toutes les membranes biologiques (plasmiques., nucléaires,, mitochondriales, chloroplastiques,...) présentent des compositions différentes,, en termes de nature des lipides et de leurs proportions. De plus, dans les solutions de l'art antérieur, les bicouches lipidiques sont seulement ancrées au niveau de leur feuillet proximal par interaction hydrophobe, via un noyau de cholestérol ou des chaînes acides hydrophobes saturées (notamment les chaînes grasses de DMPE attachées à l'extrémité C-termsnale du peptide espaceur) qui pénètrent dans le liposome lors de la formation du feuillet distal. Ce mode d'interaction peut introduire des désordres locaux au sein de la blcouche lipidique lors de sa formation, ce qui peut conduire à une destruction partielle de l'architecture membranaire lors de la manipulation de la membrane en milieu aqueux. Aussi, dans l'art antérieur., la couche proxiniale est d'abord construite via un procédé d'auto-assemblage d'une solution diluée des molécules d'attache qui correspondent généralement à des thioiipopeptides, c'est-à-dire à des peptides fonctionnalisés par un domaine lipidique hydrophobe. La couche distale de la membrane est ensuite formée; soit par fusion de liposomes, soit par dépôt de Langmulr-Blodgett sur la monocouche hydrophobe auto-assemblée. Dans ce cas, même si l'ancrage de fa couche proximaie hydrophobe permet de renforcer la stabilité mécanique de la membrane lipidique obtenue par rapport à une bicouche lipidique supportée uniquement adsorhée sur le substrat,, ce mode de formation en deux étapes ne garantit ni la formation d'une bicouche plane et continue, ni la versatilité de la composition lipidique de la membrane,, la présence de la couche lipidique hydrophobe du fait du mode d'ancrage utilisé limitant le choix de la composition du feuillet proximai. De plus, la chimie de synthèse des peptides utilisés pour obtenir le premier feuillet comportant le lipide hydrophobe peut être complexe et le comportement dynamique de la bicouche lipidique ancrée par son feuillet proxima! peut être modifié. La formation des deux feuillets de la bicouche en deux étapes distinctes est donc un inconvénient majeur pour la reconstitution de protéines transmembranaires intégrales qui nécessitent: un environnement lipidique uniforme pour le maintien de leurs fonctionnalités.

Les avancées technologiques concernant la fabrication et les applications industrielles des biopuces à membranes dédiées à la reconstitution de protéines transmembranaires sont donc encore très limitées.

L'objectif que se propose de résoudre la présente invention est de proposer une solution qui soit adaptée à l'attachement d'une large gamme de lipides et donc, à la fixation de différentes bicouches lipidiques compatibles avec l'insertion d'une grande gamme de protéines, de manière notamment à proposer de nouvelles solutions adaptées au développement de biopuces, Un autre objectif de iinvention est de proposer un procédé qui soit à la fois simple et versatile, qui permette la formation de bicouches lipidiques attachées sur un support., la liaison entre la bieouche lipidique et le support devant être robuste et adaptée à différentes compositions lipidiques, de manière à pouvoir faire varier et moduler a souhait la composition de la bieouche lipidique attachée et ainsi permettre l'Incorporation de protéines membranaires, et notamment de protéines membranalres Intégrales, sans altérer leurs propriétés intrinsèques.

Dans ce contexte,, finvention concerne un ensemble constitué d'un support sur lequel au moins une bicouche lipidique est fixée par l'intermédiaire d'un peptlde,. nommé peptlde pilotis, lui-même lié au support, caractérisé en ce que le peptide pilotis possède une extrémité C~termlnale constituée d'au moins 4 hlstidines consécutives et en ce que la bieouche lipidique comprend une part de lipides possédant une tête polaire chélatrice emprisonnant un cation métallique assurant la liaison avec le peptide pilotis grâce à des interactions métal-chélate entre le cation métallique et au moins une partie des hlstidines constituant l'extrémité C-terminale du peptlde pilotis.

Dans le cadre de l'Invention, le mode de liaison utilisé pour établir le lien entre le peptlde pilotis et la bieouche lipidique permet de moduler à souhait la composition de la bieouche lipidique qui pourra correspondre à tout type de membranes cellulaires, étant donné, que dans le cadre de l'invention, cette composition n'est plus conditionnée par un peptide espaceur fonctionnalisé par un domaine lipidique hydrophobe qui serait utilisé pour former la couche lipidique proximale (c'est-à-dire celle située proche du support), mais par la nature des lipides qui vont y être fixés. Dans le cadre de l'invention, la bieouche lipidique est attachée au peptide pilotis qui sert de bras espaceur grâce à une interaction métal-chélate établie entre lion métallique et le noyau imidazole d'au moins certaines des hlstidines formant l'extrémité C-terminale du peptlde pilotis. Certains des imidazoles de l'extrémité po!yhistid!ne du peptide pilotis jouent donc également le rôle de chélate pour lion métallique présent,, comme la partie chélafante présente sur le lipide à tête chélatrice, La liaison ainsi établie confère à l'ensemble une grande stabilité et une grande robustesse qui sont supérieures à celles obtenues avec les solutions de l'art antérieur, permettant ainsi sa manipulation.

La blcouche lipidique est donc attachée au support par l'intermédiaire du peptide pilotis, en étant maintenue à distance du support et peut être considérée comme suspendue du fait de la flexibilité des peptides pilotis.

Différents lipides chélateurs emprisonnant un cation métallique sont disponibies commercialement, et, par exemple, commercialisés par la société Avant! Polar Liplds (Aiabaster, A!abama, Etats-Unis) et peuvent être utilisés dans le cadre de l'Invention. On peut citer l'acide l^-dlmyristoyl-sogiycéro- 3-phosphoéthanolamine-M-diétiiylènetnamine pentaacétique (14:0 PE-DTPA) sous la forme de sel de cuivre ou de gadolinium, l'acide I^-dipainiitoyl-s/?- glycéro-3~phosphoéthanolamirie~N-diéthv1ènetriamlnepenta acétique (16:0 PE-DTPA) sous la forme de sel de cuivre ou de gadolinium, l'acide i,2~ distéaroyi-s/?-gfycéro-3-phosphoéthanolamine~N- diéthylènetrîaminepentaacétique (18:0 PE-DTPA) sous la forme de sel de cuivre ou de gadolinium, l'acide 1,2-dioieéoyi-sn--glycéro~3-[(rM"(5"amino~i- carbox7pentyl)iminodiacétique)succinyl] (DGS-NTA) sous la forme de sel de nickel,, le DTPA-bis(stéarylamide) sous la forme de sel de gadolinium, l'acide bis(1,2~dimyristoyi~sn-glycéro-3-phosphoéthanol3mine}-N~N' ~

diéthyiènetriarninepentaacétique (bis(14:QPE)-DTPA) sous la forme de sel de gadolinium, l'acide bis(1,2~dfp3lmitoyl~5^glycéro-3-phosphoéthanolarnfne)- N-N'-diéthylènetriaminepentaacétique (bis(16:0PE)~DTPÂ) sous la forme de sel de gadolinium,, l'acide bîs(i _/ 2-dîstearoyl-5^glycéro-3- phosphoéthanolamine)-N-N'-diéthylènetnamine pentaacétique (bis{18:0PE}~ DTP A) sous la forme de sei de gadolinium.

Dans ie cadre de l'invention, le cation métallique est, par exemple, un cation de Nickel (Nl ²⁺ ), de Gadolinium (Gd ³ *) ou de Cuivre (Cu ²⁺ ). Le groupement NIA (nitriiolriacétique} piégeant un cation Mickel est le plus efficace pour accrocher le peptide pilotis via son extrémité polyhlstidine. Aussi,, de manière préférée, le cation métallique est un cation de Nickel et la tête polaire chélatrlce est l'acide nitrilotriaeétique.

L'extrémité C-terminale du peptlde pilotis est,, par exemple, constituée, quant à elle, de 4, 5 ou 6 hlstidlnes consécutives. Des interactions vont s'établir entre le cation métallique et au moins certains des groupes imidazole des histidines situées à l'extrémité C-terminale du peptide pilotis. Plus précisément, une liaison du type métal-chélate s'établit avec l'azote porteur d'un doublet d'électrons libres d'au moins certains des groupes imidazole des histidines, comme par exemple illustré sur le Schéma i ci- dessous dans le cas de Νί-NTA :

De préférence, la liaison avec le peptide pilotis est assurée grâce à des interactions du type métal-chélate établies entre le cation métallique et deux des histidines situées dans la partie C-terminaie du peptide pilotis,

Dans le cadre de l'invention, ia part de lipides possédant une tête polaire chélatrlce emprisonnant un cation métallique est faible et n'altère en rien les propriétés de la bicouche lipidique qui peut donc mimer, au plus près, la composition des membranes biologiques, et notamment des membranes cellulaires. De manière avantageuse, la part de lipides possédant une tête polaire chélatrice emprisonnant un cation métallique représente de 0,5 à 5% molaire, de préférence de 1 à 2% molaire, de la totalité des lipides formant la bicouche lipidique. Le ou les lipides possédant une tête polaire chélatrlce emprisonnant un cation métallique est(sont) réparti(s) dans la bicouche lipidique et assure(nt) {'ancrage de la bicouche, avec une bonne répartition dans cette dernière.

De manière classique, par « bicouche lipidique », on désigne une double couche lipidique _, , constituée de deux feuillets de molécules de lipides dont la majeure partie est constituée de phospholipldes, de manière à permettre une telle structuration en feuillets, Une telle bicouche constitue une fine membrane polaire. Les phospholipldes comportant une tête polaire et au moins deux chaînes aliphatiques. Les têtes polaires constituent la surface de fa membrane et les chaînes aliphatiques sont orientées vers l'intérieur de la membrane, comme Illustré sur la Figure I.

Par phospholipldes, on entend les glycérophospholipides, dont les phospholnosltldes et les sphingophosphoîipides. La bicouche lipidique sera constituée, de préférence, à au moins 70% en masse par des phospholipldes, de préférence à au moins 80% en masse et préférentieliement à au moins 90% en masse, voire à 100% en masse par des phospholipldes. Il n'est pas exclu que la bicouche lipidique inclut d'autres lipides naturels, par exemple, tel que le cholestérol De tels lipides seront présents dans une quantité telle qu'elle n'affecte pas la structuration sous la forme d ^' une bicouche.

Dans ie cadre de l'invention, la composition lipidique de la bicouche peut être modulée à souhait,, car elle est; Indépendante du protocole de formation des bicouches. De nombreuses compositions de lipides peuvent être utilisées et ce _; dans différentes proportions, ce qui permet de mimer à façon la composition des différents types de membranes biologiques. Hormis la part des lipides qui possède une tête polaire chéiatriee emprisonnant un cation métallique, les bicouches lipidiques peuvent être constituées de n'importe quel lipide seul ou en mélange, y compris mais sans s'y limiter, PC (phosphatidylcholine), PS (phosphatidylsérine), PE

(phosphatidyléthanolamine), PI (phosphatidylinositoi, PIP ₂ (phosphatidylinositol bisphosphate), cholestérol, sphingomyëline. Des bicouches lipidiques de compositions variables incluant les différentes classes de lipides membranaires telles que les phosphoiipides (incluant les phosphoinositides), sphingolipides et ie cholestérol peuvent être obtenues. Les bicouches lipidiques peuvent également être formées à partir des extraits naturels de lipides membranaires. La possibilité d'adapter spécifiquement la composition de la bicouche lipidique, de manière à obtenir une membrane artificielle pour la protéine que l'on veut insérer, permet de respecter son environnement lipidique naturel et garantir ensuite sa réinsertion.

De manière avantageuse., la composition de la bicouche lipidique est choisie de manière â minier une membrane biologique, et notamment une membrane cellulaire, en particulier plasmique, nucléaire, mitochondriale, chioropiasmsque,,.., Dans le cadre de l'invention,, il est possible d'obtenir un ensemble dont la bicouche lipidique est fluide et continue» Pour cela, la bicouche lipidique sera formée, de préférence, d'au moins 80%, de préférence, d'au moins 90%, et de manière préférée, d'au moins 95%, en masse, de lipides fluides, La fluidité d'un lipide se définit au niveau de l'ordre des chaînes grasses acyles et à température ambiante (22°€ notamment). On dit qu'un lipide est fluide quand ii présente des désordres (c'est-à-dire des conformations « gauche » sur un plan chimique) au niveau de l'arrangement de ses chaînes grasses. La fluidité d'un lipide donné dépend principalement de la longueur de ses chaînes acyles,, de leur Insaturation et de la température. A titre d ^' exemple, à température ambiante, les phospholipldes présentant des chaînes acyles insaturées (C18:l par exemple) sont à l'état fluide.

Avec ie mode de liaison proposé dans le cadre de l ^' invention, on peut avoir une certaine variabilité de la composition lipidique : il est notamment possible de choisir les chaînes acyles, la longueur de la chaîne, choisir une chaîne acyle avec une ou plusieurs insaturations.

De manière à garantir la fixation permanente de la bicouche lipidique et la robustesse de l'ensemble, le peptide pilotis est, de préférence, attaché de manière covalente au support, de préférence par son extrémité N-terminaie. Des interactions de forte affinité, notamment du type biotine-streptavidine pourraient également être envisagées. Différentes stratégies d'Immobilisation par liaison covalente peuvent être mises en œuvre, en fonction de la nature du support. Il est possible d'utiliser les techniques mises en œuvre dans l'art antérieur» Un lien covaient pourra,, par exemple, être établi par réaction d'une fonction aminé du peptide : une fonction aminé de l'adde aminé située en position M-terminaie ou encore une fonction aminé de la chaîne latérale d ^' une lysine, ïl est également possible d'établir un lien covaient,, par réaction avec la fonction thiol d'une cystéine ou par Insertion d'un disulfide ou d'un acide lipoïque à l'extrémité N-terminale du peptide,

En fonction de la nature du support, la réaction permettant d'établir un lien covaient pourra nécessiter une fonctionnalisation préalable du support. Ceci sera notamment le cas, lorsque le support est en verre, polymère, verre silanisé. Par exemple,, la fonction thiol d'une cystéine pourra réagir avec une surface fonctionnalisée par un groupement chimique comme le maléimlde, Une fonction aminé pourra, quant à elle, établir une liaison covalente avec un groupement fonctionnel tel que les aldéhydes, les esters activés, les époxy. De tels groupements pourront être introduits préalablement sur le support, notamment, sur des lames de verre siianisées, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art

Dans le cas d'un support en or, une liaison covalente peut directement être établie avec une fonction thiol, par formation d'une liaison S-Au par chimisorption. De plus, les supports en or sont les supports de choix pour la détection des interactions moléculaires par QCM-D (pour " Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monîtoring ») et SPRi, Aussi, de manière préférée, dans le cadre de l'invention, te support est en or. Dans ce cas, de manière avantageuse, le peptide pilotis comporte une cystéine à son extrémité N-terminale établissant une liaison S-Au avec le support en or.

De préférence, le peptide présentera une structure hydrophile pour éviter son adhésion au support. La conformation et la structure du peptide pilotis, ses propriétés hydrophiles et sa longueur peuvent être contrôlées par la nature et le nombre de résidus d'acide aminé le constituant. Ces caractéristiques pourront être ajustées par l'homme du métier, de manière à obtenir ! 'écart souhaité entre ia bicouche lipidique et à contrôler ia viscosité de ia couche intermédiaire constituée par le peptide pilotis pour assurer la fluidité latérale nécessaire pour la réinsertion fonctionnelle des protéines transmembranaires, En plus des acides aminés des extrémités M et C- terminale précédemment décrits, le peptide sera avantageusement constitué d'acides aminés choisis parmi les acides aminés hydrophiles, tels que la lysine, l'arginine, l'acide glutamique, l'acide aspartlque, i'asparagine, ia glutamine et la sérine, Dans le cadre de l'invention; on pourra, par exemple,

KVAVSADRHHHH. Le peptide pilotis de SEQ ID N ^e l a été synthétisé sur la base d'un fragment peptidique issu de i'a-iaminine (PI9) possédant une cystéine en position N-terminale pour on greffage sur l'or et une étiquette poly-hlstidine en position C-terminaie pour ia fixation des liposomes par liaisons de type métai-chélate.

idéalement, s'il est possible de savoir si la protéine d'intérêt à réinsérer dans ia bicouche lipidique a des interactions privilégiées avec des protéines du cytosquelette et de connaître la séquence qui en serait responsable, cette dernière pourrait être incorporée dans la séquence du peptide pilotis, afin de favoriser les interactions avec la protéine et de stabiliser sa conformation après réinsertion,

La quantité de peptide pilotis utilisée sera sélectionnée de manière à établir un attachement suffisant Par exemple, dans le cas d'un support en or, le peptide pilotis de SEQ ID Νº 1 est présent avec une densité de 2,8.10 ¹³ molécules par cm ² , correspondant à la saturation de la surface du support en or, Le peptide sera réparti et attaché de manière homogène à la surface du support.

La longueur du peptide sélectionné, sera adaptée par l'homme du métier, notamment en fonction de la taille de i'ectodornaine de la protéine à réinsérer. Dans ie cas où le support est en or, 11 faudra également tenir compte de la sensibilité de l'appareil de SPRI qui sera utilisé pour l'analyse ultérieure, de manière à ne pas perdre le signal dans le cas d'interactions trop éloignées de la surface du support.

De façon générale,, les peptides utilisés jusqu'à présent dans la littérature engendrent un espace de 2 nm. Un espace de 6 nm est idéal pour la reconstitution d'une large gamme de protéine membranalre (Schiller 5.M., Reislnger-Friebis A,,. Gôtz H., Hawker Ci,, Frank C.W., Naumann R., and Knoll W., Biomimetie Upoglycopoiymer Membranes: Photochernical Surface Attachment of Supramofecuiar Architectures with Defined Orientation. Angewandte Chemie Internationa! Edition, 2009, 48(37): 6896). Aussi:, dans le cadre de l'invention, le peptlde sera de préférence sélectionné., de manière à établir un espacement entre le support et la bicouche lipidique de 1 à 10 nm, et préférentiel lement de 2 à 7 nm, et en particulier de l'ordre de 6 nm.

Dans le cadre de l ^' Invention, l'ensemble pourra contenir une protéine membranalre, de préférence une protéine membranalre intégrale, qui est insérée dans la bicouche lipidique, Une protéine est dite intégrale lorsqu'elle traverse au moins une fois entièrement une bicouche lipidique d ^' une membrane cellulaire. Comme explicité plus Soin _, , la protéine membranalre pourra être Introduite après la formation de la bicouche lipidique ou directement lors de la formation de cette dernière.

Les ensembles, selon l'Invention, pourront servir pour la constitution de biopuces. En particulier, ii est possible d'exprimer dans une bicouche lipidique mimant une membrane lipidique des protéines membranaires, et ce de façon aceiluiaire. En fonction de la nature de la protéine membranalre d'Intérêt qui va être insérée, le support pourra servir d'outil d'analyse, notamment pour l'étude ou le criblage de nouveaux agonsstes ou antagonistes ou pour l'étude de nouveaux agents thérapeutiques à visée membranalre. L'utilisation d'un support en or permettra, en particulier, de réaliser un suivi par imagerie par Résonance Plasmonique de surface (SPRI), qui ne nécessite aucun marquage préalable des entités moléculaires à étudier. De manière à pouvoir servir de biopuces, l'ensemble selon l'invention comprendra un support qui présente plusieurs zones sur lesquelles une blcouche lipidique est fixée par l'intermédiaire d'un peptlde, nommé peptlde pilotis, lui-même lié au support, ledit peptlde pilotis possédant une extrémité C-termlnale constituée d'au moins 4 histidines consécutives et la blcouche lipidique comprenant une part de lipides possédant une tête polaire chélatrice qui emprisonne un cation métallique et assure la liaison avec le peptlde pilotis grâce à des interactions de type métal chélate entre le cation métallique et au moins une partie des histidines situées dans la partie O terminale du peptlde pilotis,

Dans ce cas, l'ensemble correspond à une biopuce. De préférence, au moins deux, voire plus, des zones qui correspondront à différentes zones d'analyse ou spots, sont porteuses d'une blcouche lipidique différente, permettant de réaliser différentes analyses simultanément. Les différentes caractéristiques mentionnées dans le cadre de l'Invention, en relation avec la définition du peptlde pilotis, de la blcouche membrsnaire, du procédé de préparation des ensembles support/peptide pilotis/bicouehe lipidique s'appliquent à chacune de ces zones.

L'invention a également pour objet un procédé de détection par imagerie par résonance piasmonîque de surface utilisant un ensemble selon l'invention dans lequel le support est en or.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'un ensemble selon linvention qui comprend les étapes successives suivantes : a) la fixation du peptlde pilotis à la surface du support,

b) la fixation sur le peptlde pilotis de liposomes comprenant une part de lipides possédant une tête polaire chélatrice emprisonnant un cation métallique,, ladite fixation étant réalisée par établissement d'Interactions métal-chélate entre le cation métallique et au moins une partie des histidines situées dans la partie Oterminale ;

c) l'ajout d'un agent fusogène pour induire la fusion des liposomes et la formation d'une blcouche lipidique continue. Dans le cadre de ! Invention, le mode de fixation de la bicouche lipidique sur le support est compatible avec différentes compositions de membranes bilipidiques qui pourront donc être modulées,, en fonction de la protéine transmembranaire à réinsérer.

Dans le procédé selon l'Invention, les deux feuillets de la bicouche lipidique sont formés simultanément, contrairement aux protocoles décrits dans l'art antérieur, dans lesqueis les deux feuillets étaient formés indépendamment en deux étapes distinctes. Dans le cadre de l'invention, le procédé est simplifié, puisque la formation des deux feuillets de la bicouche est réalisée en une seule étape. Les bicouches lipidiques obtenues conservent leur comportement dynamique et leur fluidité puisque la bicouche n'est pas ancrée par son feuillet proximai et qu'elle n'est attachée au peptide pilotis que par quelques pourcents (notamment de 0,5 à 5% molaire, et de préférence de 1 à 2% molaire) de lipides à tête chélafrice Inclus dans la composition des liposomes, De ce fait, les bicouches lipidiques correspondantes pourront être facilement utilisées pour la réinsertion de protéines membranaires, par expression acellulalre in vitro de la protéine en présence de la bicouche lipidique plane et continue obtenue.

Un autre avantage du mode de liaison utilisé dans le cadre de l'invention., qui met en œuvre des lipides avec une tête chéiatnce emprisonnant un cation métallique établissant des liaisons du type métal- chélate avec les histldines, est que ces Interactions sont réversibles. En effet, il est possible de régénérer la surface en éliminant la bicouche lipidique et de réutiliser le support : c'est-à-dire qu'après insertion d'une protéine et utilisation, il est possible d'éliminer la bicouche lipidique pour ne garder que le support intermédiaire fonctionnalisé avec le peptide pilotis qui fait donc également partie intégrante de {invention. Dans le cas d'une exploitation industrielle, cette régénération conduira à terme à une réduction considérable des coûts de production des biopuces et d'analyse des échantillons à grande échelle.

L'invention a donc également pour objet un support intermédiaire sur lequel un peptide, nommé peptide pilotis, est fixé, de préférence par son extrémité N-termina!e, caractérisé en ce que le peptide pilotis possède une extrémité C~terrnlnale libre constituée d'au moins 4 hisidines consécutives. Les caractéristiques du support et du peptide décrites dans le cadre de l'invention s'appliquent à ce support intermédiaire.

Dans le cadre de l'invention, la bicouche lipidique est, le plus souvent, obtenue par fusion de liposomes unliameliaires, de diamètre moyen compris entre 30 et 500 nm. Le diamètre moyen des liposomes peut être défini comme le diamètre moyen en nombre de la population de liposomes utilisée, déterminé par diffusion quasi-élastique de la lumière,, également appelée diffusion dynamique de lumière (« Dynamic Light Scattering », DIS).

Par « liposome unîiamellaire », on entend un liposome qui n'est constitué que d'une seule bicouche de lipides.

Une telle technique de fusion de liposomes conduit à l'obtention d'une couche intègre, homogène,, plane et continue. Les liposomes ne sont pas désintégrés lors de leur fixation au peptide pilotis, et restent intacts. C'est ensuite l'action du peptide fusogène qui entraîne la rupture du liposome et la formation de la bicouche. L'ouverture du liposome et la formation de la bicouche sont connues sous ie terme de « fusion des liposomes »,

La fusion est, de préférence, obtenue grâce à un peptide fusogène, de préférence de SEQ 10 N°2 ; SGSWLRDV¾VDWICrVLTDFKT\'VLQSKLDYKD. Ce peptide correspond à la séquence N -terminale de 31 acides aminés de l'hélice alpha-amphîpatique (AH) de ia protéine non structurale (NS5A) du virus de l'hépatite C nécessaire à l'association rnembranaire du virus lors de sa réplication.

Un tel peptide fusogène a notamment été décrit et utilisé dans les publications de Cho et al 2007, 2009 et 2012 _f de Coutable et al 2014 et dans le brevet US 8,211,712, et ce., pour la fusion de liposomes de différentes compositions. Ce peptide est éliminé et ne se retrouve pas dans l'ensemble final (Hardy et al 2012), De pius _f la publication de Coutable et al a démontré que l'utilisation de ce peptide fusogène est compatible avec la réinsertion des protéines membranaires. D'autres pept!des fusogènes peuvent être envisagés : des peptîdes Issus des protéines de la capside virale,, tels que iiémaggiutinine (BÂ2), gp41 (VIH), gp 30, gp 32, P15E (V de la Leucémie Marine), Pour plus de détails, concernant de tels peptîdes, on pourra se référer à A, Lorin et ah 2007,

Dans le cadre de l'invention, il est possible que îes liposomes soient des protéoliposomes. Dans ce cas, l'insertion de la protéine d'Intérêt est réalisée simultanément avec la formation de la bicouche lipidique, puisque cette dernière sera directement incluse dans les protéoliposomes _*

L'obtention de liposomes unilamellaires est décrite dans la littérature : on pourra notamment se référer à Donald et aL 2007. Pour cela, un film formé de la composition lipidique sélectionnée est tout d'abord formé sur la paroi d'un tube ou d'un ballon en verre par évaporation, notamment à l'argon., du solvant organique dans lequel le mélange de lipides a été formé. Ensuite, ce film est réhydraté avec une solution tampon, notamment tamponnée à un pH appartenant à la gamme allant de 6 à 8, Idéalement de 7,4, Ces deux premières étapes sont, par exemple, effectuées à une température appartenant à la gamme allant de 10 à 35% et typiquement à température ambiante (22ºC notamment). Un tampon HEPES ou PBS pourra, par exemple, être utilisé. Des vésicules multi-iamellaires sont alors obtenues et: sont transformées par des cycles répétés de congélation (par exemple dans l'azote liquide) et de décongélation à une température de 30 à 40°C, suivis au finai d'une étape d'extrusion permettant d'ajuster la taille des liposomes unilamellaires alors obtenus,

Les étapes :

a) de fixation du peptide pilotis en surface du support,

b) de fixation sur le peptide pilotis, des liposomes comprenant une part de lipides possédant une tête polaire chélatrice emprisonnant un cation métallique, par établissement d'interactions métal-chélate entre le cation métallique et au moins une partie des hlstidines situées en position C-terminale,

c) d ^' ajout d'un agent fusogène pour induire la fusion des liposomes et la formation d'une bicouche lipidique continue, sont, le plus souvent,, réalisées à une température appartenant à la gamme allant de 10 à 35ºC, et typiquement à température ambiante (22°C notamment) et à pression atmosphérique (en particulier à 1013 hPa).

En général, le support est placé dans une chambre et les différents réactifs seront successivement injectés avec une étape de lavage entre chacune des étapes a) à c) avec une solution tampon,, notamment tamponnée à un pH appartenant à la gamme allant de 6 à 8, idéalement de 7,4, permettant ainsi d'éliminer toutes les molécules qui ne se seraient pas fixées.

Pour l'étape a), le support est mis en contact avec une solution aqueuse tamponnée du peptlde pilotis, typiquement à une concentration de 10 nM à 10 μΜ, notamment de 25 nM à 4 μM en peptlde pilotis. Les liposomes sont ensuite ajoutés sous la forme d'une suspension dans une solution aqueuse tamponnée (le tampon dans lequel ils sont formés), pour obtenir typiquement dans le mélange réactlonnel en contact avec le support une concentration de 50 à 200 pg / ml. Ensuite, l ^' agent fusogène est ajouté pour obtenir typiquement dans le mélange réactlonnel en contact avec le support une concentration de 10 à 20 μM Les mêmes types de tampon que ceux précédemment décrits pour la préparation de liposomes uni lamellaires peuvent être mis en œuvre à chacune des étapes a) à c) dans les solutions d'introduction des réactifs,

Après formation de la bieouche, 11 est également possible d'ajouter dans le milieu réactlonnel des cations divalents comme le calcium (Ca ^{2 +} ..), ou un agent chélateur comme l'EDTA à une concentration, par exemple, de 0,5 à 5 mM, sans que l'ensemble ne soit perturbé, c'est-à-dire sans qu'un décrochage de la bicouche après fixation au peptlde pilotis ne soit observé.

En conclusion,, l'invention combine différents avantages :

~ tout d'abord, la stabilité mécanique et la robustesse des bîcouches lipidiques attachées sur le support, par liaison réversible sur un peptlde pilotis de liaison qui est, lui-même, greffé par liaison covalente sur le support, - la possibilité de moduier à façon la composition de la bicouche lipidique qui peut donc être adaptée à la protéine membranaire d'intérêt qui doit être insérée,

- la possibilité de former différentes zones, de manière à obtenir des micro-réseaux de régions porteuses de bicouches lipidiques différentes et donc le développement de biopuces à membranes associées,

- la possibilité de réaliser une détection multiplexée sans marquage et en temps réel par mesure en imagerie par résonnante piasmonlque de surface (SPRJ) dans le cas de supports en or,.

L ^' Invention offre donc la possibilité de développer un outil polyvalent d'analyse à haut débit pour l'étude des interactions ligand-protéine membranaire.

Les exemples ei~après., en référence aux Figures annexées., permettent d ^' Illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.

La Figyre 1 est une représentation schématique d'un ensemble selon l'invention.

La Fispre 2 présente le % de rêflexivité en fonction du temps, suivi en imagerie par résonance piasmonlque de surface (SPRi) dans le cas de la composition lipidique : mélange de DOPC, DOPS et de DCX3S-NTA-(Ni), dans un rapport molaire 74/24/2.

La Figure 3 présents la caractérlsadon du processus de formation d'une bicouche lipidique suspendue par microscopie à force atomique - AFM (images A, 8 et C du haut) et par redistribution de fluorescence après pbotoblanchiment - FRAP (images D, F,. E, G du bas) : Haut : Images AFM de la surface d'or après greffage du peptide pilotis (A), après ajout de liposomes contenant du DOGS-NTA(Ni) (8) et après ajout de peptide fusogène (C). Bas ; Redistribution de fluorescence après photoblanchiment d'une région de la surface recouverte par des liposomes non fusionnées à G min (D) ou 1h après photoblanchiment (E) et d'une région de la surface après formation de la bicouche lipidique par ajout d'agent fusogène à 0 min (F) ou 8 min après photoblanchiment La Figure 4A présente le % de réflexivité en fonction du temps suivi par SPRi de la formation d'une bicouche lipidique constituée de DOPC/DOPS 3/1 en présence ou en absence de 150 m H NaCI, suivie de 1 interaction de lisoforme 8 de la Mucléoside DiPhosphate Kinase (NDPK-8) à une concentration finale de 30 nM La Figyre 4B présente le % de réflexivité en fonction du temps suivi par SPRi de i'adsorptîon de la NDPK-8 à une concentration finale de 30 nM sur la surface d'or en présence ou en absence de 150 mM NaCI.

La Figure SA présentent les images en microseopie de fluorescence d'un prisme d'or après dépôt d'une matrice de peptide pilotis (image de gauche) dans le cas d'un format biopuce, après incubation avec des liposomes incorporant 5% de sonde fluorescente MBO-PE {image du milieu) et après fusion des liposomes (image de droite).

La Figura SE présente révolution du % de réflectivité au cours du processus de formation d'une bicouche lipidique suivie pour chaque région de dépôt du peptide pilotis par SPRI, dans le cas d'un format biopuce. La ligne de base correspond au signa! enregistré après dépôt du peptide pilotis à l'injection des liposomes. Profil représentatif de l'ensemble des régions de dépôt.

EXEMPLES

Matériels et Réactifs

-Les iipides utilisés proviennent de la société Avant! Polar Upids®.

-L'appareil de SPRi (SPRi-Lab-f) et le prisme utilisé (SPRi-Blochip™) correspondant au support en or sont commercialisés par la société Hohba©.

- Le tampon HEPES et le chloroforme proviennent de la société Sigma

Aldriehii, Le tampon HEPES-NaCI est constitué d'HEPES (10 à 20 mM) et de MaCi (0 à 150 mM), et ajusté â pH 7,4. Le tampon PBS est constitué de Phosphate (10 mM), NaCI (140 mM) et KCI (2,7 mM), et ajusté à pH 7,4, -Le Hini-Extruder ainsi que les seringues, membranes en polycarbonate et pré-filtres utilisés pour la préparation des liposomes proviennent d¾vanti Polar Lipids®. -Le gtanu!ometre à diffusion quasi-élastique de la lumière (Diffusion Llght Scattering, DIS) est un Malvern© Zetasizer Nano S.

Un film lipidique est, tout d'abord, formé sur la paroi d'un tube en verre par évaporation à l'argon du solvant organique dans lequel le mélange de lipides, préparé dans du chloroforme ou dans un mélange chloroforme : méthanol (9 /1 ; v/v)) selon la composition choisie, a été déposé. La quantité totale de lipides évaporés est: de i mg.

Plusieurs compositions lipidiques ont été testées :

- un mélange de FOPC et de DOGS-NTA-(Ni), dans un rapport: molaire 98/2,

- un mélange de DOPC et de DCX3S-NTA-(Ni), dans un rapport molaire 98/2,

- un mélange de POPC, DGPE-Biotine et de DOGS-rcrA-(Ni), dans un rapport molaire 88/10/2,

- un mélange de DOPC, DOPS et de DOGS-HTA-fNi), dans un rapport molaire 74/24/2,

- un mélange de DOPC, DOPS, MBD-PE (lipide fluorescent) et de DGGS- NTA-(Mi), dans un rapport molaire 70/23/5/2, - un mélange de PC extraite de jaune d'œuf, PS extraite de cerveau et de DOGS-NTA-(Ni), dans un rapport molaire 67/31/2,

- un mélange de PC extraite de jaune d'œuf, PS extraite de cerveau, PIP _2, extrait de cerveau, et de DG6S~MTA-(Ni), dans un rapport molaire 67/39/2/2,

- un mélange de 5 composants lipidiques : POPC / Sphingomyéiine /Cholestéroi /POPE /DCK5S-NTA-(Ni), dans un rapport molaire : 37 / 33 / 19 / 9 / 2, qui mime la composition du feuillet externe de la membrane plasmique des ceiluies eucaryotes,

Un film lipidique est, tout d'abord, formé sur la paroi d'un tube en verre par évaporation â l'argon du solvant organique dans lequel le mélange de lipides a été formé, Le film lipidique obtenu est ensuite hydraté avec un tampon HEPES~NaQ pH= 7,4 ou avec le tampon PBS afin d'avoir une concentration en lipides de 1 mg / ml, Cette étape conduit à la séparation de morceaux de bïcouehes qui vont former des MLVs ("Muiti Lameiiar Vesicie": Vésicules Mufti Lamellaires), Ces MLVs sont alors transformées par des cycles répétés de congélation dans l'azote liquide et de décongélation au bain marie à 38°C (6x5 min de congélation et 6x10 min de décongélation)., qui sont suivis d'une étape d'extrusion (21 passages au travers d'une membrane de 400 nm, puis 21 passages au travers d'une membrane de 100 nm ou moins). Ces étapes d'extrusion conduisent à l'obtention de LUV ("Large linîlameilar Vesicie": liposomes uniiamellaires) du calibre désiré (Donald,, K.M., LlBium, J, 3. Gooding, T. Bôcking, A.L Mechter, A. P. Girard- -Egrot, and S. H. Valenzueta. 2007. Nanoblotechnoiogy of Biomimetic Membranes. Langmuïr- Blodgett Technique for Synthesis of Biomimetic Lipid Membranes, p. 25-37. Liposome Techniques for Synthesis of Biomimetic Lip ^' sd Membranes, p. 77- 79).

La taiile des liposomes est contrôlée par diffusion quasi-élastique de la lumière, également appelée diffusion dynamique de lumière (« Dynamic Light Scattering »,, DIS), 2. Formation de la bicouche lipidique

Pour former la bicouche, on injecte., en premier, dans la chambre réactionnelie, le peptide en solution aqueuse tamponnée en tampon HEPES de 10 à 20 mM pH 7,4 supplémenté de NaCI 150 mM à une concentration initiale de 9,74.1ο ^-4 M (soit 2,5 mg/ml) pour obtenir une concentration finale dans la cuve comprise entre 25 nM et 4 μΜ de SEQ ÏD H ^& 1 ; CSRARKQAASIKVAVSADRHHHH qui va servir de lien entre la bïœuche et la surface du support et qui va venir se fixer sur for grâce à ses liaisons tbiol (cystéine ^-terminale). La concentration de 4 μΜ en peptide pilotis correspond à la concentration minimale pour obtenir une saturation de la surface en peptide pilotis greffé. Les liposomes., à la concentration lipidique initiale de ! mg / ml, sont ensuite injectés dans la chambre réactionnelie à une concentration finale de 100 pg /ml et se greffent sur le peptide _* Le peptide fusogène SEQ ID Nº2 ; SGSWLRDVWDWICTVLTDFKTWLQSKLDYKD en solution dans du tampon HEPES 10 à 20 m M pH 7,4 supp lémenté de HaQ 150 mM est alors injecté à une concentration finale comprise entre 10 à 20 μΜ. II va interagir avec les liposomes et permettre le passage de LUV à une bicoucbe plane. Entre chaque dépôt, des lavages avec du tampon de travail HEPES 10 à 20 mM pH 7,4 supplémenté de NaCI 150 mM sont effectués {10 fois le volume de la chambre réactionnelie} _. , permettant ainsi d'éliminer toutes les molécules qui ne se seraient pas fixées spécifiquement.

Des essais ont été réalisés en utilisant des concentrations finales en peptide pilotis de 25 nM et 4 pR L'adsorption du peptide pilotis sur la surface d'or a été suivie par résonance plasmonique de surface. L'appareil de SPRI (SPRï-Lab+) et le prisme utilisé (SPRI-Blochip™) sont commercialisés par la société Horiba©). L'incubation de la surface d'or avec la solution contenant une concentration finale de 4 μΗ de peptide pilotis màult une variation du signal de réflectivité de 0 à 5 %, comme illustré Figure 2, mettant en évidence l'adsorption du peptide sur l¾r. Cette variation de réflectivité est la variation maximale que l'on peut obtenir quand le peptide pilotis sature la surface. Elle n'est pas modifiée après des rinçages intensifs. Les analyses effectuées à partir des valeurs de variation de réflectivité en pourcent permettent de déterminer la densité de molécules greffées en surface. Cette densité peut être estimée en utilisant l ^' équation de calibration de l'appareillage utilisé (SPRi-Lab+} :

où est la variation de réflectivité en pourcent, L _zc la profondeur de pénétration de Tonde plasmonique (1,02.1er ⁴ mm), le rapport ôn/ôC est fixé à 1,9.10 ^{- 10} mmlpg ^-1 , le S _P,R désigne la sensibilité de la SPR en pourcent par unité d'index de réfraction (2,25.10 ³ %.RIU ^-1 ) et Γ correspond à la densité en pmol.mm ^-2 .

La densité moléculaire déterminée pour une variation maximale de 5% obtenue pour une concentration finale de 4 pH de peptide pilotis dans la cuve réactionnelle et correspondant au signal de saturation, est de 2,8.10 ¹³ molécules de peptides pilotis / cm ² . A 25 nM _/ la densité est de 2.1G ¹² molécules de peptides pilotis / cm ² conduisant à un écartement théorique de 5,8 nm entre chaque pilotis, si ces derniers sont répartis de façon homogène sur le support.

Des liposomes contenant ί à 2% d'un lipide à tête chélatrice NTA(Ni) (18: 1 DOGS~MTA(Ni) (1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-a-ECN-CS-amino-l- carboxypentyl) îminodiacetic acid}succînyf) ont été utilisés pour la formation de la bicouche lipidique. Le processus a été testé avec des liposomes de tailles comprises entre 30 et 100 nm et de compositions lipidiques variables dont 98% DOPQ 98% POPC, DOPC / DGPS, POPC / POPS (ratios variables), extraits naturels de PC et PS (ratios variables), en absence ou en présence de PIP2 et/ou de cholestérol. L'ajout de liposomes à une concentration finale de 100 pg /mL de compositions lipidiques variables contenant le lipide chélateur DOGS~MTA(Mi) induit une forte augmentation de la réflectivité, comme illustré Figure 2, ce qui traduit un changement dans les propriétés optiques de la surface du prisme SPR. Cette valeur de réflectivité n'est pas modifiée après rinçage, La tête chélatrice MhMFA înteraglt donc spécifiquement avec l'étiquette poly-histldine du peptide permettant la fixation des liposomes.

L'ajout du peptide fusogène de SEQ ID Nº2 induit, comme le montre la Figyra 2, dans un premier temps, une légère augmentation de la réflectivité qui traduit son insertion dans les liposomes, suivie, dans un second temps, d'une diminution du signal qui a été précédemment interprétée., pour des liposomes directement déposés sur la surface d'or sans ajout de peptide pilotis, comme l'éclatement des liposomes et formation d'une blcouche lipidique homogène à la surface du prisme (Chars and Zare 2008), Ce profil caractéristique présenté Figyre 2 a été obtenu avec toutes les compositions lipidiques listées précédemment.

3, Caracterisation de la bicouche lipidique attachée sur le peptide pilotis

Les étapes de formation de la blcouche lipidique attachée sur le peptide pilotis, lui-même lié sur la surface d'or, ont été caractérisées par microscopie à force atomique (AFM - SOLVER-PRO© de chez MI-MOT® (balayage maximum de 50x50x2.5 pm ±10% ; tes pointes d'AFM utilisées sont des CSG01 de chez NT-MDT® (raideur : 0,03 mN.m ^-1 )} et par mesure de redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRÂP - Zeiss Observer 21), La Figure 3 montre les images obtenues dans te cas d'une blcouche formée de POPC : DOGS~NTA(Ni) (rapport molaire 98 :2) Ce cas a été choisi pour montrer que te peptide fusogène utilisée par Cho et ai était aussi efficace pour former des membranes sur pilotis (* étude ») que directement sur le support (« étude de Cho et al sans pilotis »}.

Les images d'AFM de la surface avant et après incubation avec le peptide pilotis (Figyre 3A) montrent une surface rugueuse avec des rayures caractéristiques des prismes d'or commerciaux. Après incubation du prisme porteur du peptide pilotis avec la suspension de liposomes unilamellaires, on observe une surface recouverte de vésicules (Figura 3B) indiquant l'adsorption de liposomes sur la surface. Après injection du peptide fusogène, la surface apparaît homogène (FigURE 3C), ce qui confirme la fusion des vésicules sur la surface et le recouvrement de la surface d'or par une couche continue de lipides,

L'homogénéité et la fluidité de la bicouche lipidique formée a été vérifiée par microscople de fluorescence et par redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dans ce cas, des liposomes contenant un lipide fluorescent (5% molaire de NBD-PE : sel d'ammonium de 1,2-dioléoyl- sn~glycéro~3~phosplioéthanolamine-H-(7-nitro-2-i3-benzoxad iazol-4-yl} ont été utilisés. Ces liposomes sont préparés, comme précédemment décrit, en ajoutant 5% molaire de NBD-PE. Une partie de la surface a été exposée à un puissant faisceau de lumière focalisée par l'objectif du microscope, avant et après ajout du peptlde fusogène. Le fluorophore présent dans cette région subit une destruction appelée photoblanchiment (Figyre 3D et 3F). Si le mouvement du fluorophore au sein du feuillet membranaire n'est pas contraint et si la bicouche lipidique est fluide et continue, tes molécules fluorescentes situées dans les régions avossinantes vont diffuser librement au cours du temps et la région photoblanchie redevient progressivement fluorescente. Lorsque la mesure de FRAP est effectuée avant ajout de peptlde fusogène, la zone photoblanchie ne redevient pas fluorescente (Figyre 3E). Le fluorophore ne peut pas diffuser sur la surface, ce qui est caractéristique d'une discontinuité due à la population de vésicules accrochées à la surface, mais non fusionnées. Lorsque fa mesure est effectuée après ajout de l'agent fusogène, une redistribution des deux populations entre la zone blanchie et le milieu adjacent a lieu jusqu'à disparition de la zone photoblanchie (Fîf yre 3G). La molécule fluorescente diffuse donc librement sur la surface attestant la formation d'une bicouche continue et homogène.

L'analyse de la cinétique de recouvrement de fluorescence permet de déduire le coefficient de diffusion latérale « D », caractéristique de la fluidité de la bicouche lipidique. Une valeur de 25.ÎG ^"8 om ² /s a été déterminée, ce qui correspond à une bicouche lipidique plus fluide que celles décrites pour des fixations viaôes systèmes protéines/1 igands (Ross! et ai, 20 il). L'intégrité de ia bicouche lipidique formée à la surface d'or a, quant à elle, été vérifiée en utilisant ilsoforme B de la IMudéosIde Di Phosphate Kinase (MDPK-B), Cette protéine interagit spécifiquement avec les molécules de PS et cette interaction est inhibée en présence de 150 mM de NaQ (François- Moutai et al 2014, L'ajout de f4DPK~6 après formation d'une bicouche formée sur les peptides pilotis constituée de DOPC/DOPS (3/1 en rapport molaire) en absence de MaQ induit une augmentation de ia réflectivité enregistrée par SPRI, ce qui traduit une interaction spécifique de la protéine avec la bicouche. En présence de 150 mM de NaQ,, il n'y a pas d'augmentation (Figure 4A). I! a été constaté que cette protéine s'absorbe à la surface d'or en présence et en absence de NaG à 1,50 mM (Figure 4B), L'absence d'adsorptïon en présence de 150 mM de NaQ lorsque la surface est recouverte par la bicouche lipidique suspendue sur les peptides pilotis indique que la surface d'or est parfaitement recouverte et que la bicouche lipidique est intègre et continue ; cette continuité empêchant l'interaction non spécifique de la protéine avec l'or nu.

4. Construction de la oicoyclie en fermât biopuce :

Un enjeu majeur dans l'obtention de membranes lipidiques sur un support solide est la possibilité de réaliser des mesures à hauts débits. Les méthodes traditionnelles de dépôt automatisé impliquant la déshydratation des échantillons ne peuvent pas être appliquées au dépôt de vésicules lipidiques.

Selon le protocole décrit précédemment, les dépôts des étapes a) à c) du procédé selon l'Invention ont été réalisés à l'aide d'un dispositif « piezoelectric spotter » (sdFLEXARRAYER S3, SCIEMIOM, Germany) sur un prisme d'or. Un peptide pilotis (0,04 à 4 ng/spot (2,5.10 ¹² à 2,5.1ο ¹⁴ molécules/cm ² )) a tout d'abord été déposé. La fixation des liposomes (constitués de DOPC/DOPS, 3/1 en rapport molaire,, incorporant 5% NBD-PE et 2% de DOGS-NTA(Ni)} sur les surfaces recouvertes de peptide pilotis a été suivie par SPRI et par microscopie de fluorescence (FIgyres SA et SB), Après dépôt des iiposomes, les régions où le peptide a été déposé deviennent fluorescentes; ce qui atteste la fixation des liposomes aux peptides pilotis déposés par adressage (Figyre 5 - image du centre). Cette étape s'accompagne d'une augmentation de la réflectivité au niveau de chaque dépôt de peptide pilotis (Figure SB). Après ajout de l'agent fusogène, la fluorescence persiste (Figyre 5 - image de droite) et la diminution de la réflectivité enregistrée par SPRi {Figyre SB) atteste de la formation de la bicouche suspendue au-dessus de chaque région de peptide pilotis espaceur déposé par micro-adressage.

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