DOMAINE DE L’INVENTION

La présente invention s’inscrit dans les domaines des agents de liaison, notamment des anticorps, et des maladies liées aux sarbecovirus, en particulier les infections par un sarbecovirus.

La présente invention concerne notamment des variants du VHH72 ayant une affinité améliorée, pouvant être utilisés dans la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus.

L’invention concerne en particulier un agent de liaison (tel qu’un anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprenant la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , comprenant au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé sélectionné parmi le résidu en position 57, le résidu en position 58, le résidu en position 60, le résidu en position 61 , le résidu en position 62, le résidu en position 98, le résidu en position 101 , le résidu en position 102, le résidu en position 103, le résidu en position 104, de la SEQ ID NO :1 , et toute combinaison de ceux-ci.

La présente invention concerne également une molécule d’acides nucléiques codant un de ces agents de liaison, un vecteur comprenant au moins une de ces molécules d’acides nucléiques et une cellule hôte comprenant au moins une de ces molécules d’acides nucléiques ou au moins un de ces vecteurs. La présente invention porte en outre sur l’utilisation de ces agents de liaison, molécules d’acides nucléiques, vecteurs, et cellules hôtes, pour traiter une maladie liée aux sarbecovirus. La présente invention se rapporte en outre à une composition ou un kit comprenant au moins un de ces agents de liaison et/ou au moins une de ces molécules d’acides nucléiques, ainsi que leurs utilisations. La présente invention porte également sur une méthode de diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus, ainsi qu’une méthode de suivi, de pronostic et/ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprenant l’utilisation d’au moins un agent de liaison et/ou d’au moins une molécule d’acides nucléiques et/ou d’une composition ou un kit susmentionné(e). ETAT DE LA TECHNIQUE

Les anticorps thérapeutiques ont bénéficié d’un développement rapide depuis les années 1980, ils représentent un groupe majeur parmi les médicaments biologiques. En 2019, plus de 80 anticorps thérapeutiques bénéficient d’une autorisation de mise sur le marché en Europe et/ou aux Etats-Unis. Leurs indications couvrent un large champ de pathologies avec une forte dominance dans le domaine de l’oncologie. On retrouve également des anticorps pour les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, les allergies, le rejet de greffe et les maladies cardiovasculaires.

Ces maladies, notamment les maladies infectieuses, continuent de sévir et de décimer les populations du monde entier, parmi lesquelles des virus émergents capables d’adaptation et d’évolution rapide, donnant naissance à de nouvelles maladies, ou encore des souches pathogènes possédant des attributs facilitant la pathogénicité. Les épidémies mondiales causées par ces virus et autres pathogènes émergents peuvent entraîner des dommages humains et des coûts importants pour les communautés et les économies touchées.

Les infections par les coronavirus, dont le SARS-CoV2, en sont des exemples récents. Le virus SARS-CoV2 (Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2) est à l’origine de la pandémie actuelle de COVID-19, avec des conséquences dévastatrices dans de nombreux pays. A ce jour, la vaccination des populations semble être l’approche la plus efficace pour contrôler l’ampleur de l’épidémie et protéger efficacement la santé des individus.il y a en effet peu de moyens thérapeutiques, les seules molécules ayant démontré une efficacité chez les patients infectés étant des anti-inflammatoires et des anticorps monoclonaux.

Les anticorps anti-protéine S SARS-CoV2

Pour compléter l’arsenal thérapeutique face au virus SARS-CoV2, l’immunothérapie passive, en l’occurrence l’injection d’anticorps monoclonaux, constitue une approche intéressante et complémentaire à la vaccination. En effet, l’acquisition par les patients de titres suffisants d’anticorps neutralisants semble inversement corrélée à une progression de formes sévères du COVID-19 [1]. Plusieurs études ont par ailleurs démontré que l’administration précoce d’anticorps monoclonaux neutralisant la protéine S du virus permet d’éviter une évolution vers des formes sévères [2-4].

Depuis l’apparition du virus SARS-CoV2, de très nombreux travaux ont permis l’obtention d’anticorps monoclonaux ciblant la protéine S et plus particulièrement le domaine RBD [5]. Parmi les plus avancés, neuf anticorps ont fait l’objet d’études en phase cliniques (IMDB), seuls ou en combinaison. A ce jour, la combinaison de l’imdevimab et du casivirimab développés par Regeneron [6] ainsi que la combinaison du bamlanivimab avec l’etesevimab développés par le laboratoire Lilly ont reçu une autorisation de mise sur le marché temporaire par la FDÀ et l’EMA. Encore plus récemment, une monothérapie basée sur le sotrovimab développé par Vir Biotechnology et GlaxoSmithKline a reçu une autorisation temporaire d’utilisation par la FDÀ.

Toutefois, depuis l’émergence du virus SÀRS-CoV2 fin 2019 en Chine, de nouvelles souches sont apparues dans différents pays. Celles-ci comprennent de nouvelles mutations par rapport au virus originel (virus SÀRS-CoV2 d’origine), en particulier dans la région RBM (Receptor Binding Motif) du domaine RBD (Receptor Binding Domain) responsable de l’interaction avec le récepteur ÀCE2 humain qui constitue la porte d’entrée du virus dans les cellules humaines. Les souches les plus préoccupantes sont classées comme variants préoccupants par l’OMS ou VoC (« variant of concern » en anglais). Parmi celles-ci, on trouve notamment les souches B.1.1.7 identifiée au Royaume-Uni, la souche B.1.351 identifiée en Afrique du sud, la souche P.1 identifiée au Brésil, ainsi que les souches B.1.617 identifiées en Inde. Certaines mutations contenues dans ces souches peuvent conférer une augmentation de la transmissibilité du virus mais peuvent également contribuer à un échappement à l’immunité de l’hôte [7-10].

Plusieurs études ont démontré que certaines souches peuvent être résistantes à la neutralisation par les anticorps monoclonaux, comme c’est le cas notamment pour le bamlanivimab ou l’etesevimab [11 , 12]. En particulier, les mutations E484K et L452R sont situées au sein de l’épitope du bamlanivimab et les mutations K417N/T au sein de l’épitope de l’etesevimab et induisent une réduction de la neutralisation par ces anticorps monoclonaux d’un facteur supérieur à 1000 [12] [12].

En outre, les données de la littérature montrent une évolution antigénique en réponse à la pression immunitaire de l’hôte liée à une infection préalable [13, 14] ou à la vaccination. Plusieurs études montrent une augmentation de la fréquence des mutations sur le résidu E484 ou dans la boucle comprenant les acides aminés 443-450 [15] [15]. Malheureusement, de nombreux anticorps monoclonaux ciblent cette région immuno-dominante fréquemment reconnue par les anticorps polyclonaux [12] [12].

L’utilisation de cocktails d’anticorps ciblant des épitopes distincts semble être une stratégie pertinente pour conserver l’efficacité des immunothérapies passives et réduire la sensibilité aux mutations des souches émergeantes. Néanmoins, ces données illustrent le besoin de développer des anticorps neutralisants à large spectre, ayant une activité contre différents sarbecovirus apparentés au SÀRS-CoV2 et peu sensibles à l’échappement immunitaire des différentes souches virales circulant dans les populations humaines. Aussi, il est essentiel de sélectionner des anticorps monoclonaux ciblant des épitopes conservés de par leur rôle structural ou leur fonction, mais également distincts des zones immuno-dominantes principales pour être moins susceptibles à l’évolution du virus SÀRS-CoV2.

Les anticorps anti-SARS-CoV neutralisants à large spectre

De nombreux exemples dans la littérature décrivent des anticorps SÀRS-CoV2 ciblant le receptor binding motif (RBM), i.e., le site d’interaction du domaine RBD de la protéine S avec ÀCE2. Ces anticorps monoclonaux peuvent démontrer d’excellentes affinités, une très bonne efficacité de neutralisation du virus SÀRS-CoV2, ainsi qu’un effet protecteur in vivo. En revanche, plusieurs études indiquent que la plupart de ces anticorps possèdent un spectre de reconnaissance relativement restreint, avec une absence de reconnaissance des domaines RBD issus des autres membres du sous-genre des sarbecovirus, notamment SÀRS-CoV1 [16]. Par ailleurs, un certain nombre de ces anticorps, comme le bamlanivimab ou l’etesevimab sont sujets à des pertes significatives d’affinité pour les variants émergents de SÀRS-CoV2, alors qu’il ne s’agit souvent que de mutations ponctuelles.

L’homologie de la protéine S du virus SÀRS-CoV2 avec les protéines S des autres coronavirus humains est très variable, avec environ 30% de similarité avec les autres lignées de beta- coronavirus (MERS-CoV, HCoVHKLH , et HCoV-OC43) et seulement 24% de similarité avec les alpha-coronavirus (HCoV-229E et HCoV-NL63) [17] [17]. Les protéines S des autres membres du sous-genre des sarbecovirus révèlent une plus grande proximité, avec près de 77% de similarité de séquence avec la protéine S de SÀRS-CoV1. Les sarbecovirus ou SÀRS-like bêta- coronavirus regroupent les coronavirus liés au syndrome respiratoire aigu sévère dont les SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2. Ces virus interagissent avec le récepteur ÀCE2 via la protéine Spike S pour pénétrer au sein des cellules cibles, ainsi qu’avec des sérine protéases transmembranaires de l’hôte, comme TMPRSS2 ou TMPRSS11 D, pour leur activation [18, 19].

Rapidement après le début de la pandémie actuelle, la proximité des séquences des protéines S des souches SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2 a conduit plusieurs équipes à rechercher des anticorps « cross- réactifs », en particulier à partir d’échantillons obtenus auprès de patients ayant contracté le virus SÀRS-CoV1 ou en criblant des banques d’anticorps monoclonaux obtenues suite à l’épidémie de 2003 [20-22].

Parmi les rares exemples d’anticorps « cross- réactifs » et neutralisants décrits dans la littérature à ce jour, on peut trouver les anticorps S309 [21] (dont est issu le sotrovimab), l’anticorps ÀDG-2 [23] [23], l’anticorps S2H97 [16] ainsi que l’anticorps de camélidé VHH72 [22]. Un autre anticorps, le CR3022 possède une « cross-réactivité » SÀRS-CoV1 /SÀRS-CoV2 mais n’est pas capable de neutraliser SÀRS-CoV2 in vitro [24, 25]. L’anticorps S309 a été obtenu à partir de cellules B mémoires issues de PBMC d’un patient ayant été infecté par le virus SÀRS-CoV1 en 2003 [21]. Cet anticorps dispose d’une très bonne affinité (0,2 nM) pour RBD SÀRS-CoV2 et montre une neutralisation du virus in vitro. Cet anticorps a très récemment démontré une efficacité clinique chez l’homme (sous le nom VIR-7831 ) et vient d’obtenir une autorisation d’utilisation d’urgence par la FDÀ.

L’anticorps ÀDG-2 est également dérivé d’un anticorps issu de cellules B mémoires d’un patient ayant été infecté par le virus SÀRS-CoV1 en 2003. L’anticorps amélioré obtenu par ingénierie présente une haute affinité et un large spectre. Cet anticorps a montré un effet protecteur chez des souris, dans un modèle d’infection au SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2 [23] [23].

À l’inverse des anticorps S309 et ÀDG-2, l’anticorps S2H97 a été obtenu à partir de cellules B mémoires issues de PBMC d’un patient ayant été infecté par le virus SÀRS-CoV2 en 2020 [16]. S2H97 démontre une excellente affinité pour RBD SÀRS-CoV2 (30 pM) une bonne affinité pour RBD SÀRS-CoV1 (1 ,6 nM), mais reconnaît également l’ensemble des domaines RBD des sarbecovirus, y compris au sein du clade le plus divergent, regroupant les souches asiatiques n’utilisant pas ÀCE2 comme récepteur. Toutefois, l’effet neutralisant de l’anticorps S2H97 pour SÀRS-CoV2 s’avère moins performant que les anticorps montrant la neutralisation la plus efficace du virus (e.g., S2E12, S2D106) mais ayant des épitopes moins conservés dans le RBM [16]. Ces données semblent illustrer un compromis nécessaire entre efficacité thérapeutique et la « cross-réactivité », c’est-à-dire le spectre des souches pouvant être reconnues.

Outre les anticorps monoclonaux conventionnels, il existe des anticorps provenant de camélidés (VHH). Ces VHH contiennent un seul domaine variable constitué par une seule chaîne lourde (VH) à la différence des anticorps conventionnels qui possèdent une chaîne lourde et une chaîne légère (VH VL). Ces molécules sont très stables et peuvent avoir d’excellentes affinités pour leur antigène. Grâce à la taille réduite de leur région variable, ces molécules peuvent cibler des épitopes difficilement accessibles aux anticorps conventionnels.

Le VHH-72 : un VHH à large spectre neutralisant SÀRS-CoV2 malgré une affinité modeste

Le VHH-72 a été obtenu par immunisation d’un lama avec les protéines S de SÀRS-CoV-1 et MERS-CoV suivi d’un criblage des VHH spécifiques par une approche de phage display. Le VHH-72 montre une bonne affinité pour la protéine RBD de SÀRS-CoV-1 (1 ,15 nM), une absence de reconnaissance de RBD MERS-CoV mais une affinité modeste pour RBD SÀRS-CoV- 2 (39-63 nM), caractérisée par une dissociation rapide [22]. De plus, le VHH-72 une fois exprimé en fusion avec un fragment Fc d’anticorps humain, présente une capacité très modeste de neutralisation des pseudovirus SÀRS-CoV2 (IC50 d’environ 0,2 pg/ml).

Il est donc nécessaire d’augmenter l’efficacité et l’affinité du VHH-72 pour pouvoir neutraliser le virus SÀRS-CoV2.

Des travaux ont permis l’identification de plusieurs mutants ponctuels du VHH72 (en particulier le mutant VHH72-S56À) ayant une affinité pour RBD SÀRS-CoV-2 légèrement améliorée par rapport à la molécule parentale (Kd = 8,3nM) [26, 31]. Cette amélioration se traduit également par une augmentation de la liaison du VHH à la protéine Spike trimérique de SÀRS-CoV2 et une augmentation de la neutralisation des pseudovirus SÀRS-CoV2. Toutefois, l’affinité et la cross-réactivité partielle de ce mutant du VHH72 restent insuffisantes pour cibler et neutraliser efficacement le plus grand nombre possible de variants du SÀRS-CoV2.

Àu vu de la persistance de la pandémie de COVID-19 et de la fréquence élevée d’apparition de nouveaux variants, ainsi que du risque de l’émergence de nouveaux sarbecovirus, il est primordial de mettre au point de nouveaux anticorps possédant une grande affinité pour différents variants du SÀRS-CoV2, combinée à un fort pouvoir neutralisant.

La présente invention permet de répondre à ce besoin.

EXPOSE DE L’INVENTION

Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des agents de liaison innovants, notamment des anticorps à domaine unique innovants, capables de reconnaître de manière spécifique et de neutraliser les différents variants du SÀRS-CoV2.

Ces agents de liaison optimisés ont notamment été obtenus par une approche innovante d’ingénierie moléculaire de l’anticorps et de maturation d’affinité à partir de l’anticorps à domaine unique VHH72, combinant des techniques de Deep-Mutational Scanning et de Yeast Surface Display. Cette approche a permis d’identifier les positions d’acides aminés et les mutations susceptibles de conférer une augmentation d’affinité à l’anticorps. Un assemblage dans des banques combinatoires combiné à un séquençage haut débit permis d’identifier un grand nombre de variants enrichis ayant une plus forte liaison à l’antigène que l’anticorps parental VHH72.

Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les agents de liaison ainsi mis au point possèdent de très bonnes affinités pour les différents domaines RBD des variants du virus SÀRS-CoV2, à la différence des agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur. De façon remarquable, les données montrent également que ces agents de liaison optimisés sont capables d’empêcher la liaison entre le récepteur ÀCE2 et le domaine RBD, de manière plus efficace que les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces agents de liaison pour traiter les maladies liées aux sarbecovirus, notamment les coronavirus.

Les données montrent également que ces agents de liaison sont des outils de détection des sarbecovirus.

La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de traitement puissant et à spectre large des maladies liées aux sarbecovirus, ainsi que des méthodes de diagnostic efficace et fiable de ces maladies, des méthodes de criblage de molécules mais également des outils pour la recherche dans le domaine des maladies liées aux sarbecovirus.

La présente invention concerne notamment des variants du VHH72 ayant une affinité améliorée, pouvant être utilisés dans la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus.

La présente invention concerne en particulier un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , comprenant au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M (de préférence par un acide aminé G) ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, W, R, et H (de préférence par un acide aminé S) ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I); d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, R, P, Q, I, M, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R) ; e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L) ; f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V); g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N (de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y) ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

La présente invention concerne en outre agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , comprenant une combinaison d’au moins deux substitutions de résidus d’acide aminé, le résidu d’acide aminé substitué étant sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G) ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, W, R, et H (de préférence par un acide aminé S) ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I); d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, R, P, Q, I, M, W, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R); e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L); f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V); g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N (de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y) ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; et j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

La présente invention concerne également un agent de liaison tel que défini ci-dessus, qui a été humanisé (c’est-à-dire dont la séquence a été humanisée).

Outre les substitutions ou combinaisons de substitutions listées ci-dessus, l’agent de liaison humanisé selon l’invention peut notamment comprendre au moins une substitution additionnelle d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en :

• Le résidu en position 1 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé E ;

• Le résidu en position 5 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, et L ;

• Le résidu en position 14 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé P ;

• Le résidu en position 27 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé F ; • Le résidu en position 31 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 35 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 37 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé V ;

• Le résidu en position 44 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé G ;

• Le résidu en position 45 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé L ;

• Le résidu en position 47 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé W ;

• Le résidu en position 49 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 50 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 53 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé G ;

• Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 75 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 79 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé L ;

• Le résidu en position 87 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé R ;

• Le résidu en position 88 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 89 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé E ;

• Le résidu en position 120 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé Q ; et

• Une combinaison quelconque de ceux-ci.

La présente invention concerne également une molécule d’acides nucléiques codant un de ces agents de liaison, un vecteur comprenant au moins une de ces molécules d’acides nucléiques et une cellule hôte comprenant au moins une de ces molécules d’acides nucléiques et/ou au moins un de ces vecteurs. La présente invention porte en outre sur l’utilisation de ces agents de liaison, molécules d’acides nucléiques, vecteurs, et cellules hôtes, pour traiter une maladie liée aux sarbecovirus. La présente invention se rapporte en outre à une composition ou un kit comprenant au moins un de ces agents de liaison et/ou au moins une de ces molécules d’acides nucléiques, ainsi que leurs utilisations. La présente invention porte également sur une méthode de diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus, ainsi qu’une méthode de suivi, de pronostic et/ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprenant l’utilisation d’au moins un agent de liaison et/ou d’au moins une molécule d’acides nucléiques et/ou d’une composition et/ou un kit susmentionné(e).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Résumé de l’invention

La présente invention concerne un agent de liaison comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , comprenant au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M ; de préférence par un acide aminé G ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, W, R, et H ; de préférence par un acide aminé S ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F ; de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I ; d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, R, P, Q, I, M, et F ; de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R ; e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q ; notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, A, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L ; f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D ; notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V; g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y ; de préférence par un acide aminé W ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation, l’agent de liaison comprend au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé choisie parmi : la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M (de préférence par un acide aminé G) ; la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 , de préférence par un acide aminé V ; la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO : 1 par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W); et une combinaison quelconque de celles-ci.

La présente invention se rapporte en outre à un agent de liaison comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 , comprenant une combinaison d’au moins deux substitutions de résidus d’acide aminé, le résidu d’acide aminé substitué étant sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : G, N et M ; de préférence par un acide aminé G ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, W, R, et H ; de préférence par un acide aminé S ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F ; de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I ; d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, R, P, Q, I, M, W, et F ; de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R ; e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q ; notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V,

P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L ; f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D ; notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R,

Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V ; g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; et j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : W, et Y ; de préférence par un acide aminé W ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Avantageusement, l’agent de liaison comprend au moins une combinaison de substitutions de résidus d’acide aminé choisie parmi : a) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 , de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé V; b) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et c) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé V, et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO : 1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W).

L’agent de liaison peut notamment comprendre, ou consister essentiellement en, ou consister en, une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :2 , SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, et SEQ ID NO :6.

Selon un mode de réalisation, l’agent de liaison comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins un agent de liaison choisi parmi : un anticorps, un dérivé fonctionnel d’anticorps, et un fragment fonctionnel d’anticorps ; le fragment fonctionnel d’anticorps étant de préférence choisi parmi : un anticorps à domaine unique, un nanocorps (nanobody en anglais), et un VHH (domaine variable unique de chaîne lourde), et une combinaison quelconque de ceux-ci.

Avantageusement, l’agent de liaison est humanisé, l’agent de liaison humanisé comprenant de préférence une séquence d’acides aminés ayant au moins 85% d’identité avec la séquence

SEQ ID NO :7, de préférence ayant au moins 86% d’identité, de préférence ayant au moins

87% d’identité, de préférence ayant au moins 88% d’identité, de préférence ayant au moins

89% d’identité, de préférence ayant au moins 90% d’identité, de préférence ayant au moins

91% d’identité, de préférence ayant au moins 92% d’identité, de préférence ayant au moins

93% d’identité, de préférence ayant au moins 94% d’identité, de préférence ayant au moins

95% d’identité, de préférence ayant au moins 96% d’identité, de préférence ayant au moins

97% d’identité, de préférence ayant au moins 98% d’identité, de préférence ayant au moins

99% d’identité, avec la séquence SEQ ID NO : 7.

Selon un mode de réalisation, l’agent de liaison comprend en outre un fragment de chaîne lourde d’anticorps, de préférence un fragment Fc d’anticorps (fragment cristallisable d’anticorps), le fragment de chaîne lourde d’anticorps et/ou le fragment Fc étant de préférence humains.

Avantageusement, l’agent de liaison est capable de reconnaître : un domaine RBD (Receptor Binding Domain) d’une protéine Spike de sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SARS-CoV1 , les variants du virus SARS-CoV1 , le virus SARS-CoV2, et les variants du virus SARS-CoV2 ; l’agent de liaison étant de préférence capable de reconnaître un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV1 et un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS- CoV2 ; et/ou un domaine RBD d’une protéine Spike du virus SARS-CoV2 d’origine, et un domaine RBD d’une protéine Spike d’au moins un variant du virus SARS-CoV2 d’origine, le variant étant de préférence choisi parmi un variant Alpha, un variant Beta, un variant Gamma, un variant Delta, un variant Epsilon, un variant Zêta, un variant Eta, un variant Têta, un variant Iota, un variant Kappa, un variant Lambda, et toute combinaison de ceux-ci ; de préférence choisi parmi un variant Alpha, un variant Beta, un variant Gamma, un variant Delta, et toute combinaison de ceux-ci.

De préférence, la constante de dissociation K<J(VHH72 substitué) de l’agent de liaison, mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2 est inférieure à la constante de dissociation Kd(VHH72 non substitué) de l’anticorps à domaine unique VHH72 d’origine, comprenant la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2.

La présente invention concerne également une molécule d’acides nucléiques codant un agent de liaison selon l’invention, comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, de préférence une séquence d’acides nucléiques ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :11 ,

SEQ ID NO : 12, et SEQ ID NO 13, de préférence ayant au moins 86% d’identité, de préférence ayant au moins 87% d’identité, de préférence ayant au moins 88% d’identité, de préférence ayant au moins 89% d’identité, de préférence ayant au moins 90% d’identité, de préférence ayant au moins 91% d’identité, de préférence ayant au moins 92% d’identité, de préférence ayant au moins 93% d’identité, de préférence ayant au moins 94% d’identité, de préférence ayant au moins 95% d’identité, de préférence ayant au moins 96% d’identité, de préférence ayant au moins 97% d’identité, de préférence ayant au moins 98% d’identité, de préférence ayant au moins 99% d’identité, avec une séquence choisie parmi les SEQ ID NO :9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO 12, et SEQ ID NO : 13, de préférence encore une séquence choisie parmi les SEQ ID NO :9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO 12, et SEQ ID NO : 13.

La présente invention concerne également un vecteur comprenant la molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ainsi qu’une cellule hôte comprenant la molécule d’acides nucléiques selon l’invention et/ou le vecteur selon l’invention.

La présente invention porte en outre sur un agent de liaison selon l’invention, une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, un vecteur selon l’invention, ou une cellule hôte selon l’invention, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d’une maladie, la maladie étant de préférence choisie parmi les maladies liées aux sarbecovirus, la maladie liée aux sarbecovirus étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS- CoV2 d’origine.

La présente invention concerne également l’utilisation in vitro d’au moins un agent de liaison selon l’invention, pour : i. le diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie liée aux sarbecovirus ; ii. le suivi chez un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; iii. la stratification d’un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; iv. l’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment curatif) administré à un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; v. détecter la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; vi. déterminer la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; vii. cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître au moins un sarbecovirus ; de préférence cribler des composés/molécules capables de neutraliser au moins un sarbecovirus ; ou viii. une combinaison quelconque de i. à vii. ; la maladie liée aux sarbecovirus étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus. Définitions

Dans le présent document, le terme "coronavirus" désigne un groupe de virus appartenant à la famille des Coronaviridae. De manière générale, les coronavirus sont des virus enveloppés avec une capside à symétrie hélicoïdale. Ils possèdent un génome à ÀRN positif monocaténaire et sont capables d'infecter les cellules des oiseaux et des mammifères. La morphologie des virions est typique, avec un halo de protubérances protéiques ("Spike") qui leur a valu leur nom. Parmi les quatre genres de coronavirus (Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus et Deltacoronavirus), le genre Betacoronavirus (B-CoVs ou Beta-CoVs) comprend des virus infectant les animaux et/ou les humains. Les coronavirus comprennent généralement quatre protéines structurelles, dont les protéines de pointe (S ou protéine S), d'enveloppe (E), de membrane (M) et de nucléocapside (N).

Le terme "bétacoronavirus" ou « Betacoronavirus » désigne tout virus appartenant au genre Betacoronavirus (B-CoVs ou Beta-CoVs) au sein de la famille des Coronaviridae, en particulier tout bétacoronavirus appartenant à l'une des quatre lignées désignées comme A, B, C et D. Il désigne un bétacoronavirus infectant les animaux (de préférence un mammifère) et/ou les humains. En particulier, cette désignation inclut les bétacoronavirus infectant les organismes humains choisis dans le groupe constitué par OC43, HKU1 , SARS-CoV-1 , SARS- CoV-2 et MERS-CoV. Le genre Bétacoronavirus est subdivisé en quatre lignées désignées A, B, C et D. La lignée A (également désignée comme le sous-genre Embecovirus) comprend les virus HCoV-OC43 et HCoV-HKU1 , qui sont capables d'infecter diverses espèces. La lignée B (également désignée comme le sous-genre Sarbecovirus) comprend les virus SARS-CoV-1 , SARS-CoV-2, et Bat SL-CoV-WIV1. La lignée C (également appelée sous-genre Merbecovirus) comprend le coronavirus HKU4 (BtCoV-HKU4) de la chauve-souris Tylonycteris, le coronavirus HKU5 (BtCoV-HKU5) de la chauve-souris Pipistrellus et le MERS-CoV, capables d'infecter notamment les chameaux et les humains. La lignée D (également appelée sous-genre Nobecovirus) comprend le coronavirus HKU9 (BtCoV-HKU9) de la chauve-souris Rousettus.

Chez l'homme, les infections à coronavirus peuvent provoquer des pathologies respiratoires associées à des symptômes similaires au rhume, à la bronchiolite et à des maladies plus graves comme le syndrome respiratoire aigu sévère causé par le SARS-CoV-1 , qui a généré une épidémie en 2003, et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient causé par le MERS-CoV, qui a généré une épidémie en 2012. Le SARS-CoV-2 (et ses variants) est le bêta-coronavirus à l'origine de l'épidémie de coronavirus de 2019-2021 (en cours), générant la forme de pneumonie connue sous le nom de maladie à coronavirus 2019 ou COVID-19. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), au 28 mars 2021 , 126 372 442 cas de COVID-19 ont été confirmés et 2 769 696 patients sont décédés dans le monde. Cette épidémie a été déclarée urgence de santé publique de portée internationale par l'OMS le 30 janvier 2020.

Par « sarbecovirus », on entend un sous-genre de Betacoronavirus regroupant les coronavirus liés au syndrome respiratoire aigu sévère dont les SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2. Les virus du sous-genre Sarbecovirus étaient auparavant connus sous le nom de coronavirus du groupe 2b5. Les Sarbecovirus utilisent l'ÀCE2 comme récepteur. La grande majorité des sarbecovirus infectent des chauve-souris rhinolophes mais certains se sont adaptés à d'autres mammifères comme la civette, le blaireau ou l'humain pour le SÀRS-CoV-1 , le pangolin et l'humain pour le cluster du SÀRS-CoV-2, mais aussi différents carnivores (chat, tigre, vison et chien). Le sous-genre Sarbecovirus est caractérisé par la présence d'une seule protéinase de type papaïne (PLpro) dans le cadre de lecture ouvert ORF18, au lieu de deux dans le sous- genre Embecovirus et le genre Alphacoronavirus.

Par "SARS-CoVI" ou « SRAS-CoVI" ou « SARS-COV1" ou "SARS-CoV-1" ou "virus SARS-CoVI" on entend le coronavirus responsable de l'épidémie de syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) qui a sévi de 2002 à 2004. C'est une souche de l'espèce de coronavirus SARSr-CoV (pour SARS- related coronavirus, soit « coronavirus lié à un SRAS »). Cet agent infectieux serait apparu en novembre 2002 dans la province du Guangdong, en Chine. Entre le 1er novembre 2002 et le 31 août 2003, le virus aurait infecté 8 096 personnes dans une trentaine de pays, causant 774 décès, essentiellement en Chine, à Hong Kong, à Taïwan, et en Asie du Sud -Est. Issu d'une espèce de coronavirus bien implantée chez les chauves-souris (Rhinolophes), le SARS- CoV-1 infecte civettes, blaireaux et humains.

Par "SARS-CoV2" ou « SRAS-CoV2" ou « SARS-COV2" ou "SARS-CoV-2" ou "virus SARS-CoV2" on entend le coronavirus 2 qui provoque le syndrome respiratoire aigu sévère. Le SARS-CoV2 appartient à l'espèce Coronavirus, au sous-genre Sarbecovirus au genre Betacoronavirus et à la famille Coronaviridae. Le terme "SARS-CoV2" désigne ici le virus SARS-CoV2 tel qu'il a été identifié à l'origine, ainsi que tous les variants du SARS-CoV2. Tel qu'il est utilisé ici, le virus SARS-CoV2 tel qu'il a été identifié à l'origine (appelé virus SARS-CoV2 d’origine) fait référence au virus SARS-CoV2 identifié pour la première fois à Wuhan, en Chine, et séquencé au début de l’année 2020 par une équipe de l'Université Fudan à Shanghai (Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature Mar;579(7798):270-273. doi : 10.1038/s41586-020-2012-7.(2020)). Tels qu'ils sont utilisés dans le présent document, les variants du virus SARS-CoV2 font référence aux virus apparentés à cette première souche virale identifiée, qui sont apparus par la suite, et en particulier les variants suivants du SÀRS-CoV2 : i. Les variants Alpha (incluant les souches de la lignée B.1 .1 .7); ii. Les variants Beta (incluant les souches des lignées B.1.351 , B.1.351.2, B.1.351.3) ; iii. Les variants Delta (incluant les souches des lignées B.1.617.2, AY.1 , AY.2, AY.3) ; iv. Les variants Gamma (incluant les souches des lignées P.1 , P.1.1 , P.1.2) ; v. Les variants Epsilon ; vi. Les variants Eta (incluant les souches de la lignée B.1.525) ; vii. Les variants Iota (incluant les souches de la lignée B.1.526) ; viii. Les variants Kappa (incluant les souches de la lignée B.1.617.1 ) ; ix. Les variants Zêta ; x. Les variants Têta ; xi. Les variants Iota ; xii. Les variants Lambda ; xiii. Les variants de la lignée B.1.617.3 ; xiv. les souches "Wuhan-like" ; xv. La souche hCoV-19/France/ARA- 104350/2020 (GISAID ID : EPI_ISL_683350) de la lignée B.1 (cette souche possède au moins la mutation D61 G dans sa protéine spike) ; xvi. La souche variante britannique hCoV-19/France/ARA-SC2118/2020 (GISAID : EPI_ISL_900512) de la lignée B.1.1.7 ; xvii. La souche sud-africaine (501 Y. V2. HV001 ) de la lignée B.1.351 ; xviii. Les souches variantes brésiliennes des lignées B.1 .1 .28 et P.1 ; xix. Les variants N501Y ; xx. Les variants E484K ; xxi. Les variants K417N ; xxii. Les variants K417T ; xxiii. Les variants L452R ; xxiv. Les variants T478K xxv. Les variants R346K ; xxvi. Les variants K417T ; xxvii. Tout autre variant de SARS-CoV2 encore à identifier ; xxviii. Toute combinaison de i. à xxvii.

Par "Spike" ou "protéine S" ou "S", on désigne ici une protéine de structure d'un coronavirus.

La protéine spike est généralement composée de deux sous-unités, S1 et S2, qui sont dérivées d'une seule protéine par clivage protéolytique. La sous-unité S1 contient un domaine de liaison au récepteur (RBD) qui reconnaît et se lie au récepteur hôte, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ÀCE2), tandis que la sous-unité S2 assure la fusion de la membrane cellulaire virale en formant un faisceau à six hélices via le domaine répété à deux heptades. La protéine spike joue donc un rôle clé dans la reconnaissance des récepteurs, le processus de fusion de la membrane cellulaire et l'entrée dans la cellule hôte. D'une taille de 180-200 kDa, la protéine S comprend une extrémité N-terminale extracellulaire, un domaine transmembranaire (TM) ancré dans la membrane virale, et un court segment C- terminal intracellulaire. La protéine S est de préférence modifiée de manière post- traductionnelle, de préférence par glycosylation (protéine S glycosylée). Les trimères de protéine S forment visuellement un halo caractéristique en forme de bulbe et de couronne entourant la particule virale. La protéine Spike de SÀRS-COV2 a été bien caractérisée. La longueur totale de la protéine S de SÀRS-CoV2 est de 1273 acides aminés et se compose d'un peptide signal (acides aminés 1 -13) situé à l'extrémité N-terminale, de la sous-unité S1 (acides aminés 14-685) et de la sous-unité S2 (acides aminés 686-1273) ; les deux dernières régions sont responsables de la liaison au récepteur et de la fusion membranaire, respectivement. Dans la sous-unité S1 , on trouve un domaine N-terminal (acides aminés 14- 305) et un domaine de liaison au récepteur (RBD, acides aminés 319-541 ) ; le peptide de fusion (FP) (acides aminés 788-806), la séquence répétée heptapeptidique 1 (HR1 ) (acides aminés 912-984), HR2 (acides aminés 1163-1213), le domaine TM (acides aminés 1213-1237), et le domaine cytoplasmique (acides aminés 1237-1273) constituent la sous-unité S2.

Par "domaine RBD de la protéine Spike" ou « domaine RBD », il est fait référence ici à un domaine de liaison au récepteur (RBD) (c'est-à-dire un domaine qui reconnaît et se lie au récepteur de la cellule hôte) de la protéine S de n'importe quel virus, de préférence de n'importe quel coronavirus, de préférence de n'importe quel bétacoronavirus, plus préférablement de n'importe quel virus SÀRS-CoV.

Les termes "variant", ou "mutant", "dérivé" peuvent être utilisés de manière interchangeable pour désigner généralement un composant ou une espèce (protéine, anticorps, fragment de protéine, polypeptide, polynucléotide, oligonucléotide, nucléoside, nucléotide, vecteur, virus, etc.) présentant une ou plusieurs modifications par rapport à un composant de référence (par exemple, le composant de type sauvage tel qu'on le trouve dans la nature tel qu'il a été identifié à l'origine, c'est-à-dire le composant correspondant "original" appelé le composant d’origine). Un variant de nucléotide ou de nucléoside peut avoir une base modifiée et/ou un sucre modifié et/ou une liaison modifiée. En ce qui concerne les variants de polypeptides, de polynucléotides et d’anticorps, toute modification peut être envisagée, y compris la substitution, l'insertion, la suppression, et toute combinaison de celles-ci, d'un ou plusieurs résidus de nucléotides/acides aminés. En ce qui concerne les virus, toute modification du génome et/ou du protéome peut être envisagée, y compris la substitution, l'insertion, la suppression, et toute combinaison de celles-ci, d'un ou plusieurs résidus de nucléotides/d'acides aminés. Le variant peut être d'origine naturelle ou artificielle (par exemple, muté et/ou fabriqué). Dans le présent document, les variants sont de préférence d'origine naturelle. Des exemples de tels variants naturels dans le contexte des virus comprennent des variants naturels de coronavirus (notamment les variants de sarbecovirus, tels que les variants de virus SÀRS-CoV, en particulier les variants de SÀRS-CoV2, tels que les variants de SÀRS-CoV2 énumérés ci-dessus, y compris les variants Alpha, les variants Beta, les variants Gamma, les variants Delta, les variants Epsilon, les variants Zêta, les variants Eta, les variants Têta, un variant Iota, les variants Kappa, les variants Lambda, les souches "Wuhan-like", la souche hCoV-19/France/ARA- 104350/2020 (GISAID ID : EPI_ISL_683350) de la lignée B.1 , la souche variante britannique hCoV-19/France/ARA- SC2118/2020 (GISAID : EPI_ISL_900512) de la lignée B.1.1.7, la souche sud-africaine (501 Y. V2. HV001 ) de la lignée B.1 .351 , les souches variantes brésiliennes des lignées B.1 .1.28 et P.1 , SARS-COV2 N501Y, SARS-CoV2 E484K, SARS-CoV2 K417N, SARS-CoV2 K417T, toute combinaison de ces variants, et tout autre variant de SARS-CoV2 encore à identifier).

Lorsque plusieurs mutations sont envisagées, elles peuvent concerner des résidus consécutifs et/ou des résidus non consécutifs. Sont préférés les variants (par exemple, respectivement, les variants de protéine, les variants d’anticorps, les variants de virus) qui conservent un degré d'identité de séquence d'au moins 80 % avec le composant de référence (par exemple, respectivement, la protéine "originale" correspondante, le fragment de protéine "original" correspondant, le virus "original" correspondant). A titre d'exemple, "au moins 80% d'identité" signifie 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Dans certains modes de réalisation, une identité d'au moins 80 % englobe également une identité de 100 %.

Par « identité » ou « identité de séquence », on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides ou acides aminés, ou entre deux molécules d’acides nucléiques ou oligonucléotides. Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement global optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions. Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier. Le pourcentage d’identité est déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970). Notamment, pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNÀFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).

Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.

À titre illustratif, "au moins 80% d'identité de séquence", tel qu'utilisé ici, représente notamment 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité de séquence.

Les termes "agent de liaison" désignent une molécule capable de se lier à une autre molécule (dite « molécule cible »), ladite liaison étant de préférence une liaison spécifique. L’agent de liaison reconnaît un site, un domaine, une région, une poche et/ou un épitope de liaison défini de la molécule cible. L'agent de liaison peut être de toute nature ou de tout type et ne dépend pas de son origine. L'agent de liaison peut être synthétisé chimiquement, d'origine naturelle, produit par recombinaison (et optionnellement purifié), ou encore conçu et produit synthétiquement. L’agent de liaison peut donc être une petite molécule, un produit chimique, un peptide, un polypeptide, un anticorps, ou tout dérivé de ceux-ci, tel qu'un peptidomimétique, un anticorps mimétique, un fragment fonctionnellement actif, un dérivé chimique, entre autres. Avantageusement, l’agent de liaison peut être choisi parmi les anticorps, les dérivés de ceux-ci (de préférence les dérivés fonctionnels), et les fragments fonctionnels d’anticorps. La molécule cible peut notamment être un agent pathogène (tel qu’un virus) ou un fragment de celui-ci (par exemple un acide nucléique, une protéine, un polypeptide, un peptide, un épitope, etc.). Par exemple, lorsque la molécule cible est un sarbecovirus (tels que SARS-CoV1 et SARS-CoV2), la molécule cible peut-être le sarbecovirus ou toute partie de celui-ci (notamment la protéine Spike, en particulier le domaine RBD).

Par "anticorps" on entend une protéine ou une glycoprotéine appartenant à la superfamille des immunoglobulines ; les termes anticorps et immunoglobuline sont utilisés indifféremment. Chez les mammifères, les anticorps sont pour la plupart sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Ils sont notamment utilisés par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les corps étrangers (notamment les agents pathogènes, tels que les bactéries et les virus), de manière spécifique. Les anticorps comprennent également les auto-anticorps (produits par exemple dans le cas d'une maladie auto-immune). L'anticorps reconnaît une partie unique de la cible étrangère, son antigène. Les anticorps présentent une structure formée de 4 chaînes polypeptidiques (150 000 uma ou dalton) : deux chaînes lourdes identiques (H pour « heavy », de 50 000 uma chacune) et deux chaînes légères identiques (L pour « light », de 25 000 uma chacune) qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant la cohésion de la molécule. Ces chaînes forment une structure en Y (chaque chaîne légère constitue pour moitié un bras du Y) et sont constituées de domaines immunoglobulines pouvant comprendre 110 acides aminés environ. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (nommé CL) et d'un domaine variable (appelé VL); les chaînes lourdes sont composées d'un domaine variable (appelé VH) et, selon l'isotype, de trois ou quatre domaines constants respectivement appelés CH1 , CH2, CH3, (CH4). Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristiques de l'espèce et de l'isotype. Les domaines constants ne sont généralement pas impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, mais interviennent dans l'activation du système du complément, ainsi que dans l'élimination des complexes immuns (anticorps lié à son antigène) par les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants (RFc). Un anticorps possède quatre domaines variables situés aux extrémités des deux « bras ». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Ainsi, une molécule d'immunoglobuline possède deux sites de liaison à l'antigène, un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques (mais destiné à différents épitopes), d'où la possibilité de lier deux molécules d'antigène par anticorps. Le site de reconnaissance de l'antigène (ou paratope) comprend 6 régions appelées régions déterminant la complémentarité (ou CDR, pour « Complementarity-determining regions » en anglais). Chaque VH comporte 3 CDR et chaque VL en comporte également 3.

Le clivage enzymatique spécifique permet d'isoler différents fragments : le fragment Fc (Fragment cristallisable). Il est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément. Il est constitué des fragments constants des chaînes lourdes (CH2) au-delà de la région charnière (« hinge », en anglais). Il ne reconnaît en général pas l'antigène ; le fragment Fv (Fragment variable). C'est le plus petit fragment gardant les propriétés de l'anticorps que possède l'immunoglobuline. Il est constitué uniquement des régions variables VL et VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet et est monovalent ; le fragment Fab (Fragment antigen-binding). Ce fragment a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1 ). Il est monovalent; le fragment F(ab')2. Il correspond à l'association de deux fragments Fab reliés par une petite partie des parties constantes des chaînes lourdes, la région charnière (en anglais : hinge). Il a la même affinité que l'anticorps pour l'antigène et est divalent.

Tel qu'il est utilisé ici, le terme anticorps englobe les anticorps natifs et leurs dérivés fonctionnels, (par exemple, les anticorps mutés et/ou modifiés ainsi que les anticorps mimétiques), à condition qu'un tel dérivé soit capable de se lier spécifiquement à un antigène (on parle de « dérivés fonctionnels d’anticorps »).

Les anticorps peuvent être produits par différents systèmes connus de l’homme du métier. Les systèmes de production d’anticorps comprennent par exemple les systèmes animaux (tels que des rongeurs, des camélidés, etc.), les systèmes d’hybridomes, les systèmes cellulaires mammifères (incluant notamment les lignées cellulaires CHO (cellules d'ovaire de hamster chinois ; par exemple CHO-K1 , CHO-DG44, etc.), les lignées cellulaires de myélome de souris (par exemple NSO), les lignées cellulaires de rein de bébé hamster (par exemple BHK), les lignées cellulaires de rein embryonnaire humain (par exemple HEK293), etc.), les systèmes levures (incluant notamment les levures améliorées pour la glycolisation), les systèmes cellulaires d’insectes (incluant notamment les lignées cellulaires d’insecte améliorées pour la glycolisation), les systèmes cellulaires de plantes (incluant notamment les lignées cellulaires de plantes améliorées pour la glycolisation), etc.

De préférence, l'anticorps est un anticorps d'un animal, de préférence un anticorps de mammifère, plus préférablement un anticorps humain ou humanisé. Avantageusement, l'anticorps est humanisé.

Les différentes catégories d'anticorps et leurs méthodes de production sont bien connues de l'homme du métier, qui pourra notamment se référer aux ouvrages de référence dans le domaine (tels que Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Jennifer Lippincott-Schwartz, Graham Johnson Cell Biology E-Book, Elsevier Health Sciences, 1 Nov. 2016 ; Mohammed Zourob, Recognition Receptors in Biosensors, DOI 10.1007/978-1 -4419-0919-0, Springer- Verlag New York 2010 ; Abbas, Lichtman, Pillai, Cellular and Molecular Immunology E-Book, Elsevier Health Sciences, 22 août 2014 ; Bayer V., Un aperçu des anticorps monoclonaux. Semin Oncol Nurs. 2019 Sep 2: 150927 ; Wang W, Wang EQ, Balthasar JP. Pharmacocinétique et pharmacodynamique des anticorps monoclonaux. Clin Pharmacol Ther. 2008 Nov;84(5):548-58).

Le terme "fragment fonctionnel d'anticorps", tel qu'il est utilisé ici, désigne une ou plusieurs partie(s) ou fragment(s) d'un anticorps, conservant la capacité de se lier spécifiquement à un antigène. Des exemples de fragments de liaison englobés dans le terme "fragment fonctionnels d'anticorps" comprennent, sans s'y limiter, un fragment de liaison à l'antigène (Fab), un fragment Fab', un fragment F(ab')2, un fragment variable (Fv), un fragment variable à chaîne unique (scFv pour « single chain variable fragment »), correspondant aux régions VH et VL fusionnées à l’aide d’un peptide de liaison), un fragment dsFv (« disulfide- bond stabilised Fv »), un fragment ds-scFv (« disulfide-bond stabilised scFv »), un domaine VH, un domaine VL, un di-scFv (scFv divalent, constitué de l’association de deux scFv), un « diabody » (constitué de l’association covalente ou non de deux scFv), un « diabody » à chaîne unique, un triple corps, un minicorps (« minibody », constitué des fragments VL-VH- CH3), un nanocorps (« nanobody »), un anticorps à domaine unique (sdÀb), un fragment d'anticorps à chaîne unique (scÀb), un anticorps à chaîne lourde (HcÀb), un VHH, un VNÀR (variable new antigen receptor), un récepteur de nouvel antigène d'immunoglobuline (IgNÀR), un engageur de cellules T bispécifique (BITEs), une molécule de reciblage à double affinité (DÀRT), et toute combinaison de ceux-ci (par ex. une protéine de fusion de ceux- ci).

Le terme "anticorps à domaine unique", ou « sdÀb », tel qu'il est utilisé ici, désigne les fragments d'anticorps constitués d'un seul domaine variable monomère d'un anticorps. Ces anticorps ne comprennent que les régions variables monomériques de la chaîne lourde des anticorps à chaîne lourde produits notamment par les camélidés ou les poissons cartilagineux. En raison de leurs origines différentes, ils sont également appelés fragments VHH (camélidés) ou VNÀR (variable new antigen receptor ; poissons cartilagineux). Les anticorps à domaine unique sont également appelés nanocorps (nanobody en anglais). Les anticorps à domaine unique peuvent également être obtenus par monomérisation des domaines variables d'anticorps conventionnels de souris ou d'humains par le biais du génie génétique. Ils présentent une masse moléculaire d'environ 12-15 kDa et sont donc les plus petits fragments d'anticorps capables de reconnaître un antigène.

Par « agent de liaison humanisé » ou « Kd » ou « Kd » on entend un agent de liaison dont la séquence a été modifiée afin d’optimiser sa fonction chez un humain. Pour ce faire, la séquence de l’agent de liaison humanisée peut être modifiée afin d’être plus proche des séquences de agents de liaison trouvés chez l’humain. Les agents de liaisons humanisés présentent donc une proportion plus importante (i.e. supérieure à celle de l’agent de liaison avant humanisation) de matières/substances d’origine humaine (i.e. trouvées de manière naturelle chez l’humain), en particulier une proportion plus importante de séquences, notamment de séquences d’acides nucléiques et/ou d’acides aminés, d’origine humaine (i.e., trouvées de manière naturelle chez l’humain). Les agents de liaison humanisés présentent de préférence au moins 80% de matières/substances (en particulier de séquences, notamment de séquences d’acides nucléiques et/ou d’acides aminés) d’origine humaine. De préférence, l’agent de liaison humanisé comprend au moins une séquence (notamment une séquence d’acides nucléiques et/ou d’acides aminés de l’agent de liaison) comprenant au moins 80% de séquences (notamment de séquences d’acides nucléiques et/ou d’acides aminés) d’origine humaine, de préférence au moins 85% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 86% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 87% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 88% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 89% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 90% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 91% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 92% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 93% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 94% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 95% de séquences d’origine humaine, de préférence ayant au moins 96% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 97% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 98% de séquences d’origine humaine, de préférence au moins 99% de séquences d’origine humaine, de préférence encore 100% de séquences d’origine humaine (i.e., de séquences trouvées de manière naturelle chez l’humain).

Dans le cas où l’agent de liaison est un anticorps ou un fragment fonctionnel d'anticorps (tel qu’un anticorps à domaine unique), l’anticorps humanisé ou le fragment fonctionnel d'anticorps humanisé comprend au moins une séquence d’acides aminés comprenant au moins 80% (de préférence au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) de séquences d’acides aminés d’origine humaine (i.e., de séquences d’acides aminés trouvées de manière naturelle chez l’humain). Différentes techniques sont connues de la personne du métier pour humaniser un agent de liaison. Par exemple, dans le cas où l’agent de liaison est un anticorps ou un fragment fonctionnel d'anticorps (tel qu’un anticorps à domaine unique), l’anticorps humanisé ou le fragment fonctionnel d'anticorps humanisé peut être obtenu en greffant/insérant les CDR d’intérêt dans la charpente d’un domaine variable d’un anticorps humain ou d’un fragment fonctionnel d’anticorps humain (cette technique est dite humanisation par « CDR- grafting »). L’anticorps humanisé ou le fragment fonctionnel d'anticorps humanisé peut également être obtenu en effectuant dans leurs séquences, des substitutions d’acides aminés spécifiques afin d’obtenir une séquence plus proche d’une séquence d’origine humaine. Quelle que soit la technique sélectionnée pour humaniser l’anticorps ou le fragment fonctionnel, on peut avantageusement utiliser la séquence germinale d’un anticorps humain ou d’un fragment fonctionnel d’anticorps humain (i.e. la séquence dépourvue de mutations liée à la maturation de l'anticorps) codée par le gène humain le plus proche de la séquence de l’anticorps non-humain ou du fragment fonctionnel d’anticorps non-humain à humaniser (i.e. dont les CDR sont issus). La séquence germinale la plus proche peut notamment être identifiée en réalisant des alignements de séquences en utilisant les bases de données de séquences et les outils connus de la personne du métier (cette technique est dite technique du « best-fit »).

Par « constante de dissociation à l’équilibre » ou « Kd » ou « Kd » on entend la constante qui permet d'évaluer l’affinité entre deux molécules (par exemple entre un anticorps et le domaine RBD de la protéine Spike ou un sarbecovirus). Cette affinité repose sur la nature, la géométrie et le nombre des interactions physicochimiques entre les deux molécules (interaction électrostatique, liaisons hydrogène, interaction de van der Waals et forces hydrophobes). Plus la valeur Kd est basse, plus l'affinité de liaison entre les deux molécules est élevée. Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM.

Il existe plusieurs techniques permettant de déterminer/mesurer les constantes de dissociation, qui sont bien connues de l’homme du métier, telles qu'ELISÀ, les essais de retard sur gel, la filtration, la chromatographie, la thermophorèse, les essais « pull-down », la dialyse à l'équilibre, l'ultracentrifugation analytique, la résonance plasmonique de surface (RPS, ou SPR en anglais), les essais spectroscopiques, le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la filtration sur membrane de nitrocellulose, l’interférométrie (par exemple l’interférométrie BioLayer), etc. La méthode pour déterminer/mesurer les constantes de dissociation est de préférence l’interférométrie. La constante de dissociation à l’équilibre peut notamment être déterminée, dans des conditions standards, à l'aide des représentations de Scatchard et de Lineweaver Burk, ou encore à l’aide des modèles de liaison de Langmuir (tel que le modèle de Langmuir global), bien connus de l’homme du métier.

Par « polypeptide », “protéine” et “peptide”, on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans le présent document, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé "peptide". Les sens de lecture et d’écriture d’une séquence d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide tel qu’utilisés ici sont les sens de lecture et d’écriture conventionnels. La convention de lecture et d'écriture pour des séquences d’acides aminés d’un polypeptide, d’une protéine et d’un peptide place la terminaison amine à gauche, la séquence étant alors écrite et lue de la terminaison amine (N-terminus) à la terminaison carboxyle (C-terminus), de gauche à droite.

Les acides aminés constituant les polypeptides, protéines et peptides, comprennent notamment les acides aminés dits « standards » (également appelés « acides aminés naturels », dont le tableau 1 ci-dessous fournit une liste non exhaustive), ainsi que les acides aminés non standards (également appelés « acides aminés rares », comprenant par exemple la pyrrolysine (symbolisée par la lettre O), la sélénocystéine (symbolisée par la lettre U), l’alloisoleucine, l’allothréonine, l’ornithine, etc.)

Tableau 1 : Acides aminés standards

[Table 1]

Les termes "polynucléotide", "molécule d'acide nucléique" et "acide nucléique" sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document et désignent une macromolécule polymère ou oligomère constituée de monomères nucléotidiques (de préférence d'au moins 5 monomères nucléotidiques, également appelés résidus nucléotidiques). Les monomères nucléotidiques sont composés d'une nucléobase, d'un sucre à cinq carbones (tel que, mais sans s'y limiter, le ribose ou le 2'-désoxyribose), et d’un à trois groupes phosphates. Typiquement, un polynucléotide est formé par des liaisons phosphodiester entre les monomères nucléotidiques individuels. Les molécules d'acide nucléique comprennent, sans s'y limiter, l'acide ribonucléique (ÀRN), l'acide désoxyribonucléique (ADN) et leurs mélanges, comme par exemple les hybrides ARN-ADN (polyribo-polydésoxyribonucléotides mixtes). Ces termes englobent les versions simples ou double brin, linéaires ou circulaires, naturelles ou synthétiques, non modifiées ou modifiées de celles-ci (par exemple, polynucléotides génétiquement modifiés ; polynucléotides optimisés), polynucléotides sens ou antisens, mélange chimérique (par exemple, hybrides ARN-ADN). En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides d'origine non naturelle et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques. Les exemples d'acides nucléiques d'ADN comprennent, sans limitation, l'ADN complémentaire (ADNc), l'ADN génomique, l'ADN plasmidique, le vecteur d'ADN, l'ADN viral (par exemple, les génomes viraux, les vecteurs viraux), les oligonucléotides, les sondes, les amorces, l'ADN satellite, l'ADN microsatellite, l'ADN codant, l'ADN non codant, l'ADN antisens, et tout mélange de ceux-ci. Les acides nucléiques ARN exemplaires comprennent, sans limitation, l'ARN messager (ARNm), l'ARN messager précurseur (pré-ARNm), le petit ARN interfèrent (ARNsi), l'ARN en épingle à cheveux courte (ARNc), microARN (miARN), vecteur ARN, ARN viral, ARN guide (gRNA), ARN antisens, ARN codant, ARN non codant, ARN antisens, ARN satellite, petit ARN cytoplasmique, petit ARN nucléaire, etc. Les polynucléotides décrits ici peuvent être synthétisés par des méthodes standard connues dans l'art, par exemple en utilisant un synthétiseur d'ADN automatisé (tel que ceux qui sont disponibles commercialement auprès de Biosearch, Applied Biosystems, etc.) ou obtenus à partir d'une source naturelle (par exemple un génome, un ADNc, etc.) ou d'une source artificielle (telle qu'une bibliothèque disponible commercialement, un plasmide, etc.) en utilisant des techniques de biologie moléculaire bien connues dans l'art (par exemple le clonage, la PCR, etc.). Les acides nucléiques peuvent par exemple être synthétisés chimiquement, par exemple selon la méthode du phosphotriester (voir, par exemple, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).

Par « molécule isolée », on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d’acides nucléiques, un vecteur (par exemple un vecteur plasmidique ou un vecteur viral) ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).

Par « vecteur », on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acide nucléique ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.

D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte).

D’un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.

Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme "vecteur" doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.

Un "plasmide" tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positives ou négatives sont connus dans la technique. À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positive permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.

Le terme "vecteur viral" tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acide nucléique qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale ou une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients en réplication.

Par « cellule hôte », on entend une cellule contenant au moins un vecteur selon l’invention, ou au moins une molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ou un mélange quelconque de ceux-ci. Avantageusement encore, la cellule hôte est capable d’exprimer les gènes codés par la molécule d’acides nucléiques selon l’invention et/ou le vecteur selon l’invention et/ou de produire le vecteur de l'invention.

La cellule hôte peut être constituée d'un type unique de cellules ou d'un groupe de différents types de cellules. La cellule hôte peut également être une cellule hybride, c’est-à-dire résultant de la fusion d’au moins deux cellules de types différents.

La cellule hôte peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives. Le terme "cellules hôtes" comprend des cellules procaryotes, des cellules eucaryotes inférieures telles que des cellules de levures, et d'autres cellules eucaryotes telles que des cellules de champignons, des cellules d'insectes, des cellules de plantes, des cellules d’algues, des cellules de microalgues, des cellules de parasites, des cellules animales et des cellules de mammifères (par exemple humaines ou non humaines, de préférence non humaines). La cellule hôte peut être une cellule différenciée, une cellule pluripotente, une cellule totipotente, une cellule souche, une cellules souche pluripotente induite (CSPi ou iPS en anglais), une cellule souche totipotente induite, ou encore une cellule embryonnaire ou une cellule souche embryonnaire. Dans le cas d’une cellule embryonnaire ou d’une cellule souche embryonnaire, la cellule est de préférence une cellule non humaine.

Le terme « cellule hôte » comprend plus largement des cellules qui contiennent ou ont contenu la molécule d’acides nucléiques selon l’invention, ainsi que la descendance de telles cellules. La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d’un organisme complet. Dans le cas où la cellule hôte est au sein d’un organisme complet, ledit organisme n’est pas humain.

Par "maladie" ou « affection » ou "trouble" ou "pathologie", on entend une altération des fonctions ou de la santé d'un organisme vivant. Il s'agit aussi bien de la maladie, se référant à l'ensemble des altérations de santé, que d'une maladie, qui désigne alors une entité particulière caractérisée par des causes, des symptômes, une évolution et des possibilités thérapeutiques propres.

"Infection" ou "maladie infectieuse" désigne ici une maladie provoquée par la transmission d'un micro-organisme ou d'un agent infectieux : virus, bactérie, parasite, champignon, protozoaire, etc.

Par « maladie liée aux sarbecovirus » ou "maladie à sarbecovirus" on entend toute maladie qui se développe chez un sujet infecté ou qui a été infecté par un sarbecovirus. Les maladies liées aux sarbecovirus comprennent notamment les infections par un sarbecovirus (par exemple une maladie COVID, en particulier la COVID-19)), ainsi que toute maladie non infectieuse qui est provoquée, causée, amplifiée et/ou entretenue par au moins une infection par un sarbecovirus et/ou par une exposition ponctuelle, occasionnelle, régulière, prolongée ou répétée à au moins un sarbecovirus.

"Infection par un sarbecovirus " ou "infection à sarbecovirus" désigne le fait que des cellules d'un organisme ont été infectées par au moins un sarbecovirus, l'ensemble de l'organisme étant dit atteint de ladite infection par un sarbecovirus.

Les termes "maladie COVID" ou "COVID" ou "maladie à bétacoronavirus" désignent la maladie liée (associée) à l'infection par au moins un bétacoronavirus, tel qu'énuméré ci-dessus. En particulier, les termes "maladie COVID- 19" ou "COVID- 19" ou "maladie à coronavirus 19" désignent la maladie liée (ou associée) à l'infection par (au moins) le SÀRS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2).

Par "prévention" ou "prévention d'une maladie" ou "prévention de l'apparition d'une maladie" on entend la réduction du risque d'apparition, de développement ou d'amplification d'une maladie, des causes d'une maladie, des symptômes d'une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences néfastes, délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci ; et/ou retarder l'apparition, le développement ou l'amplification d'une maladie, les causes d'une maladie, les symptômes d'une maladie, les effets (ou les conséquences, de préférence les effets/conséquences délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci. La prévention comprend notamment les traitements préventifs.

Par "traitement" ou "traitement d'une maladie" on entend la réduction, l'inhibition et/ou la disparition d'une maladie, des causes d'une maladie, des symptômes d'une maladie, des effets (ou conséquences, de préférence les effets/conséquences nocifs, délétères) d'une maladie, ou toute combinaison de ceux-ci. Le traitement est de préférence un traitement curatif.

Un "traitement" ou une "thérapie" comprend, sans s'y limiter, une ou plusieurs molécules et/ou des médicaments (y compris tout type de molécule ou de médicament, comme les composés chimiques ou biologiques, les anticorps, les antigènes, la thérapie génique, la thérapie cellulaire, l'immunothérapie, la chimiothérapie, toute combinaison de ceux-ci, etc.), et/ou d'autres traitements (tels que la radiothérapie, l'immunothérapie, la chimiothérapie, la chirurgie, l'endoscopie, la radiologie interventionnelle, l'oncologie physique, la photothérapie, la luminothérapie, l'ultrasonothérapie, la thermothérapie, la cryothérapie, l'électrothérapie, l'électroconvulsivothérapie, l'oxygénothérapie, la ventilation assistée, le massage hydrothérapeutique, la transplantation d'organes/de tissus/de fluides, l'implantation, et toute combinaison de ceux-ci, etc.) Une thérapie peut être administrée par différents modes d'administration. L'homme du métier sait comment sélectionner le ou les modes d'administration les plus appropriés en fonction de la thérapie, de la maladie et du sujet à traiter. Par exemple, les modes d'administration comprennent, sans s'y limiter, l'administration orale, l'administration par injection dans une veine (intraveineuse, IV), dans un muscle (intramusculaire, IM), dans l'espace autour de la moelle épinière (intrathécale), sous la peau (sous-cutanée, sc) ; administration sublinguale ; administration buccale ; administration rectale ; administration vaginale ; voie oculaire ; voie otique ; administration nasale ; par inhalation ; par nébulisation ; administration cutanée, topique ou systémique ; administration transdermique.

"Médicament" ou "drogue" désigne toute substance ou composition présentée comme ayant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales. Un médicament comprend donc toute substance ou composition pouvant être utilisée chez l'homme ou l'animal ou administrée à ceux-ci dans le but d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique, immunologique ou métabolique.

Le terme "vaccin" ou "composition vaccinale" désigne une substance pathogène ou productrice de tumeurs qui, lorsqu'elle est inoculée à un individu sous une forme de préférence inoffensive, confère une immunité contre une maladie (ou une protection contre une maladie). En général, un vaccin stimule la réponse immunitaire de l'organisme. Un vaccin peut être préventif, permettant la prévention d'une maladie. Un vaccin peut également être thérapeutique, en aidant le patient à combattre une maladie en cours. Par conséquent, le terme "vaccin" désigne tout composant ou groupe de composants qui est censé provoquer une réponse biologique lorsqu'il est administré de manière appropriée à un sujet par la présence ou l'expression d'une ou plusieurs substances biologiques (par exemple, un polypeptide tel qu'un antigène ou un anticorps, une molécule d’acides nucléiques, une enzyme, une cytokine, un SiRNA, etc.).

Les termes "thérapeutique" ou "utilisations thérapeutiques" dans le contexte de la présente invention couvrent les utilisations "prévention", "traitement" et "vaccin".

Une "quantité thérapeutiquement efficace" correspond à la quantité de chaque entité active qui est suffisante pour produire un résultat bénéfique pour la santé. Une "quantité immunologiquement efficace" correspond à la quantité de chaque entité active qui est suffisante pour produire une réponse immunitaire détectable. L’entité active est par exemple

Tel qu'utilisé ici, un "véhicule pharmaceutiquement acceptable" ou « support pharmaceutiquement acceptable" est destiné à inclure tous les supports, solvants, diluants, excipients, adjuvants, milieux de dispersion, enrobages, agents antibactériens et antifongiques, et agents retardateurs d'absorption, et autres, compatibles avec l'administration chez un sujet notamment chez un animal, et en particulier chez l'homme. Les supports appropriés pour une utilisation dans le présent document sont bien connus de l'art (voir par exemple l'édition la plus récente de Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).

Le terme "criblage" désigne un procédé permettant de tester et de sélectionner des composés/agents actifs pour un effet/une activité spécifique sur une molécule, un virus, un parasite, une bactérie, une cellule, un tissu, un organe, une maladie (de préférence une maladie infectieuse et/ou un cancer), un organisme (à l'exclusion des êtres humains, des embryons humains et des cellules souches embryonnaires humaines). Par exemple, les composés/agents actifs peuvent être testés pour une activité/un effet antiviral (tel qu'une activité/un effet anti-coronavirus, en particulier anti-sarbecovirus), pour une activité/un effet antibactérien, pour une activité/un effet antitumoral et/ou anticancer, et toute combinaison de ceux-ci.

Par « diagnostic », on entend l’identification/la détermination d’une maladie, ou de l’absence d’une maladie, chez un sujet. Le diagnostic comprend par exemple la recherche des causes (étiologie) et des effets (symptômes) de la maladie, notamment sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies liées aux sarbecovirus, les outils de diagnostic comprennent l’observation de signes cliniques spécifiques comme l’apparition soudaine d’asthénie (sensation de fatigue) inexpliquée ; de myalgies (douleur musculaire) inexpliquées ; de céphalées (maux de tête) ; d’agueusie (absence du sens du goût) et pour les formes graves de l’apparition de troubles respiratoires mais également la détection/quantification de biomarqueurs génétiques et/ou biochimiques. Les biomarqueurs génétiques peuvent être des allèles ou des mutations dans le génome qui ont été identifiés comme prédisposant aux maladies liées aux sarbecovirus. Ce type de marqueurs permet ainsi d’identifier une population « à risque », qui a une plus forte probabilité de développer des maladies liées aux sarbecovirus. Les marqueurs biochimiques sont des biomolécules dont la présence et/ou la quantité est corrélée à l’évolution de la pathologie (par exemple l’accumulation de protéines virales ou la détection d’anticorps anti-S ou anti-N pour les infections par un sarbecovirus).

Par « stratification », on entend la séparation/classification de sujets en sous-groupes par sévérité/gravité de la maladie. Les différents sous-groupes comprennent notamment le sous- groupe des sujets sains ainsi que différents sous-groupes de sujets souffrant d’une maladie, classés en fonction du stade d’évolution/d’avancement de la maladie. On peut aussi stratifier les sujets en fonction du type de symptômes présents. Le stade d’évolution et les symptômes peuvent être déterminés sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies liées aux sarbecovirus, les outils de stratification comprennent les outils qui sont également utilisés pour leur diagnostic.

Par « pronostic », on entend la prédiction/la détermination/l’évaluation des risques d'évolution d'une maladie chez un sujet. Le pronostic comprend notamment l’évaluation du développement futur de l'état du sujet et des chances éventuelles d’amélioration voire de guérison. Le pronostic peut être déterminé sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies liées aux sarbecovirus, les outils de pronostic comprennent les outils qui sont également utilisés pour leur diagnostic ou la stratification des sujets.

Par « suivi », on entend la détermination/l’évaluation de l’évolution d’une maladie chez un sujet. Le suivi peut être réalisé sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils, à différents intervalles de temps. Les intervalles peuvent être réguliers ou irréguliers. Leur fréquence dépend de la maladie mais aussi du stade d’évolution de la maladie. Elle peut être de l’ordre de quelques jours (par exemple en cas de maladie à un stade sévère/avancé/grave et/ou en cas de maladie à évolution rapide et/ou en cas de phase d’exacerbation) à quelques années (par exemple en cas de maladie à un stade préliminaire, léger ou modéré, et/ou en cas de maladie à évolution lente). Dans le cas des maladies liées aux sarbecovirus, les outils de suivi comprennent les outils qui sont également utilisés pour le diagnostic ou le pronostic de la maladie, ou la stratification des sujets.

Par « évaluation de l'efficacité d'un traitement », on entend la détermination de l’état clinique d’un sujet soumis à un traitement. Le traitement peut être préventif, par exemple en cas de prédisposition à une maladie, ou il peut être curatif, par exemple en cas de maladie diagnostiquée. L’efficacité du traitement peut par exemple être évaluée en déterminant l’état du sujet à différents intervalles de temps. L’état du sujet peut notamment être évalué avant la première prise du traitement puis à des intervalles de temps réguliers (ou irréguliers) après cette première prise (par exemple après chaque nouvelle prise du traitement). Une comparaison de l’état du sujet évalué à ces différents intervalles peut alors être effectuée afin d’identifier un éventuel changement. Dans le cas d’un traitement curatif, une amélioration, une absence d’aggravation, ou une aggravation de l’état du patient inférieure à celle attendue en absence de traitement indique que le traitement est efficace, tandis qu’une aggravation de l’état du patient au moins égale à celle attendue en absence de traitement indique que le traitement n’est pas efficace. Dans le cas d’un traitement préventif, une absence d’apparition de la maladie ou une apparition plus tardive et/ou moins grave qu’attendue en l’absence de traitement indique que le traitement est efficace, tandis qu’une apparition aussi précoce et grave qu’attendue en l’absence de traitement indique que le traitement n’est pas efficace. L’état du patient peut être évalué sur la base d’observations et/ou de mesures, effectuées à l’aide de différents outils. Dans le cas des maladies liées aux sarbecovirus, les outils d’évaluation de l’efficacité d’un traitement comprennent les outils qui sont également utilisés pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi de la maladie, ou la stratification des sujets.

Par « aggravation » ou « phase d’aggravation », on entend une période durant laquelle les signes cliniques d’une maladie liée aux sarbecovirus se majorent chez un sujet souffrant de ladite maladie.

Par « sujet » ou « patient », on entend un individu humain ou un animal différent d’un humain. Le sujet est par exemple un humain ou un animal susceptible de contracter une maladie liée aux sarbecovirus, susceptible d’être atteint d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou souffrant d’une telle maladie. Le sujet est de préférence un être humain. Le sujet peut être un enfant (sujet humain âgé de 16 ans ou moins) ou un adulte (sujet humain âgé de plus de 16 ans). Par « sujet sain » on entend un sujet qui ne souffre pas de la maladie considérée. Dans le cadre de la présente invention, un sujet sain est de préférence un sujet qui ne souffre d’aucune maladie liée aux sarbecovirus, en particulier un sujet qui ne souffre d’aucune infection par un sarbecovirus, de préférence encore un sujet qui ne souffre d’aucune maladie. Par « sujet de référence » on entend un sujet qui souffre d’une maladie liée aux sarbecovirus connue (notamment une infection par un sarbecovirus, et en particulier par un SÀRS-CoV1 ou à un SÀRS-CoV2, à un stade connu).

Par "échantillon biologique" ou "prélèvement" d’un sujet, on entend un organe entier ou un tissu ou une partie d’un tel organe ou tissu, un fluide ou une fraction d’un tel fluide, des cellules ou des composants cellulaires, obtenus de ce sujet, ainsi qu’un homogénat, un lysat ou un extrait préparé à partir de ceux-ci. En particulier, un "échantillon biologique" ou "prélèvement" est de préférence tout tissu (de préférence des portions ou fractions de celui- ci) qui peut contenir des sarbecovirus, y compris, mais sans s'y limiter, du plasma, du sang, de la lymphe, du sérum, de l’urine, du mucus, de la salive, un échantillon du système nerveux central (SNC ; tel qu'un échantillon de cerveau ou un échantillon de moelle épinière), un échantillon de voie respiratoire (tel qu’un échantillon de poumon, etc.), un échantillon de glandes salivaires, un échantillon nasopharyngé, un échantillon oropharyngé, un échantillon du système digestif (par exemple le colon), etc.

L'échantillon biologique peut avoir été préalablement obtenu par toute technique connue dans la profession. Ces techniques comprennent, par exemple, le prélèvement à l’aide d’un écouvillon, d’une aiguille ou d’une seringue, la chirurgie (telle que la chirurgie stéréotaxique), la ponction, l'explant, l'excision, la biopsie. Par "excision", on entend une procédure chirurgicale consistant à couper (exciser) une partie plus ou moins large ou profonde du tissu, de préférence une anomalie ou une croissance du tissu. Une excision peut être pratiquée pour enlever et/ou analyser une tumeur cancéreuse ou suspecte. Le terme "biopsie" désigne ici un échantillon de cellules ou de tissus prélevé pour analyse. Plusieurs types de procédures de biopsie sont connus et pratiqués sur le terrain. Les types les plus courants comprennent (1 ) la biopsie incisionnelle, dans laquelle seul un échantillon du tissu est prélevé ; (2) la biopsie excisionnelle (ou biopsie chirurgicale), qui consiste à retirer totalement une masse tumorale, réalisant ainsi une procédure thérapeutique et diagnostique ; et (3) la biopsie à l'aiguille, dans laquelle un échantillon de tissu est prélevé à l'aide d'une aiguille, qui peut être grosse ou fine. D'autres types de biopsie existent, comme les frottis ou le curetage, et peuvent également être utilisés pour obtenir l'échantillon. Par conséquent, l'échantillon peut être, par exemple, un expiant, une excision, une biopsie, etc. L'échantillon est de préférence obtenu par une procédure peu invasive, telle que la chirurgie stéréotaxique.

Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation peuvent être pris seuls ou dans toute combinaison appropriée par l'homme du métier, et les définitions ci-dessus s'appliquent à tous les modes de réalisation décrits ci-dessous ainsi qu’à leurs combinaisons.

Agent de liaison

Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis au point des agents de liaison, notamment des anticorps à domaine unique, innovants, capables de reconnaître de manière spécifique et de neutraliser les différents variants du SARS-CoV2.

Ces agents de liaison ont notamment été obtenus par une approche innovante d’ingénierie moléculaire de l’anticorps et de maturation d’affinité à partir de l’anticorps à domaine unique VHH72, combinant des techniques de Deep-Mutational Scanning et de Yeast Surface Display. Cette approche a permis d’identifier les positions d’acides aminés et les mutations susceptibles de conférer une augmentation d’affinité à l’anticorps. Un assemblage dans des banques combinatoires combiné à un séquençage haut débit permis d’identifier un grand nombre de variants enrichis ayant une plus forte liaison à l’antigène que l’anticorps à domaine unique parental VHH72.

Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les agents de liaison ainsi mis au point possèdent de très bonnes affinités pour les domaines RBD de différents sarbecovirus, y compris des variants du virus SARS-CoV2, à la différence des agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur. De façon remarquable, les données montrent également que ces agents de liaison optimisés sont capables d’empêcher la liaison entre le récepteur ÀCE2 de la cellule hôte et le domaine RBD, de manière plus efficace que les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces agents de liaison pour traiter les maladies liées aux sarbecovirus, notamment les infections par un sarbecovirus.

Les données montrent également que ces agents de liaison sont des outils de détection des sarbecovirus.

La présente invention fournit donc à la fois des méthodes de traitement puissant et à spectre large des maladies liées aux sarbecovirus, ainsi que des méthodes de diagnostic efficace et fiable de ces maladies, des méthodes de criblage de molécules mais également des outils pour la recherche dans le domaine des maladies liées aux sarbecovirus.

Les agents de liaison ainsi mis au point présentent plusieurs avantages au regard des agents de liaison (notamment des anticorps à domaine unique) de l’art antérieur : 1 ) ils reconnaissent le domaine RBD de la protéine Spike de sarbecovirus avec une grande spécificité ; 2) ils ont une plus forte affinité pour le domaine RBD de la protéine Spike de sarbecovirus; 3) ils présentent un spectre plus large de reconnaissance de sarbecovirus, notamment de variants de SÀRS-CoV2 ; 4) ils sont capables d’inhiber plus efficacement l’interaction entre la protéine Spike de sarbecovirus et le récepteur ÀCE2 de la cellule hôte.

L’invention concerne donc notamment un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique), comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 comprenant au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé sélectionné parmi le résidu en position 57, le résidu en position 58, le résidu en position 60, le résidu en position 61 , le résidu en position 62, le résidu en position 98, le résidu en position 101 , le résidu en position 102, le résidu en position 103, le résidu en position 104, de la SEQ ID NO : 1 , et toute combinaison de ceux-ci. En effet, les données montrent que de tels agents de liaison présentent une affinité et une capacité de neutralisation améliorées vis-à-vis du virus SÀRS- Cov2 et de ses différents variants. L’agent de liaison peut être donc être utilisé de manière efficace dans la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus.

La séquence SEQ ID NO : 1 est comme suit :

QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFVATISWSGGS TYYTDSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAAGLGTWSEWDYDYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO : 1 ).

La présente invention concerne également des variants du VHH72 ayant une affinité améliorée, pouvant être utilisés dans la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus. La présente invention concerne en particulier un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 , comprenant au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M (de préférence par un acide aminé G) ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, W, R, et H (de préférence par un acide aminé S) ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I); d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : S, R, P, Q, I, M, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R) ; e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L) ; f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V); g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N (de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y) ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Avantageusement, l’agent de liaison est choisi parmi les anticorps et les fragments fonctionnels d’anticorps. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’agent de liaison est un anticorps à domaine unique.

Selon un mode de réalisation préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé choisie parmi : la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 par un acide aminé par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M (de préférence par un acide aminé G) ; la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 , de préférence par un acide aminé V ; la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et une combinaison quelconque de celles-ci.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend au moins la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 par un acide aminé sélectionné parmi G, N, et M ; de préférence par un acide aminé G.

Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, l’affinité pour le domaine RBD de la protéine Spike de sarbecovirus et l’effet neutralisant des agents de liaison optimisés développés dans le cadre de la présente invention, augmentent lorsque l’agent de liaison combine deux substitutions ou plus à des positions distinctes l’une de l’autre.

La présente invention concerne donc un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprenant, ou consistant essentiellement en, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 , comprenant une combinaison d’au moins deux substitutions de résidus d’acide aminé, le résidu d’acide aminé substitué étant sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G) ; b) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, W, R, et H (de préférence par un acide aminé S) ; c) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I); d) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, R, P, Q, I, M, W, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R); e) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L); f) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V); g) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W ; h) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N (de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi E et Y) ; i) Le résidu en position 103 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé V ; et j) Le résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et k) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la combinaison de substitution comprend au moins la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO : 1 par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : G, N et M, de préférence par un acide aminé G.

Selon un mode de réalisation préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend au moins une combinaison de substitutions de résidus d’acide aminé choisie parmi : a) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1, de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé V; b) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; c) la combinaison de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé V, et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et d) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé V, et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W).

Les données montrent que les agents de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) combinant une substitution en position 57 et une substitution en position 103, ou combinant une substitution en position 57 et une substitution en position 104, ou combinant une substitution en position 57 et une substitution en position 103 et une substitution en position 104, présentent une affinité pour les RBD de différents sarbecovirus et un effet neutralisant particulièrement élevés.

Ainsi, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend avantageusement au moins une combinaison de substitutions de résidus d’acide aminé choisie parmi : a) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1, de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé V; b) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W) ; et c) la combinaison de la substitution du résidu en position 57 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : G, N et M (de préférence par un acide aminé G), et de la substitution du résidu en position 103 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé V, et de la substitution du résidu en position 104 de la SEQ ID NO :1 de préférence par un acide aminé sélectionné parmi : W, et Y (de préférence par un acide aminé W).

Selon ces modes de réalisation, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) peut en outre comprendre au moins une substitution additionnelle d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en : a) Le résidu en position 58 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, W, et R, et H, (de préférence par un acide aminé S) ; b) Le résidu en position 60 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, L, I, T, M, H, Q, Y, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, L, et I); c) Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : S, R, P, Q, I, M, W, et F (de préférence par un acide aminé sélectionné parmi S, et R); d) Le résidu en position 62 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de D, C, et Q (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : F, L, V, P, I, M, W, Y, À, G, S, T, N, E, H, K, et R ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi F, et L); e) Le résidu en position 98 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi n’importe quel acide aminé à l’exception de À, P, et D (notamment substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, W, R, Q, I, E, L, F, V, M, Y, G, C, S, T, N, H, et K; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi : V, W, R, et Q ; de préférence encore par un acide aminé V); f) Le résidu en position 101 de la SEQ ID NO :1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : V, F, Y, C, E, et W; g) Le résidu en position 102 de la SEQ ID NO : 1 , substitué par un acide aminé sélectionné de préférence parmi : E, Y, et N ; de préférence encore par un acide aminé sélectionné parmi : E et Y ; et h) Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, et SEQ ID NO :6.

Les séquences SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, et SEQ ID NO :6 sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : Séquences comprises dans les agents de liaison préférés [Table 2] Selon un mode de réalisation de l'invention, l’agent de liaison comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, au moins un agent de liaison choisi parmi : un anticorps, un dérivé fonctionnel d’anticorps, et un fragment fonctionnel d’anticorps ; le fragment fonctionnel d’anticorps étant de préférence choisi parmi : un anticorps à domaine unique, un nanocorps (nanobody en anglais), et un VHH (domaine variable unique de chaîne lourde), et une combinaison quelconque de ceux-ci.

De préférence, l’agent de liaison est choisi parmi les anticorps, les dérivés fonctionnels d’anticorps, et les fragments fonctionnels d’anticorps (notamment les anticorps à domaine unique).

Avantageusement, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps) comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, un anticorps à domaine unique, un nanocorps (nanobody en anglais), ou un VHH (domaine variable unique de chaîne lourde). Avantageusement, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps) est un anticorps à domaine unique, un nanocorps, ou un VHH. Les anticorps à domaine unique, les nanocorps, et les VHH, présentent l’avantage d’être des molécules très stables ayant d’excellentes affinités pour leur antigène. Grâce à la taille réduite de leur région variable, ces molécules peuvent cibler des épitopes difficilement accessibles aux anticorps conventionnels.

Les Inventeurs ont notamment mis au point des anticorps (notamment des anticorps à domaine unique) tels que définis ci-dessus, fusionnés à un fragment constant d’immunoglobuline humaine. Les données montrent qu’un anticorps ainsi humanisé conserve à la fois sa spécificité de reconnaissance des RBD de sarbecovirus et son affinité à spectre large pour les RBD de différents sarbecovirus, ainsi que sa capacité neutralisante envers les sarbecovirus.

Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne également un agent de liaison tel que défini ci-dessus, qui a été humanisé (c’est-à-dire dont la séquence a été humanisée).

Outre les substitutions ou combinaisons de substitutions listées ci-dessus, l’agent de liaison humanisé selon l’invention peut notamment comprendre au moins une substitution additionnelle d’un résidu d’acide aminé sélectionné dans le groupe consistant en :

Le résidu en position 1 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé E ; • Le résidu en position 5 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé sélectionné parmi V, et L ;

• Le résidu en position 14 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé P ;

• Le résidu en position 27 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé F ;

• Le résidu en position 31 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 35 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 37 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé V ;

• Le résidu en position 44 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé G ;

• Le résidu en position 45 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé L ;

• Le résidu en position 47 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé W ;

• Le résidu en position 49 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 50 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 53 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé G ;

• Le résidu en position 61 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 75 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé S ;

• Le résidu en position 79 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé L ;

• Le résidu en position 87 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé R ;

• Le résidu en position 88 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé À ;

• Le résidu en position 89 de la SEQ ID NO :1 , substitué de préférence par un acide aminé E ; • Le résidu en position 120 de la SEQ ID NO : 1 , substitué de préférence par un acide aminé Q ; et

• Une combinaison quelconque de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’agent de liaison humanisé (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 85% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :7, de préférence ayant au moins 86% d’identité, de préférence ayant au moins 87% d’identité, de préférence ayant au moins 88% d’identité, de préférence ayant au moins 89% d’identité, de préférence ayant au moins 90% d’identité, de préférence ayant au moins 91% d’identité, de préférence ayant au moins 92% d’identité, de préférence ayant au moins 93% d’identité, de préférence ayant au moins 94% d’identité, de préférence ayant au moins 95% d’identité, de préférence ayant au moins 96% d’identité, de préférence ayant au moins 97% d’identité, de préférence ayant au moins 98% d’identité, de préférence ayant au moins 99% d’identité, avec la séquence SEQ ID NO : 7.

La séquence SEQ ID NO : 7 est comme suit :

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFVATISWSGGG TYITDSVKGRFTIS

RDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAVAGLGVWVSEWDYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 7).

Avantageusement, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend en outre au moins un fragment de chaîne lourde d’anticorps, de préférence un fragment Fc d’anticorps (fragment cristallisable d’anticorps), le fragment de chaîne lourde d’anticorps (notamment le fragment Fc d’anticorps) étant de préférence humain.

Lorsque l’agent de liaison selon l’invention (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) comprend en outre au moins un fragment de chaîne lourde d’anticorps, ledit fragment de chaîne lourde d’anticorps comprend de préférence, ou consiste essentiellement en de préférence, ou consiste en de préférence, une séquence d’acides aminés ayant au moins 85% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8, de préférence ayant au moins 86% d’identité, de préférence ayant au moins 87% d’identité, de préférence ayant au moins 88% d’identité, de préférence ayant au moins 89% d’identité, de préférence ayant au moins 90% d’identité, de préférence ayant au moins 91% d’identité, de préférence ayant au moins 92% d’identité, de préférence ayant au moins 93% d’identité, de préférence ayant au moins 94% d’identité, de préférence ayant au moins 95% d’identité, de préférence ayant au moins 96% d’identité, de préférence ayant au moins 97% d’identité, de préférence ayant au moins 98% d’identité, de préférence ayant au moins 99% d’identité, avec la séquence SEQ ID NO : 8.

La séquence SEQ ID NO : 8 est comme suit :

SEQ ID NO : 8 : KTHTCPPCPÀPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNÀKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKÀLPÀPIEKTISK ÀKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIÀVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNV FSCSVMHEÀLHNHYTQKSLSLSPGK.

L’invention a en outre pour objet un anticorps, un dérivé fonctionnel d’anticorps, ou un fragment fonctionnel d’anticorps, comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en, un agent de liaison selon l’invention (notamment un VHH) fusionné à des régions constantes d'anticorps, de préférence des régions constantes d'anticorps humains.

Selon un mode de réalisation, les formats d'anticorps, les formats de dérivé fonctionnel d’anticorps, ou les formats de fragment fonctionnel d’anticorps, sont de type Fab et sont caractérisés par l'association de deux domaines VHH ou de deux domaines VH humains, identiques ou différents, ou deux domaines VH humains sur lesquels sont greffés les CDRs (« complementarity determining regions ») des VHH, l'un des domaines étant fusionné à la région constante CK OU CX d'une immunoglobuline humaine, l'autre à la région constante CH1 d'une immunoglobuline humaine. Les formats d'anticorps, les formats de dérivé fonctionnel d’anticorps, ou les formats de fragment fonctionnel d’anticorps, peuvent également être de type Fab' et sont alors caractérisés par l'association de deux domaines VHH ou de deux domaines VH humains, identiques ou différents, ou deux domaines VH humains sur lesquels sont greffés les CDRs des VHH, l'un des domaines étant fusionné à la région constante CK OU CX d'une immunoglobuline humaine, l'autre à la région constante CH1 suivie d'une région charnière H d'une immunoglobuline humaine. Les formats d'anticorps, les formats de dérivé fonctionnel d’anticorps, ou les formats de fragment fonctionnel d’anticorps, peuvent également être de type F(ab')z et sont caractérisés par l'association de deux formats de type Fab' tels que définis ci-dessus. Sont également inclus les formats d'anticorps sont de type F(ab')z , caractérisés par l'association de deux Fab' obtenus par réduction des formats de type F(ab')z ci-dessus. Les formats d'anticorps, les formats de dérivé fonctionnel d’anticorps, ou les formats de fragment fonctionnel d’anticorps, peuvent également être de type (HCH2CH3)2 (H représentant la région charnière "Hinge" d'une immunoglobuline humaine ; CH2 et CH3 représentant les second et troisième domaines constants d'une chaîne lourde d'une Ig humaine), et sont caractérisés par l'association de deux VHH ou de deux VH humains, identiques ou de deux VH humains sur lesquels sont greffées les régions hypervariables des VHH, chacun étant fusionné à la région H-CH2-CH3 d'une Ig humaine. Sont également inclus les formats d'anticorps, les formats de dérivé fonctionnel d’anticorps, ou les formats de fragment fonctionnel d’anticorps, de type mAb* (ce type désigne les domaines variables d'origine remplacés par tout ou partie des domaines de VHH ou de VHH humanisés ou de VH humains, fusionnés à des régions constantes d'anticorps humains), qui sont caractérisés par l'association de deux VHH ou de deux VH humains, identiques ou différents, ou de deux VH humains sur lesquels sont greffées les régions hypervariables des VHH, l'un étant fusionné à la région CK OU CÀ humaine, l'autre à la région CH1 -H-CH2-CH3 d'une Ig humaine.

Les VHH peuvent être remplacés par des VH humains ou des VHH humanisés par greffage des CDRs des VHH sur des VH humains.

L'immunoglobuline utilisée est de préférence une IgG, telle qu’une isoforme lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4 humaine, ou une IgA humaine correspondant à une isoforme lgA1 , lgA2, ou toute autre Ig humaine.

Avantageusement, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) selon l’invention est capable de reconnaître un domaine RBD (Receptor Binding Domain) d’une protéine Spike de sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SARS-CoV1 , les variants du virus SARS-CoV1 , le virus SARS-CoV2, et les variants du virus SARS-CoV2.

Selon un mode de réalisation préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) est capable de reconnaître un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV1 et un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2, notamment comme le démontrent les données obtenues par les Inventeurs.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) est capable de reconnaître un domaine RBD d’une protéine Spike du virus SARS-CoV2 d’origine, et un domaine RBD d’une protéine Spike d’au moins un variant du virus SARS-CoV2 d’origine, le variant étant de préférence choisi parmi les variants listés dans la section définition ci-dessus, le variant étant en particulier choisi parmi un variant Alpha, un variant Beta, un variant Gamma, un variant Delta, un variant Epsilon, un variant Zêta, un variant Eta, un variant Têta, un variant lota, un variant Kappa, un variant Lambda, et toute combinaison de ceux-ci ; de préférence choisi parmi un variant Alpha, un variant Beta, un variant Gamma, un variant Delta, et toute combinaison de ceux-ci.

L’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) selon l’invention est notamment issu de l’anticorps VHH72. Les Inventeurs ont montré que, de manière surprenante, les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) ainsi mis au point possèdent une affinité pour les différents domaines RBD des variants du virus SARS-CoV2 significativement supérieure à celle de VHH72 pour ces domaines RBD.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) selon l’invention a une constante de dissociation K<J(VHH72 substitué) mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2 qui est inférieure à la constante de dissociation Kd(VHH72 non substitué) de l’anticorps à domaine unique VHH72 comprenant la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1 sans substitution (i.e., le VHH72 d’origine) mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2.

Selon un mode de réalisation préféré, la constante de dissociation Kd(VHH72 substitué) mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2, est inférieure (de préférence significativement inférieure) à la constante de dissociation Kd(VHH72 non substitué) mesurée pour un domaine RBD d’une protéine Spike de virus SARS-CoV2, de préférence inférieure d’au moins 10 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 11 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 12 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 13 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 14 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 15 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 20 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 25 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 30 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 40 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 50 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 100 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 200 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 300 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 400 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 500 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 600 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 700 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 800 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 900 fois, de préférence encore inférieure d’au moins 1000 fois. Molécule d’acides nucléiques - Vecteurs - Cellules hôtes

La présente invention se rapporte également à une molécule d’acides nucléiques codant un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que décrit ci-dessus.

Avantageusement, la molécule d’acides nucléiques comprend, ou consiste essentiellement en, ou consiste en, une séquence d’acides nucléiques ayant au moins 85% d’identité avec une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, et SEQ ID NO 13, de préférence ayant au moins 86% d’identité, de préférence ayant au moins 87% d’identité, de préférence ayant au moins 88% d’identité, de préférence ayant au moins 89% d’identité, de préférence ayant au moins 90% d’identité, de préférence ayant au moins 91% d’identité, de préférence ayant au moins 92% d’identité, de préférence ayant au moins 93% d’identité, de préférence ayant au moins 94% d’identité, de préférence ayant au moins 95% d’identité, de préférence ayant au moins 96% d’identité, de préférence ayant au moins 97% d’identité, de préférence ayant au moins 98% d’identité, de préférence ayant au moins

99% d’identité, avec une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, et SEQ ID NO 13, de préférence encore une séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, et SEQ ID NO 13.

Les séquences SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, et SEQ ID NO 13 sont indiquées dans le Tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 : Séquences comprises dans les molécules d’acides nucléiques codant les agents de liaison préférés [Table 3]

L’invention concerne également un vecteur comprenant ladite molécule d’acides nucléiques. Le vecteur est avantageusement un vecteur viral.

L’invention concerne en outre une cellule hôte comprenant ladite molécule d’acides nucléiques et/ou ledit vecteur. Compositions et kits

La présente invention concerne en outre une composition ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci -dessus.

La présente invention concerne également une composition ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une molécule d’acides nucléiques selon l’invention (telle que définie ci-dessus).

La présente invention concerne également une composition ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins un vecteur selon l’invention (tel que défini ci- dessus).

La présente invention concerne également une composition ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en, au moins une cellule hôte selon l’invention (tel que définie ci-dessus).

La présente invention concerne également une composition ou un kit comprenant, ou consistant essentiellement en : au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, ou au moins une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, ou au moins une cellule hôte telle que définie ci-dessus, ou une combinaison quelconque de ceux-ci.

Avantageusement, la composition ou le kit comprend, ou consiste essentiellement en, une combinaison choisie parmi : une combinaison d’au moins deux agents de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) distincts, tels que définis ci-dessus ; une combinaison d’au moins deux molécule d’acides nucléiques distinctes, telle que définie ci-dessus (i.e., chacune codant un anticorps à domaine unique distinct) ; une combinaison d’au moins deux vecteurs distincts, tels que définis ci-dessus, ou une combinaison d’au moins deux cellules hôtes distinctes, telle que définie ci- dessus, ou une combinaison quelconque de celles-ci. La composition est de préférence une composition pharmaceutique. Elle peut donc comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est présentée sous une forme propre à une administration par injection, ou sous une forme propre à une administration à l’aide d’un système thérapeutique transdermique adhésif (par exemple sous une forme de patch), ou sous une forme propre à une administration par pulvérisation ou par vaporisation (par exemple sous une forme de pulvérisateur, de vaporisateur, de spray, etc.), ou sous une forme propre à une administration topique (par exemple sous une forme de crème, gel, lait, sérum, etc.), etc.

Avantageusement, le kit est un kit choisi parmi : un kit pour traiter au moins une maladie liée à au moins un sarbecovirus chez un sujet, la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus ; un kit pour détecter (de préférence in vitro) la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; un kit pour déterminer (de préférence in vitro) la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; un kit pour cribler (de préférence in vitro) des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître au moins un sarbecovirus, de préférence pour cribler des composés/molécules capables de neutraliser au moins un sarbecovirus ; un kit pour le diagnostic (de préférence in vitro) d’une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie liée aux sarbecovirus, la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus ; un kit pour le pronostic et/ou le suivi et/ou la stratification (de préférence in vitro) d’un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus ; un kit pour l’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment un traitement curatif et/ou préventif) administré à un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ou susceptible de contracter une maladie liée aux sarbecovirus, la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus ; et une combinaison quelconque de ceux-ci.

Avantageusement, le kit comprend en outre des moyens adaptés pour la détection de la présence ou de l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon. La détection ou la quantification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment toute technique de détection et/ou quantification de protéines (pour détecter le virus au niveau protéique, en détectant et/ou quantifiant de protéines virales), telles que la cytométrie de flux (en particulier tri cellulaire activé par fluorescence (FÀCS)), western blot, dosage immunoenzymatique, LFÀ (lateral flow assay), ELISÀ, ELISPOT, puces à anticorps, immunoprécipitation, immunohistologie, coloration de la membrane cellulaire par biotinylation ou autres techniques équivalentes suivie d'une immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques, dot blot, puce (« microarray ») de protéines, microarray de tissus, microarray d'anticorps, microarray d'acides nucléiques, immunohistochimie. D'autres techniques appropriées comprennent le FRET ou le BRET, des méthodes de microscopie ou d'histochimie de cellules uniques utilisant une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et appliquant l'une quelconque des méthodes optiques adaptées, des méthodes électrochimiques (techniques de voltamétrie et d'ampérométrie), la microscopie à force atomique, des méthodes de radiofréquence (par ex. spectroscopie à résonance multipolaire), microscopie confocale et non-confocale, détection de la fluorescence, de la luminescence, de la chimiluminescence, de l'absorbance, de la réflectance, de la transmittance et de la biréfringence ou de l'indice de réfraction, ELISÀ cellulaire, radioisotopique, imagerie par résonance magnétique, analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PÀGE), HPLC, spectroscopie de masse, spectrométrie, chromatographie couplée à (par exemple, chromatographie liquide/spectrométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS)).

La quantité de sarbecovirus peut être mesurée, par exemple, au niveau nucléique, en mesurant la quantité d'ÀDN de sarbecovirus et/ou de transcrits de sarbecovirus (ARNm ou ÀRN régulateur) et/ou d'ÀDNc de de sarbecovirus. Dans ce cas, toute technologie habituellement utilisée par l'homme du métier peut être mise en oeuvre. Ces technologies comprennent des méthodes bien connues telles que la PCR (réaction en chaîne par polymérase, si elle part de l'ÀDN), la RT-PCR (transcription inverse-PCR, si elle part de l'ÀRN), la RT-PCR quantitative (RT-qPCR), les capteurs à base d'acide nucléique, les microréseaux d'acide nucléique (y compris les puces à ADN et les puces à oligonucléotides), l'analyse du transcriptome, l'analyse ARN-seq (y compris 3'RNASeq, 5'RNA-seq, 3'scRNA-Seq, 5'scRNA-Seq). Il est également possible d'utiliser l'hybridation avec une sonde d'acide nucléique marquée, comme le Northern blot (pour l'ARNm) ou le Southern blot (pour l'ADNc) ou l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse de l'expression génétique en série (SAGE) et ses dérivés, comme LongSÀGE, SuperSÀGE, DeepSÀGE, etc. Il est également possible d'utiliser des puces tissulaires (également appelées TMA : "tissue microarrays"). Les tests généralement utilisés avec les puces tissulaires sont l'immunohistochimie et l'hybridation fluorescente in situ. Pour l'analyse des ARNm, les puces tissulaires peuvent être couplées à l'hybridation in situ fluorescente. Enfin, il est possible d'utiliser le séquençage massif en parallèle pour déterminer la quantité d'ARNm dans l'échantillon (RNA-Seq ou "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing").

Au niveau des particules virale, la quantité de sarbecovirus peut être mesurée, par exemple, en mesurant la quantité de particules (particules infectieuses et/ou particules non- infectieuses), en utilisant l'une des techniques énumérées ci-dessous pour mesurer les particules virales infectieuses. Toute technique bien connue dans l'art de la détection/quantification de particules virales infectieuses peut être utilisée, par exemple les techniques basées sur l’utilisation d’anticorps anti-virus tel que l’anticorps selon l’invention, la spectrophotométrie, l'immunofluorescence quantitative, la quantification des cellules positives au sarbecovirus après l'infection en quantifiant les protéines, l'ARN ou l'ADN viraux dans les cellules hôtes (en utilisant toute technique de quantification des protéines ou des acides nucléiques mentionnée ci-dessus ; de préférence après une étape de purification cellulaire, par exemple après avoir retiré la culture cellulaire et lavé les cellules en utilisant un milieu approprié), etc.

En outre, toutes les technologies citées ci-dessus peuvent être utilisées pour détecter au moins un sarbecovirus (au niveau des acides nucléiques, des protéines et/ou des particules). Il est possible d'utiliser une combinaison d'une ou plusieurs des techniques citées ci-dessus.

Avantageusement, le kit ou la composition comprend en outre une molécule compétitrice de la liaison de l’anticorps au domaine RBD de sarbecovirus (c’est-à-dire des molécules entrant en compétition avec l’anticorps pour la liaison au domaine RBD de sarbecovirus). De telles molécules compétitrices comprennent notamment le récepteur cellulaire ACE2 ou des fragments de celui-ci (à condition que ces fragments soient capables de se lier au domaine RBD de sarbecovirus). En effet, l’utilisation d’une telle molécule permet de détecter efficacement et de manière fiable la présence ou l’absence de sarbecovirus dans un échantillon comme le montrent les données obtenues par les Inventeurs.

Alternativement ou en combinaison, l’anticorps est lié à une molécule détectable par les méthodes listées ci-dessus, de façon à permettre sa détection dans un échantillon.

Selon un mode de réalisation, le kit selon l’invention est caractérisé en ce que, lorsque le kit comprend plusieurs anticorps et/ou plusieurs molécules d’acides nucléiques et/ou plusieurs vecteurs et/ou plusieurs cellules hôtes et/ou une combinaison de ceux-ci, les différents constituants du kit sont : a) tous dans une seule composition, ou b) répartis dans plusieurs compositions distinctes dans des récipients séparés, incluant le cas où chacun des aptamères est dans une composition distincte située dans un récipient séparé.

Selon un mode de réalisation, le kit comprend en outre une notice d’utilisation.

La composition ou le kit selon l’invention peut en outre comprendre un excipient (choisi par exemple parmi les supports, les solvants, les diluants, les adjuvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les conservateurs, les agents antibactériens et antifongiques, les agents d'absorption, et toute combinaison de ceux-ci). Dans le cas d’un kit, les différents excipients peuvent être chacun dans une composition distincte située dans un récipient séparé, ou peuvent être mélangés deux à deux ou plus dans des compositions distinctes dans des récipients séparés, ou tous dans une même composition. Ils peuvent également être mélangés avec un ou plusieurs anticorps du kit.

Des exemples non limitatifs d’excipients comprennent l'eau, le NaCl, les solutions salines, les solutions de saccharides (par exemple le glucose, le tréhalose, le saccharose, le dextrose, etc.), le Ringer lacté, les alcools, les huiles, les gélatines, les hydrates de carbone tels que le lactose, l'amylose ou l'amidon, les esters d'acides gras, l'hydroxyméthycellulose, etc. (voir par exemple l'édition la plus récente de Remington : The Science and Practice of Pharmacy, À. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).

On peut notamment citer comme adjuvant les agents de gonflement comme par exemple un sucre tel que le lactose, le saccharose, le tréhalose, le sorbitol, le glucose, le raffinose, le mannitol, de préférence le lactose, le saccharose, le tréhalose, le glucose, ou le mannitol, un acide aminé tel que l’arginine, la glycine, ou l’histidine, de préférence la glycine, ou des polymères de type dextrane ou polyéthylène glycol, ou leurs mélanges. Selon ce mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend 50 à 99% en poids d’adjuvants, de préférence de 80 à 97% en poids, par rapport au poids total de la composition.

La composition ou le kit selon l’invention peut en outre comprendre les composés nécessaires à l’amplification (in vitro) des sarbecovirus, notamment des sarbecovirus présents dans un échantillon (l’échantillon étant de préférence choisi parmi les échantillons nasopharyngés, les échantillons salivaires, et les échantillons oropharyngés), notamment des échantillons prélevés sur des patients présentant des signes et des symptômes évocateurs de maladie liées à un sarbecovirus (la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, la maladie étant de préférence encore la COVID-19). L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques comprennent notamment les méthodes d’amplification d’acides nucléiques viraux, telles que la RT-PCR (transcription inverse-PCR), la RT-PCR quantitative (RT-qPCR), l’amplification génique par TMA (Transcription Mediated Amplification), l’amplification isotherme à médiation par boucle (loop-mediated isothermal amplification ou LAMP), etc.

Utilisations et Méthodes thérapeutiques

Les Inventeurs ont notamment montré que, de manière surprenante, les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) ainsi mis au point possèdent de très bonnes affinités pour les domaines RBD de différents sarbecovirus, y compris des variants du virus SARS-CoV2. De façon remarquable, les données montrent également que ces anticorps optimisés sont capables d’empêcher la liaison entre le récepteur ACE2 de la cellule hôte et le domaine RBD et de neutraliser le virus, de manière plus efficace que les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur. Ces données révèlent ainsi le potentiel thérapeutique de ces agents de liaison pour traiter les maladies liées aux sarbecovirus, notamment les infections par un sarbecovirus (telles que la COVID- 19).

La présente invention concerne donc un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, un vecteur tel que défini ci- dessus, une cellule hôte telle que définie ci-dessus, une composition telle que définie ci- dessus, ou un kit tel que défini ci-dessus, pour son utilisation comme médicament. Avantageusement, le médicament est un vaccin.

La présente invention concerne donc un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, un vecteur tel que défini ci- dessus, une cellule hôte telle que définie ci-dessus, une composition telle que définie ci- dessus, ou un kit tel que défini ci-dessus, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une maladie, la maladie étant de préférence choisie parmi les maladies liées aux sarbecovirus. Selon un mode de réalisation préféré, la maladie liée aux sarbecovirus est choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section « Définitions » ci-dessus). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la maladie liée aux sarbecovirus est une maladie COVID, de préférence la COVID-19.

Selon un mode de réalisation préféré, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, la molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, le vecteur tel que défini ci- dessus, la cellule hôte telle que définie ci-dessus, la composition telle que définie ci-dessus, ou le kit tel que défini ci-dessus, est administré à un sujet en ayant besoin, de préférence en une quantité thérapeutiquement efficace.

Le sujet en ayant besoin est de préférence un sujet susceptible de contracter une maladie liée aux sarbecovirus, susceptible d’être atteint d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou souffrant d’une telle maladie (notamment un sujet diagnostiqué comme souffrant d’une telle maladie).

La présente invention concerne également l’utilisation d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, d’une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci- dessus, d’un vecteur tel que défini ci-dessus, d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, d’une composition telle que définie ci-dessus, ou d’un kit tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d’un médicament.

Avantageusement, le médicament est un vaccin.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, d’une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci- dessus, d’un vecteur tel que défini ci-dessus, d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, d’une composition telle que définie ci-dessus, ou d’un kit tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d’un médicament pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie, la maladie étant de préférence choisie parmi les maladies liées aux sarbecovirus (la maladie étant de préférence encore la COVID- 19). La présente invention concerne également l’utilisation d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, d’une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci- dessus, d’un vecteur tel que défini ci-dessus, d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, d’une composition telle que définie ci-dessus, ou d’un kit tel que défini ci-dessus, en tant que médicament.

Avantageusement, le médicament est un vaccin.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, d’une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci- dessus, d’un vecteur tel que défini ci-dessus, d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, d’une composition telle que définie ci-dessus, ou d’un kit tel que défini ci-dessus, pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie, la maladie étant de préférence choisie parmi les maladies liées aux sarbecovirus.

La présente invention concerne également une méthode de prévention et/ou de traitement d’une maladie, la maladie étant de préférence choisie parmi les maladies liées aux sarbecovirus, comprenant l’administration à un sujet en ayant besoin, d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, d’une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, d’un vecteur tel que défini ci-dessus, d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus, d’une composition telle que définie ci-dessus, ou d’un kit tel que défini ci-dessus.

Selon un mode de réalisation préféré des utilisations et des méthodes décrits ci-dessus, la maladie liée aux sarbecovirus est choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SARS-CoV1 d’origine, les variants du virus SARS-CoV1 d’origine, le virus SARS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SARS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section « Définitions » ci-dessus). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la maladie liée aux sarbecovirus est une maladie COVID, de préférence la COVID-19.

Selon un mode de réalisation préféré des utilisations et des méthodes décrits ci-dessus, l’agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, la molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus, le vecteur tel que défini ci-dessus, la cellule hôte telle que définie ci-dessus, la composition telle que définie ci-dessus, ou le kit tel que défini ci-dessus, est administré à un sujet en ayant besoin, de préférence une quantité thérapeutiquement efficace.

Le sujet en ayant besoin est de préférence un sujet susceptible de contracter une maladie liée aux sarbecovirus, susceptible d’être atteint d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou souffrant d’une telle maladie (notamment un sujet diagnostiqué comme souffrant d’une telle maladie).

Utilisations et Méthodes in vitro

Les données révèlent que les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) selon l’invention peuvent être utilisés comme des outils de diagnostic, de pronostic, de stratification ou encore de suivi de maladies liées aux sarbecovirus, notamment des infections par un sarbecovirus, ou encore d’évaluation de l'efficacité d’un traitement.

Les données montrent en particulier que les anticorps selon l’invention présentent une forte affinité pour le domaine RBD d’un grand nombre de sarbecovirus. De manière remarquable, ces anticorps sont spécifiques aux sarbecovirus.

La présente invention se rapporte donc à l’utilisation in vitro d’au moins un agent de liaison selon l’invention (tel que défini ci-dessus), pour : i. le diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie liée aux sarbecovirus ; ii. le suivi chez un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; iii. la stratification d’un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; iv. l’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment curatif) administré à un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus ; v. détecter la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; vi. déterminer la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; vii. cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître au moins un sarbecovirus ; de préférence cribler des composés/molécules capables de neutraliser au moins un sarbecovirus ; ou viii. une combinaison quelconque de i. à vii. ; la maladie liée aux sarbecovirus étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus. La présente invention se rapporte notamment à une méthode in vitro de diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus ; b) la détection de la présence ou de l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon biologique de l’étape a); et c) le diagnostic de la présence ou de l’absence de la maladie chez ledit sujet en fonction du résultat de l’étape b) ; la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

Avantageusement, l’étape b) de détection est réalisée comme décrit ci-dessus en lien avec les compositions et les kits selon l’invention.

Selon un mode de réalisation, le sujet est atteint d'une maladie liée aux sarbecovirus, si on détecte la présence d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon. A l’inverse, le sujet n’est pas atteint d'une maladie liée aux sarbecovirus, si on ne détecte pas la présence d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon.

Selon un mode de réalisation, la méthode comprend en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro) des sarbecovirus éventuellement présents dans un échantillon biologique dudit sujet (appelé échantillon (A)). L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques sont notamment décrites dans la section « Compositions et Kits » ci-dessus.

Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), la détection de la présence ou de l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus, dans un ou plusieurs échantillon(s) biologique(s) de sujet(s) de référence. Le(s) sujet(s) de référence comprend(comprennent) de préférence au moins un sujet de référence souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus et/ou au moins un sujet de référence sain. Comme échantillon d’un sujet de référence souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, on pourra notamment utiliser un échantillon d’un sujet souffrant d’une infection par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS- CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

Plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de différentes les infections par un sarbecovirus peuvent être utilisés à l’étape b’). Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des sarbecovirus détectés (notamment des quantités de sarbecovirus détectées), pour les étapes b) et b’). Dans ce cas, l’étape c) comprend le diagnostic de la maladie liée aux sarbecovirus chez le sujet en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet sera diagnostiqué comme souffrant d’une maladies liée aux sarbecovirus si la comparaison de l’étape b”) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence d’un sujet de référence souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus (selon les différents échantillons de référence, un diagnostic plus précis parmi les maladies liées aux sarbecovirus peut potentiellement être fait sur le même principe), et comme ne souffrant pas d’une maladies liée aux sarbecovirus si le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence d’un sujet de référence sain.

Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus.

La présente invention concerne également une méthode in vitro de pronostic, de suivi, de stratification, ou de toute combinaison de ceux-ci, d’un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus; b) la détection de la présence ou de l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon biologique de l’étape a) ; et c) le pronostic, le suivi, la stratification, ou toute combinaison de ceux-ci, de la maladie chez ledit sujet en fonction du résultat de l’étape b) ; la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SARS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

La présente invention concerne également une méthode in vitro d’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment curatif) administré à un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus; b) la détection de la présence ou l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon biologique de l’étape a) ; et c) l’évaluation de l’efficacité du traitement chez ledit sujet en fonction du résultat de l’étape b) ; la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

La présente invention concerne en outre une méthode in vitro d’évaluation de l’efficacité d’un traitement préventif d’une maladie liée aux sarbecovirus (tel qu’un vaccin), administré à un sujet susceptible de contracter la maladie liée aux sarbecovirus, comprenant : a) la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus; b) la détection de la présence ou l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon biologique de l’étape a) ; et c) l’évaluation de l’efficacité du traitement préventif chez ledit sujet en fonction du résultat de l’étape b) ; la maladie étant de préférence choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

Avantageusement l’étape b) de détection (et/ou de quantification) des différentes méthodes est réalisée comme décrit ci-dessus en lien avec les compositions et les kits selon l’invention. Selon un mode de réalisation préféré des méthodes de pronostic, de suivi, de stratification, ou de toute combinaison de ceux-ci, ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement, la maladie liée aux sarbecovirus est aggravée, ou le pronostic de la maladie liée aux sarbecovirus est négatif, ou la maladie liée aux sarbecovirus a évolué, ou le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus est inefficace ou peu efficace, si on détecte la présence d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon.

Selon un mode de réalisation, la méthode comprend en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro) des éventuels sarbecovirus présents dans un échantillon biologique dudit sujet (appelé échantillon (À)). L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques sont notamment décrites dans la section « Compositions et Kits » ci-dessus.

Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), de détection de la présence ou l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus dans un ou plusieurs échantillon(s) biologique(s) de sujet(s) de référence. Le(s) sujet(s) de référence comprend(comprennent) de préférence au moins un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus à un pronostic/stade/niveau de stratification connu (de préférence au moins un sujet de référence souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, la maladie liée aux sarbecovirus étant la même pour le sujet de référence et pour le sujet testé/pronostiqué) et/ou au moins un sujet de référence sain. Comme échantillon d’un sujet de référence souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, on pourra notamment utiliser un échantillon d’un sujet souffrant d’une infection par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS- CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus). Plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de différentes infections par un sarbecovirus peuvent être utilisés à l’étape b’). Préférentiellement, plusieurs échantillons de sujets de référence souffrant de la même maladie liée aux sarbecovirus mais à des pronostics/stades/niveaux de stratification différents connus peuvent être utilisés à l’étape b’). Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des sarbecovirus détectés (notamment des quantités de sarbecovirus détectées), pour les étapes b) et b’). Dans ce cas, l’étape c) comprend le pronostic, le suivi, la stratification, ou toute combinaison de ceux-ci, ou l’évaluation de l’efficacité d’un traitement, de la maladie liée aux sarbecovirus chez le sujet, en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet aura un pronostic comparable, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification comparable, à celui d’un sujet de référence souffrant de la même maladie liée aux sarbecovirus à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, si la comparaison de l’étape b”) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence (selon les différents échantillons de référence, un pronostic, un suivi, une stratification, et/ou une évaluation plus précis(e) parmi les différents stades peut potentiellement être fait sur le même principe). Le sujet aura un pronostic plus négatif, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification plus avancé (plus grave), qu’un sujet de référence souffrant de la même maladie liée aux sarbecovirus à un pronostic/stade/niveau de stratification connu ou d’un sujet de référence sain, si le résultat de l’étape b) montre une détection plus importante de sarbecovirus ou une quantité de sarbecovirus plus élevée, que celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence ou du sujet de référence sain. À l’inverse, le sujet aura un meilleur pronostic, et/ou sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification moins avancé (moins grave), qu’un sujet de référence souffrant de la même maladie liée aux sarbecovirus à un pronostic/stade/niveau de stratification connu, si le résultat de l’étape b) montre une détection moins importante de sarbecovirus, ou une quantité de sarbecovirus moins élevée, que celui obtenu à l’étape b’) pour un échantillon de référence du sujet de référence.

Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus.

Selon un mode de réalisation alternatif ou en combinaison avec les modes de réalisation décrits ci-dessus, la méthode in vitro de stratification d'une maladie liée aux sarbecovirus, de pronostic d'une maladie liée aux sarbecovirus, de suivi d'une maladie liée aux sarbecovirus, ou d’évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, comprend en outre une étape b’) réalisée entre l’étape b) et l’étape c), de détection de la présence ou l’absence (et/ou la quantification) d’au moins un sarbecovirus, dans un second échantillon biologique du sujet testé (appelé échantillon (B)). Ledit second échantillon (B) a de préférence été obtenu/prélevé postérieurement à l’échantillon (A), par exemple lors d’une seconde visite (l’échantillon (A) ayant alors lui été obtenu lors d’une première visite), de préférence ledit échantillon (B) ayant été obtenu au moins 24 heures après l’échantillon (A), de préférence encore au moins 48 heures après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 72 heures après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 7 jours après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 10 jours après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 15 jours après l’échantillon (À), de préférence encore au moins

I mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 2 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 3 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 4 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 5 mois après l’échantillon (À), , de préférence encore au moins 6 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 7 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 8 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 9 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 10 mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins

I I mois après l’échantillon (À), de préférence encore au moins 12 mois après l’échantillon (À). De préférence encore ledit échantillon (B) a été obtenu entre 7 jours et 6 mois après l’échantillon (À), de préférence encore ledit échantillon (B) ayant été obtenu entre 10 jours et 5 mois après l’échantillon (À), de préférence encore entre 15 jours et 4 mois, de préférence encore entre 21 jours et 3 mois, de préférence encore entre 30 et 60, de préférence encore entre 40 et 50 jours. Selon ce mode de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape b”) réalisée entre l’étape b’) et l’étape c), de comparaison des sarbecovirus détectés (notamment des quantités de sarbecovirus détectées), pour les étapes b) (donc pour l’échantillon (À) du sujet) et b’) (donc pour l’échantillon (B) du sujet). Dans ce cas, l’étape c) comprend la stratification de la maladie liée aux sarbecovirus, le pronostic de la maladie liée aux sarbecovirus, le suivi de la maladie liée aux sarbecovirus, l’évaluation de l'efficacité du traitement de la maladie liée aux sarbecovirus, chez le sujet, en fonction de la comparaison de l’étape b”). Le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification inchangé/comparable, ou le sujet aura un pronostic inchangé/comparable, ou la maladie liée aux sarbecovirus n’aura pas ou peu évolué chez le sujet (sera stable), ou le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus sera raisonnablement efficace, si la comparaison de l’étape b’) montre que le résultat de l’étape b) est comparable à celui obtenu à l’étape b’).

Le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification plus avancé (plus grave), ou le sujet aura un pronostic plus négatif, ou la maladie liée aux sarbecovirus aura évolué (aura empiré, se sera aggravée) chez le sujet, ou le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus sera inefficace ou peu efficace, si le résultat de l’étape b) montre une détection plus importante de sarbecovirus, ou une quantité de sarbecovirus plus élevée, que celui obtenu à l’étape b’). À l’inverse, le sujet sera stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification moins avancé (moins grave), ou le sujet aura un meilleur pronostic, ou la maladie liée aux sarbecovirus se sera améliorée (sera moins grave, aura reculé) chez le sujet, ou le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus sera efficace, si le résultat de l’étape b) montre une détection moins importante de sarbecovirus, ou une quantité de sarbecovirus moins élevée, que celui obtenu à l’étape b’).

La méthode selon le mode de réalisation susmentionné peut également comprendre en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro) des éventuels sarbecovirus présents dans un échantillon biologique dudit sujet (appelé échantillon (À)). L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques sont notamment décrites dans la section « Compositions et Kits » ci-dessus. Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre les étapes a’), a), b), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a’), a), b), b’), et c) telles que décrites ci-dessus, ou les étapes a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci-dessus, ou encore les étapes a’), a), b), b’), b”), et c) telles que décrites ci- dessus.

Selon un mode de réalisation, si le sujet est stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification plus avancé (plus grave), ou si le sujet a un pronostic plus négatif, ou si la maladie liée aux sarbecovirus a évolué (a empiré, s’est aggravée) chez le sujet, ou si le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus est inefficace ou peu efficace ; un traitement pourra être administré au sujet si le sujet n’était pas sous traitement au moment du prélèvement de l’échantillon ; ou le traitement pourra être modifié (par exemple par la modification du médicament et/ou de la dose de médicament administrée et/ou de la fréquence d’administration du médicament), si le sujet était déjà sous traitement au moment du prélèvement de l’échantillon.

Selon un mode de réalisation, si le sujet est stratifié comme étant à un stade/niveau de stratification moins avancé (moins grave), ou si le sujet a un meilleur pronostic, ou si la maladie liée aux sarbecovirus s’est améliorée (est moins grave, a reculé) chez le sujet, ou si le traitement de la maladie liée aux sarbecovirus est efficace; le traitement pourra être modifié (par exemple par la modification du médicament et/ou de la dose de médicament administrée et/ou de la fréquence d’administration du médicament), si le sujet était déjà sous traitement au moment du prélèvement de l’échantillon ; ou aucun traitement ne sera administré au sujet si le sujet n’était pas sous traitement au moment du prélèvement de l’échantillon ; ou le traitement pourra être arrêté en cas de guérison complète.

La présente invention se rapporte également à l’utilisation in vitro d’au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus, pour le diagnostic d’une maladie liée aux sarbecovirus chez un sujet susceptible de souffrir d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou pour le suivi chez un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou pour la stratification d’un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou pour l’évaluation de l’efficacité d’un traitement (notamment curatif) administré à un sujet souffrant d’une maladie liée aux sarbecovirus, ou toute combinaison de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation préféré, la maladie liée aux sarbecovirus est choisie parmi les infections par un sarbecovirus, le sarbecovirus étant de préférence choisi parmi le virus SÀRS-CoV1 d’origine, les variants du virus SÀRS-CoV1 d’origine, le virus SÀRS-CoV2 d’origine, et les variants du virus SÀRS-CoV2 d’origine (notamment tels que listés dans la section définition ci-dessus).

L’utilisation peut notamment comprendre: i. la détection de la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon biologique ; et/ou ii. la détermination de la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon biologique.

Avantageusement les étapes i et ii de l’utilisation sont mises en oeuvre comme décrit ci- dessus en lien avec les compositions et les kits selon l’invention.

Avantageusement les utilisations sont mises en oeuvre comme décrit ci-dessus en lien avec les méthodes de diagnostic, de pronostic, de suivi, de stratification, ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement, telles que définies ci-dessus.

Les Inventeurs ont montré que, de manière surprenante, les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) ainsi mis au point possèdent de très bonnes affinités pour les domaines RBD de différents sarbecovirus, y compris des variants du virus SARS-CoV2. De façon remarquable, les données montrent également que ces anticorps optimisés sont capables d’empêcher la liaison entre le récepteur ACE2 de la cellule hôte et le domaine RBD, de manière plus efficace que les agents de liaison (notamment les anticorps à domaine unique) décrits dans l’art antérieur.

Les données montrent également que ces anticorps sont des outils de détection des sarbecovirus. La présente invention fournit donc des outils pour la recherche dans le domaine des maladies liées aux sarbecovirus.

La présente invention concerne donc une méthode in vitro pour détecter la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon, comprenant : a) la mise en contact de l’échantillon avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus ; et b) la détection de la présence ou de l’absence d’au moins un sarbecovirus dans l’échantillon de l’étape a).

La présente invention concerne également une méthode in vitro pour déterminer la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon, comprenant a) la mise en contact de l’échantillon avec au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus ; b) la quantification des sarbecovirus dans l’échantillon de l’étape a); et

L’échantillon peut être n’importe quel échantillon prélevé dans la nature. Avantageusement, l’échantillon est un échantillon végétal, un échantillon prélevé sur être vivant tel qu’un animal, un échantillon d’air, un échantillon de terre, un échantillon de sol, un échantillon d’eau, un échantillon d’eaux usées, un échantillon d’eaux de circulation dans des conduits d’un bâtiment ou dans sol, ou encore un échantillon de cours d’eau naturel ou un échantillon d’eau de mer.

La présente invention concerne également une méthode in vitro pour cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître au moins un sarbecovirus, de préférence pour cribler des composés/molécules capables de neutraliser au moins un sarbecovirus, la méthode comprenant : a) la mise en contact d’au moins un composé/une molécule à tester avec au moins un sarbecovirus pour obtenir un mélange ; b) l’ajout d’un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que défini ci-dessus au mélange de l’étape a); c) la détection de la présence ou de l’absence d’au moins un sarbecovirus dans le mélange de l’étape b), et/ou la détection de la présence ou de l’absence d’au moins un composé/une molécule à tester.

Avantageusement, l’étape de détection (et/ou de quantification) des méthodes susmentionnées est réalisée comme décrit ci-dessus en lien avec les compositions et les kits selon l’invention, mutatis mutandis.

Avantageusement, les méthodes sont mises en oeuvre comme décrit ci-dessus en lien avec les méthodes de diagnostic, de pronostic, de suivi, de stratification, ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement, telles que définies ci-dessus, mutatis mutandis.

Selon un mode de réalisation, la méthode comprend en outre une étape a’) réalisée avant l’étape a), d’amplification (in vitro) des éventuels sarbecovirus présents dans l’échantillon. L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques sont notamment décrites dans la section « Compositions et Kits » ci-dessus.

La présente invention concerne également une utilisation in vitro d’au moins un agent de liaison (tel qu’un anticorps ou un fragment fonctionnel d’anticorps, notamment un anticorps à domaine unique) tel que définie ci-dessus, pour : i. détecter la présence ou l’absence d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon; ii. déterminer la quantité d’au moins un sarbecovirus dans un échantillon ; iii. cribler des composés/molécules capables de détecter et/ou reconnaître au moins un sarbecovirus ; de préférence cribler des composés/molécules capables de neutraliser au moins un sarbecovirus ; ou iv.une combinaison quelconque de a) à c).

L’échantillon peut être n’importe quel échantillon prélevé dans la nature. Avantageusement, l’échantillon est un échantillon végétal, un échantillon prélevé sur être vivant tel qu’un animal, un échantillon d’air, un échantillon de terre, un échantillon de sol, un échantillon d’eau, un échantillon d’eaux usées, un échantillon d’eaux de circulation dans des conduits d’un bâtiment ou dans sol, ou encore un échantillon de cours d’eau naturel ou un échantillon d’eau de mer.

Avantageusement, l’étape de détection (et/ou de quantification) des utilisations susmentionnées est réalisée comme décrit ci-dessus en lien avec les compositions et les kits selon l’invention, mutatis mutandis.

Avantageusement, les utilisations sont mises en oeuvre comme décrit ci-dessus en lien avec les méthodes de diagnostic, de pronostic, de suivi, de stratification, ou d’évaluation de l’efficacité d’un traitement, telles que définies ci-dessus, mutatis mutandis.

Selon un mode de réalisation, l’utilisation comprend en outre une étape préliminaire d’amplification (in vitro) des éventuels sarbecovirus présents dans l’échantillon. L’amplification des sarbecovirus peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier. De telles techniques sont notamment décrites dans la section « Compositions et Kits » ci-dessus.

Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention, et ne sauraient être considérés comme limitatifs.

DESCRIPTION DES FIGURES

[Fig. 1] Figure 1 : Scanning mutationnel profond (Deep Mutational Scanning) sondant la liaison de VHH-72 au domaine RBD de la protéine Spike du SARS CoV2.

(A) Deux bibliothèques dADN de mutants uniques de VHH72 (correspondant à la partie N- terminale et C-terminale du nanocorps) ont été transformées en levure en utilisant la recombinaison de réparation des lacunes. (B) Principe général du criblage fonctionnel par affichage de surface en levure. Les cellules sont incubées avec l'antigène et les clones portant les mutations VHH72 avec une liaison accrue du RBD SARS-CoV2 par rapport à l'anticorps parental sont triés en FACS. (C) Analyse par cytométrie en flux bivariée des bibliothèques L1 et L2 de cellules de levure exprimant des variants VHH72 à leur surface. Les cellules ont été doublement marquées avec un antigène biotinylé/Streptavidin-PE (liaison RBD SARS-CoV2) et des marqueurs APC anti-HA tag (expression VHH). Les bibliothèques ont été enrichies de 10 % de cellules clonales exprimant la VHH72 parentale avec la protéine egfp pour distinguer les cellules présentant une liaison antigènique accrue. Les cellules sélectionnées (délimitées par un cadre « cellules triées ») ont été triées et séquencées avec Illumina Deep Sequencing.

[Fig. 2] Figure 2 : Cartographie des paratopes du nanocorps VHH72 et conception de bibliothèques combinatoires pour la sélection de clones améliorés.

Carte thermique basée sur le NGS représentant les valeurs d'enrichissement de chaque mutant unique VHH72 après un tri fonctionnel dans FÀCS. Le score d'enrichissement est une fonction logarithmique en base 2 de l'enrichissement entre les populations de levures VHH72 triées et non triées pour une substitution d'acide aminé donnée. Le tableau correspondant est coloré en gris clair pour les mutations enrichies et en gris foncé pour les mutations appauvries. Les substitutions en noir ont été sélectionnées pour la conception de bibliothèques combinatoires visant à identifier des variants de VHH72 ayant des propriétés de liaison améliorées. En raison de la grande diversité générée, deux bibliothèques distinctes ont été conçues (avec des diversités théoriques respectives de 4,14e4 et 1 ,12e7 clones).

[Fig. 3] Figure 3 : Criblage de bibliothèques basé sur le Yeast Surface Display et tri des clones VHH72 avec une liaison améliorée pour l'antigène RBD SÀRS-CoV2.

(À) La bibliothèque À a été incubée avec 10nM de RBD SÀRS-CoV2 et analysée en FÀCS. Peu de clones présentant une meilleure liaison à l'antigène étaient détectables. La bibliothèque B a été triée deux fois aux concentrations respectives de 10 nM et 1 nM de RBD SÀRS-CoV2. Àu deuxième tour, une sélection basée sur K _O ff a été entreprise. Après l'équilibre avec 1 nM d'antigène, une quantité excédentaire de 100 nM d'antigène non biotinylé a été introduite pour entraîner la dissociation et limiter la réassociation. (B) Clones sélectionnés dans la bibliothèque B après deux cycles de sélection FACS. Tous les clones sélectionnés présentent une forte liaison aux antigènes RBD de SARS-CoV-1 et SARS-CoV-2.

[Fig. 4] Figure 4 : (À) Logo de la séquence des clones contenus dans la bibliothèque B avant le tri (B) Logo de la séquence des clones sélectionnés après la sélection par maturation d'affinité basée sur le FÀCS.

[Fig. 5] Figure 5 : Affinité de l'anticorps VHH-Fc Mut76 pour le RBD de SARS-CoV et SARS- CoV-2.

Mesure de l'affinité de VHH-Fc Mut76 pour le RBD de SARS-CoV-2 par interférométrie en couche biologique. Les anticorps ont été chargés sur des biocapteurs anti-Fc humain via la protéine A pour la mesure de l'association et de la dissociation du RBD SARS-CoV-2 à des concentrations variables. [Fig. 6] Figure 6 : Essai de neutralisation en ELISÀ de la liaison entre le récepteur ÀCE2 et le domaine RBD du virus SÀRS-CoV2.

Ce test permet d’évaluer la capacité des anticorps VHH-Fc sélectionnés à bloquer l'interaction entre l'ÀCE2 et différents variants du domaine RBD. Les IC50 ont été déterminées à l'aide du logiciel Prism 6.0. Les valeurs ont été générées à partir de 3 expériences indépendantes.

[Fig. 7] Figure 7 : Modélisation moléculaire de l'interaction entre le VHH-72 muté (avec les mutations S57G / T103V / V104W) et le RBD SÀRS-CoV-2.

(À) Localisation des substitutions d'acides aminés présentes dans les différentes variantes de la préoccupation (VOC) du SÀRS-CoV-2 dans le modèle d'homologie de l'interaction entre la VHH72 mutée et le domaine RBD du SÀRS-CoV-2. (B) Interaction du résidu tryptophane muté W104 avec une cavité hydrophobe délimitée par les résidus RBD F377 et P384. Les résidus RBD SÀRS-CoV2 Y369 présentent une conformation préférentielle différentielle par rapport à la structure SÀRS-CoV-1 , imposée par la présence d'une proline en position 384 dans SÀRS- CoV-2. L'introduction de la mutation S57G pourrait introduire plus de flexibilité dans la CDR2 et pourrait aider à accommoder l'orientation préférentielle de Y369 vers l'interface avec VHH72.

EXEMPLES

EXEMPLE : Conception et mises au point d’anticorps VHH72 à large spectre

1 . Matériels et méthodes

1. 1. Conception et génération des bibliothèques de DMS (Deep Mutational Scanning)

Deux banques de variants de VHH72 (dont la séquence sauvage, non mutée, est SEQ ID NO :1 ) avec des mutations d'un seul acide aminé ont été générées par épissage par PCR d'extension par recouvrement (SOE-PCR) en utilisant des amorces NNK dégénérées. Une banque a été générée pour chacune des deux régions ciblées (banque 1 : acides aminés 1 à 59 et banque 2 : acides aminés 61 à 125) correspondant respectivement à une diversité théorique de 1888 et 2112 variants d'ÀDN.

1.2. Génération de bibliothèques combinatoires pour la maturation par affinité La conception d'amorces mutagènes contenant des codons dégénérés a été réalisée à l'aide de SwiftLib (http://rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/). Deux banques distinctes ont été conçues, correspondant respectivement aux régions CDRH1 et CDRH2+CDRH3.

1.3. Affichage de VHH à la surface de levures

La préparation des cellules de levure compétentes EBY100 (ÀTCC® MYA-4941 ) et la transformation des banques ont été effectuées selon Benatuil et al [27]. Les transformations utilisant la technique du gap-repair ont été effectuées dans le plasmide pNT VHH72 entre les sites de restriction Nhel et Notl avec 1 pg de vecteur digéré et un rapport molaire de 12: 1 (banque linéaire/vecteur digéré ; Fig. 1 (A)). Après transformation, 250 mL de milieu SD-CAA [6,7 g/L de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g/L de glucose, 5 g/L d'acides aminés, 100 mM de phosphate de sodium, pH 6,0] ont été ensemencés avec 400 L de cellules transformées et incubés pendant la nuit à 30° C, 200 rpm. La culture saturée (typiquement OD600 de 8-10) a été passée afin d'obtenir une culture initiale OD600 de 0.25- 0.50 dans 50 mL. La culture a été cultivée à 30°C jusqu'à ce que sa D0600 atteigne 0, 5-1 ,0. Les cellules ont été centrifugées et remises en suspension dans 50 mL de milieu d'induction au galactose SG-CAA [6,7 g/L de base azotée de levure sans acides aminés, 20 g/L de galactose, 5 g/L d'acides aminés, 100 mM de phosphate de sodium, pH 6,0] et induites pendant 16-36 h à 20° C, 200 rpm.

1.4. Cytométrie en flux

Pour le tri des banques, 10 ⁷ à 2.10 ⁸ cellules induites de chaque banque ont été lavées avec 1 mL de tampon PBSF (PBS, BSA 0,1%). Les cellules ont été remises en suspension dans du PBSF avec la concentration appropriée d'antigène RBD SARS-CoV2 (Fig. 1 (B)), en utilisant un volume adéquat pour éviter l'épuisement des ligands, comme cela a été fait dans Hunter et al [28]. Après une incubation à 20° C avec agitation pendant 3 heures, les cellules ont été lavées avec du PBSF glacé pour éviter la dissociation. Les cellules ont été incubées sur glace dans l'obscurité pendant 15 minutes avec un anticorps anti-HA (Invitrogen HA Tag Mouse antiTag, DyLight® 650 conjugué, Clone : 2-2.2.14 ; dilution 1 : 100) et Streptavidin-PE (Thermo Fisher scientific ; numéro de catalogue S866 ; dilution 1 : 100). Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBSF glacé et triées avec un cytomètre BD FACS Aria™ III en utilisant le logiciel BD FACSdiva™. Des « gates » diagonales ont été définies pour trier les cellules présentant une expression de VHH et une forte liaison RBD SARS-CoV-2 (Fig. 1 (C)). 1.5. Séquençage massif et analyse des données NGS

L'ÀDN plasmidique de chaque population de levure a été extrait à l'aide de Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II et préparé pour le séquençage comme décrit dans Medina-Cucurella et Whitehead [29]. Une PCR en deux étapes a été réalisée pour amplifier la région d'intérêt et ajouter des adaptateurs et des codes-barres Illumina pour le multiplexage. Le séquençage profond a été réalisé avec un dispositif Illumina ISeq 100 (2x150 bp, 300 cycles) avec au moins 300 000 lectures par population. Les lectures ont été démultiplexées et chaque échantillon a été traité séparément à l'aide de la plateforme Galaxy (https://usegalaxy.org/) en utilisant les fonctions décrites dans Blankenberg et al [30]. Tout d'abord, les lectures appariées ont été jointes (Fastq Joiner). Une sélection a ensuite été effectuée (Fastq Trimmer) sur les lectures pour ne garder que la région d'intérêt dans le cadre correct de lecture. Un filtre de qualité (Filter FASTQ) a été appliqué pour éliminer les lectures dont le score de qualité minimum était inférieur à 30. Ensuite, les séquences d'ADN ont été traduites en séquences protéiques et les séquences identiques ont été regroupées. Les séquences non répétées au moins deux fois ont été filtrées. À l'aide du logiciel RStudio, le calcul des ratios d'enrichissement pour chaque mutation unique a été effectué.

1.6. Production et purification des ligands VHH72-Fc

Les constructions VHH72-Fc et RBD SARS-CoV2 ont été obtenues par transfection transitoire de HEK293 Freestyle™ (Thermo). Les gènes synthétiques correspondant aux mutants VHH72 sélectionnés ont été commandés à IDT sous forme de « gblocks » et clonés dans le vecteur d'expression mammalien pcDNA 3.4 VHH72-Fc. Les gènes codant pour les différents domaines RBD ont été clonés dans le plasmide pCAGGS RBD-SARS-CoV2, qui est un don du laboratoire de Florian Krammer. Les HEK293 Freestyle™ ont été transfectées de façon transitoire à une densité de 2,5 106 cellules/mL dans 100mL de milieu Freestyle (Thermo-Fisher) par l'ajout de 150 pg de plasmide et de 1 ,8 mL de polyéthylèneimine linéaire (PEI, 0,5 mg/ml) (Polysciences). Après 24h, 100 mL de milieu frais ont été ajoutés. Après sept jours à 37° C, 120 rpm, 8% CO2, le surnageant a été purifié en utilisant HiTrap Protein A pour les constructions VHH-Fc ou HisTrap Excel pour les constructions RBD, en suivant les instructions du fabricant (GE Healthcare). Une chromatographie d'exclusion de taille a été réalisée (HiPrep Sephacryl-S-200HR ou S100HR) avec du PBS.

1.7. Mesure de l'affinité par interférométrie BioLayer Les cinétiques de liaison ont été déterminées en utilisant un instrument Octet RED96 (ForteBio). Les biocapteurs anti-hlgG Fc Capture (ÀHC) (Fortebio) ont été chargés avec des molécules VHH-Fc (50 nM) pendant 60 secondes. Après une ligne de base utilisant un tampon cinétique (PBS, 0,5 % (p/v) de BSA et 0,05 % (v/v) de Tween 20), l'association de RBD SARS- CoV2 ou de RBD SARS-CoV1 (Sinobiological) a été mesurée à différentes concentrations (50 nM à 0,78 nM) pendant 300 secondes avant la dissociation dans le tampon cinétique. Les données du contrôle sans antigène ont été soustraites de toutes les courbes de liaison et les cinétiques de liaison ont été ajustées en utilisant un modèle de liaison de Langmuir global 1 : 1.

1.8. Essai de neutralisation

Les essais de neutralisation de la liaison entre le récepteur ACE2 et le domaine RBD du virus SARS-CoV2 sont réalisés en ELISA. Ce test permet d’évaluer la capacité des anticorps VHH- Fc sélectionnés à bloquer l'interaction entre IACE2 et différents variants du domaine RBD. Les IC50 ont été déterminées à l'aide du logiciel Prism 6.0. Les valeurs ont été générées à partir de 3 expériences indépendantes.

2. Résultats

Pour améliorer l’affinité du VHH72 vis-à-vis du domaine RBD de la protéine Spike du virus SARS-CoV2, les Inventeurs ont entrepris une maturation d’affinité par ingénierie moléculaire.

Lors d’une première étape, l’influence de toutes les substitutions possibles pour chaque acide aminé de la séquence du VHH72 a été cartographiée exhaustivement. Cette approche appelée Deep Mutational Scanning (DMS) est couplée à un criblage fonctionnel en Yeast Surface Display (YSD) pour identifier les variants affichant les meilleures propriétés de liaison (Fig. 1 ). Ceci permet d’une part d’identifier les résidus impliqués dans la reconnaissance de l’antigène, mais également d’identifier les substitutions favorables susceptible de conférer une augmentation de l’affinité.

Après séquençage à haut débit, les données d’enrichissement des différents mutants peuvent être représentées sous forme de « heatmap », avec un code couleur permettant de distinguer les mutations favorables en gris clair et défavorables en gris foncé (Fig. 2). Les « heatmaps » obtenues suggèrent trois zones principales d’interaction avec l’antigènes, au moins partiellement chevauchantes avec les 3 CDR du VHH. Les mutations au sein des CDR2 et CDR3 sont très majoritairement défavorables à l’interaction avec l’antigène. Quelques positions ne semblent tolérer que certaines substitutions bien définies (e.g. A/G/l en position 57, W en 58, Y/W/P en position 101 , ainsi que T103V ou V104W. Par ailleurs, quelques positions semblent permissives à la mutation, comme la majorité des résidus du CDR1 , les acides aminés en aval du CDR2 (positions 59 à 62) ou la position 98 dans le CDR3.

Pour potentialiser l’augmentation d’affinité, les meilleures substitutions ont été assemblées au sein de banques combinatoires (Positions entourées en noir, Fig. 2). Ces banques ont été générées puis criblées grâce à la technique du YSD pour identifier les clones démontrant une liaison accrue à l’antigène. Les meilleurs variants ont alors été sélectionnés par plusieurs tours de sélection successifs. Les cellules exprimant les meilleurs variants de VHH sont triées en cytométrie de flux, en présence de concentrations décroissantes d’antigène. Lors d’une dernière étape une sélection des clones ayant la plus lente dissociation de l’antigène a été entreprise, avec un crible sur le paramètre cinétique Koff (Fig. 3). À l’issue des étapes de criblage, l’analyse de la population triée montrent que tous les clones sélectionnés ont un gain très substantiel d’affinité pour l’antigène RBD SÀRS-CoV-2 avec une liaison notable à RBD en présence d’une concentration de 50pM d’antigène (Fig. 3B). Par ailleurs, ces mêmes clones ont conservé leur capacité de reconnaissance de l’antigène SÀRS-CoV1 comme en témoigne le fort signal observé en présence d’une concentration de 1 nM d’antigène RBD SÀRS-CoV1 .

À l’issue des étapes de criblage, une nouvelle étape de séquençage haut débit a été entreprise. Ce séquençage a permis d’obtenir la fréquence des mutations au sein des zones mutées (représentée sous forme de graphique « Sequence Logo », Fig. 4). Les données montrent qu’à l’issue des étapes de tri en FÀCS, les clones sélectionnés possèdent très majoritairement les mutations S57G et V104W, souvent associées avec la mutation T103V. Les autres positions n’affichent pas un consensus aussi marqué et restent plus variables.

Le séquençage NGS a également permis d’obtenir une liste des clones les plus fréquemment observés dans la population triée. Pour évaluer ces anticorps d’un point de vue fonctionnel, quelques variants ont étés choisis parmi les séquences les plus représentées (cinq variants ont été choisis, nommés VHH6 (ou VHH72mut6), VHH65 (ou VHH72mut65), VHH66 (ou VHH72mut66), VHH71 (ou VHH72mut71 ), VHH76 (ou VHH72mut76), respectivement, dont les séquences respectives sont SEQ ID NO : 2-6). Ceux-ci ont été clonés avec un fragment constant d’immunoglobuline humaine (ayant pour séquence SEQ ID NO :8) pour une expression sous forme de VHH-Fc en cellules HEK293.

De plus, une version humanisée du variant VHH76 (ou VHH72mut76) a été générée à l’aide de la technique dite du "best fit". La séquence IGHV3-23*01 , correspondant à la séquence germinale (i.e., dépourvue de mutation liée à la maturation de l'anticorps) codée par le gène V humain le plus proche de celle de VHH72mut76, a été utilisée. Le variant VHH72mut76 humanisé ainsi obtenu a pour séquence SEQ ID NO :7.

Les constantes d’affinité des molécules VHH-Fc ont été mesurées en BioLayer Interferometry (OctetRED96) pour les antigènes RBD SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2, ainsi que pour les variants SÀRS-CoV2 (alpha, beta, gamma et delta) (Fig. 5 et Tableau 4). Les cinq clones améliorés testés montrent un gain important d’affinité vis-à-vis de l’antigène RBD SÀRS-CoV2 par rapport à l’anticorps parental VHH72. Les constantes de dissociation de ces molécules sont notablement plus lentes et expliquent l’essentiel du gain d’affinité. De plus, la présence de substitutions au sein de l’antigène RBD SÀRS-CoV2 correspondant aux variants naturels du virus SÀRS-CoV2 n’affectent pas la reconnaissance par les molécules VHH-Fc. De manière intéressante, les cinq molécules VHH-Fc montrent une excellente affinité pour l’antigène RBD-SÀRS-CoV1 , sans qu’aucune pression de sélection n’ait été introduite pour conserver cette « cross-réactivité ».

Tableau 4 : Constantes d’affinité des molécules VHH-Fc mesurées pour les antigènes RBD SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2, ainsi que pour les variants SÀRS-CoV2 (alpha, beta, gamma et delta)

[Table 4]

Pour compléter la caractérisation des molécules améliorées, un test de neutralisation en ELISÀ a été mis en oeuvre pour vérifier la capacité de ces molécules à inhiber l’interaction entre la protéine RBD et le récepteur angiotensin-converting enzyme 2 (ÀCE2) soluble (Fig. 6). Les molécules VHH-Fc améliorées montrent des valeurs inhibitrices IC50 bien plus faibles que la molécule parentale qui sont bien corrélées à l’augmentation d’affinité mesurée. Enfin, un test de neutralisation du virus entier sur cellules humaine indique que chacun des variants VHH-Fc améliorés est capable de neutraliser efficacement le virus SÀRS-CoV2 et différents variants (données non montrées). Le pouvoir neutralisant de chacun des variants VHH-Fc améliorés est nettement supérieur à celui du VHH72 parental.

Les clones VHH-Fc sélectionnés possèdent en commun les substitutions S57G, T103V ainsi que V104W. Pour mieux comprendre l’implication des différentes substitutions communes, les constantes d’affinités de clones incorporant ces mutations seules ou en combinaison ont été mesurées. Les données d’Octet obtenues (Tableau 5) montrent que chacune de ces substitutions améliore individuellement l’affinité pour la protéine RBD SÀRS-CoV2, avec des affinités comprises entre 2 et 7 nM pour les monomutants. Les combinaisons S57G/V104W ainsi que S57G/T103V/V104W montrent une certaine additivité, avec des affinités mesurées en dessous du nanomolaire (respectivement 0,53 nM et 0,18 nM). En revanche, les mutations T103V/V104W ne semblent pas avoir d’effet synergétique, l’affinité mesurée de 5,5 nM étant du même ordre de grandeur que pour les mutations testées individuellement.

Tableau 5 : Constantes d’affinités mesurées pour les clones incorporant différentes substitutions seules ou en combinaison

[Table 5]

Afin de mieux comprendre les modifications structurales et les nouvelles interactions moléculaires induites par ces substitutions, un modèle d’interaction entre le domaine RBD de SARS-CoV2 et le VHH72 incorporant les 3 substitutions S57G/T103V/V104W a été établi par homologie, à partir de la structure tridimensionnelle du complexe RBD SARS- CoV1 /VHH72 précédemment publiée [22]. Le modèle suggère une légère modification de la boucle du CDR2 liée à la substitution S57G. La présence de la glycine permet une plus grande flexibilité et libère un espace pour la chaîne latérale du résidu Y369. Ce résidu possède en effet une conformation différente dans la structure de l’antigène SÀRS-CoV-1. Par ailleurs, la mutation V104W semble mieux accommoder une cavité hydrophobe, délimitée par les résidus F377, P384 et C379 (Fig. 7).

3. Discussion

L’approche d’ingénierie moléculaire décrite ici a permis d’obtenir des variants du VHH72 très affins avec des constantes d’affinité améliorées de près d’un facteur 1000 par rapport à la molécule parentale. Ces molécules sont en outre à large spectre puisqu’elles sont à la fois capables de reconnaître les antigènes des virus SÀRS-CoV1 et SÀRS-CoV2 ainsi que les différents variants naturels observés pour le SÀRS-CoV2.

L’augmentation d’affinité de ces molécules pour le domaine RBD de la protéine Spike a permis d’augmenter leur pouvoir de neutralisation du virus de manière significative. Un traitement de patients avec ces anticorps pourrait donc se révéler plus efficace qu’avec la molécule parentale VHH72 non mutée. Par ailleurs, la dose efficace pour le traitement pourrait éventuellement être réduite sans altérer l’efficacité thérapeutique. Enfin de par la reconnaissance à large spectre des différents variants de RBD, ces nouvelles molécules seront potentiellement efficaces pour les différentes souches du virus, actuelles ou susceptibles d’être découvertes à l’avenir. Ces molécules présentent donc un fort potentiel pour une application thérapeutique chez l’homme.

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