Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, Homologe, Fragmente und Teile davon, ein solches Peptid zur Verwendung in der Behandlung von Morbus Alzheimer und die Verwendung eines solchen Peptids zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß- Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.

Die Alzheimer'sche Demenz (AD) bzw. Morbus Alzheimer ist einem geschätzten Anteil von knapp zwei Dritteln - was ca. 27 Millionen Menschen entspricht - die häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Sie wird einer heterogenen Gruppe zugeordnet, welche symptomatisch durch eine fortschreitende Demenz gekennzeichnet sind.

Nach aktuellem Kenntnisstand wird vermutet, dass die Aggregation des Amyloid-ß- Proteins (Aß) die AD-Pathologie initiiert und zu den charakteristischen amyloiden Plaques, Tau-Aggregaten und dem Verlust von Neuronen im Gehirn führt. Aß- Monomere werden im normalen Stoffwechsel kontinuierlich durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) gebildet und sind per se nicht toxisch. Erst durch die Ausbildung einer ß-Faltblatt-Struktur und einer damit verbundenen Aggregation entwickeln sich die Aß-Proteine zu toxischen Spezies und schließlich zu Fibrillen und den charakteristischen Aß-Plaques. Dabei wird postuliert, dass Aß-Oligomere die toxische Spezies sind, welche für die Entstehung und Progression der AD verantwortlich gemacht wird. Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, die Bildung toxischer Aß- Oligomere zu verhindern bzw. bereits vorhandene Aß-Oligomere vollständig zu eliminieren.

Zum jetzigen Zeitpunkt existiert kein kausal wirkendes Medikament zur Behandlung der Alzheimer'schen Demenz (Morbus Alzheimer). Eingesetzte Medikamente sind bestenfalls in der Lage, einige Symptome kurzzeitig zu mildern, können aber die Progression der Erkrankung nicht verlangsamen, geschweige denn aufhalten.

Es existieren eine Reihe von Substanzen, von denen postuliert wird, dass diese kausal wirksam sind. Dieser Nachweis konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt jedoch nicht oder nur in Teilen (im Tiermodell) erbracht werden. Die meisten klinischen Kandidaten (u.a. viele Antikörper) scheitern in der letzten Phase der klinischen Entwicklung an mangelnder Wirksamkeit. Dies könnte daran liegen, dass die meisten dieser klinischen Kandidaten nicht die korrekte Struktur (Aß-Oligomere) als Ziel haben. Das Ziel einer kausal wirksamen Therapie muss es sein, die höchst toxischen Aß-Oligomere direkt zu eliminieren.

Ein weiteres großes Problem besteht darin, dass es keine adäquate Möglichkeit gibt, die AD vor Ausbruch der Symptomatik zu diagnostizieren. Es ist jedoch bekannt, dass Aß-Oligomere und zeitlich darauffolgend Plaques bis zu 20 Jahre vor dem Auftreten der Symptome im Gehirn der Patienten entstehen und irreversibel Schaden anrichten. Molekulare Sonden, die dem Patienten intravenös injiziert werden und die nach der Passage über die Blut-Hirn-Schranke an Aß-Oligomere und Plaques binden, können mittels bildgebender Methoden sichtbar gemacht werden und somit eine frühere Diagnose der AD ermöglichen.

In der Vergangenheit wurde verschiedene D-enantiomere Peptide für eine mögliche kausale Therapie der AD entwickelt. Zu diesen zählen u.a. D3 (rprtrlhthrnr), RD2 (ptlhthnrrrrr) und verschiedene weitere Peptide.

Es besteht jedoch weiterhin ein Bedarf an neuen Verbindungen (Wirkstoffen), die sehr spezifisch und mit hoher Affinität an Aß -Oligomere binden, und so deren Vermehrung verhindern und diese direkt Zerstörern. Diese Verbindungen sollten keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen, insbesondere keine Immunreaktion hervorrufen. Die Verbindungen sollen außerdem toxische Aß-Oligomere und damit auch die kleinen frei diffundierbaren Oligomere auch in kleinen Konzentrationen erkennen, vollständig vernichten und/oder deren (Prionen-ähnliche) Vermehrung verhindern.

Des Weiteren besteht auch ein Bedarf an neuen Verbindungen, die als Sonden für die Erkennung und Markierung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten einsetzbar sind, insbesondere, wenn diese erst in kleinen Konzentrationen auftreten.

Diese Aufgabe wurde durch ein Peptid gemäß Anspruch 1, insbesondere durch ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, umfasst, gelöst.

Diese umfassen insbesondere die folgenden sieben D-enantiomere Peptide

SEQ ID NO 1:

SaSl rkrirlhrhrrr

SEQ ID NO 2:

SaS2 rkrirll rirrr

SEQ ID NO 3:

SaS3 rkrhrhhrhrrr

SEQ ID NO 4:

SaS4 rktirlhrhtrr

SEQ ID NO 5:

SaS5 rkrirlhrhrrr

SEQ ID NO 6:

SaS6 rkrhrlhrhrrr SEQ ID NO 7:

SaS7 rktlrlhrhtrr

Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 7 können durch die spezifische Bindung an das Amyloid-ß-Peptid, als mögliches Medikament gegen die Alzheimer'sche Demenz genutzt werden.

Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend Homologe, Fragmente und Teile der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 7.

Unter Amyloid-ß-Peptid bzw. Amyloid-ß-Protein wird hier bevorzugt das humane Amyloid-ß-Peptid, insbesondere die Aminosäuren 1-42, bzw. das Amyloid-ß-Protein, insbesondere die Aminosäuren 1-42, verstanden.

Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% aufweist. Bevorzugt sind hierbei 80% und 90%. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. und Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981) ) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.

Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch, wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.

Unter Homologe sind in einer Variante die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen zu verstehen, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu zwei oder drei Aminosäuren unterscheiden.

In einer Ausführungsform ist die Homologie bzw. die Identität unabhängig davon, ob es sich um D- oder L-Aminosäuren handelt. Die Homologie bzw. die Identität bezieht sich hier nur auf die Aminosäuresequenz.

Ferner können als Peptide auch Sequenzen eingesetzt werden, die die oben genannten Sequenzen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH ₂ -Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCI-Gruppe, COBr-Gruppe, CONH-alkyl- Rest oder ein CONH-alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt.

Damit wird besonders vorteilhaft zusätzlich die Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negative Ladung am C-terminus, bereitgestellt wird. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass dieses mit höherer Affinität an das Zielmolekül binden kann, als ein Peptid, welches eine Carboxylgruppe am freien C-terminus aufweist. Peptide mit freier, nicht-modifizierter Carboxylgruppe weisen im physiologischen Zustand eine negative Ladung an diesem Ende auf.

In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide im physiologischen Zustand, insbesondere bei pH 6-8, insbesondere 6, 5-7, 5, insbesondere bei pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5 pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 bzw. pH 8,0 derart modifiziert, dass der C-terminus keine negative Ladung trägt, sondern stattdessen neutral ist oder eine oder mehrere positive Ladungen aufweist. In einer Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, dass am freien C- terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vorliegt. Statt der Carboxylgruppe (-COOH-Gruppe) ist also eine Säureamidgruppe (-CONH ₂ -Gruppe) am C-terminus angeordnet.

Das Peptid ist demnach besonders vorteilhaft am freien C-Terminus amidiert und am freien N-Terminus nicht modifiziert.

Dadurch wird besonders vorteilhaft die weitere Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negativen Ladungsüberschuss vorliegt, welches affiner an das Zielmolekül binden kann und auf einfache Weise erhältlich ist.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegen folgende weitere Gruppen an Stelle der Carboxylgruppe vor: COH, COCI, COBr, CONH-alkyl-Rest, CONH-alkyl- Amin-Rest (positive Netto-Ladung) etc., wobei man hierauf nicht beschränkt, sofern der technischen Lehre des Hauptanspruchs gefolgt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist daher die Affinität der Bindung der erfindungsgemäß modifizierten Peptide ohne negative Ladung am C-terminus im Vergleich zu linearen Peptiden mit negativer Ladung am C-terminus aber im Übrigen gleicher Aminosäuresequenz, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,

49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,

93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100%, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,

124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139,

140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,

156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,

188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, insbesondere 200%,

201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216,

217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232,

233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264,

265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280,

281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296,

297, 298, 299, insbesondere 300%, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325,

326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341,

342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357,

358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373,

374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389,

390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, insbesondere 400%, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418,

419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434,

435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450,

451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466,

467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482,

483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498,

499, vorteilhaft sogar 500%, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527,

528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543,

544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559,

560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575,

576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591,

592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, besonders vorteilhaft 600%, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619,

620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635,

636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651,

652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667,

668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683,

684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, besonders vorteilhaft 700%, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727,

728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743,

744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759,

760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775,

776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791,

792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, ebenfalls besonders vorteilhaft 800%, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817,

818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833,

834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849,

850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865,

866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881,

882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897,

898, 899, ebenfalls besonders vorteilhaft 900%, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923,

924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939,

940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955,

956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971,

972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987,

988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, oder sogar um 1000%, oder sogar um 10000% oder sogar um bis zu 100000% oder 1000000% erhöht, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.

Dies wird durch einen entsprechend erniedrigten Ko-Wert angezeigt. Der Ko-Wert als Maß für die Affinität der Bindung eines modifizierten Peptids an Amyloid-ß-Monomer ist im Vergleich zu einem linearen, bindenden Peptid mit negativer Ladung am freien C-terminus, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere

99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5%, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 bis zu 99,99 oder sogar 99,999% erniedrigt, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7 enthält.

Es sind auch Varianten denkbar, wobei das Peptid 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

20 oder mehr Peptide mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7 enthält. Insbesondere bevorzugt sind Dimere der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 7, wobei es sich bei den beiden Monomeren des Dimers um Peptide mit der gleichen SEQ ID oder mit einer verschiedenen SEQ ID handelt.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D- enantiomeren Aminosäuren", dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sind.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 besteht.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.

Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1, Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.

Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt.

Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen, die die Wirkung der Peptide verstärken. In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.

In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.

Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügten Linker oder Linker-Gruppen.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.

Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin-Tetramer, miteinander verknüpft sind.

Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Peptid verknüpft. Bei einem verzweigten Peptid kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.

Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z. B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Peptid bilden.

Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Affinität der Bindung der Peptide über die Dissoziationskonstante (Ko-Wert) definiert.

Die Dissoziationskonstante (Ko-Wert) eines erfindungsgemäßen Peptids ist dabei in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft erniedrigt. Damit verbunden sind verbesserte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide, wie höhere Affinität der Bindung und höhere Effektivität des Abbaus und/oder der Verhinderung der Bildung toxischer Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß-Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregate.

In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an ein Amyloid-ß-Monomer mit einer Dissoziationskonstante (Ko-Wert) von höchstens 500 pM, bevorzugt 250, 100, 50 pM, besonders bevorzugt 25, 10, 1 pM, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (Ko-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer KD von kleiner als ein zweistelliger pM Bereich (< 10 pM), vorzugsweise nM Bereich (< 1 pM) an das Amyloid-ß-Peptid, binden kann.

Die Peptide können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden. In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von Amyloid-ß-Fi brillen, Amyloid-ß- Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.

In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Enttoxifizierung von Amyloid-ß-Fi brillen, Amyloid-ß-Oligomere und/oder Amyloid-ß- Aggregaten.

Die erfindungsgemäßen Peptide enttoxifizieren die Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß- Oligomere und/oder Amyloid-ß-Aggregaten oder daraus gebildete Polymere vorzugsweise indem sie nicht daran binden sondern an Amyloid-ß-Monomer binden und durch Verschiebung des Gleichgewichts zur Reduktion der Amyloid-ß-Oligomere bzw. Fibrillen führen und diese somit in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der Amyloid-ß-Oligomeren, daraus gebildeten Aggregaten oder Fibrillen.

Die Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von Amyloid-ß-Oligomeren, Amyloid-ß-Fibrillen und/oder Amyloid-ß-Aggregaten, bzw. die Enttoxifizierung der Amyloid-ß-Oligomeren, Amyloid-ß-Fibrillen und/oder Amyloid-Beta -Aggregaten kann dabei in vitro oder in vivo erfolgen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Behandlung der Alzheimer'schen Demenz (Morbus Alzheimer).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Sonde zur Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-ß-Fibrillen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten.

Alle vorstehenden aufgeführten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen der der erfindungsgemäßen Peptide gelten dabei analog für die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Sonde. Solche Sonden sind von großer Bedeutung, da damit eine frühe Diagnose der AD möglich wird. Mit der Frühdiagnose kann der Krankheit schon in einem sehr frühen Stadium entgegengewirkt werden.

Solche molekularen Sonden enthalten vorzugsweise das erfindungsgemäße Peptid und gegebenenfalls Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope, (PET etc.), Gadolinium (MRI), sowie alternative Stoffe geeignet für die Bildgebung der Sonden und können den Patienten z. B. intravenös injiziert werden. Nach Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an Amyloid-ß-Fibril len, Amyloid-ß- Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten bzw. Plaques binden. Die so markierten Amyloid-ß-Fibri llen, Amyloid-ß-Oligomeren und/oder Amyloid-ß-Aggregaten bzw. Plaques können mittels bildgebender Verfahren wie z.B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen-MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden.

Beschreibung der Figuren

Figur 1:

Einfluss der SaS-Peptide auf die Aß-induzierte Zelltoxizität.

Alle SaS-Peptide reduzieren die Aß-induzierte Zelltoxizität. Dieser Effekt ist, mit Ausnahme des SaS3-Peptides, signifikant bei Einsatz äquimolarer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.

(One-way ANOVA mit Bonferroni post hoc Analyse, * p < 0.05, *** p < 0.001.)

Figur 2:

Einfluss der SaS-Peptide auf die Aß-Fi bri llenbildung . Alle SaS-Peptide reduzieren die Aß-Fibrillenbildung bei Einsatz äquimolarer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.

Figur 3:

Die SaS-Peptide reduzieren signifikant toxische Aß(l-42)-Oligomere. Alle SaS- Peptide eliminieren signifikant toxische Aß-Oligomere und wandeln diese in höhermolekulare, nicht-amyloidogene Präzipitate bei Einsatz substöchiometrischer Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.

Die Erfindung wird nachfolgend in nicht beschränkenden Beispielen näher erläutert. Beispiele

Im Folgenden werden experimentelle Daten der erfindungsgemäßen SaS-Peptide dargestellt, die darlegen, dass diese eine Bindungsaffinität sowie ein Spezifität an Aß(l-42) (Tabelle 1) zeigen, die Aß-induzierte Zelltoxizität (Abbildung 1) und Aß- Fibrillenbildung inhibieren (Abbildung 2) und spezifisch Aß-Oligomere eliminieren (Abbildung 3).

Bindunqsstudien (SPR-Messunqen)

Durchführung:

Die Dissoziationskonstanten (KD) der Bindung der SaS-Peptide an Aß(l-42) wurden mittels SPR-Spektroskopie mit einem Biacore T200 Gerät bestimmt.

Dafür wurde Aß(l-42) auf einem Serie S CM-5 Sensorchip durch eine Aminkopplung immobilisiert.

Zunächst wurden die Durchflusszellen mit 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 16,1 mM N-Ethyl-NL(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) für 7 min aktiviert.

Aß(l-42) wurde in 10 mM Natriumacetat pH 5 zu einer Endkonzentration von 50 g/mL gelöst und über eine der aktivierten Durchflusszellen bis zu einem Endsignal von 1700 RU injiziert.

Nach der Immobilisierung wurden die Liganden- und Referenzdurchflusszellen durch Injektion von 1 M Ethanolamin pH 8,5 für 7 min gequencht.

Für die Bestimmung der KD wurden multizyklische kinetische Experimente durchgeführt mit 10 mM HEPES + 50 mM NaCI, pH 7,4 als Laufpuffer bei 25 C und einer Flussrate von 30 L/min durchgeführt.

Die Peptide wurden in dem Laufpuffer auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Alle Proben wurden für 180 s über die Durchflusszellen injiziert, gefolgt von einem Dissoziationsschritt von 600 s mit Laufpuffer. Die Regeneration des Sensorchips wurde durch eine 45 s lange Injektion von 2 M Guanidiniumhydrochlorid (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) erreicht.

Die Referenz-Durchflusszelle und Pufferinjektionen (c = 0 nM) wurden zur doppelten Referenzierung der Sensorgramme verwendet.

Zur Datenauswertung wurden die Sensorgramme mit dem in der Biacore T200 Evaluation Software 3.2 implementierten Steady-State-Affinitätsmodell gefittet.

Tabelle 1:

Zelltoxizitätsassav

Durchführung:

Der MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid)-basi erte Zellviabil itätsassay wurden durchgeführt, um die Zytotoxizität von Aß(l-42) in Gegenwart der SaS Pepdite auf PC-12 Zellen zu untersuchen.

PC-12-Zellen (DSMZ, Deutschland) wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, 1 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) und 5 % Pferdeserum auf mit Kollagen A beschichteten Gewebekulturflaschen kultiviert. Die Zellen wurden alle drei bis vier Tage, abhängig von der Konfluenz, passagiert.

Der MTT-Test wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt (CellProliferation Kit I; Roche, Schweiz).

PC-12-Zellen wurden in durchsichtigen, kollagenbeschichteten 96-Well-Flachboden- Mikrotiterplatten in einer Dichte von 1 x 104 Zellen in einem Volumen von 100 pl pro well ausgesät und für 24 h inkubiert.

Die Peptide wurden als Fünffachbestimmung in drei unabhängigen Experimenten untersucht. 51 pM Aß(l-42) wurde für 4,5 h bei 37 °C unter Schütteln bei 600 U/min inkubiert.

Danach wurde je 51 pM SaS-Peptid zugegeben und für weitere 40 min inkubiert. Während des gesamten Tests wurden die Zellen mit 1 pM Aß mit oder ohne 1 pM der SaS-Peptide inkubiert.

Es wurde das arithmetische Mittel aller Messungen pro Ansatz berechnet. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der MTT-Reduktion dargestellt, unter der Annahme, dass die Extinktion der Kontrollzellen 100 % betrug.

Die Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengefasst. ThT-Assav

Durchführung:

Um auf eine Störung der Fibrillenbildung zu testen, wurde ein Thioflavin-T-Test (ThT) durchgeführt.

Das Fluoreszenzsignal von ThT, einem Benzothiazol-Farbstoff, erhöht sich bei Bindung an Amyloidfibrillen. Unter Verwendung des ThT-Assays wurde die Wirksamkeit der SaS-Peptide zu Inhibierung der Fibrillenbildung von Aß(l-42) analysiert.

Dafür wurden äquimolare Konzentrationen Aß(l-42) und der SaS-Peptide mit 5 pM ThT inkubiert. Die ThT-Fluoreszenz wurde über 48 h bei ex = 440 nm und em = 490 nm in einem Platereader bei RT gemessen.

Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefasst.

QIAD-Assav

Durchführung:

Nach Brener et al., wurde ein QIAD-Assay durchgeführt, um die Aß(l-42) Eliminierungseffizienzen der SaS-Peptide zu untersuchen.

80 pM Aß(l-42) wurde für 2 h vorinkubiert, um Aß-Oligomere anzureichern. Anschließend wurden 20 pM des jeweiligen SaS-Petides zu der vorinkubierten Lösung gegeben und für weitere 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Dichtegradienten (5-50% (w/v) lodixanol) gegeben, gefolgt von einem Ultrazentrifugationsschritt (3 h bei 4 C und 259000 g).

Nach der Ultrazentrifugation wurden 14 Fraktionen (je 140 pl) (von oben nach unten) abpipettiert. Fraktion 15 enthält das gelöste Pellet in 6 M Guanidinhydrochloridlösung.

Die Fraktionen 1 bis 2 enthalten Aß-Monomere, die Fraktionen 4 bis 6 enthalten die Aß-Oligomere, die von besonderem Interesse sind, und die Fraktionen 11 bis 14 enthalten hochmolekulare (Co-)Präzipitate oder aggregiertes Aß(l-42).

Die Aß(l-42) Konzentrationen jeder Fraktion wurden mittels analytischer RP-HPLC und UV-Absorptionsdetektion bei 214 nm bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Figur 3 zusammengefasst.