【발명의 명칭】

물리적 및 생물학적 특성이 개선된 바이오 잉크 조성물

【기술분야】

본 출원은 2015년 7월 21일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0103313 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 물리적 및 생물학적 특성이 개선된 바이오 잉크 조성물에 관한 발 명으로， 보다 상세하게는 세포적합성을 가지며 프린팅이 용이한 높은 점성， 강한 전단 감소 (shear-thinning) 경향， 빠른 가교결합의 형성 및 프린팅 후 적절한 기계 적 특성을 나타내는 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

삼차원적인 세포 배양기술은 실험실 내 ( in v ro)에서 생체조직과 유사한 환경에서 세포 및 조직을 제조할 수 있는 기술로 발달하여 세포의 성장과 분화, 조 직 및 기관의 형성과 관련된 여러 연구 분야에 적용되어지고 있다. 이러한 조직 유 사기관은 실제 조직이나 장기를 대신하여 약물의 독성 및 약물 동력학 연구에서 유 용하게 사용되어 질 수 있으며, 이에 따라 인간 검체 및 기타 포유동물에의 직접적 인 실험 적용을 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 또한， 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학 (t i ssue engineer ing) 기법의 중요한 요소로 조직 및 장기의 공학적 설계에 기여하고 있다. 삼차원 바이오 프린팅 기술은 이러한 조직 유사기관 및 이식 가능한 구조체 를 정밀하게 제조하기 위한 유용한 장치가 되었다. 이러한 기술은 실제 인간의 조 직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체를 생성하는 것을 가능하게 하 고 있다. 하지만 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉， 바이오 잉크 (bio-ink)는 그 활용도에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다. 바이오 프린팅 에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되 고， 미세구경의 디스펜싱 노즐 (di spensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴 으로 프린팅이 될 수 있는 물리적 성질을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신 호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있어야 한다는 것 등이다. 비 록， 삼차원 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크 가 개발되어 현재 사용돠고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성， 프린팅 적합성， 기하학적 정밀성， 정밀도와 같은 물리적 및 생 물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다.

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】

이에， 본 발명은 특정한 함량의 세포 운반물질， 점성 증강제， 윤활제 및 구 조물질올 포함하는 바이오 잉크 조성물이 높은 점성， 강한 전단 감소 (shear- thinning) 경향, 빠른 가교결합 및 프린팅된 구조물을 유지하는 기계적 특성을 나 타내어 상기한 문제점들을 해결할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 또한， 이 바이오 잉크 조성물에 조직유래 세포외기질 성분이 첨가되어 조직특이성 을 가지거나 특정한 세포분화 조절물질이 첨가되어 특정조직으로의 분화를 유도할 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 세포 0.05-60 ⁶ /mL, 세포 운반물질 0.1-10 w/v%, 점 성 증강제 0.01-1 w o, 윤활제 1-30 v/v% 및 구조물질 0.1-10 /\^을 포함하는 바 이오 잉크 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린터에 층전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법올 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 조직 유사기관을 제공하는 것이다.

【과제의 해결 수단】 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 세포 0.05-60 ⁶ /mL, 세포 운반물질 0.1-10 w/v%, 점성 증강제 0.01-1 w/v%, 윤활제 1-30 v/v% 및 구조물질 0.1-10 /^을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린터에 층전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기 관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물올 가 교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 방법에 따라 제조 된 조직 유사기관을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 세포 0.05-60 ⁶ /mL, 세포 운반물질 0.1-10 w/vo, 점성 증강제 0.01-1 w/v%， 윤활제 1-30 v/v% 및 구조물질 0.1-10 /\^을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 세포는 바람직하게는， 줄기세포， 조골세포 (osteoblast), 근아세포 (myoblast), 건세포 (tenocyte)， 신경아세포 (neuroblast)， 섬유아세포 (fibroblast), 신경교아세포 (glioblast), 배세포 (germ cell), 간세포 (hepatocyte) , 신장세포 (renal cell), 지대세포 (Sertoli cell), 연골세포 (chondrocyte)， 상피세포 (epithelial cell), 심혈관세포， 각질세포 (keratinocyte)， 평활근세포 (smooth muscle cell), 심장근세포 (cardiomyocyte)， 신경교세포 (glial cell), 내피세포 (endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포， 췌장섬세포 (pancreatic islet cell) 및 신경세포 (neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으 나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조작된 조직에서 사용되는 세포 유형은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고， 예 를 들어 문헌 [Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures ;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고， 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기 술， 세포주， 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌 [Doyle, A., Griffiths, J. B. , Newell, D. G.， (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고， 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질 과 배양될 수도 있다. 예를 들면， 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨 으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상 기 줄기 세포는 비제한적 예로서 골원성 (osteogenic) 분화 배지， 연골원성 (chondrogenic) 분화 배지, 지방생성 (adipogenic) 분화 배지， 신경 분화 배지 , 심 근세포 분화 배지， 및 장세포 분화 배지 (예， 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉 하여 인큐베이션 될 수 있다. 추가적으로， 세포는 성장인자， 사이토카인 등과 배양될 수 있다. "성장인 자''는 세포에 의해 생성되고 그 자체 및 /또는 여러 가지의 다른 인접한 또는 동떨 어진 세포에게 영향을 줄 수 있는， 사이토카인을 포함하는 단백질， 폴리펩티드， 또 는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 통상， 성장인자는 발생적으로 또는 다수의 생화 학적인 또는 환경적인 자극에 반응하여 특정 유형의 세포의 성장 및 /또는 분화에 영향을 미친다. 전부는 아니지만 일부의 성장인자는 호르몬이다. 예시적 성장인자 는 인슐린， 인술린 유사 성장인자 (IGF), 신경 성장인자 (NGF), 혈관 내피 성장인자 (VEGF) , 케라티노사이트 성장인자 (KGF), 기본 FGF(bFGF)를 포함하는 섬유아세포 성 장인자 (FGF), PDGF-AA 및 PDGF-AB를 포함하는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), BMP-2 및 BMP-7등을 포함하는 뼈형성단백질 (BMP), 간세포 성장인자 (HGF), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-a), TGFP1 및 TGF|33을 포함하는 형질전환 성장인자 베타 (TGF-β )， 표피 성장인자 (EGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로 니-자극인자 (G-CSF), 인터류킨 -6(IL-6), IL-8 둥이 있다. 성장인자는， 다른 곳 중 에서도, [Molecular Cell Biology, Sc i ent i f i c Amer i canBooks , Darnel 1 et al . , eds., 1986； Principlengs of Tissue Engineering, 2d ed. , Lanza et al . , eds., Academic Press, 200이에서 논의된다. 당업자는 본원에 기술된 조건화 배지에 서의 임의의 배양물 및 모든 배양물 유래 성장 인자가 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해할 수 있다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 세포 운반물질은 0.01-30 w/v% ， 0.05-20 w/v% ， 0.1-10 w/v%, 0.5—10 w/v%, 1-10 w/v%, 1.5-10 w/v%, 2-10 w , 0.1-8 w/v%, 0.5-8 w/v%, 1-8 /v%, 2-8 ΦΛ' 0.1-6 w/v%, 0.5-6 w/v%, 1-6 wM, 2-6 w/v%, 0. 1-5 vi Mo , 0.5-5 w , 1-5 w/v% 또는 2—5 w/v 포함될 수 있으나, 이 에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 0.01-3 w/v%, ， 0.05-3 w/v%, 0. 1-3 w/v%, 0.01-2 w/v%, 0.05-2 w/v%, 0. 1-2 w/v%, 0.01-1 w/v%, 0.05-1 w/v%, 0. 1-1 w/v%, 0.01-0.8 w/v%, 0.05-0.8 w/v% 또는 0. 1-0.8 w/v¾ 포함 될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 0. 1-50 v/v%, 0.5-50 v/v%, 1-50 v/v%, 0. 1-40 v/v%, 0.5-40 v/v%, 1-40 v/v%, 0. 1-30 v/v%, 0.5-30 v/v , 1-30 vMo , 0. 1-20 v/v%, 0.5-20 v/v%, 1-20 v/v%, 0. 1-15 v/v%, 0.5-15 v/v%또는 1-15 v/v%포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 0. 1-30 w/v , 0.5-30 w/v%, 1-30 w/v , 0. 1-20 w/v%, 0.5-20 w/v%, 1-20 w/v%, 0. 1-10 w/v%, 0.5-10 w/v%, 1-10 wM, 0. 1-8 w/v%, 0.5-8 w/v%, 1-8 w/v%, 0. 1-5 wM, 0.5—5 w/v% 또 는 1-5 w/v 포함될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 발명자들은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용되기에 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타내는 바이오 잉크 조성물을 개발하기 위해 다양한 조합의 구성을 갖는 조성물의 물리적 및 생물학적 특성을 테스트하여 본 결과， 상기 조합 및 상기 함량의 구성성분의 조합으로 이루어진 바이오 잉크 조성물이 높은 점성， 강한 전단 감소 (shear-thiming) 경향， 빠른 가교결합 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내어 조직 유사기관의 제조를 위한 삼차원적 바이오 프린팅에 특히 적 합하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 세포 운반물질은 균일한 세포 현탁 액의 제조 및 우수한 프린팅 경향성을 나타내는데 적합한 것을 선택할 수 있으며， 이의 비제한적인 예시로는 젤라틴， 콜라겐， 알기네이트， 아가 (agar) , 아가로스， 플 루로닉 (pluroni c) 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 우수한 프린팅 경향 성 및 바이오 잉크의 초기 강성 (strength)을 유지하는데 적합한 것을 선택할 수 있 으며, 이의 비제한적인 예시로는 하알루론산 또는 덱스트란일 수 있다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 전단률 (shear rate)을 최 소화 할 수 있고， 분배 속도 (di spensing speed)를 개선할 수 있는 물질 중에서 선 택되는 것이 바람직하며， 이의 비제한적인 예시로는 글리세를을 들 수 있다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 빠른 가교결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있는 물질로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비 제한적인 예시로는 피브리노겐， 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 히알루론산 ( 예， 메타아크릴레이티드 히알루론산， 사이올레이티드 히알루론산， 등) , 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 젤라틴 (예， 젤라틴 메타아크릴레이티드, 사이을레이티드 젤라틴， 등)， 콜라겐， 알기네이트, 메틸 셀를로오스， 키토산, 키틴， 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이 상일 수 있다. 상기 젤라틴은 온도-민감성 특성을 나타내기 때문에 상기 세포 운반물질로 서 특히 적합하다. 즉， 젤라틴은 37 ^° C에서 액상화되며 상온 이하에서 고체화 되는 특성을 지니고 있다. 상기 피브리노겐은 겔의 안정성 측면에서 구조물질로서 적합 할 뿐만 아니라， 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경 을 조성한다는 점에서 바람직한 구조물질로 선택될 수 있다. 히알루론산과 글리세 롤은 각각 삼차원적 바이오 프린팅 적용시 분배 균일성 (di spens ing uni formi ty) 및 노즐의 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다. 구체적으로， 본 발명의 일실시예에 따르면, 바이오 잉크 조성물에 포함되는 젤라틴의 함량에 따라서 조성물의 di spens ing rate가 달라지는 것을 확인하였다. Di spensing rate가 낮아질수록 패턴의 분해능은 증가하는데， 젤라틴이 35 mg/mL 이 상이 될수록 패턴의 분해능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이와는 달리， 다양 한 농도의 히알루론산을 바이오 잉크 조성물에 포함하여 그 물성을 평가하여 본 결 과， 히알루론산은 조성물의 di spensing rate에는 영향을 미치지는 않지만， 패턴의 균일성을 현저하게 향상시켜주는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 3) .

즉， 본 발명의 바이오 잉크 조성물에 있어서 젤라틴은 패턴의 분해능 측면 에서， 히알루론산은 패턴의 균일성 측면에서 기여도가 높다는 것을 알 수 있다. 본 발명에서 세포는 삼차원적 바이오프린터로부터 바이오 잉크를 침착 또는 압출시킴으로써 바이오 프린팅된다. 본 발명의 바이오 잉크는 복수의 세포를 포함 하는 액체， 반고체， 또는 고체 조성물을 포함한다. 바이오 잉크는 액체 또는 반고 체 세포 용액, 세포 현탁액， 또는 세포 농축물을 포함한다. 상기 바이오 잉크 조성 물은 1) 복수의 세포 또는 세포 웅집체와 생체적합성 액체 또는 겔을 소정의 비을 에서 흔합하여 바이오잉크를 제조하는 단계， 및 2) 바이오 잉크를 치밀화하여 원하 는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오 잉크를 제조하는 단계에 의해 제조된다. 구체 적으로， 바이오 잉크의 치밀화는 원심분리， 접선류 여과 ( "TF ) , 또는 이의 조합에 의해 실현되며 바이오 잉크의 치밀화는 압출가능한 조성물을 제조하여 다세포 웅집 체 또는 다세포체를 형성한다. 상기 "압출가능한 "이란 노즐 (nozzle) 또는 오리피스 (예, 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어， 압력 하에서) 통과시킴으로써 성 형될 수 있는 것을 의미한다. 또한 바이오 잉크의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 바이오 잉크에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다. 본 발명은 또한， 상기 바이오 잉크 조성물은 조직유래 성분이 추가로 포함 된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 조직유래 성분은 연골, 신장, 심장， 간, 근육 등과 같은 동물의 특정조직이 탈세포화 되고 세포외기질을 주성분으로 하는 물질의 겔 (gel )화 된 것을 의미하며， 이는 바이오 잉크 조성물의 조직특이성을 강화하기 위하여 포함될 수 있다. 바이오 잉크 조성물에 포함된 세포가 삼차원 프린팅된 조직 유사기관 내에 서 정상적으로 성장， 분화하기 위해서는 신체 내 원 조직의 미세환경 (microenvi ronment )과 유사한 자연적인 환경을 조성할 필요가 있다. 인위적으로 생 성된 어떠한 조성물도 세포외기질 (extracel lular matr ix)과 같은 자연적인 조직유 래 성분이 갖고 있는 특성을 모두 재연하는 것이 사실상 불가능하며， 따라서 탈세 포화된 조직유래 성분을 바이오 잉크 조성물에 추가함으로써， 세포가 정상적으로 성장하고 분화할 수 있는 미세환경을 조성해 줄 수 있다. 탈세포화된 조직유래 성분은 인체 내에서 세포와의 상호작용을 통해 조성된 각각의 조직 특화된 구성성분 및 위상을 갖고 있기 때문에， 세포의 성장 및 분화에 유리한 환경을 제공하여 줄 수 있다. 따라서， 본 발명의 바이오 잉크 조성물에 조 직유래 성분을 추가함으로써， 세포가 정상적인 형태를 유지하며 그 기능을 원활히 보존할 수 있도록 할 수 있다. 본 발명에서의 상기 조직유래 성분을 얻을 수 있는 조직은 특별히 제한되지 않으며， 제조하고자 하는 조직 유사기관에 따라 선택하여 탈세포화한 후 겔 (gel )화 하여 사용할 수 았다. 조직을 탈세포화 하는 방법 및 겔 (gel )화 하는 방법은 당업 계에 공지되어 있으며， 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자가 용이하게 선택하여 실시할 수 있을 것이다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 근육조직 유래의 성분이 포함된 바이오 잉크 조성물을 이용하여 근육세포를 프린팅한 결과 조직유래성분이 포함되지 않은 조성 물과 비교하여 세포의 증식과 분화가 향상된 것을 확인할 수 있었다. 본 발명은 또한， 상기 바이오 잉크 조성물은 분화조절 물질이 추가로 포함 된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 분화조절 물질은 바이오 잉크 조성물에 포함된 줄기세포 (배아줄기세포, 유 도만능줄기세포， 성체줄기세포를 포함하는)가 특정 세포로 분화되는 것을 유도하기 위해 포함될 수 있으며， 이에 대한 비제한적인 예시로는 바이오 프린팅된 줄기세포 를 골세포로 분화 유도할 때 뼈형성단백질 -2(BMP-2)나 연골세포로 분화할 때 TGF- beta3 와 같은 성장인자， 골세포로 분화할 때 덱사메타손이나 근육세포로 분화할 때 5-아자시티딘 (5-azacyt idine) 과 같은 화학물질올 예로 할 수 있다. 이 외에도 추가적으로 사이토카인， 펩타이드 및 저분자 화학물질 등이 포함될 수 있다. 이와 같은 예에서 보듯이 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 줄기세포를 특정한 조직세포 로 분화할 수 있도록 유도할 수 있는 성장인자， 사이토카인， 펩타이드 및 저분자 화학물질 등을 함유하여 바이오프린팅 후에 제조된 줄기세포를 포함한 조직유사 구 조체를 특정조직으로 분화가 되도록 유도할 수 있는 기능성 바이오 잉크로 활용될 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 배양 배지를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포 함하는 개념이며, 세포 배양 배지의 비제한적인 예시로는 둘베코 인산 완층 식염 수, 얼 균형화 염, 행크 균형화 염， 티로드 염， 알시버 용액， 게이 균형화 염 용 액， 크랩 -헨젤라이트 변성 완층제, 크랩 -링거 중탄산 완층제, 퍽 식염수， 둘베코 변성 이글 배지， 둘베코 변성 이글 배지 /영양소 F-12 Ham, 영양소 흔합물 F- 10Ham(Ham' s F-10) , 배지 199, 이글 최소 필수 배지, RPMI— 1640 배지， 에임즈 배 지， BGJb 배지^^ -^샨 。^。^ ^^ ^)] )， 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배 지， 글라스코우 최소 필수 배지 (GMEM) , 이스코브 변성 둘베코 배지 ( IMDM) , L-15 배 지 (Leibovitz) , 맥코이 5A 변성 배지， NCTC 배지， 스윔 S-77 배지， 웨이마우스 배 지,월리엄 배지 E, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한， 상기 세포 배양 배지는 알부민， 셀레늄， 트랜스페린, 페투인， 슈가， 아미노산， 비 타민， 성장 인자， 사이토카인， 호르몬, 항생물질， 지질， 지질 담체， 시클로덱스트 린, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 바이오 잉크 조성물은 세포 접착을 촉진하는 물질 및 /또는 산 화방지제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 세포사 (예， 괴사, 세포사멸， 또는 자 율홉수작용)를 억제하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 세포사를 억제하는 물질의 비제한적 예로서， 소분자, 항체， 펩티드， 펩티바디 , 항 -TNF 물질， 인터류킨의 활성 을 억제하는 물질， 인터페론의 활성을 억제하는 물질, GCSF (과립구 콜로니—자극 인 자)의 활성을 억제하는 물질, 대식세포 염증성 단백질의 활성을 억제하는 물질, TGF-B (형질전환 성장 인자 B)의 활성을 억제하는 물질， MMP (매트릭스 메탈로프로티 나제)의 활성을 억제하는 물질, 카스페이스의 활성을 억제하는 물질， MAPK/JNK 신 호전달 캐스케이드의 활성을 억제하는 물질， Src 키나아제의 활성을 억제하는 물 질， JAK (야누스 키나아제)의 활성을 억제하는 물질， 또는 이의 조합으로부터 선택 될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 트롬빈 용액 또는 광학개시제 (photoinit iator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린터 에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 바이오 잉크 조성물은 다양한 조직 유사기관의 제조 에 용이하다. 바이오 프린팅 기술은 조직 유사기관을 제조하기 위한 유용한 도구로 서 당업계에서 발전되고 있다. 한편， 바이오 프린팅에 사용되기 위한 종래의 바이 오 잉크 조성물들은 액상 형태이기 때문에 층분한 물리적 강성을 갖기가 힘들거나， 또는 지나치게 물리적 강성이 강하여 프린팅 과정에서 세포의 생존이 층분히 보장 되지 않는다는 문제점이 있었다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용하여 조직 유사기관을 제조함에 있어서， 층분한 물리적 강성은 유지 하고 바이오 프린터에 의해 분사됨에 있어서 세포의 생존이 충분히 보장된다는 장 점이 있어 조직 유사기관의 제조에 굉장히 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타 낸다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 바이오 프 린터에 적용하여 바이오 프린팅을 한 후 일주일간 배양하여 본 결과， 세포의 생존 율이 80% 이상 유지되는 것을 확인하여 노즐에 의해 압출， 분사되는 과정에서 세포 의 사멸이 최소화 된다는 점 및 세포의 생존에 유리한 미세환경이 층분히 제공되고 있다는 점을 알 수 있었다.

또한， 본 발명의 바이오 잉크 조성물로 제조된 구조 조직체를 배양배지에서 21일간 배양한 후에도 그 형태 및 크기가 양호하게 유지되는 것을 확인하여 조직 유사기관 또는 조직 구조체를 제조하기에 적합한 물리적 강성을 보유하고 있다는 것을 확인하였다. 본 발명에서의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적인 구조체의 적층을 가능하게 한다. 층분한 양의 세포가 포함된 본 발명의 바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 적층됨으로써 조직 유사기관을 형성하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서의 "바이오 프린팅 "이란 자동화된， 컴퓨터 보조의， 삼차원 시제 품화 장치 (예， 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침 착 (예， 세포 용액， 세포 함유 겔， 세포 현탁액， 세포 농축물， 다세포 웅집체， 다세 포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 바이오 프린팅 방법은 연속 및 /또는 실질적으로 연속이다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁 (di spense t ip) (예 , 주사기， 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉 크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바 이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형， 정사각형， 직사각형， 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구 조를 갖는다. 추가 구체예에서， 바이오 프린탕된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포 함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린 팅된다 (예를 들면， 적층된다) . 구체적으로， 2 , 3 , 4, 5， 6， 7 , 8， 9， 10， 11， 12， 13 , 14， 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 된다. 바이오 프린팅된 기능 단위는 격자무늬 (tessel lated) 패턴으로 반복된다. " 격자무늬 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 층전하는 평면 도형이다. 연속 및 /또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 바이오 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 바이오 잉크의 요 소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 바이오 잉크의 대형 저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다. 바이오 프린트로부터 적당한 및 /또는 최적의 분사 거리는 재료 편팡화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 바이오 프린터 분사 팁은 약， 5， 10， 20， 50， 100 , 150， 200， 250 , 300 , 350 , 400， 450 , 500， 550， 600， 650， 700 , 750， 800， 850 , 900， 950 , 1000 이상 및 이 범위 내의 증분의 내경을 갖는다. 또한， 바이오프린터의 바이오 잉크 저장소는 약 .5， 1 , 2， 3 , 4, 5， 6， 7， 8， 9 , 10， 15 , 20， 25， 30 , 35， 40， 45 , 50， 55， 60， 65 , 70， 75， 80， 85 , 90， 95， 100 입방 센티 미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고 /하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장 소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고， 보다 높은 비율은 보다 낮은 핍프 속도를 필요로 한다. 다양한 종류의 조직 유사기관이 상기한 방법에 의해 생성될 수 있다. 바이 오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 조직 유사기관 의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다. 또한， 조직 유사기관을 제조하기 위해 사용되는 바이오 잉크에 포함되는 세포의 개수는 세포의 종류， 바이오 잉크 조성물 에 포함된 세포 영양성분의 함량 등에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조 성물에 포함되는 세포의 종류는 상기 방법에 따라 제조하고자 하는 조직 유사기관 의 종류에 따라 다양하게 변경이 가능하다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자라면， 삼차원 바이오 프린팅으로 통해 제조하고자 하는 조직 유사기 관의 종류에 따라 적절한 세포를 선택하여 이에 적용할 수 있을 것이다. 바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후 에는 이를 자외선에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성 물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 한편, 상기 자외선은 적층된 바이오 잉크 조성물의 표면에 직접적으로 노출시킬 수 있으며, 예를 들어 8-와트 (watt ) 자외선 발생기로부터 발생된 365 nm의 파장을 갖는 자외선의 적층된 바이오 잉크 조성물로부터 1~20 cm 거리에서 1초 내지는 1000초간 노출이 될 수 있고， 또 는 20초 내지 500초， 또는 40초 내지 240초간 노출될 수 있다. 이러한 자외선 노출 거리 및 시간은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면， 짧은 거리 및 강한 파장이라면 짧은 시간 동안의 노출로도 층분한 가교결합을 형성 할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 상기 가교결합을 촉진하기 위해서 광학개시제 (photoini t i ator)를 사용할 수 있으며， 이러한 광학개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물 질을 의미한다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는， 아세토페논, 벤조인 메 틸 에티르， 디에록시아세토페논， 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사아클로핵 실 페닐 케톤 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다. 가교결합을 위한 바람직한 자외선의 파장은 300 nm 내지 400 nra일 수 있으며 , 보다 바람직하게는 350 nm 내지 400 nm, 350 nm 내지 390 nm, 355 nra 내지 380 nm, 360 nm 내지 370 nm, 가장 바람직하게는 365 nm일 수 있다. 한편 본 발명의 방법은 (d) 상기 조직 유사기관을 배양액에서 배양하는 단 계를 추가로 포함할 수 있다. 배양 및 배양 배지에 대해서는 상기한 바와 같다. 본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 조직 유사기관 또는 체내 이식 가 능한 조직 구조체를 제공한다. 삼차원 바이오 프린팅 기술은 임상적으로 모양 및 크기 면에서 임상적으로 적용이 가능한 조직 또는 기관 구조물을 제작할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 해부학적으로 또는 기능적으로 적용 가능한 복잡한 조직 구조체를 생산할 수 있음을 시연하였다. 조직-특이적인 세포 종류 및 삼차원적 구조물에 적용된 바이오 잉크의 조합을 통하 여, 세포에 내재된 재생산 능력을 이용할 수 있고， 이를 통해 필요한 조직 또는 장 기를 생산해 내는 것이 가능할 수 있다. 삼차원적 바이오 프링팅된 조직 구조체에 서, 노즐의 크기는 세포가 포함된 바이오 잉크의 집적을 부피 및 위치 측면에서 미 세한 조작이 가능하도록 해준다 . 뿐만 아니라， 조직 유사기관의 기하학적 및 구성 적 구조를 조절할 수 있다. 따라， 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물을 이용하여 바이오 프린팅된 조직 구조체들은， 포유류 조직 및 기관과 해부학적으로 및 기능학 적으로 유사성을 지닌 구조체를 제공해준다. 본 발명의 조성물을 이용하면 조직 유사기관 또는 체내 이식 가능한 조직의 단일 구조체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 여러 가지 세포를 동시에 프린팅하여 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있는, 기능성이 현저히 향상된 조직 구조체를 제조할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 간 세포와 혈관세포를 이용하여 프린팅한 조직 구조체， 골 세포와 연골세포를 이용하여 프린팅한 조직 구조체, 근육세포와 힘줄세 포를 이용하여 프린팅한 조직 구조체 및 신경세포와 근육세포를 이용하여 프린팅한 조직 구조체를 제조함으로써 체내의 실제 조직 구조와 기능적으로 유사한 구조체를 재연하였다.

【발명의 효과】

본 발명의 바이오 잉크 조성물은 높은 점성, 강한 전단 감소 (shear- thinning) 경향, 빠른 가교결합의 형성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내 기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사기관의 제조에 매우 유용하 게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명의 바이오 잉크를 이용하여 삼차원적 하이드로겔 조직 구조체 를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도 2는 본 발명의 바이오 잉크로 제조된 구조체의 세포배양조건에서 21일간 배양 후 구조안정성을 평가한 결과이다 (A: 21일 배양 후 조직 구조체의 외관변화， B: 바이오 프린팅된 후 21일간 조직구조체의 크기 변화측정) . 도 3은 바이오잉크 조성물에 포함되는 점성 증강제의 함량에 따라， 바이오 프린팅된 구조체의 안정성에 어떤 변화가 나타내는지를 확인한 도면이다. 도 4는 바이오 잉크의 프린팅 성능， 분출율에 따른 해상도를 평가한 도면으 로, 본 발명의 바이오 잉크는 분출율이 증가함에 따라 패턴분해능이 향상되었고 사 용된 분출율하에서 균일성을 유지함을 확인한 도면이다 (feed rate : 분출율) . 도 5는 3T3 섬유아세포가 포함된 다양한 조성의 바이오 잉크를 삼차원적 프 란팅 한 후 7일간 세포의 생존여부를 형광 염색을 통해 평가한 결과이다 (Gel-MA 50： 50% 메타아크릴레이션 된 젤라틴을 의미함) . 도 6은 C2C12 myoblast 세포주 포함된 다양한 조성의 바이오 잉크를 삼차원 적 프린팅 한 후 7일간 세포의 생존여부를 형광 염색을 통해 평가한 결과이다 (Gel- MA: 젤라틴 메타아클릴레이트) . 도 7은 근육조직 유래의 성분이 포함된 바이오 잉크 조성물을 이용하여 근육 세포를 프린팅한 결과， 조작유래의 성분이 포함되지 않은 대조군과 비교하여 세포 의 증식과 분화가 더 향상된 것을 확인한 결과이다 (control : 조직유래성분 미처리 대조군， muscle ECM: 근육유래의 세포외 기질이 포함된 조성물군) . 도 8은 세포의 분화조절에 관여하는 성장인자를 모사한 펩타이드를 화학적 결합을 통해 바이오 잉크 조성물에 포함시키는 방법을 나타낸 모식도이다. 도 9는 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 제작된 조직 유사기관을 나타낸 사진이다 (A : 간조직 유사 기관， B : 심근조직 유사기관, C : 근육조직 유사기 관) . 도 10은 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 3차원적 바이오 프린팅된 조작된 조직 구조체를 제조한 결과이다 (A: 귀 조직 구조체， B : 코 조직 구조체, C : 혈관 유사 조직 구조체) . 도 11은 여러 가지 세포를 동시에 프린팅 함으로써 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있음을 확인한 결과이다 (A: 간 -혈관 세포 프린팅， B: 뼈 -연골 세포 프린 팅， C: 근육 -힘줄 세포 프린팅) 도 12는 본 발명의 조성물을 이용하여 신경세포와 근육세포를 동시에 프린팅 함으로써 기능성이 향상된 근육조직 구조체를 형성한 결과이다 (빨간색: 근육， 녹 색: 신경세포)

【발명올 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

세포배양

본 발명의 바이오 잉크 조성물을 평가하기 위해 다음과 같은 다양한 세포가 활용되었다. 3T3 섬유아세포주 (ATCC, Manassas VA, USA)는 10% 소태아혈청 (FBS, Life Technologies, Carsbad, CA, USA)와 1%쩨티실린 /스트렙토마이신이 함유된 고 포도당 DMEM배양액 (Life Technologies)으로 37도, 5% C0 ₂ 세포배양기에서 배양되었 다.

연골세포는토끼에 귀연골에서효소로 분리되어 10% FBS와 1%페티실린 /스트 렙토마이신이 함유된 DMEM/F-12 배양액 (Life Techologies)으로 37도， 5% C0 ₂ 세포배 양기에서 배양되었다.

C2C12 근육세포주 (ATCC)는 10% FBS와 1% 페티실린 /스트랩토마이신이 함유된 고포도당 DMEM 배양액으로 배양되었으며 근육섬유화되기 위해 DMEM/F-12 배양액과 1% 말혈청 (HS, Life Technologies)으로 추후 배양되었다. <실시예 2>

바이오 잉크 조성물의 제조

본 발명의 바이오 잉크 조성물은 세포가 균일하게 흔합된 형태로 프린팅이 수행될 수 있도록 층분한 점도를 가지며 온도에 민감한 젤라틴 (35 mg/mL , Sigma- Aldr i ch, St . Loui s , MO, USA) , 프린팅시 바이오 잉크의 점도를 강화하고 패턴의 균일성을 향상시킬 수 있는 히알루론산 (3 mg/mL , Sigma-Aldr ich) , 노즐 막힘 현상 을 줄여주기 위한 윤활제로 글리세롤 ( 10 v/v%, Sigma-Aldr i ch) 및 프린팅 후 가교 에 의해 구조 안정성을 제공하는 화학적으로 변형된 젤라틴 (20 mg/mL methacrylated gelat in)이다. 각 조성물은 37 ^° C에서 하루 동안 교반되어 균일하게 흔합되었다. 완전히 흔합되어 용해된 바이오 잉크 조성물을 0.45 urn 주사형 필터를 이용하여 멸균하였다.

<실시예 3>

바이오 잉크 조성물의 분배율 ( di spensing rate)과 구조 안정성 평가

본 발명의 바이오 잉크의 프린팅시 패턴의 균일성과 프린트된 구조체의 안정 성을 평가하였다. 이는 본 발명의 바이오 잉크의 우수성을 나타내는 지표가 된다. 평가를 위해 본 발명의 바이오 잉크가 바이오 프린터에 층전되었으며 50-80 kPa의 압력으로 300 um 구경의 노즐을 통해 프린트 되었다. 본 실험에 사용된 바이오 프 린터는 삼축으로 움직이는 스테이지， 공기압으로 사출이 가능한 디스펜싱 모들 및 바이오 잉크를 층전하는 주사형 저장소와 노즐로 구성되어 있다.

젤라틴 또는 히알루론산의 농도에 따른 Di spensing rate 변화를 평가하기 위 해， 젤라틴 또는 히알루론산을 제외한 나머지 구성성분들의 함량은 상기 <실시예 2>와 동일하게 유지하고 젤라틴 또는 히알루론산의 함량을 변화 시켜가며， 시간에 따른 프린팅된 바이오 잉크의 부피를 측정하였다. 측정된 값을 이용하여 coeff i cient of var iat ion(COV) 값올 계산하여 농도에 따른 프린팅의 성능을 평가 하고 이를 토대로 최적함량을 결정했다. 이에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 【표 1】

상기 표 1에 나타낸 바와 같이， 젤라틴 농도에 따라 dispensing rate이 달라 지는 것을 알 수 있었다. Dispensing rate은 프린팅되는 바이오 잉크의 부피를 시 간당으로 표시한 것이다. Dispensing rate가 낮아질수록 패턴의 분해능은 증가한다 고 할 수 있다.

젤라틴의 경우 35 mg/mL이상에서 패턴의 분해능이 급격히 증가했다. Coeff icient of variat ion (COV)는 프린팅된 패턴의 균일성 (uni formi ty)을 나타내 는 지수이다. 이 지수의 값이 클수록 di spensing rate이 블균등하다고 할 수 있다. 결과적으로 젤라틴은 35 mg/mL 이상에서 패턴의 분해능은 향상되지만 균일성에는 변화가 없었다.

이와는 다르게， 히알루론산을 젤라틴 하이드로겔에 첨가하였을 때 dispensing rate의 변화는 크지 않았다 (HA: 히알루론산) . 하지만 낮은 C0V 수치에 서 보여주는 것과 같이 프린팅된 패턴의 균일성이 현저하게 향상 시켜줌을 보여주 었다. 즉， HA의 함유는 패턴의 분해능에는 기여도가 낮지만 패턴의 균일성에 큰 영 향을 주고 있다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 바이오 잉크 조성물에서의 젤라틴과 HA의 함유는 필수적이 라고 할 수 있다. 또한， 본 발명의 바이오 잉크의 구조 안정성을 평가하기 위해， 본 발명의 바 이오 잉크를 이용하여 격자모양의 구조체를 삼차원적으로 프린팅하였다. 바이오 프 린팅된 구조체는 UV에 1 - 1000 초간 노출되어 가교되었다. 이를 세포 배양액에 담 가서 37 ^° C 인큐베이션 한 후 시간에 따라 크기의 변화를 측정하였다. 이에 대한 평 가를 21일간수행하였다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 바이오 프린팅된 구조체가 21일간 배양된 이후에, 초기 (Day 0) 크기의 약 70% 정도의 크기를 유지해 그 구조 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다. 그 다음으로, 바이오잉크 조성물에 포함되는 점성 증강제의 함량에 따라， 바 이오 프린팅된 구조체의 안정성에 어떤 변화가 나타내는지 확인하고자 하였다. 상 기 실시예 2와 동일한 방법으로 바이오 잉크 조성물을 제조하되， 점성 증가제인 히 알루론산의 농도만 0， 1 , 2 및 3 mg/ml로 변화시켜가며 구조 안정성을 평가하였다. 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 바이오 프린팅된 구조체의 안정성은 히알루론산의 함량이 증가함에 따라 높아지는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4>

바이오 잉크 조성물의 성능평가: 분출율과 패턴분해능

본 발명의 바이오 잉크의 프린팅의 성능， 분출율에 따른 해상도를 평가하기 위해 본 발명의 바이오 잉크를 100 - 700 mm/min의 분출율의 조정하에 200 urn 구경 의 노즐을 통해 프린트 하였다. 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 바이오 잉크는 분출율이 증가함에 따라 패턴분해능이 향상되었고 사용된 분출율하에서 균일성을 유지하였다.

<실시예 5>

바이오 잉크 조성물 내 세포 생존율 평가

본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물의 세포 적합성을 평가하기 위해, 본 발 명의 바이오 잉크를 3T3 섬유아세포주와 흔합하여 바이오 프린터에 층전하였으며 50-80 kPa의 압력으로 300 urn 구경의 노즐올 통과하며 패턴을 형성하며 삼차원적 구조체를 완성했다. 바이오 프린트된 세포가 포함된 삼차원 구조체는 Live/Dead assay ki t (Li fe Technologies)를 사용하여 세포의 생존율을 평가하였다. 본 실험에 사용된 바이오 잉크 조성물은 상기 실시예 2의 방법에 따라 제조하였으며， 젤라틴 메타아크릴레이트에서 젤라틴의 분자량 및 가교정도 (20， 50 및 80%)를 변화시켜 바 이오 잉크의 물리적 강도에 변화를 주었다.

0.5 uL/ml Calcein-AM과 2 uL/mL Eth-D가 용해되어 있는 인산완층액 (PBS, Li fe Technologies)를 세포와 함께 프린트된 바이오 잉크 구조체에 노출시켰다. 2 시간 뒤에 형광현미경으로 관찰하여 녹색 형광 (calcein)을 띄는 세포， 즉 살아있는 세포를 확인하였다. 세포생존율이 80% 이상의 조건에서 바이오 잉크의 최적화를 결 정하였다. 이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 Gel-MA 50은 50% 메타아크릴 레이션 된 젤라틴을 의미한다.

도 5에 나타낸 바와 같이， 바이오 프린트된 삼차원 구조체 내의 대부분의 세 포에서 녹색 형광이 관찰되었으며， 이는 살아있는 세포를 나타낸다. 이를 정량화했 을 때， 실험에 사용된 모든 조성물 조건에서 세포 생존율이 90% 이상 (그래프 참 조)으로 나타났다. 즉， 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 프린팅시 발생하는 높은 전단 압력에서 세포의 손상을 최소화 해주고 있다는 것을 알 수 있었다. 상기 실험과 동일한 조성의 바이오 잉크에서, Gel-MA 50의 농도만 변화시키 고 - 50% 메타아크릴레이션된 젤라틴을 두 가지 농도 20 mg/ml과 30 mg/ml로 실험 에 사용함- C2C12 myoblast 세포주를 포함시켜 프린팅 하였다. 프린팅 조건은 분출 율 120 mm/min 이었으며， 노즐크기는 300 μ Tef lon nozzle을 사용하였다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내았다.

도 6에 나타낸 바와 같이， 모든 조성에서 바이오 프린트된 삼차원 구조체 내 의 대부분의 세포가 녹색 형광을 나타내었으며， 이는 살아있는 세포를 나타내는 것 이다. 보통 젤의 강도를 높이기 위해 젤라틴의 농도를 높여주는데 이렇게 되면 젤 내의 di ffusion rate가 감소되어 세포의 생존률이 감소될 수 있다. 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물의 경우 Gel-MA 50이 30 mg/ml 농도에서도 세포생존률에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

<실시예 6>

조직유래 성분이 포함된 바이오 잉크 조성물의 세포 증식 및 분화능 평가 인위적으로 생성된 어떠한 조성물도 세포외기질 (extracel lular matrix)과 같은 자연적인 조직유래 성분이 갖고 있는 특성을 모두 재연하는 것이 사실상 불가 능하며, 따라서 탈세포화된 조직유래 성분을 바이오 잉크 조성물에 추가함으로써， 바이오 프린팅된 구조체 내에서 세포가 정상적으로 성장하고 분화할 수 있는지 여 부를 확인하고자 하였다. 사용된 조성물은 앞서 실험된 바이오 잉크 조성물 (20 mg/ml Gel -MA 50 (bloom 300)， 30 mg/ml 젤라틴 (bloom 90-100) , 3 mg/ml HA, 10% 글리세를입니다.

)에 근육조직유래 성분을 12% 함유시켰다 (세포: C2C12 myoblast cel l l ine ( lxlO ⁶ cel ls/ml ) , 분출율: 120 瞧 /min, 노즐크기: 300 μ Tef lon nozzle. ) . 상기 근육조직 유래 성분은 돼지의 근육조직을 탈세포화 한 후 남은 세포외 기질 단백질을 약산성 과 펩신으로 용해하여 분리한 것이다. 이를 중성화 시킨 후에 바이오잉크 구성물에 함유시켜 사용하였다. 근육조직유래 성분의 주성분으로는 콜라겐， 글리코사미노글 리칸, 성장인자 및 사이토카인이다. 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이， 근육조직 유래의 성분이 포함된 바이오 잉크 조 성물을 이용하여 근육세포를 프린팅한 결과， 조직유래의 성분이 포함되지 않은 대 조군과 비교하여 세포의 증식과 분화가 더 향상된 것올 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

분화조절물질이 포함된 바이오 잉크 조성물의 제조

본 발명자는 바이오 잉크 조성물에 포함된 줄기세포 (배아줄기세포， 유도만 능줄기세포， 성체줄기세포를 포함하는)가 특정 세포로 분화되는 것을 유도하기 위 해 분화조절물질이 포함된 바이오 잉크 조성물을 제조하였다. 구체적으로， 본 실시예에서는 바이오 프린팅된 줄기세포를 골세포로 분화 유도할 때 사용하는 뼈형성단백질 -2(BMP-2, 서열번호 1)， 연골세포로 분화 유도할 때 사용하는 TGF-beta3와 같은 성장인자 (서열번호 2， 서열번호 3) 또는 혈관내피세 포로 분화 유도할 때 사용하는 혈관내피세포 성장인자 (서열번호 4)를 모사한 펩타 이드를 화학적 결합을 통해 바이오 잉크 조성물에 포함시켰다.

서열번호 1 : KIPKASSVPTELSAISTLYL

서열번호 2: ANVAENA 서열번호 3 : LIANAK

서열번호 4: KLTWQELYQLKYKGI 분화조절에 관여하는 성장인자가 포함된 바이오 잉크 조성물의 제조방법 모 식도를 도 8에 나타내었다.

<실시예 8>

바이오 잉크 조성물을 이용한 조직 유사기관 및 이식 가능한 조직 구조체의 제조

본 발명의 바이오 잉크를 이용하여 여러 가지 조직 유사기관 및 이식 가능한 조직 구조체를 제조하였다. 이를 위해 특정 조직의 특성이 되는 구조를 획득하기 위해 조직학적 염색 이미지나 바이오 이미지 (CT 나 MRI 같은 바이오 이미징 기술로 획득된)를 삼차원적 CAD 모델로 전환하고 이를 다시 프린팅이 가능한 모션 파일로 전환하였다. 전환된 모션 파일은 바이오 프린터에 연동되어 특정 구조체로 프린팅 작업을수행하였다. 이에 대한 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이 , 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 이용하여 간 조 직 (도 9A) , 심근 조직 (도 9B) 및 근육 조직 (도 9C) 유사기관이 양호하게 형성되는 것을 확인하여， 조직의 기능성과 연관되는 정교한 방향성을 가지는 내부구조를 프 린팅할 수 있다는 것을 확인하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이， 3차원적 바이오 프린팅된 조작된 귀 (도 10A) , 코 (도 10B) 및 관모양 조직 (도 10C) 구조체 또한 양호하게 제조할 수 있어， 본 발명 에서 개발된 바이오 잉크 조성물을 이용하여 이식이 가능한 여러 가지 조직과 장기 를 프린팅할 수 있음을 확인하였다.

도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 조성물을 이용하여 여러 가 지 세포를 동시에 프린팅 함으로써 조직과 조직간의 연계작용 또한 재연할 수 있음 을 확인하였다. 즉, 도 11A에서는 간 세포와 혈관세포의 연계작용， 도 11B에서는 뼈 세포와 연골세포의 연계작용, 도 11C에서는 근육세포와 힘줄세포의 연계작용 및 도 12에서는 신경세포와 근육세포의 연계작용을 확인함으로써， 본 발명의 조성물을 이용하여 기능성이 향상된 조직 구조체를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.