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Title:
BIO-MARKER FOR MONITORING ANTIBODY-MEDIATED REJECTION IN ABO BLOOD TYPE-INCOMPATIBLE TRANSPLANTATION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/107673
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided are a bio-marker for monitoring antibody-mediated rejection in ABO blood type-incompatible transplantation, and a method for monitoring antibody-mediated rejection in ABO blood type-incompatible transplantation by means of the bio-marker.

Inventors:
YANG, Jaeseok (#37-604, 10 Sinbanpo-ro 19-gil,Seocho-gu, Seoul, 06505, KR)
JEON, Hee Jung (A-903, 401 Mokdongseo-ro,Yangcheon-gu, Seoul, 08092, KR)
LEE, Jae-Ghi (#503, 24 Suyu-ro 17-gil,Gangbuk-gu, Seoul, 01080, KR)
JANG, Joon Young (#201, 99 Jayang-ro 26-gil,Gwangjin-gu, Seoul, 05041, KR)
Application Number:
KR2018/002720
Publication Date:
June 06, 2019
Filing Date:
March 07, 2018
Export Citation:
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Assignee:
SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL (101 Daehak-ro, Jongno-gu, Seoul, 03080, KR)
International Classes:
C12Q1/6883; G01N33/68
Foreign References:
US20170191128A12017-07-06
EP2194145A12010-06-09
US20060246485A12006-11-02
US20130143755A12013-06-06
EP2603604B12017-07-19
Other References:
KOO, TAI YEONET ET AL.: "Current Progress in ABO-incompatible Kidney Transplantation", KIDNEY RESEARCH AND CLINICAL PRACTICE, vol. 34, 2015, pages 170 - 179, XP055528363, DOI: doi:10.1016/j.krcp.2015.08.005
Attorney, Agent or Firm:
YOU ME PATENT AND LAW FIRM (115 Teheran-ro, Gangnam-gu, Seoul, 06134, KR)
Download PDF:
Claims:
2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

【특허청구범위】

【청구항 1】

때 , CFD, 1 ¾38, 0014, 0^, 犯사3, 期 孔, 0069, 011¾6, 96, / , 11£¾06 ■¾, 쇼0¾1, 此01, 1 1¾1 2/\, 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는, 쇼明 혈액형 부적합이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물.

【청구항 2]

제 1항에 있어서, 別 1( , 1???3 , (:抑, [ ¾38 , 0)14 , (:½쇼 , 1½¾38 , 的 3, ⑶ 孔, 0069, 01116, 및 96로 이루어진 군에서 선택된

1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를포함하고, 혈액 시료에사용하기 위한것인,조성물.

【청구항 3】

제 1항에 있어서,

3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검줄 가능한 제제를 포함하고, 조직 시료에 사용하기 위한것인,조성물.

【청구항 4]

저 11항내지 제 3항중어느한항에 있어서 ,상기 검출가능한제제는 상기 유전자 또는 단백질에 결합하는 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.

【청구항 5】

쇼的 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적

상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준을측정하는단계를포함하는, 상기 새0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상에서의 항체-매개성 거부반응 모니터링 방법.

【청구항 6】

제 5항에 있어서,

쇼«) 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

시료가혈액 시료이고,

상기 혈액 。!), 1¾3民 0014,

FFAR2, 的 3, 0及7쇼2ᄂ 0예9, 附16, 및 96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는단계를포함하는,

방법.

【청구항 7】

제 6항에 있어서,

상기 쇼표0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 측정된 유전자 또는 단백질 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자또는단백질의 발현수준과비교하는단계를추가로포함하고,

방법.

【청구항 8】

제 7항에 있어서, 상기 비교하는 단계 이후에, 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:

새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여, 상기 쇼 혈액형

경우, 또는 的 3 , 0¾7쇼2ᄂ 0069 , 0附16 및 96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 대상이 쇼制 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을

2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

높은경우, 상기 대상이 요80혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을 나타내는것으로확인하는단계.

【청구항 9】

제 5항에 있어서,

쇼潮 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가혈액 시료이고,

상기 혈액 시료에서 0«7쇼2ᄂ 0069 , )14, 。 !), 및 的 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자수준을 정량적 ᄄ묘로 측정하는 단계를포함하고,

하기의 식 1을계산하는단계를추가로포함하는, 방법 :

식 1 = -104.2 - 140 , 4* [0¾7쇼2니 - 184.3* [0069] + 772.5* [0014] - 1056.9*比 1)] + 518.5아下이산3] .

【청구항 10】

제 9항에 있어서 , 상기 계산하는 단계 이후에, 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:

상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 큰 경우, 상기 대상이 쇼 혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계; 또는 상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다작은 경우, 상기 대상이 쇼¾) 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는것으로확인하는단계. 【청구항 11】

제 5항에 있어서,

쇼묘0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가조직 시료이고,

乂기 조직 시료에서 , ¾^1106/\, ¾11£4, TNFRSF12A 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가암호화하는단백질의 발현수준을측정하는단계를포함하는,

방법.

【청구항 12】

제 11항에 있어서,

상기 쇼요0 .혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서 측정된 유전자 또는 단백질 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자또는단백질의 발현수준과비교하는단계를추가로포함하고, 상기 비교대상 시료는 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

또는적응을나타내는것이 확인된개체로부터 분리된조직 시료인,

방법.

【청구항 13】

제 12항에 있어서, 상기 비교하는단계 이후에, 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:

쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여, 상기 쇼明 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서, 1四 106 ^0X1, 및 쇼0)1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우,

3100쇼8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 대상이 쇼요0 혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계; 또는

쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여, 상기 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서, / , 11묘¾1106 10X1, 및 01로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 또는 요온 쇼 및 310 8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 대상이 새0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는것으로확인하는단계.

【청구항 14】

제 5항에 있어서,

혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가조직 시료이고,

상기 조직 시료에서 ■¾, 此01, 00쇼8, 1¾¾射06 및 쇼0¾1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자수준을정량적 ᄄ요로 측정하는단계를포함하고,

하기의 식 2을계산하는단계를추가로포함하는, 방법 :

식 2 = -3.2 - 15.8* [¾« ] + 4.0* 況4] + 23. 1* [쇼0)1] +

11 .0* [3100쇼8] + 20.0* 묘附06/\] - 50.6* [/\⑴) (1] .

【청구항 15】

제 14항에 있어서 , 상기 계산하는단계 이후에 , .다음의 단계를추가로 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

포함하는,방법:

상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 큰 경우, 상기 대상이 혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계;또는 상기 식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다작은경우,상기 대상이 새0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는것으로확인하는단계.

【청구항 16】

제 8항, 제 10항, 제 13항, 및 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확인하는단계 이후에,다음의 단계를추가로포함하는,방법:

(3) 상기 대상이 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로확인된 경우, 상기 쇼敗혈액형 부적합이식에 대하여 거부 반응을치료하거나진행중인면역억제 치료를강화하는단계,또는

0)상기 대상이 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을나타내는 것으로 확인된 경우, 면역억제제 투여량 또는 투여 횟수를 유지 또는 감소시키거나면역악제제투여를종료하는단계:

【청구항 17】

01), 1 ¾3民 0)14, 0^, 1 ¾38, FFAR2, 的자3, 16, 96, ¾從·, 1¾··, 1X4, 此 , 此01, 0쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가암호화하는단백질을포함하는바이오마커,또는

상기 바이오마커의 검출가능한제제

의,새0혈액형 부적합이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링에 사용하기 위한용도.

【청구항 18】

제 17항에 있어서 ,상기 바이오 1¾38, 0)14, 0^, 的 3,⑶7쇼2匕, 0069, 0«16, 및 196로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고,혈액 시료에사용하기 위한것인,용도.

【청구항 19]

제 17항에 있어서 , 상기 바이오마커는 11표¾1106/\, ^04, 쇼⑶차, 01, 요的요쇼 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 조직 시료에 사용하기 위한 것인,용도.

【청구항 20】 2019/107673 1»(:1/10公018/002720

제 17항에 있어서, 상기 검출 가능한 제제는 상기 유전자 또는 단백질에 결합하는 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 화학물질로이루어진군에서 선택된 1종이상인, 용도.

Description:
【명세세

【발명의 .명칭】

AB0 혈액형 부적합 이식시의 항체-매개성 거부반응의 모니터링을 위한바이오마커

【기술분야】

AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개성 거부반응을 모니터링하기 위한 바이오마커 , 및 . 이를 이용한 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체- 매개성 거부반응모니터링 방법을제공한다.

【배경기술】

신장 이식 (Kidney transpl antat ion; KT)이 필요한 말기 신장 질환 환자의 수가 급속히 증가하고 있지만, 기증 장기가 부족한 실정이다. 이러한 신장 이식의 문제를 해결하기 위한 방안의 하나로 AB0 혈액형 부적합신장 이식 (ABO incompat ible (ABOi ) KT)이 제안되고 있으며, 이를 통하여 신장이식률이 약 20%정도증가된것으로알려져 있다.

최근, 보다 강력한 면역억제제와 탈감작 방법이 개발됨에 따라서, ABOi KT사례가 증가되고 이식 결과도 개선되고 있다. 공여자 (기증자)의 혈액형에 대한 항- AB0 항체의 존재가 성공적인 ABOi KT의 주요한 면역 장벽이 되고 있다. 미리 형성된 항- AB0 항체를 제거하고 새로운 항- AB0 항체의 추가 형성을 억제하기 위하여, 항-抑 20 단일 클론 항체 및 pl asmapheres i s를 이용한 이식 전 탈감작 (Pre-transpl antat ion desens i t i zat i on)이 시행되고 있다. 이러한 탈감작 요법에 의하여 초급성 거부 반응 (hyperacute rej ect ion)과 급성 항체-매개성 거부반응 (acute ant ibody-medi ated rej ect ion; acute AMR)의 발생을 예방할 수 있다. 그러나, 항- AB0 항체는 적절한 면역억제에도 불구하고 ABOi KT 이후 재생산되고 지속된다. 신장을 이식 받은 환자의 혈청에 항- AB0 항체가 계속존재하고공여자신장에 표적 항원이 존재하더라도, 이식 후 4주 이상 경과되면, 항- AB0 항체 매개성 조직 손상이 일어나지 않고 이식 장기가 기능을잘발휘할수 있는데, 이러한현상을 적응 (accommodat ion)이라한다. 항- AB0 항체와 신장이식편 사이의 적응 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀진 바없다.

현재, ABOi KT 이후의 급성 AMR 또는 이식 적응의 진단은 신장 동종이식 생검 (kidney al lograft biopsy)에 의존하고 있다. 그러나 신장 생검은 침습적인 과정이며 때로는 부작용을 일으킨다. 이러한 문제를 해소하기 위하여, ABOi KT시에 비침습적인 과정으로 이식 적응과 급성 AMR를구분하는기술의 개발이 요구된다.

【발명의 내용】

【해결하고자하는과제】

일 예는 AB0 혈액형 부적합 이식(ABO blood-type incompat i ble transpl antat ion)에서의 거부 반응을 모니터링(진단)하기 위한 바이오마커 및 상기 바이오마커를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개성 거부반응을모니터링하기 위한조성물을제공한다.

y]·이오 커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는것일수있다.

일구체 예에서 , 상기 바이오마커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상(예컨대, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD및 F0XJ3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상)의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 ■ , TPPP3, C抑, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상)는 (이식 받은 환자로부터 분리된) 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.

다른 예는 KHK, TPPP3, C抑, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물을제공한다.

일 구체 예에서, 상기 모니터링용조성물은 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 로 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 0供7쇼2ᄂ 0069 , 0)14, 및 的¾3으로이루어진군으로부터 선택된 1종이상)의 유전자(예컨대,미 , 00 등) 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 (이식 받은 환자로부터 분리된) 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.

다른예는

상기 유전자가암호화하는단백질을포함하는바이오 마커,또는

상기 바이오마커의 검출가능한제제

의, 쇼80혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개 거부반응 모니터링에 사용하기 위한용도를제공한다.

일 실시 예에 따른 용도에 있어서 , 상기 바이오마커는

0?0, ! , 0014, (: , 1 8, FFAR2, «)X13, 0供7쇼2ᄂ 0069, 및 96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 혈액 시료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 다른 실시 예에 따른 용도에 있어서, 상기 바이오마커는 能, 1표¾1106/\, «4, 쇼⑶如, 요0)1, 3 0쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 조직 시료에 사용하기 위한것일수있다.

다른예에서, 상기 바이오

8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다.상기 바이오마커 (¾¾ , 1£¾!106/\, ¾11£4, 쇼(:0)(1, 쇼0)1,

3100요8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)는조직 시료 (예컨대, 이식 장기 또는조직으로부터 분리된조직)에사용하기 위한것일수있다.

다른 예는, 요묘0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 (분리된) 생물학적 시료에서 볘1(, (:抑, 1¾3氏 0014, 0^, 炯!^, ?새2, ⑴ 7쇼2ᄂ 0069, 0^16, 1方96,

■£4, 1仰!« 2/\, 및와0 8로 아루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 . (예컨대, 및/또는상기 유전자가암호화하는 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 쇼期 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링하는 방법을 제공한다 . 상기 생물학적 시료는상기 대상으로부터 얻은 (분리된) 말초 혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료, 상기 대상의 이식된 장기 또는 조직으로부터 얻은 (분리된)조직을포함하는조직 시료, 또는이들모두일수있다.

일 예에서, 생물학적 시료가 혈액 시료일 경우, 쇼표0 혈액형 부적합 이식의 항체-매개성 이식 거부반응을 모니터링하는 방법은 다음의 단계를 포함할수있다:

쇼 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료

96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 즉정하는 단계; 및

상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기

단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3, ⑴X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를나타내는것으로확인 (또는판단또는결정)할 수있다.

다른예에서, 생물학적 시료가혈액 시료인 경우, AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:

AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 C0X7A2L, CD69, CD 14, CFD, 및 FoxJ3으로 이루어진군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및

하기의 식 1을계산하는단계:

식 1 = -104.2 - 140.4 * [ C0X7A2L] - 184.3 * [ CD69] + 772.5 * [ CD14] - 1056.9 * [ CFD] + 518.5 * [ FoxJ3]

(상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로, 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR (예컨대, quantitative real-time PCR)을통하여 얻어진유전자수준일수있다). 상기 수학식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는 결정)할 수 있으며, 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로 확인 (또는판단 또는결정)할수있다.

일 예에서, 생물학적 시료가조직 시료인 경우, AB0 혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:

AB0 혈액형 부적합 이식 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료 (조직 시료; 이하 "시험 시료 (시험 조직 시료)")에서 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현수준을측정하는단계 ;

상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 발현 수준과비교하는단계 . 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

상기 비교대상시료는새0혈액형 부적합이식을받은개체로서 거부 반응 또는 적응을 나타내는 개체로부터 얻은 (분리된) 조직 (예컨대, 이식 받은조직)을포함하는것일수있다.

상기 방법에서,

(1) 쇼¾) 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 리 !!)을 나타내는 비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 , 1표11106/\, ^0X1, 및쇼0)1로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대,

등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나, 및/또는시험 시료에서 0(½8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없가나 낮은 수준(수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)하거나, 및/또는

(2) 쇼130 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응( : 0)_ 0<1 )]!)을 나타내는 비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 11표¾1106/\, 0X1, 및此01로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대,

등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 州요 요쇼 및 0(½8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를 나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는결정)할수있다.

다른예에서,생물학적 시료가조직 시료인 경우,새0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다: 쇼汉) 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 및 10X1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 이 /\, 신) 등) 및/또는 상기 유전자가암호화하는단백질 발현수준을즉정하는단계 ;및

하기의 식 2를계산하는단계:

식 2 = -3.2 - 15.8*[¾«}·] + 4.0* 1£4] + 23.1*[/\⑶ 1] +

11.0*[5100새] + 20.0*肝 £射06/\] - 50.6*[/\〔:0사]

(상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR (예컨대, quantitative real-time PCR)을통하여 얻어진유전자수준일수있다). 상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은수준 (수용가능한수준)임)을나타내는 것으로 확인 (또는판단또는 결정)할 수 있으며 0.5보다 적은 경우 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 (또는판단 또는결정)할수있다.

상기 대상은인간등의 포유동물에서 선택된개체일수있다.

본 명세서에 기재된 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법, 상기 비교하는 단계, 계산하는 단계, 및/또는 확인 (또는 판단또는 결정)하는 단계 이후에, 다음의 단계를추가로포함할수 있다:

(a) 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)된 경우, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 치료하거나 진행중인 면역 억제 치료를 강화(면역억제제투여량증가, 투여 횟수증가등)하는단계, 및/또는

(b) 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부 반응이 없거나 낮은 수준 (수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는 결정)된 경우, 면역억제제 투여량또는투여 횟수를유지 또는감소시키거나면역억제제 투여를종료하는단계 .

【과제의 해결수단】

일 예는 AB0 혈액형 부적합 이식(ABO blood-type incompatible transplantation)에서의 거부 반응을 모니터링(진단)하기 위한 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용하여 AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개 거부반응을모니터링하는기술을제공한다.

본 명세서에서 사용된 바로서, AB0 혈액형 부적합 이식은 신장, 간 등의 고형 장기의 이식에 있어서 수여자와 공여자의 AB0식 혈액형이 일치하지 않는경우를의미한다.

바이오 마커는 KHK TPPP3, CFD FCGR3B CD14, C1QA TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8로이루어진군에서 선택된 1종이상의 유전자 (예컨대, 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자및/또는단백질은인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트등의 설치류등을포함하는포유동물유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.

상기 마커로 사용 가능한 유전자/단백질들 중 인간 유래의 유전자/단백질을아래의 표 1 에 예시하였다:

[표 1]

일구체예에서 , 상기 바이오마커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상(예컨대, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD및 F0XJ3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상)의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 (■, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8 , FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, ⑶ 69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)는(이식 받은 환자로부터 분리된) 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.

다른 구체예에서, 상기 바이오마커는 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 (MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상)는 조직 시료 (예컨대, 이식 장기 또는조직으로부터 분리된조직)에 사용하기 위한것일수있다. 본 명세서에사 사용된 바로서, ’’거부 반응(reject ion)”은 항체- 매개성 거부반응 (ant ibody-medi ated rej ect ion) 및 항체-매개성 거부반응을 포함하는 혼합 거부 반응(mixed rej ect ion)을 포괄하는 의미일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바로서, . 혈액형 부적합 이식 (blood-type incompat i b le transpl antat ion)은 신장, 간 등의 고형 장기 또는이들로부터 분리된조직의 AB0혈액형 부적합이식을의미할수있다. 다른 예는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물을제공한다.

일 구체예에서, 상기 모니터링용조성물은 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, ⑶ 14, C1QA, TNFRSF8 , FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상 (예컨대, C0X7A2L, CD69, CD 14, C抑 및 F0XJ3으로이루어진군으로부터 선택된 1종이상)의 유전자(예컨대, mRNA 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 (이식 받은 환자로부터 분리된) 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.

다른 구체예에서, 상기 모니터링용조성물은 ¾¾ , 1 £¾106/\, 11X4, 쇼(:0)(1 , 3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자 (예컨대, 11 浪 , 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 조직 시료 (예컨대, 이식 장기 또는 조직으로부터 분리된조직)에 사용하기 위한것일수있다.

상기 검출 가능한 제제는상기 유전자 및/또는 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질 (예컨대, 항체 등), 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 (예컨대, 프라이머 (예컨대, 상기 유전자 중 연속하는 50-20아 의 양 말단과혼성화가능한 핵산서열을 갖는 5-50位 , 5-30 , 5-25 , 5_20位, 10-50 , 10-30111; , 10-25 , 또는 10_20 의 올리고뉴클레오타이드), 프로브 (예컨대, 상기 유전자중 연속하는 10-10아)1), 10-5애1), 또는 10-30 5 ? 와 혼성화 가능한 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드), 압타머, { 쇼 등), 화학 물질 (<± 6111 크1) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 임의로 통상적으로 사용되는 표지 물질 (예컨대, 형광물질 (예컨대, 형광 단백질, 형광 화학 물질 등), 방사성동위원소 등)로 표지된 것일 수 있다. 상기 ’혼성화 가능하다 함은 상기 유전자 부위의 핵산서열과 80%이상, 예컨대 90%이상, 95%이상, 98%이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할수 있다.

다른 예는, 쇼期 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진

단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 쇼的 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링하는 방법 또는 쇼«) 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링에 정보를.제공하는 방법 제공한다. 다른 예는, 쇼 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개 거부반응을 모니터링을 위하여, AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 (분리된) 생물학적 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 , C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가 암호화하는단백질의 발현수준을측정하는방법을제공한다.

상기 생물학적 시료는 상기 대상으로부터 얻은 (분리된) 말초 혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료, 상기 대상의 이식된 장기 또는 조직으로부터 얻은 (분리된) 조직을포함하는조직 시료, 또는 이들모두일 수있다.

상기 유전자 및/또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는, 상기 생물학적 시료에 상기 유전자 및/또는 단백질의 검출 가능한 제제를 접촉 (첨가)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 제제는 앞서 설명한바와같다.

생물학적 시료 (예컨대, 혈액 시료)에서, KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B,

CD 14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 상대적으로 높은 발현 수준, 및/또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 상대적으로 낮은 발한수준은 상기 시료가 얻어진 (분리된) 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 적응을 나타냄 (이식 거부를 나타내지 않거나 수용 가능한수준으로약하게 나타냄)을의미할수있다.

상기 유전자의 발현 수준을 즉정하는 단계는 상기 유전자와혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 앱타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR), 역전사폴리머레이즈연쇄 반응법 (RT-PCR) , FISH(f luorescent in s i tu hybr idi zat ion), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 . 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화학 물질, 항체, 또는 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을통하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 유세포 분석, 면역크로마토그래피(Immunochromatography) , 면역조직화학염색 , 효소결합 면역톱착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radioimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA) 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) , 발광면역분석 (luminescence immunoassay · LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.

일 예에서, 생물학적 시료가 혈액 시료일 경우, AB0 혈액형 부적합 이식의 항체-매개성 이식 거부반응을 모니터링하는 방법은 다음의 단계를 포함할수있다:

AB0혈액형 부적합 이식을받은 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료

(혈액 시료; 이하 "시험 시료 (시험 혈액 시료n에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD 14 C1QA, TNFRSF8, FFAR2 F0XJ3, C0X7A2L CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자및/또는단백질의 발현수준과비교하는단계.

상기 비교대상 시료는 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 또는 적응을 나타내는 것이 확인된 개체로부터 얻은 (분리된) 혈액 시료일 수있다.

따라서 , 상기 방법은상기 비교하는단계 이전에 , 비교대상시료에서 KHK, TPPP3 , CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준을측정하는단계를추가로포함할수있다.

상기 방법에서

(1) AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응 (rejection)을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 낮은 경우 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나낮은수준(수용가능한수준)임)을 나타내는것으로확인 (또는판단또는결정)하거나 및/또는

(2) AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응(accommodation)을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD,

FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대 mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를나타내는 것으로 확인 (또는판단또는결정)할 수있다.

따라서, 상기 방법은. 상기 비교하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로포함할수있다:

AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응(rejection)을 나타내는 비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우, 및/또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69 CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응

(거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는판단또는결정)하는단계 , 및/또는

AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응(accommodation)을 나타내는 비교대상시료와비교하여 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루아진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대 mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA cDNA 등) 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는것으로확인 (또는판단또는결정)하는단계.

다른예에서, 생물학적 시료가혈액 시료인 경우, AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:

AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 C0X7A2L, CD69, CD14, CFD, 및 FoxJ3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및

하기의 식 1을계산하는단계 :

식 1 = -104.2 - 140.4 * [ C0X7A2L] - 184.3 * [ CD69] + 772.5 * [ CD14] - 1056.9 * [ CFD] + 518.5 * [ FoxJ到

(상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로, 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR (예컨대, quant i tat ive real-t ime PCR)을통하여 얻어진유전자수준일수있다). 상기식 1에 의해 얻어진값이 0.5보다큰경우, 상기 시료가유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)할 수 있으며, 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 (또는판단 또는결정)할수있다.

따라서, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법은, 식 1을 계산하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다:

상기 식 1에 의해 얻어진값이 0.5보다큰경우, 상기 시료가유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준 (수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)하는단계, 및/또는

상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 나타내는 것으로확인 (또는판단또는결정)하는단계.

조직 시료에서, MGAM, TMEM106A, A⑴ XI 및 AC01로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 상대적으로 높거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, 2019/107673 1»(:1^1{2018/002720

등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 상대적으로낮은경우, 상기 조직 시료가유래한대상이 쇼요0혈액형 부적합 이식에 적응을 나타냄 (거부반응이 없거나 낮은 수준 (수용 가능한 수준)임)을확인할수 있다.

일 예에서, 생물학적 시료가조직 시료인 경우, 새0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다: 새0 혈액형 부적합 이식 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료 (조직 시료; 이하 "시험 시료 (시험 조직 시료)")에서 ,

1X4, 쇼0))(1, 此01, 및 3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현수준을측정하는단계;

상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 발현 수준과비교하는단계 .

상기 비교대상시료는쇼묘0혈액형 부적합이식을받은개체로서 거부 반응 또는 적응을 나타내는 개체로부터 얻은 (분리된) 조직 (예컨대, 이식 받은조직)을포함하는것일수있다.

따라서, 상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이전에, 비교대상 시료에서 / , 1¾£ 06/\, 狀4, 0)X1, 쇼〔:01, 및 3100쇼8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, 111 韻 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로포함할수있다.

상기 방법에서,

(1) 쇼期 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응 0^^ 011 )을 나타내는비교대상시료와비교하여 , 시험 시료에서 ¾ , 11£ 106 쇼0))(1, 및此이로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대, 미四 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나, 및/또는시험 시료에서 3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(예컨대, 111 /\, 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 쇼 ) 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한 수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)하거나, 및/또는

(2) 쇼130 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응(^0) 1 ^ 110 (1^1 011 )을 나타내는비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 MGAM, TMEM106A, AC0X1 , 및 AC01로이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자(예컨대 mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대 mRNA cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는결정)할수있다.

따라서, 상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 다음의 . 단계를 추가로포함할수있다:

AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응(rej ect ion)을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 MGAM TMEM106A, AC0X1, 및

AC01로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유·전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높가나 및/또는시험 시료에서 TNFRSF12A및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우 , 상기 시험 시료가 유래한 대상아 AB 0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한수준)임)을나타내는 것으로확인 (또는판단또는결정)하는단계, 및/또는

AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응(accommodat ion)을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 MGAM, TMEM106A, AC0X1, 및 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는결정)하는단계 .

다른예에서 , 생물학적 시료가조직 시료인경우, AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:

AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 MGAM, MUC4, AC01 S100A8, TMEM106A 및 AC0X1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는 상기 유전자가암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및

하기의 식 2를계산하는단계 :

식 2 = -3.2 - 15.8 *[ MGAM] + 4.0아:MUC4] + 23.1 *[ AC01] + ll.(MS100A8] + 20.0 *[ TMEM106A] - 50.6 *[ AC0X1]

(상기 식 중 [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR (예컨대, quantitative real-time PCR)을통하여 얻어진유전자수준일수있다). 상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은수준 (수용가능한수준)임)을나타내는 것으로확인 (또는판단또는 결정)할 수 있으며, 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 (또는판단 또는결정)할수있다. ·

따라서, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법은, 식 2를 계산하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다:

상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부반응이 없거나 낮은 수준(수용 가능한수준)임)을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단또는 결정)하는단계, 및/또는

상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다적은경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 나타내는 것으로확인 (또는판단또는결정)하는단계.

상기 대상은 인간 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을포함하는포유동물에서 선택된개체일수있다.

본 명세서에 기재된 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법 , 상기 비교하는 단계 , 계산하는 단계, 및/또는 확인 (또는판단또는 결정)하는 단계 이후에, 다음의 단계를추가로 포함할수 있다:

(a) 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인 (또는 판단 또는 결정)된 경우 상기 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 치료하거나 진행중인 면역 억제 치료를 강화 (면역억제제 투여량증가,투여 횟수증가등)하는단계, 및/또는

(b) 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부 반응이 없거나 낮은 수준 (수용 가능한 수준)임)을 나타내든 것으로 확인 (또는 판단또는 결정)된 경우, 면역억제제 투여량또는 투여 횟수를유지 또는감소시키거나면역억제제 투여를종료하는단계.

상기 거부반응의 치료는 상기 대상에게 항-이식거부 면역억제제 (anti-rejection immunosuppressive drug)의 유효량의 투여 및/또는 혈장분리술 (plasmapheresis)등에 의하여 수행될수있다.

상기 항-이식거부 면역억제제 또는 면역억제제는 면역억제 활성을 갖는 모든 단백질 (예컨대, 항체 등), 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 화학 약물등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체 예에서, 항-이식거부 면역억제제는 바실리시맙 크 11x^ 3 1) , 에이티지 (Ant i-thymoglobul in, ATG) , 알렘투주맙( 3 1 6011 112111113 1) , 메틸프레드나솔론 (methylprednisolone), 타클로리무스 (1크: 10 1 배) , 프레드니솔론 (prednisolone) 및 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofeti 1) , 면역글로불린 (;_에 0 용1 0 1 111111) , 리툭스맙 (r ituximab), 보테조밉 (1X 1 ^ 62011 ^1) , 에큘리주 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수있으나, 이에 제한되는것은아니다.

【발명의 효과】

본명세서에서 제공되는모니터링 기술에 의하여,쇼的혈액형 부적합 이식을 받은 환자에서의 이식 거부 여부를 보다 간편하면서도 정확하게 모니터링할 수 있어서, 쇼 혈액형 부적합 이식 후의 환자 상태에 따른 적절한치료를 제공할수 있어서, 이식의 성공가능성을보다높일 수 있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 일 실시예에 따른 혈액 또는 조직 시료를 이용한 이식 거부반응모니터링 과정을개략적으로보여주는모식도이다.

도 2는혈액 시료에서의 functional annotation및 pathway analysis 결과를보여준다

도 3은 혈액 시료에서 GSEA (gene set enrichment analysis) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 상향조절되는유전자세트를보여준다. 도 4는 혈액 시료에서 GSEA (gene set enr i chment analys i s) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 하향조절되는유전자세트를보여준다. 도 5는혈액 시료에서 ABOiR과비교하여 ABOiA와유의적 상관관계를 갖는후보유전자를보여준다.

도 6a 내지 7b는 혈액 시료에서의 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14,

C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 유전자의 정량적 real-t ime PCR결과를보여주는그래프이다.

도 8은 실시예 2의 식 1를 적용하여 혈액 시료에서 Training Set과 Val idat ion Set (8 개의 ABOiA와 2 개의 ABOiR이 포함됨)을 분석한 결과를 보여준다.

도 9는 조직 시료에서 GSEA (gene set enr i chment analys i s) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 관련성을갖는유전자세트를보여준다. 도 10은 조직 시료에서 ABOiR과 비교하여 ABOiA와 유의적 상관 관계를갖는후보유전자를보여준다.

도 11a 및 l ib는 조직 시료에서의 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1,

AC01, TNFRSF12A 및 S100A8 유전자의 정량적 real-t ime PCR 결과를 보여주는그래프이다.

도 12는실시예 3의 식 2를적용하여 조직 시료에서 Training Set을 분석한결과를보여준다.

【발명을실시하기 위한구체적인내용】

이하본발명을다음의 실시예에 의하여 보다구체적으로설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가이들실시예에 의하여 제한되는것은아니다. 실시예 1. 시료의 준비 및 RNA시퀀싱

AB0 혈액형 부적합 신장 이식 (ABO incompat i ble kidney transpl antat ion; ABOi KT)을 받은 수여자들 중, 이식 후 10 일째의 프로토콜 생검 (protocol biopsy)에서 이식 거부반응을 나타내지 않고 신장 이식 후 3 개월간 비정상적인 신장 기능을 보이지 않는 18 명의 ABOi KT 수여자 (이식 적응 (accommodat ion) 수여자: ABOiA)를 선정하였다. 비교를 위하여, 10 일째 프로토콜 생검에서 급성 항체-매개 거부반응 (ant ibody- medi ated rej ect i on; AMR)을 보인 10명의 ABOi KT 수여자 (이식 거부 (rejection) 수여자: ABOiR)를 선정하였다. 상기 선정된 수여자들의 말초혈액 (per ipheral blood; PB) 시료를 취하여 2010년 6월부터 20M년 8월까지 bioreposi tory에 저장하였다. 그 중 16 명의 ABOiA 수여자와 6 명의 ABOiR 수여자의 신장 생검 조직을 biorepository에 저장하고, intragraft transcr iptomic analysis에사용하였다.

ABOi KT의 경우, 모든 수여자에 대하여 탈감작 프로토콜 (desensitization protocol)을 수행한후, 혈장분리교환술 (plasmapheresis) 개시 전 7일 이내에 항 CD20 키메라 모노클로날 항체인 리툭시맙 (rituximab)을 125 mg/m 2 (single dose)의 양으로 투여하였다. 혈장분리교환술은 미리 형성된 isoagglutinin (항 AB⑴ 항체를 제거하기 위하여 신장 이식 전에 수행한다. plasmapheresis의 횟수는 anti -donor isoagglutinin IgG 기준 역가에 따라 결정되고, 수술 전 허용되는 isoagglutinin IgG 역가는 1:16 이하이다. 항- ABO isoagglutinin 항체 역가는 수여자의 혈청을 2 배 연속 희석하여 측정하였다. 항- AB0 항체 역가는 gel card test (Sigma-Aldr ich, St. Louis, M0, USA)를 사용하여 즉정하였다. plasmapheresis의 각 세션 후, intravenous immunoglobul in의 저용량 (100 mg八 eg)을 투여하였다. 유도 요법으로, 모든 환자에 대하여 0 일과 4 일째에 바실리시맙 (basi 1 iximab) 20 mg을 투여하고, 타클로리무스 (tacrol imus), 프레드니솔론 (prednisolone) 및 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil)을 포함한 통상적인 삼중 유지 면역 억제제 (triple maintenance immunosuppressive agent)를 투여하였다.

정량적 중합효소연쇄반응 (Q-PCR) 시험의 검증을 위하여, 독립적인 인센터 (in-center) PB 시료 (15 ABOiA 및 9 ABOiR) 또는 독립적 인센터 이식편 조직 (graft tissue) 시료 (18 ABOiA 및 9 ABOiR)로부터 training set을 준비하고, 다른 center의 독립적 시료 (8 ABOiA 및 2 ABOiR)로부터 validation set을준비하여 분석에 사용하였다.

세포내 RNA의 안정화를위하여 , 모든 PB시료를 PAXgene® Blood RNA Tube (PreAnalyt iX GmbH , Hombrecht ikon, Switzer land)에 수집하였다. PB 및 조직 시료는 전체 RNA 추출시까지 -70 ° C에서 보관하였다. RNeasy®

Mini 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를사용하여 PB및 조직 시료로부터 전체 RNA를 추출하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 시료량과 integrity를 체크하였다. 품질 관리 (RNA mass ñ 1 g 및 RNA Integrity 2019/107673 1»(:1/10公018/002720

Number > 6)를 통과한 각각의 시료를 사용하였다. Illumina TruSeq 프로토콜에 따라, PB 및 조직 시료로부터 추출된 쇼를 단편화, 역전사 및 랜덤 올리고- dT 프라이머를 사용하여 증폭시켜, adapter-ligated complementary DNA (cDNA) 라이브러리를 제조하였다. Illumina HiSeq platform (Illumina Inc. , San Diego, CA, USA)을 사용하여 cDNA 라이브러리의 서열을 분석하였다. Illumina HiSeq 결과는 시스템 제어용 HiSeq Control Software v2.2.38 (Illumina Inc.)를 이용하여 이미지화하고, base call은 Real Time Analysis vl 18.61.0 (Illumina Inc.)라 불리는 integrated primary analysis software를 통하여 분석하였다. base cal 1 binary data는 Illumina package bcl2fastq (vl.8.4, Illumina Inc.)를 사용하여 FASTQ로변환하였다.

FASTQ데이터는 FastQC:Read QC [Brown J, Pi r rung M, McCue LA. FQC Dashboard: integrates FastQC results into a web-based, interact ive, and extensible FASTQ quality control tool. Bioinformatics, 201기를 사용하여 Quality control하였다. 전사체 (transcript)의 정렬 및 정량을 위하여, Ensembl GRch37 reference genome을 사용하는 STAR (v.2.4. Id) mapper [Dobin A, Gingeras TR. Mapping RNA-seq Reads with STAR. Curr Protoc Bioinformatics 51:11 M 11-19, 2015; Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29:15-21, 2013]를 통해, 101 bp paired-end read를 인간 유전체 (GRCh37/hgl9 assembly)에 정렬시켰다 각각의 전사체에 대하여 FPKM (fragments per ki lobase per million reads) 값을 사용하여 transcript assembly 및 transcript abundance를 결정하고, 표준화시켰다. differential gene-cal ling 방법으로 DESeq (Bioconductor)를 사용하여 차별발현유전자 (Differential ly expressed genes; DEGs)를 확인하였다

(FDR (false discovery rate)을 <0.05로 제어 (13,373 개의 유전자)). functional annotation 및 pathway analysis 를 위하여, DEG를 주가 조사하였다. 또한, gene set enrichment analysis (GSEA)를공지된 방법에 따라서 수행하였다 (Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, et al . Gene set enrichment analysis : a knowledge-based approach for interpret ing genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 15545— 15550, 2005). 그 후, PB 시료 및 조직 시료 각각에서, ABOiR과 비교하여 ABOiA와상관관계가있는몇몇후보유전자를선정 였다. 초기 검증을 위해, RNA-seq (Discovery Set)에서 사용된 시료와 동일한 cDNA 시료에 대하여 Q-PCR을 수행하였다. internal validation을 위하여 RNA-seq에 사용되지 않은 독립적 인센터 시료 (independent in center samples)에 대해서도 Q-PCR를 수행하였다. 독립적 인센터 시료 (Training Set)의 Q-PCR 데이터를 사용하여 로지스틱 회귀 분석을 통해 ABOiA와 ABOiR 간와 구별을 위한 분류 모델을 개발하였다. 개발된 분류 모델은 external validation을 위하여 다른 센터로부터 얻어진 2차 독립 시료 (검증세트)에 적용하였다.개략적인시험 과정을도 1에 나타내었다. 실시예 2: 말초혈액 시료에서 AB0 혈액형 부적합 이식 적응군

(ABOiA)과상관관계가높은유전자의 선별

말초혈액 (PB) 시료의 RNA-seq 결과, ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 차별발현유전자 (DEG)의 수는 총 1385 개였다 (FDR <0.05). 이 중에서 ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 상향 조절된 DEG의 수는 483개이고, ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 하향 조절된 DEG의 수는

902개였다.

DEG의 functional annotation및 pathway analysis는 DAVID 6.8 Beta (https : //david.nci fcrf .gov)를 통해 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난바와같이, 5가지 kegg pathways (즉,산화적 인산화, 알츠하이머병, 리보솜, 헌팅톤병, 및 파킨슨 병)은 ABOiR과 비교하여 ABOiA와보다유의한관련성이 나타났다.

PB 시료에 대하여, 상기 실시 예 1에서 설명한 방법에 따라 GSEA (gene set enrichment analysis)를 수행하여, 그 결과를 도 3및 도 4에 나타내었다. 도 3은 ABOiR과 비교하여 ABOiA에서 상향조절되는 유전자 세트를보여주고,도 4는 ABOiR과비교하여 ABOiA에서 하향조절되는유전자 세트를보여준다.

ABOiR과 비교하여 ABOiA와 유의적 상관 관계를 갖는 후보 유전자를 선별하였으며,유전자선별거준은다음과같다:

(1)차별발현유전자중에서 발현 차이가크거나 (high fold change) 유의성 (p- value & FDR)이 높은유전자들,

(2) GSEA (gene set enrichment analysis) 또는 pathway ana lysis에서의 유의한 gene set또는 pathway에 포함된유전자들,

(3)면역 기능과기능적으로관련 있는유전자들, (4) 이식 적응또는이식 거부와관련 있는것으로알려진유전자들. 상기 선별 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 초기 검증(initial ver i f icat ion)을 위하여 13개 유전자, 즉, KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 , C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96이 선정되었다.

RNA-seq 에 사용된 것과 동일한 cDNA 시료(Discovery Set; RNA-seq samples) 및 RNA-seq에 사용되지 않은 독립 인센터 시료 (15 ABOiA 및 9 ABOiR을 포함하는 Training Set; Internal validation samples)에 대하여 Q-PCR를 수행하여, 그 결과를 도 6a, 6b, 7a, 및 7b에 나타내었다. 상기 Q-PCR에 사용된프라이머를하기의 표 2에 정리하였다:

[표 2]

Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여, 제조사가 . 제공하는 Standard protocol에 파라서 수행하였다. Expression value 계산을 위한 reference gene은 GAPDH을이용하였다.

classification model 구죽을 위하여, two-tail t_test에 의하여 확인된 significant set (7개 유전자)를 추가 분석하였다. Training Set 시료의 Q-PCR데이터를사용하여, 다음과같은로지스틱 회귀 분석을통해, ABOiA와 ABOiR를 판단하기 위한 5 가지 유전자의 classification model을 개발하였다 (아래 식 1 중, □는 Q-PCR로 측정된 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 발현수준을의미함) .

상기 모델을 적용하여 Training Set과 Val idat ion Set (8 개의 ABOiA와 2 개의 ABOiR이 포함됨)을 분석한결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 것과 같이, Training Set에서, 상기 c l assi f i cat ion model을 사용하여 분류시, 100% 민감도, 100% 특이성, 및 100% 정확도로 ABOiA와 ABOiR를 구분할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, Val idat ion Set에서는 75% 민감도, 100% 특이성, 및 80% 정확도로 ABOiA와 ABOiR을 분류할수는것으로나타났다. 실시예 3: 조직 시료에서 ABOiA과상관관계가높은유전자의 선별 조직 시료에 대한 RNA-seq에서 , ABOiR군과 바교하여 ABOiA 군에서 차별 발현되는 유전자 (DEG)의 수는 총 179 개였다 (FDR <0.05) . ABOiR 군과비교하여 ABOiA군에사상향조절된 DEG의 수는 122개이고, ABOiR군과 비교하여 ABOiA군에서 하향조절된 DEG와수는 57개였다.

조직 시료에 대하여 상기 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 GSEA

(gene set enr i chment analysi s)를수행하여, 그결과를도 9에 나타내었다. 도 9는 G況 A의 결과 및 ABOiR과 비교하여 ABOiA와 관련성을 갖는 gene set와예를보여준다. .

상기 실시예 2에서 기재한 유전자 선별 기준에 따라 ABOiR과 비교하여 ABOiA와유의적 상관관계를갖는후보유전자를선별하였다. 그 결과, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8의 7개 유전자가초기 검증을위하여 선택되었다 (도 10참조) .

RNA-seq 에 사용된 것과 동일한 cDNA 시료 (Di scovery Set ; RNA-seq samples) 및 RNA-seq에 사용되지 않은 독립 인센터 시료 (18 ABOiA 및 9 ABOiR)을 포함하는 Training Set; Internal val idat ion sampl es)에서 상기 7개 유전자에 대한 Q-PCR를 수행하여, 그 결과를 도 11a 및 lib에 나타내었다. 상기 Q-PCR에 사용된프라이머를하기의 표 3에 정리하였다:

[표 3]

상기 Q-PCR은 Applied Biosys terns Prism 7300 (PE Applied Biosystems , Foster City, CA, USA)을 이용하여, 제조사가 제공하는 Standard protocol에 따라 수행하였다. Expression value 계산을 위한 reference gene은 GAPDH을이용하였다.

Training Set 시료의 Q-PCR 데이터를 사용하여, 다음과 같은 로지스틱 회귀 분석을 통해, ABOiA와 ABOiR를 판단하기 위한 6 가지 유전자의 classification model을 개발하였다(아래 식 2중, □는요- 로 측정된유전자(예컨대, mRNA, cDNA등)발현수준을의미함).

상기 모델을 적용하여 Training Set을 분석한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인되는 것과 같이, Training Set에서, 상기 classification model을사용하여 분류시, 88,9%민감도, 55.5%특이도, 및 77.8%정확도로 ABOiA와 ABOiR를구분할수있는것으로나타났다.