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Patent Searching and Data


Title:
BIOACTIVE POLYPEPTIDE, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/121725
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided is a polypeptide, the amino acid sequence of which is SLPQ. The polypeptide is prepared by fermented skimmed milk by Lactobacillus helveticus. The polypeptide can enhance immunity of a body, so also provided are food, health products and medicines comprising the polypeptide.

Inventors:
ZHANG SHAOHUI (CN)
LU SHANSHAN (CN)
SUN GUANHUA (CN)
MA LIULIU (CN)
ZHOU JIEHUI (CN)
GUO HAIBIN (CN)
HU DI (CN)
Application Number:
PCT/CN2014/071726
Publication Date:
August 14, 2014
Filing Date:
January 29, 2014
Export Citation:
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Assignee:
UNIV SHANGHAI JIAOTONG (CN)
International Classes:
C07K5/103; A23L33/00; A61K38/07; A61P37/04; C12P21/02
Other References:
GEERLINGS, A. ET AL.: "Identification and characterization of novel angiotensin-converting enzyme inhibitors obtained from goat milk.", JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, vol. 89, no. 9, 2006, pages 3326 - 3335
WU, YUFENG.: "Sleep disorders and nursing strategy of elderly patients with hypertension.", CHINESE JOURNAL OF COAL INDUSTRY MEDICINE, vol. 14, no. 12, December 2011 (2011-12-01), pages 1856 AND 1857
Attorney, Agent or Firm:
J.Z.M.C. PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (CN)
上海光华专利事务所 (CN)
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Claims:
权利要求书

1. 一种生物活性多肽, 其氨基酸序列为 Ser-Leu-Pro-Gln。

2. 权利要求 1所述的生物活性多肽, 其特征在于, 所述生物活性多肽为乳源性。

3. 编码权利要求 1所述生物活性多肽的核苷酸片段。

4. 权利要求 3 所述的核苷酸片段, 其特征在于, 所述核苷酸片段的序列如 SEQ ID NO: 2 所示。

5. 权利要求 1-2任一权利要求所述生物活性多肽的制备方法, 步骤如下:

1 ) 发酵: 将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵, 获得瑞士乳杆菌发酵乳;

2) 多肽的粗提: 对步骤 1 ) 的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离, 取上清液;

3) 多肽的纯化:

a. 对步骤 2) 的上清液进行超滤处理, 收集滤液;

b. 收集的滤液采用反向层析柱 S0URSE 5 RPC ST进行反相高效液相色谱分离, 收集洗脱时 间为 21min的多肽混合物;

c 用反相高效液相色谱分离纯化获得多肽 SLPQ。

6. 如权利要求 5 所述的制备方法, 其特征在于, 步骤 1 ) 所述厌氧发酵的条件为: 发酵温 度 36〜38°C, 发酵时间 15〜20h。

7. 如权利要求 5 所述的制备方法, 其特征在于, 步骤 3) a 中所述超滤法所采用的滤膜的 截留分子量分别为 lOkDa和 3kDa; 所述超滤过程中, 压力范围为 0. 1〜0. 3MPa, 滤液流速为 0. 8〜L 2mL/min。

8. 权利要求 1-2任一权利要求所述生物活性多肽或者权利要求 3-4任一权利要求所述核苷 酸片段在制备增强机体免疫力的食品、 保健品及药物中的应用。

9. 一种增强机体免疫力的药物, 含有权利要求 1-2任一权利要求所述生物活性多 SLPQ和 / 或生物活性多肽 SLPQ的衍生物。

Description:
生物活性多肽、 其制备方法和应用

技术领域 本发明涉及蛋白领域, 具体涉及一种乳源性生物活性多肽 SLPQ及其制备和 应用。

背景技术 在牛乳经乳酸菌发酵的过程中, 牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用, 并发生了一系列生理生化反应, 使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸, 被人体消 化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进 入人体的血液循环。在这些多肽中, 有一部分具有特殊的生理功能, 被称为 "生物活性肽"。 免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得 并证明其生理活性的一类生物 活性多肽。 1981年 Jolles等人首次发现, 利用胰蛋白酶水解人乳蛋白, 可以得到 一个氨基酸序列为 Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽,体外实验证明该肽 够增强小 鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。 Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白 的六肽 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小 腹膜巨噬细胞的吞 噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。 李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽 (PGPIPN)伺喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬 用和红细胞相关的免疫调节 功能有显著的增强。 研究表明,免疫活性肽不仅能够增强机体免疫 力,刺激机体淋巴细胞的增殖, 增强巨噬细胞的吞噬功能, 促进细胞因子的释放、 提高机体抵御外界病原体感染 的能力, 降低机体发病率, 而且不会引起机体的免疫排斥反应。

免疫活性肽无论是作为功能食品还是药品, 其最终都要进入人体内被吸收, 只有到达相应的靶器官才能发挥其生理功能。 在人体胃肠道复杂的环境下, 肽极 容易受到胃蛋白酶、 胰蛋白酶等一系列酶的影响而发生降解, 从而在体内失去生 理活性, 无法达到预期目的。 因此, 研究免疫调节肽的抗胃肠道酶降解的能力对 于其今后的应用具有重要意义。 发明内容 本发明的目的在于提供一种生物活性多肽,其 氨基酸序列为 Ser-Leu-Pro-Gln ( SLPQ, SEQ ID NO: 1 )。 较优的, 所述生物活性多肽的来源为乳源性。

本发明的生物活性多肽 SLPQ为乳源性, 具体来源于 β-酪蛋白, 并且为 β-酪蛋 白 (SEQ ID NO:3)第 84〜87位的氨基酸残基。

较优的, 所述生物活性多肽具有增强机体免疫力的功能 。 本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方 法和化学方法人工合成,也可 以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得。

本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷 酸片段。 β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有 技术, 编码 β-酪蛋白第 84〜87 位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物 活性多肽 SLPQ。

进一步的, 编码前述生物活性多肽的核苷酸片段, 其序列为: agc ctc cca cag

本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制 备方法, 步骤如下:

1 ) 发酵:将瑞士乳杆菌(Lflctobfld// e/wrio«)添加到脱脂乳中进行厌氧发酵, 获得瑞士乳杆菌发酵乳;

2) 多肽的粗提: 对步骤 1 ) 的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离, 取上清液;

3) 多肽的纯化: a. 对步骤 2) 的上清液进行超滤处理, 收集滤液; b. 收集的滤液采用反向层析柱 SOURSE 5 RPC ST (4.6 X 150mm) 进行反相 高效液相色谱分离, 收集洗脱时间为 21min的多肽混合物; c 采用超高效液相-电喷雾 -四级杆-飞行时间质谱仪分离获得多肽 SLPQ。 本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的乳制品, 通常脱脂乳中脂肪含量小于 0. 1%。 较优的,步骤 1 )所述厌氧发酵的条件为:发酵温度 36〜38°C,发酵培养 15〜 20h ; 优选发酵培养 19h。 较优的, 步骤 2)所述低温离心的条件为: 4°C, 8000〜10000rpm, 离心 15〜 30min。 较优的, 步骤 3) a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别 lOkDa和 3kDa。 本发明采用截留分子量分别为 10kDa、 3kDa的滤膜, 使样品依次通过两张 滤膜进行超滤。 更优的, 步骤 3) a所述超滤过程中, 压力范围为 0.1〜0.3MPa, 滤液流速为 0.8—1. 2mL/min。

较优的, 步骤 3) b反相高效液相色谱分离法中, 流动相 A为含有 2%乙腈和 0.05%TFA的 ddH 2 0; 流动相 B为 100%乙腈。

本发明生物活性多肽 SLPQ的分子量为 444. 24 Da。

本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制 备增强机体免疫力的食品、保 健品及药物中的应用。 本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷 酸片段在制备增强机体免疫 力的食品、 保健品及药物中的应用。 本发明的生物活性多肽 SLPQ可以用于酸奶等乳制品食品, 并且由于本发明 的生物活性多肽 SLPQ能够通过胃肠道直接吸收不被降解,因此 以用于制备提高 免疫力的保健品,或者增强机体免疫力的药物 。编码所述生物活性多肽 SLPQ的核 苷酸片段由于可以用于制备 SLPQ, 因此, 也可以用于制备食品、 提高免疫力的保 健品, 或者增强机体免疫力的药物。 本发明第四方面公开了一种增强机体免疫力药 物, 包含前述生物活性多肽 SLPQ或前述生物活性多肽 SLPQ的衍生物。 所述多肽的衍生物, 是指在多肽的氨基酸侧链基团上、 氨基端或羧基端进行 羟基化、 羧基化、 羰基化、 甲基化、 乙酰化、 磷酸化、 酯化或糖基化等修饰, 得 到的多肽衍生物。 本发明的生物活性多肽 SLPQ能够增强机体免疫力, 增强淋巴细胞和巨噬细 胞的体外增殖能力, 促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加, 提高机体抵御外界病原 体感染的能力, 降低机体发病率, 而且不会引起机体的免疫排斥反应, 对开发具 有增强免疫功能的乳制品和保健品具有十分重 要的意义。

附图说明

图 1 : 瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超 滤后粗提物的质谱对比 图 (A: 3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图, B: 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳 粗提物质谱图)

图 2 : 3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与 3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提 物分子量差异及丰度比较 图 3 : 反相高效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆 菌发酵乳中生物活性多 肽比较图 (a曲线: 对照发酵乳反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱; b曲线: 瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱) 图 4: B峰的一级质谱和二级质谱原始图 图 5 : 经过 Masslynx软件处理过的 B峰的二级质谱图 (m/z=444 ) 图 6 : B峰小肽的氨基酸序列以及 az, by断裂情况 图 7 : 生物活性多肽 SLPQ经过消化酶处理前后的总离子流图 图 8 :生物活性多肽 SLPQ经过胃蛋白酶-胰酶处理所得 444. 24前峰的一级质 谱图 图 9:生物活性多肽 SLPQ经过胃蛋白酶-胰酶处理所得 444. 24后峰的一级质 谱图

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前, 应理解, 本发明的保护范围不局限 于下述特定的具体实施方案; 还应当理解, 本发明实施例中使用的术语是为了描 述特定的具体实施方案, 而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时, 应理解, 除非本发明另有说明, 每个数值范围的 两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可 选用。 除非另外定义, 本发明中使 用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人 员通常理解的意义相同。 除实施例 中使用的具体方法、 设备、 材料外, 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌 握及本发明的记载, 还可以使用与本发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似 或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来实现本发明。

除非另外说明, 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本 技术领域常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培 养、 重组 DNA技术及相关领域的常规技术。 这些技术在现有文献中已有完善说 明, 具体可参见 Sambrook等 MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001 ; Ausubel 等, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates ; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego , 1998 ; METHODS IN ENZYMOLOGY , Vol.304 , Chromatin (P.M.Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999 ; 和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY , Vol.1 19 , Chromatin Protocols(P. B.Becker, ed.)Humana Press, Totowa, 1999等。 实施例 1 活性肽的制备 一、 发酵乳的制备 1 ) 瑞士乳杆菌发酵乳 采用脱脂奶粉 (新西兰 NZMP牌脱脂奶粉) 与水配置 12wt%的脱脂乳 (12g 脱脂奶粉加入到 88g水中,下同)。在无菌条件下,挑取瑞士乳 杆菌 actobadllus helveticus , CICC6024) 菌落三环, 将其加入已灭菌的 12wt%的脱脂乳中, 搅拌 均匀。 接种完成后, 用铝箔封口, 以防止污染。 置于培养箱中 37°C培养 19小时。 培养结束后, 将凝乳搅拌均匀, 即完成瑞士乳杆菌的活化, 制得用于制备瑞士乳 杆菌发酵乳的发酵剂。

取 10mL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到 500mL已灭菌的 12% (v/v) 脱 脂乳中 (接种率为 2 v/v %), 37°C发酵 19小时后, 搅开凝乳后, 在 4°C条件下保 存, 得到瑞士乳杆菌发酵乳。

2 ) 对照发酵乳 采用同样方法, 使用保加利亚乳杆菌 ( ictobacillus Bulgaricus, LB340)和嗜 热链球茵0¾/¾/^ ^^ Thermophilus, TA40 M乍为发酵菌种制作对照发酵乳。 具体方法为: 在无菌条件下, 分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三 环, 将其分别加入已灭菌的 12% (w/w) 的脱脂乳中, 搅拌均匀。 接种完成后, 用铝箔封口, 以防止污染。 置于培养箱中 37°C培养 19h。 培养结束后, 将凝乳搅 拌均匀, 即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化, 制得用于制备对照发酵乳 的两种发酵剂。

取 5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和 5mL嗜热链球菌发酵剂, 共同接 种到 500mL已灭菌的 12 %脱脂乳中 (接种率为 2 v/v %), 37°C发酵 19h后, 搅 开凝乳后, 在 4°C条件下保存, 得到对照发酵乳。 二、 生物活性多肽的确认

1.实验方法

1 ) 样品处理

分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对 照发酵乳,以及 12 wt%的脱脂 乳装入离心管中进行低温离心, 离心条件为 9000rpm/min, 4°C, 20min。 离心后 弃沉淀, 取上清液。

将上清液分别倒入超滤杯中, 为了防止生物活性多肽氧化, 打开氮气罐压力 阀充氮, 同时打开磁力搅拌装置, 以防止溶液出现浓差极化现象。 使样品分别通 过截留分子量为 10kDa、 3kDa的滤膜, 待有滤液流出时进行收集。

超滤过程中, 应保持流速稳定, 滤液清澈。 流速控制在 lmL/min左右, 压力 为 0.1〜0.3MPa, 分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳, 以及未发酵的 12 wt% 脱脂乳的滤液作为实验样、 对照样以及空白对照, 于 -4°C冷冻保存。

2 ) 质谱分析

将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的 滤液 (实验样) 和脱脂乳超滤 后的滤液 (空白对照) 进行质谱分析, 质谱条件如下: 离子方式: ES+

质量范围 (m/z): 100-1500

毛细管电压 (Capillary) (kV): 3.0

采样锥 (V): 35.0

离子源温度 (°C ) ) : 100

去溶剂温度 (°C ): 350

去溶剂气流 (L/hr): 600.0

碰撞能量 ( eV): 6.0

扫描时间 (sec): 0.3

内扫描时间 (sec): 0.02

2. 实验结果

瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液 (实验样) 和脱脂乳超滤后的滤液 (空白对 照)的质谱对比结果见图 1〜2。图 1中的 A曲线为 3000Da未经发酵的脱脂乳(空 白对照)粗提物样品,图 1中的 B曲线为 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品(实 验样)。 经过比较可以看出, 经过瑞士乳杆菌发酵后, 3000Da未经发酵乳粗提物 和 3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发 生很大变化,且这些组分由于 疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量 范围为 100D a -1500Da, 因此可知脱 脂乳在 1500Da以下、 210nm处有吸收的小分子物质相对较少; 而经过瑞士乳杆菌 发酵后, 在这一分子量范围内的物质明显增多, 说明了这些多肽并不存在于未经 发酵处理的脱脂乳中, 而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。 而且我们发现随着发 酵时间的延长, 多肽的丰度明显增多, 进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵, 脱 脂乳中原有的大分子蛋白被分解, 从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子 多肽。 图 2是 3000Da未经发酵脱脂乳 (空白对照) 粗提物与 3000Da瑞士乳杆菌发 酵脱脂乳 (实验样) 粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。 纵向轴表明在 脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量, 横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对 应的分子量。 通过比较, 可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳 中, 因为 发酵所带来的差异较大的物质的分子量, 从而选择这些质荷比的母离子通过二级 质谱进行进一步的分析。 如图 1所示,分子量 397. 07Da,保留时间 6. 72分钟的物质在脱脂乳粗提物中 含量较高(图 1-A图谱中的峰),而对照发酵乳中几乎没有。 而分子量为 232. 15Da, 保留时间为 3. 61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较 。 因此, 我们选 择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂 乳中含量较低的组分进行了差异比 较, 比较结果见表 1。 根据 MarkerLynx Marker 软件分析, 得到具有显著性差异的 (p〉0. 05 ) 分子 量片段如表 1所示,根据丰度和质荷比情况,选择 444. 24Da,保留时间为 16. 20 min 的多肽进行二级质谱的测序分析。 表 1 : 3000Da发酵乳粗提物与 3000Da脱脂乳粗提物差异比较 分子量 3000Da脱脂乳粗提物 3000Da发酵乳粗提物

显著性

(Da) (unit) (unit)

504.2302 0.0779 0 37.23±2.78

444.2442 0.1498 0 71.58±4.27

585.3251 0.0886 0 41.72±4.02

748.3877 0.0753 0 35.25±2.46

439.291 0.3968 0 186.95±10.67

1025.5662 0.2441 0 115.86±7.17

三、 生物活性多肽的高效液相法分离提纯

1.实验仪器和试剂 仪器: AKTA蛋白纯化仪 purifier 10

色谱柱规格: SOURSE 5 RPC ST4.6/150

流速: lmL/min

温度: 25 °C

紫外检测波长: 215nm

流动相 A: 含有 2%乙腈和 0.05%TFA的 ddH20 流动相 B: 100%乙腈

进样量: lmL

梯度条件: 0min-7.5min保持 100%A液; 7.5min-42.5minB液从 0%变为 50%; 42.5min-45minB液从 50%变为 100%; 45min-50min保持 100%B液; 50min-72minA 液从 0%变为 100%。

2. 实验方法 样品前处理: 将实验样和对照样与流动相 A液对半稀释 (体积比 1 : 1进行稀 释), 作为上样样品。 上样样品进行反相高效液相色谱分析, 实验结果见图 3。

3. 实验结果 由图 3可见, a曲线是对照样的反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱, 洗脱 时间为 26min处有一明显的吸收峰, 其余峰高相对较低, 根据吸收值和肽键浓度 的正比关系, 可认为在 12%对照发酵乳 3000Da上清液 (对照样) 中, 其多肽类 物质较少, 且种类单一。 b曲线是瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液(实验样)反 相高效液相色谱 215nm 的洗脱图谱, 与对照发酵乳相比, 瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液的反相图谱中吸收峰明显增多, 且在洗脱时间为 21min、 24min和 33min处有三处最为明显的吸收峰, 实验中对这三个峰进行了收集, 分别记录为 发酵乳分离物 B峰、 发酵乳分离物 C峰和发酵乳分离物 D峰。

根据对各分子量对应的多肽与原发酵乳分离物 B峰、 C峰和 D峰对应分子量 物质的保留时间对比, 发现 444. 24Da的物质来源于发酵乳分离物的 B峰。

通过对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳的比较, 可发现经过瑞士乳杆菌发酵得 到的发酵乳, 其含有比对照发酵乳更为丰富的、 分子量小于 3000Da的多肽物质。 这些多肽类物质是由于原脱脂乳中的大蛋白被 瑞士乳杆菌所分泌的胞内酶和胞外 酶分解, 释放出一些多肽片段和游离的氨基酸所形成的 。 乳酸菌所分泌的胞外酶 对乳品中 β -酪蛋白片段具有非特异性或特异性的切割。 通常这些由微生物发酵 得到的多肽类物质, 极有可能具有一定的生物活性。 如果使用保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌组合生产普通酸奶, 由于多肽的产量少, 品种单一, 生物活性相对较 低。

根据反相高效液相色谱原理, 疏水性较差的物质由于与分离柱固相结合力较 弱, 先从分离柱中洗脱下来, 而疏水性较好的物质与分离柱固相键合作用较 大, 后从分离柱中被洗脱下来。 由此可得, 三个分离物其疏水性按如下顺序排列: 瑞 士乳杆菌发酵乳分离物 8峰>〔峰> 0峰。 经过收集操作, 得到 B峰值的样品, 采用真空冷冻干燥技术进行冷冻干燥, -4°C冷冻保藏, 作为后续质谱分析的实验 材料。 四、 生物活性多肽的质谱法分析和氨基酸序列测定

1.实验方法

( 1 ) 色谱条件:

仪器: Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾 -四级杆-飞行时间质谱仪 色谱柱规格: BEH C18 色谱柱

流速: 0.4mL/min

温度: 45 °C

紫外检测波长: 210nm

进样量: 7 L

梯度条件: 0min-3min保持 99%A液, 1%B液; 3min-9minB液从 1%变为 5%, A 液从 99%变为 95%; 9min-15minB液从 5%变为 10%, A液从 95%变为 90%; 15min-21min%B液从 10%变为 25%, A液从 90%变为 75%; 21min-24min, B液 从 25%变为 40%, A也从 75%变为 60%; 24min-27min, B液从 40%变为 80%, A液从 60%变为 20%; 27min-27.5min保持 80%B液, 20%A液; 27.5min-28min, B液从 80%变为 5%, A液从 20%变为 95%; 28min-28.5min, B液从 5%变为 1%, A液从 95%变为 99%; 28.5min-30min, 保持 99%A液, 1%B液。 A液: 含有 2% 乙腈和 0.05%TFA的 ddH20; B液: 100%乙腈

(2) 质谱条件:

离子方式: ES+

质量范围 (m/z): 100-1500

毛细管电压 (Capillary) (kV): 3.0

采样锥 (V): 35.0

离子源温度 (°C ) ) : 100

去溶剂温度 (°C ): 350

去溶剂气流 (L/hr): 600.0

碰撞能量 ( eV): 6.0 扫描时间 (sec): 0.3

内扫描时间 (sec): 0.02

二级质谱母离子质量 (m/z): 444.24

根据上述实验条件, 利用超高效液相-电喷雾 -四级杆-飞行时间质谱, 得到瑞 士乳杆菌发酵乳分离物 B峰中分子量为 444.24Da的多肽的一级质谱图、 二级质 谱图, 并通过 Masslynx软件计算氨基酸序列, 结果见图 4-6。

2. 实验结果 经过 Masslynx软件分析计算, 得到分子量为 444.25Da的活性多肽片段的氨 基酸序列为 Ser-Leu-Pro-Gln ( SLPQ), 记为 SEQ ID NO: 1。 该片段来源于瑞士 乳杆菌发酵乳分离物 B峰, 与 β-酪蛋白的 84〜87号的残基序列相对应, β-酪蛋白 氨基酸序列的 genbank序列号为 AAA30431.1 , 序列见 SEQ ID NO: 3。

实施例 2 生物活性肽的促进机体免疫力活性实验 一、 MTT法测定生物活性多肽 SLPQ的体外淋巴细胞增殖能力实验

1)实验材料与仪器:

试剂与材料: 实验动物 balb/c小鼠 (雄性 6-8周龄, 上海交通大学农业与生 物学院动物实验中心);瑞士乳杆菌发酵后反 高效液相色谱分离纯化得到的乳源 性生物活性多肽 SLPQ; 小鼠淋巴细胞提取液 (购自索来宝公司); RPMI1640培 养基(购自 GIBCO公司); 3-(4, 5-二甲基噻唑 -2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT, 购自 Amresco公司);伴刀豆蛋白(ConA,购自 Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA, 购自 Genebase公司); 胃蛋白酶 (购自 Sigma公司); 胰酶 (Corolase PP, 购自 AB公司)。

仪器: LRH-250F生化培养箱, 上海一恒科技有限公司; GL-22M高速冷冻离 心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司; Hera cell 150 C0 2 培养箱, Heraeus公司; Dragon Wellscan MK3酶标仪, Labsystems公司; ALPHA 1-2-LD 真空冷冻干燥机, Christ公司; 超高效液相色谱 -四极杆飞行时间质谱仪, waters公司。

2) 实验方法:

无菌条件下取小鼠脾脏, 用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞, 进行元代培 养。 用完全 RPMI1640培养液将细胞密度调整为 2.5 X 10 6 个 /mL。 在 96孔细胞培 养板中依次加入: 100 小鼠淋巴细胞悬液, 100 RPMI1640完全培养液, 20 L伴刀豆蛋白, lOO L样品。 另外, 设置空白对照组 (pH7.2〜7.4, 3mol/L 的 PBS)和阴性对照组(500 g/mLBSA), 研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没 有影响。 每组 3个平行实验样。 在 5%C0 2 37°C培养箱中培养 68h后, 无菌条件 下每孔加入 20 LMTT, 继续培养 4h, 小心弃去上清液, 每孔加入 lOO L二甲 基亚砜, 37°C生化培养箱孵化 lOmin, 摇匀, 用酶标仪在 570nm处测定吸光值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示, 计算方法如下: 束嫩指数=^:^ xlOOo/o

A 2 - A l 式中: Al为空白对照在 570nm处下的吸光值; A 2为阴性对照组在 570nm 处下的吸光值, A3为实验组在 570nm处下的吸光值。

3) 实验结果及分析 实验结果见表 2。 由表 2可知, 在生物活性肽 SLPQ的质量浓度为 500 μ g/mL 的条件下, 乳源性生物活性肽 SLPQ的刺激指数大于 BSA, 说明 SLPQ—定程度上 能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。 并且 SLPQ的刺激指数达到了 1.298, 和阴性对 照组具有显著差异(P〈0.05)。 因此, 可以认定该瑞士乳杆菌发酵乳分离得到的活 性多肽 SLPQ具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力, 可以作为一种保健品或者 添加剂食用, 能够提高动物和人体的特异性免疫能力。 表 2生物活性多肽 SLPQ对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组 刺激指数 SI

阴性对照组 1.107±0· 027

SLPQ 10 μ g/mL 1.180±0.096

SLPQ 100 μ g/mL 1.132±0· 056

SLPQ 500 μ g/mL 1.298±0.124*

注: *号标记为与阴性对照比较, 有显著性差异 (Ρ <0.05) 二、 ΜΤΤ法测定生物活性多肽 SLPQ的体外巨噬细胞增殖能力实验

1) 实验试剂及仪器

试剂: 实验动物 balb/c小鼠 (雄性 6-8周龄) 上海交通大学农业与生物学院 动物实验中心; 瑞士乳杆菌发酵后反相高效液相色谱分离纯化 得到的乳源性生物 活性多肽 SLPQ; 3-(4, 5-二甲基噻唑 -2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) Amresco 公司; LPS (月旨多糖) Sigma公司; 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA) Genebase公司; 三联溶解液, 含 10%SDS、 5%异丁醇以及 0. 012mol/L HC1的水溶 液。

仪器设备: LRH-250F生化培养箱 上海一恒科技有限公司; GL-22M高速冷 冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司; Hera cell 150 C0 2 培养箱 Heraeus 公司; Dragon Wellscan MK3酶标仪 Labsystems公司。

2) 试验方法:

balb/c小鼠腹腔注射 2mL的 2% (w/w)灭菌淀粉溶液, 连续注射三天, 最后 一次注射 24 小时后断颈处死。 剥去腹部皮肤, 用注射器吸取 4°C磷酸盐缓冲液 (PBS) 反复冲洗腹腔, 离心管收集冲洗液后, 离心 (lOOOrpm, 4°C ) 10分钟后 弃上清, 用 4°C RPMI1640完全培养液 (含 10%FBS) 洗涤两次, 0.2%台盼蓝溶 液染色做细胞活力检测, 确认采集到的有活力巨噬细胞占 95%以上。 细胞计数板 读数后, 调整细胞浓度至 2 X 10 5 个 /mL。

将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以 100 μ L/mL加入 96孔细胞培养板, 37°C、 5%C0 2 环境下培养 4小时后, 吸弃孔中液体,用 37°C RPMI1640完全培养液小心 清洗细胞培养板孔底, 洗去未贴壁的细胞和细胞碎片, 得到纯化后的贴壁腹腔巨 噬细胞。 每孔加入 0.2mL RPMI1640完全培养基, 实验用小肽样品及 LPS事先溶 解于培养基后加入, 开始细胞培养。

加入细胞个数为 2xl0 5 /mL的细胞悬液 100μΙ7孔,贴壁纯化后加入含生物活性 多肽 SLPQ(100、 50(^g/mL)的 RPMI1640完全培养液 (10%FBS) 200μΙ7孔; 设 置阴性对照组, 为 500 μ g/mL BSA的 RPMI1640完全培养液( 10%FBS); 以及空 白组连续培养 48小时, 炎症组在 24小时时加入 LPS至终浓度 100ng/mL。 44小 时时加入 5% ΜΤΤ 20μΙ7孔,达到 48小时后加入 100μΙ7孔的三联溶解液以终止培 养, 隔夜溶解后, 在波长 570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值 (OD570), 生长 指数 (Growth Indices) 的计算公式如下: 牛长 数 实验组 OD值 -空白培养液 OD值

"空白组 OD值 -空白培养液 OD值 其中, 空白培养液为含 10%FBS的 RPMI 1640完全培养液。 3 ) 实验结果

实验结果见表 3,在实验组中生物活性多肽 SLPQ的添加浓度分别为 500、 100 g/mL。 在正常组中, 和阴性对照组相比, 在浓度为 500 g/mL时, 具有极显著 差异(P<0.01 )。 说明生物活性多肽 SLPQ具有促进巨噬细胞增殖的能力, 能够有 效提高机体的非特异性免疫能力。

表 3生物活性多肽 SLPQ对体外巨噬细胞增殖的影响

实验分组 正常组 生长指数 GI 炎症组 生长指数 GI 阴性对照组 1. 027 ±0· 006 1. 051 ±0· 036

SLPQ 100 μ g/mL 1. 051 ±0· 360 1. 061 ±0· 029

SLPQ 500 μ g/mL 1. 155 ±0· 032** 1. 065 ±0· 029

注: **号标记为与阴性对照比较, 有显著性差异 (Ρ <0. 01)。 三、 生物活性多肽 SLPQ的促巨噬细胞一氧化氮分泌量实验 (Griess法)

1.实验试剂及设备

1 )试剂: 实验动物 balb/c小鼠 (雄性 6-8周龄)上海交通大学农业与生物 学院动物实验中心; 合成小肽 SLPQ (由上海强耀生物技术有限公司合成); LPS, Sigma公司; 一氧化氮检测试剂盒, 碧云天生物技术研究所生产。

2) 仪器设备

LRH-250F生化培养箱 上海一恒科技有限公司; GL-22M高速冷冻离心机 上海 卢湘仪离心机仪器有限公司; Hera cell 150 C02 培养箱 Heraeus公司; Dragon Wellscan MK3酶标仪 Labsystems公司。

2.试验方法

加入细胞个数为 2 X 10 mL的细胞悬液 100 μ !7孔, 贴壁纯化后加入含肽的 RPMI 1640完全培养液 (含 10%FBS) 200 μ !7孔, 设置不加小肽的细胞空白组。 炎 症组在 24小时时加入 LPS至终浓度 1 μ g/mL, 连续培养 48小时后, 收集培养液 上清 50 μ L/孔, 在培养液上清中依次添加 Griess试剂 1和 Griess试剂 2各 50 μ !7孔, 室温反应 10分钟后, 在 540nm波长下测定吸光度值 (0D540)。

3. 实验结果

实验结果见表 4, 与细胞空白相比, 正常组在 SLPQ浓度为 500 μ g/mL时具有 显著性差异 (P<0. 05), 说明 SLPQ具有促进巨噬细胞诱导一氧化氮分泌的能 , 能够有效促进巨噬细胞的免疫能力。 此外, 一氧化氮作为炎症严重程度的指标之一, 在炎症组中, 最高浓度到达 500 μ g/mL的 SLPQ也未引起一氧化氮分泌量的显著性增加, 明在 LPS引起的炎 症状态下, SLPQ不会进一步加重炎症的程度, 具有使用的安全性。 表 4生物活性多肽 SLPQ对巨噬细胞一氧化氮诱生量的影响 实验分组 正常组 0D540 炎症组 0D540 细胞空白 0.067 ±0· 003 0.130±0.015

SLPQ 100 μ g/mL 0.062 ±0· 002 0.128±0· 005

SLPQ 500 μ g/mL 0.071 ±0· 002* 0.132±0· 012

注: *号标记为与阴性对照比较, 有显著性差异 (Ρ <0.05) 实施例 3 生物活性多肽 SLPQ胃肠道消化稳定性

(1) 体外模拟胃肠道消化

模拟胃肠道消化实验主要分为两步进行。 首先, 配制浓度为 500 μ g/mL生物 活性多肽 SLPQ溶液, 在浓度为 500 μ g/mL SLPQ溶液中加入胃蛋白酶, 比例是每 克 SLPQ加入胃蛋白酶 20mg, 调节反应液的 pH值至 2.0, 在 37 °C恒温水浴中保温 90min ; 然后将反应液的 pH值调整至 7.5, 加入胰酶, 比例是每克 SLPQ加入胰酶 40mg, 在 37°C恒温水浴中保温 150min; 最后置于 95°C水浴中加热 5min使消化酶 失活, 将反应液冷冻浓縮干燥, 制成干粉, 储存于 -20°C条件下, 备用。

(2) 消化产物的质量和氨基酸序列测定

取体外模拟肠胃道消化后的样品粉末 0.2mg,加入 50 μ L水和 450 μ L无水乙 醇, 充分震荡后放入 -20°C冰箱 20min, 在 15000rpm转速条件下离心 30min, 取上 清液 400 μ L进行 UPLC-Q-T0F-MS分析。

UPLC条件: Hypers il GOLD C18色谱柱( 100mm*2. lmm, 1· 9 μ m, 19θΑ) (Thermo Scientific Co. ); 流动相 A: 0.1%甲酸水溶液, 流动相 B: 含 0.1%甲酸乙腈; 采 用从 99%的 A相到 50%A相的梯度洗脱程序; 流速 0. rnin; 柱温: 45°C; 进样 量: 5μΙ。

Q-T0F-MS条件: 飞行时间质谱仪, 质谱采用电喷雾电离源 (ESI), 正离子模 式。 并以 200n g /mL的亮氨酸脑啡肽进行实时精确质量校正 。质量扫描范围为 m/z 80-1000, 扫描时间为 0.3s。 毛细管电压 3kV; 锥孔电压 35V; —级质谱碰撞能量 为 4.0eV; 离子源温度 100°C ; 脱溶剂气温度和流量分别为 300°C, 500L/h。

根据上述实验条件, 生物活性多肽 SLPQ经过消化酶处理前后产物经 UPLC-Q-TOF-MS分析, 在所获得的总离子流图 (图 7 ) 中, 在空白对照、 胃蛋白酶 处理组、 胃蛋白酶-胰酶处理组中, 均只出现了 2个分子量为 444. 24Da的主峰, 分子量与 SLPQ相同, 且各个处理的保留时间和峰面积接近。 对胃蛋白酶-胰酶处 理组的 2个主峰进行了提取,采用 Q-T0F-MS分析获得了相应的质谱图(图 8和图 9), 两个峰的一级质谱图相同, 主要物质的核质比均为 444. 23, 证明 2个峰组成 物质相同, 是同分子量的第二个主峰由于第一次洗脱不完 全所形成的。 总离子流 图中主峰的分子量为 444. 24Da,说明是底物 SLPQ。上述实验结果证明生物活性多 肽 SLPQ在模拟胃肠道消化条件下不会被降解,在 过消化道后仍然能发挥所具有 的生物活性。