Biopuce à rapport signal fluorescent/signal parasite amélioré

Domaine technique de l'invention

L'invention concerne une biopuce comprenant un substrat supportant au moins une couche mince réfléchissante offrant une face de réception pour des éléments chimiques ou biologiques contenant au moins un constituant apte à émettre un signal fluorescent sous l'action d'un signal d'excitation, ladite couche réfléchissante présentant un coefficient de réflexion inférieur à 4% à la longueur d'onde du signal d'excitation et un coefficient de réflexion supérieur à 40% à la longueur d'onde du signal fluorescent.

état de la technique

Les dispositifs de détection par marquage fluorescent sont notamment utilisés dans les domaines reposant sur la détection de réactions chimiques ou biologiques (par exemple biopuces à ADN, puces à protéines, puces à cellules, puces à sucre...).

De tels dispositifs emploient le phénomène de fluorescence. Ce phénomène se produit lorsqu'une molécule émet, sous forme d'un signal fluorescent, une partie de l'énergie emmagasinée par absorption d'un signal lumineux d'excitation provenant d'une source lumineuse telle qu'un laser, une lampe à arc ou des diodes électroluminescentes (LED). Le signal fluorescent est, le plus souvent, sous la forme d'un rayonnement ultraviolet ou visible ayant une longueur d'onde supérieure à celle du signal d'excitation.

A titre d'illustration, un dispositif d'imagerie de fluorescence 1 selon l'art antérieur est représenté sur la figure 1. Le dispositif d'imagerie 1 fonctionne suivant le principe d'épifluorescence. Il comporte une source lumineuse 2

destinée à émettre un signal d'excitation 3 en direction d'un cube séparateur 4 dans lequel le signal d'excitation 3 est réfléchi en direction d'éléments chimiques ou biologiques 5 à analyser. Lorsque le signal d'excitation 3 atteint les éléments 5, qui sont déposés sur un substrat 6, ceux-ci ré-émettent un signal fluorescent 7 après excitation d'au moins un constituant fluorescent contenu dans les éléments 5. Parallèlement, le signal d'excitation 3 se réfléchit sur la face supérieure 8 du substrat 6 où sont déposés les éléments 5 à analyser pour créer un signal d'excitation réfléchi 9, dont l'intensité dépend du coefficient de réflexion de la face supérieure 8 du substrat 6. Ce coefficient est, par exemple, proche de 4% dans le cas d'une lame de verre. Le signal fluorescent 7 et le signal d'excitation réfléchi 9 traversent un filtre 10 qui laisse passer essentiellement le signal fluorescent 7, qui est ensuite lu par un détecteur 11 , par exemple une caméra CCD ou un photomultiplicateur.

La détection de réactions chimiques ou biologiques sur un substrat 6 par marquage fluorescent est rendue difficile par le faible niveau d'intensité du signal fluorescent 7 émis par les constituants fluorescents, généralement des fluorophores. Le document US6177990-B1 décrit un système d'imagerie à épifluorescence, semblable au dispositif d'imagerie 1 de la figure 1 , mais visant à remédier à l'inconvénient précédent en renforçant la fluorescence. Dans ce système, le substrat comporte une base rigide ayant une surface réfléchissante spéculaire, lisse, généralement plate, et une couche de revêtement transparente déposée sur ladite surface réfléchissante. La couche de revêtement présente une épaisseur sélectionnée de sorte que le trajet optique allant de la partie supérieure de la couche de revêtement jusqu'à la surface réfléchissante est égal à un quart de la longueur d'onde du signal d'excitation. Les éléments chimiques ou biologiques à analyser sont déposés sur la face supérieure de la couche de revêtement. Ce système permet de renforcer le signal d'excitation, ce qui induit une augmentation concomitante du signal fluorescent.

Ce système d'imagerie à épifluorescence n'est pas complètement satisfaisant. En effet, bien que le signal fluorescent reçu par le détecteur soit plus élevé que dans l'art antérieur, ce dernier reçoit aussi un signal parasite plus élevé à cause du renforcement du signal d'excitation. En pratique, le rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite est plus faible que pour une lame de verre classique, détériorant la qualité des résultats mesurés. Ceci rend, de surcroît, impossible l'analyse d'éléments chimiques ou biologiques de concentrations très faibles car, dans ce cas, le rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite est alors trop faible. Ces inconvénients dus à la constitution du substrat sont présents quel que soit le type de dispositif d'imagerie dans lequel ledit substrat est utilisé.

Le document US2004/0092028-A1 décrit une biopuce permettant un renforcement de la fluorescence grâce à une couche mince ou à un empilement de couches minces assurant une fonction miroir pour la longueur d'onde du signal d'excitation. L'épaisseur e de la couche mince ou l'épaisseur de chaque couche mince de l'empilement est calculée à partir de la formule suivante :

N.e = k./4 où N est l'indice de réfraction du matériau de couche mince pour la longueur du signal d'excitation et k est un entier impair. Ce type de biopuce permet d'augmenter le signal fluorescent par un renforcement du signal d'excitation et présente donc les mêmes inconvénients que le substrat décrit dans le document US6177990-B1.

Le document WO2004/109264 décrit, quant à lui, un substrat échantillon comportant un revêtement multicouche à interférence ayant au moins deux couches, dans lequel l'épaisseur des couches garantit que le signal fluorescent émis par le constituant correspondant placé sur la face supérieure de ce revêtement est réfléchi. Ce document prévoit que l'épaisseur des couches garantit une réflexion de la quasi-totalité (99,5%) de la lumière émise par les

fluorophores, ainsi qu'une transmission de la quasi-totalité (98%) de la lumière d'excitation non absorbée par le matériau fluorescent. Ces substrats ne fournissent cependant pas des résultats satisfaisants.

Objet de l'invention

L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients et, plus particulièrement, d'améliorer le rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite détectés par un dispositif d'imagerie par fluorescence.

Ce but est atteint par une biopuce selon les revendications annexées. En particulier, la présente invention prévoit ainsi une biopuce où la couche réfléchissante introduit une différence de phase sensiblement égale à 360° entre le signal fluorescent émis par le constituant et le signal fluorescent réfléchi par la couche réfléchissante.

Description sommaire des dessins

D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 illustre un mode particulier de réalisation d'un dispositif d'imagerie de fluorescence selon l'art antérieur, - la figure 2 est une vue en coupe transversale d'une biopuce selon l'invention, la figure 3 est une vue en coupe transversale d'un exemple de réalisation de biopuce selon l'invention, optimisée pour le fluorophore CY3, la couche réfléchissante constituant une cavité de Fabry-Pérot, - la figure 4 illustre l'évolution du coefficient de réflexion de la couche réfléchissante de la biopuce de la figure 3, en fonction de la longueur d'onde

d'un signal incident,

- la figure 5 illustre le signal parasite mesuré pour trois biopuces, respectivement selon l'art antérieur (A et B) et selon l'invention (C), la figure 6 illustre le rapport K entre le signal fluorescent mesuré et le signal parasite mesuré pour les trois biopuces A, B et C, la figure 7 schématise la luminosité reçue par le détecteur pour chacune des trois biopuces A, B et C.

Description de modes particuliers de réalisation

La figure 2 est une vue en coupe transversale d'une biopuce selon la présente invention. Elle représente un substrat 12 supportant une couche mince réfléchissante 13. Cette dernière offre une face de réception 14 pour des éléments chimiques ou biologiques 15, schématisés sous la forme d'une couche. Lesdits éléments contiennent un ou plusieurs constituants fluorescents destinés à être activés par un signal d'excitation pour émettre un signal fluorescent (non représentés sur la figure 2).

La couche mince réfléchissante 13 présente un coefficient de réflexion inférieur à 4% à la longueur d'onde du signal d'excitation et un coefficient de réflexion supérieur à 40% à la longueur d'onde du signal fluorescent. Ainsi, le signal d'excitation réfléchi est très faible, tandis que le signal de fluorescence réfléchi est important. Ainsi, alors que dans l'art antérieur précité, certaines biopuces permettent un renforcement de fluorescence par une augmentation, par réflexion, du signal d'excitation, la biopuce de la figure 2 permet de renforcer la fluorescence uniquement grâce à un coefficient de réflexion élevé (au moins

40%) pour le signal fluorescent. Par contre, le signal d'excitation réfléchi est réduit autant que possible grâce à un coefficient de réflexion inférieur à 4% à cette longueur d'onde.

La couche mince réfléchissante 13 est, de préférence, constituée par un

empilement de sous-couches minces de matériaux diélectriques présentant alternativement un indice de réfraction fort et faible. Ces matériaux peuvent être déposés par des techniques de type PVD (« Physical Vapor Déposition »), par dépôt chimique en phase vapeur du type CVD (« Chemical Vapor Déposition ») ou par dépôt par voie sol-gel (trempage/retrait ou centrifugation). L'épaisseur des sous-couches peut varier de quelques dizaines à quelques centaines de nm.

Le matériau à fort indice de réfraction est par exemple choisi parmi les matériaux suivants : TiO ₂ , HfO ₂ , Si ₃ N ₄ , Ta ₂ O ₅ , AI ₂ O ₃ , In ₂ O ₃ . Le matériau à faible indice de réfraction est, quant à lui, choisi parmi par exemple les matériaux suivants : SiO ₂ , MgF ₂ , LiF.

Suivant les applications, la couche réfléchissante 13, de préférence sous forme d'un empilement de sous-couches minces, peut être déposée sur l'ensemble du substrat 12 ou sur un substrat structuré. En outre, la dernière sous-couche doit comporter une compatibilité biologique ou chimique avec les sondes à greffer sur cette sous-couche. De manière générale, la face de réception 14 doit être chimiquement réactive pour une liaison avec un constituant donné des éléments chimiques ou biologiques 15, ou doit posséder des propriétés électrostatiques aptes à créer un accrochage avec ledit constituant.

Quel que soit le type de dispositif d'imagerie dans lequel la biopuce de la figure 2 est utilisée, les matériaux constituant les sous-couches minces, l'épaisseur et le nombre desdites sous-couches, sont déterminés de telle manière que la couche réfléchissante 13 présente un coefficient de réflexion inférieur à 4% à la longueur d'onde du signal d'excitation et un coefficient de réflexion supérieur à 40% à la longueur d'onde du signal fluorescent émis par les éléments 15.

Un coefficient de réflexion très élevé de la couche 13 pour la longueur d'onde des signaux fluorescents est certes un paramètre important pour le contrôle de

l'émission de la fluorescence, mais il est indispensable de considérer également l'aspect ondulatoire de ces signaux. Les signaux émis par les éléments 15 peuvent être décomposés en ondes planes. En considérant une seule direction d'onde plane, définie par un angle mesuré par rapport à la normale à la couche 13, le signal total reçu par le détecteur 11 correspond à la somme de l'intensité de l'onde plane émise par les éléments 15 et reçue directement par le détecteur 11 et de l'intensité de l'onde plane réfléchie par la couche 15 et reçue, après réflexion, par le détecteur 11. Cette somme résulte de l'interférence entre ces deux ondes planes et l'intensité émise dans la direction s'écrit :

I = E _{1 +} E; I 2

où E ₁ et E ₂ représentent le champ électromagnétique respectivement de l'onde plane émise par les éléments 15 et reçue directement par le détecteur 11 et de l'onde plane réfléchie par la couche 15 et reçue ensuite par le détecteur 11.

Et :

E ₁ = E ₀

E ₀ étant l'amplitude du champ électromagnétique émis par les éléments 15 dans la direction .

De plus : E ₂ = E ₀ r exp(iφ)

où r est le coefficient de réflexion de la couche 13 à la longueur d'onde des signaux fluorescents et φ la phase induite par la couche 13.

L'intensité émise dans la direction s'écrit donc :

l = l _o | 1+r exp(iφ) | ²

Par conséquent, l'intensité totale des signaux fluorescents reçus par le détecteur 11 est maximale pour les conditions suivantes : - un coefficient de réflexion maximal des signaux fluorescents, par exemple proche de 100%, une différence de phase égale à 360° introduite par la couche 13 lors de la réflexion des signaux fluorescents.

Ainsi, quel que soit le type de dispositif d'imagerie dans lequel la biopuce de la figure 2 est utilisée, les matériaux constituant les sous-couches minces, l'épaisseur et le nombre desdites sous-couches, sont déterminés de telle manière que la couche réfléchissante 13 introduit une différence de phase sensiblement égale à 360° entre les signaux fluorescents émis par les éléments 15 et les signaux fluorescents réfléchis par la couche 13. En effet, les éléments 15 émettent des signaux fluorescents aussi bien en direction du filtre 10 et du détecteur 11 , qu'en direction de la couche réfléchissante 13. Cette différence de phase permet d'éliminer toute interférence qui risquerait d'annuler le signal fluorescent émis directement. Avec un déphasage de 360°, les ondes des signaux fluorescents parvenant directement au détecteur 11 sont en interférence constructive avec les ondes des signaux fluorescents réfléchis sur la couche 13.

A titre d'exemple, la longueur d'onde du signal d'excitation est 532 nm et celle du signal fluorescent est environ 580 nm pour le fluorophore CY3. La figure 3 illustre une biopuce optimisée pour ce fluorophore. Sur le substrat 12, par exemple en silicium, la couche mince réfléchissante 13 a été déposée sous la forme d'un empilement de dix sous-couches minces 16 à 25. Les sous- couches sont alternativement en silice et en dioxyde de titane. Ainsi les sous- couches 16, 18, 20, 22, et 24 sont en silice, d'indice de réfraction faible, par exemple égal à 1 ,5 pour la longueur d'onde du signal d'excitation. Les sous-

couches 17, 19, 21 , 23, et 25 sont en dioxyde de titane TiO ₂ , d'indice de réfraction fort, par exemple égal à 2,3 pour la longueur d'onde du signal d'excitation. Les sous-couches 16 à 25 sont déposées avec la technique PVD et leurs épaisseurs sont des quarts d'ondes optiques pour la longueur d'onde d'excitation. L'empilement des sous-couches 16 à 25 constitue une cavité de Fabry-Pérot centrée sur la longueur d'onde du signal d'excitation.

La figure 4 illustre l'évolution du coefficient de réflexion CR de la couche réfléchissante 13 de la figure 3 en fonction de la longueur d'onde d'un signal incident. Conformément à l'invention, le coefficient de réflexion CR est presque nul pour la longueur d'onde d'excitation (532nm). Par contre, CR est proche de 100% à la longueur d'onde du signal fluorescent afin de renforcer la fluorescence.

Des essais et des mesures ont été réalisés avec un second exemple de biopuce conforme à l'invention (non représenté). Cette dernière comporte un substrat supportant une couche mince réfléchissante constituée d'un empilement de 14 sous-couches minces de SiO ₂ alternées avec 13 sous- couches minces de TiO ₂ . Le tableau suivant indique l'épaisseur des sous- couches :

Dans les essais, trois biopuces ont été comparées : une lame de verre classique (référencée A), une biopuce conforme aux enseignements du document

US2004/0092028-A1 (référencée B), le deuxième exemple de biopuce conforme à l'invention (référencée C), comportant les 27 sous-couches minces ci-dessus.

La face de réception des trois biopuces a été préparée pour être chimiquement réactive pour le greffage de sondes biologiques contenant chacune des

fluorophores CY3.

Les essais et les mesures ont été réalisés grâce à un scanner. La figure 5 illustre le signal parasite mesuré pour les trois biopuces et révèle d'une part son augmentation avec la biopuce B (de 55 à 113 NG) et d'autre part sa diminution avec la biopuce C (de 55 à 40 NG), par comparaison avec la biopuce A. La figure 6 illustre, quant à elle, le rapport K entre le signal fluorescent mesuré et le signal parasite mesuré. La figure 6 révèle que K diminue avec la biopuce B (de 882 à 459) et augmente avec la biopuce C (de 882 à 1222), par comparaison avec la biopuce A.

La figure 7 schématise l'intensité L des signaux optiques reçus à proximité d'une sonde biologique par le détecteur du scanner pour chacune des trois biopuces A, B et C. La figure 7 illustre l'intensité L, d'une part, du signal fluorescent mesuré (partie supérieure du créneau) et, d'autre part, du signal parasite mesuré (partie basse du créneau). La figure 7 confirme que le signal fluorescent mesuré pour le cas C est nettement supérieur au signal fluorescent du cas A, grâce au coefficient de réflexion de la couche mince réfléchissante, supérieur à 40% pour la longueur d'onde du signal fluorescent. Pour le cas A, le coefficient de réflexion est environ égal à 4% quelle que soit la longueur de l'onde incidente. De plus, le signal parasite dans le cas C est inférieur ou égal à celui du cas A grâce à un coefficient de réflexion de la couche réfléchissante inférieur à 4 %, pour le signal d'excitation. Le rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite est donc nettement amélioré pour le cas C par rapport à la biopuce A.

De plus, le coefficient de réflexion de la couche mince réfléchissante à la longueur d'onde du signal d'excitation est nettement inférieur dans le cas C (égal à moins de 4%) que dans le cas B (60% au moins). Comme l'intensité du signal d'excitation réfléchi varie suivant la valeur de ce coefficient, le signal d'excitation réfléchi est nettement plus faible pour le cas C. Or, le signal

parasite mesuré augmente avec le signal d'excitation réfléchi. En effet, en pratique, une partie du signal d'excitation réfléchi traverse le filtre 10 placé devant le détecteur 11 et le filtre 10 lui-même peut être rendu fluorescent à cette irradiation. Par conséquent, et comme l'illustre la figure 7, le signal parasite dans le cas B est très supérieur à celui du cas C.

Par contre, le signal de fluorescence reçu de la biopuce C est inférieur à celui reçu de la biopuce B, car, avec celle-ci, l'augmentation du signal d'excitation augmente l'émission du signal fluorescent détecté. Cependant, la réduction du signal fluorescent détecté est moins importante que celle du signal parasite, car le coefficient de réflexion de la couche mince réfléchissante à la longueur d'onde du signal fluorescent reste élevé (au moins 40%) dans la biopuce C. Le rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite est donc amélioré avec la biopuce C.

L'augmentation du rapport entre le signal fluorescent et le signal parasite grâce à la biopuce conforme à l'invention permet d'améliorer la qualité d'analyse. En particulier, ceci rend possible l'analyse d'éléments chimiques ou biologiques de concentrations très faibles au moyen d'une amplification adéquate des signaux reçus par le détecteur.

Enfin, quel que soit le type de dispositif d'imagerie dans lequel la biopuce conforme à l'invention est utilisée, les matériaux constituant les sous-couches minces de la couche réfléchissante, l'épaisseur et le nombre desdites sous- couches, sont déterminés par tout moyen approprié, par exemple grâce à des résultats expérimentaux ou des calculs numériques. On peut notamment utiliser des logiciels ou méthodes d'optimisation connus, par exemple de l'article de A. V. Tikhonravov et al « Application of the needle optimization technique to the design of optical coatings » (Applied Optics- 1 octobre 1996- Vol 35- N°28).