DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne le domaine des agents d'imagerie médicale, en particulier des agents d'imagerie bimodale et/ou des agents théragnostiques. L'invention vise notamment à permettre un marquage spécifique de biomolécules par des sondes d'imagerie.

En particulier, l'invention concerne une plateforme trifonctionnalisée de formule (I), telle que décrite ci-dessous, qui permet de conjuguer un agent bioactif vectorisant à au moins une sonde d'imagerie, et dont la troisième fonctionnalité peut être une seconde sonde d'imagerie (application en imagerie bimodale), un agent cytotoxique (application en théragnostique), un agent d'affinité ou un agent solubilisant.

L'invention porte également sur une méthode de synthèse de ces plateformes trifonctionnalisées par réaction de Diels-Alder à demande électronique inverse à partir d'une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) pouvant être elle-même obtenue à partir d'une tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) (Figure 1). L'invention concerne en outre les plateformes tétrazines intermédiaires mono- et bi-fonctionnalisées de formules (IV) et (II) respectivement.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE

Le marquage de biomolécules, telles que par exemple des protéines comme les anticorps ou encore des peptides, par des sondes d'imagerie et/ou des agents cytotoxiques connaît un essor important et vise à fournir de puissants outils pour la biologie chimique ou la médecine humaine. Des protéines marquées par de la biotine et des fluorophores sont par exemple utilisées quotidiennement en tant que sondes pour explorer la biologie cellulaire. Des peptides ou des anticorps, conjugués à des sondes d'imagerie, servent d'agents de diagnostic dans les

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) services de médecine nucléaire. De même, des anticorps conjugués à des agents cytotoxiques (ADC - Antibody Drug Conjugate) présentent des résultats cliniques prometteurs et sont au cœur de la recherche dans l'industrie pharmaceutique.

Il a été démontré qu'un contrôle rigoureux du site de conjugaison sur la biomolécule est critique. En effet, le nombre et la localisation des sondes d'imagerie ou des agents cytotoxiques attachés à une biomolécule peut avoir un fort impact sur sa biodistribution, la qualité d'image ou l'activité thérapeutique. De plus, un marquage aléatoire des biomolécules peut poser des problèmes de reproductibilité, notamment lors du passage à une production à grande échelle, et complique l'obtention des autorisations de mise sur le marché par les organismes de réglementation.

De récents progrès en biochimie ont permis de synthétiser des biomolécules doublement marquées. De tels conjugués, encore difficiles à obtenir, ouvrent cependant de nouvelles opportunités. Boerman et co. ont par exemple développé des sondes d'imagerie bimodale permettant un diagnostic du corps entier du patient par imagerie nucléaire, suivi du guidage du chirurgien par imagerie par fluorescence du champ in tra- opératoire (Lutje et al., Mol Imaging Biol, 2014, 16, 747-755 ; Hekman et al., Clin Cancer Res, 2016, 22, 4634-4642). De même, Maruani et al. ont marqué de manière spécifique un anticorps avec un agent cytotoxique et un fluorophore, obtenant ainsi un ADC à potentiel théragnostique (Maruani et al., Org Biomol Chem, 2016, 14, 6165-6178). Xu et al. ont pour leur part développé des agents hétéro-bivalents, pour l'imagerie et la thérapie, capables de cibler deux récepteurs présents à la surface d'une cellule spécifique, afin d'améliorer la sélectivité cellulaire et l'absorption de médicaments (Xu et al., PNAS, 2012, 109, 21295-21300).

Le double marquage de biomolécules nécessite le développement de nouvelles méthodes qui doivent être :

- faciles à mettre en œuvre, i.e. ne nécessitant pas de compétences avancées en chimie organique et/ou en biologie moléculaire ;

- régio-sélectives, afin d'assurer leur reproductibilité, faciliter la production à grande échelle et affecter le moins possible l'activité des biomolécules ;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) - biocompatibles, i.e. pouvant être réalisées en conditions douces pour préserver l'intégrité de constituants sensibles tels que par exemple des protéines ou des fluorophores ; et

- modulables, afin de préparer une grande variété de biomolécules doublement marquées à partir d'un même intermédiaire, par une même méthode.

Les méthodes actuelles de marquage régio-sélectif des protéines reposent sur le génie génétique des protéines recombinantes, les modifications enzymatiques, le ciblage chimique des acides aminés rares ou l'introduction d'acides aminés non naturels portant des fonctions réactives bio-orthogonales. Effectuer des modifications ré gio- sélectives sur deux acides aminés d'une protéine est réalisable, mais nécessite des technologies avancées en génie protéique qui sont souvent difficiles à adapter à la production à grande échelle.

Afin de s'affranchir de ces problèmes, la présente invention propose une méthode modulaire mettant en œuvre une plateforme trifonctionnelle, permettant de lier de manière ré gio- sélective deux marqueurs à une biomolécule. Dans le cas d'une protéine, l'acide aminé par lequel elle est couplée à la plateforme trifonctionnelle peut être un acide aminé non-naturel, ou une cystéine introduite par des méthodes bien connues telles que la mutagenèse dirigée.

De plus, la présente invention propose une méthode de marquage ayant une excellente sélectivité pour les fonctions thiol des cystéines par rapport aux fonctions aminé ou hydroxy des lysines et des sérines respectivement, ou d'autres fonctions potentiellement réactives, présentes sur des groupes bioactifs tels que des peptides ou des anticorps.

Quelques plateformes trifonctionnelles permettant le double marquage de protéines ont été décrites, mais leur mise en œuvre nécessite un grand nombre d'étapes, dont certaines sont incompatibles avec des molécules fragiles comme les sondes proche infra-rouge ou les protéines (Maruani et al., Org Biomol Chem, 2016, 14, 6165-6178 ; Beal et al., Angew Chem Int Ed, 2012, 51, 6320-6326 ; Maruani et al., Nat Commun, 2015, 6, 6645 ; Rhashidian et al., J Am Chem Soc, 2013, 135, 16388-16396). De plus, ces synthèses ne sont pas modulables car elles débutent généralement par l'étape de

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) préparation de la sonde doublement marquée : faire varier la nature de l'un des marqueurs nécessite alors de refaire la synthèse complète, et éventuellement d'adapter certaines étapes de synthèse.

Il existe donc un besoin pour de nouvelles plateformes trifonctionnelles permettant de fournir de manière modulable et biocompatible des biomolécules doublement marquées, i.e. marquées par une sonde d'imagerie et une seconde fonctionnalité pouvant être une seconde sonde d'imagerie, un agent cytotoxique, un agent d'affinité ou un agent de solubilisation.

La méthode de la présente invention est modulaire et permet l'accès à la biomolécule doublement marquée en seulement deux ou trois étapes de synthèse. La biomolécule peut être introduite lors de la dernière étape, ce qui permet de limiter sa dégradation lors des étapes intermédiaires si elle est très sensible ou dans le cas d'une biomolécule peu stable. Alternativement, elle peut être introduite avant le second marquage, facilitant ainsi l'optimisation du double marquage et permettant des approches de pré-ciblage. Comme mis en évidence dans la partie expérimentale ci-dessous, la méthode de synthèse de l'invention peut être mise en œuvre dans des conditions extrêmement douces et en milieu aqueux, compatibles avec les biomolécules fragiles, telles que les protéines ou des anticorps.

RÉSUMÉ

L'invention concerne donc un com osé de formule (I)

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) ou un de ses tautomères, dans laquelle le cycle A, X 1 , L1 , L2 , L 3 , R 1 , R2 et R 3 sont tels que définis ci-après, en particulier R 1 , R2 et R 3 représentent chacun indépendamment un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R2 représente un groupe détectable, et au moins l'un de R 2 et R 3 représente un groupe bioactif.

Selon un mode de réalisation, dans le composé de formule (I) :

le groupe détectable est choisi parmi un fluorophore, un chromophore, une sonde pour l'imagerie nucléaire, une sonde IRM ;

le groupe bioactif est choisi parmi un anticorps, un peptide, un peptidomimétique, une protéine, une petite molécule telle que l'acide folique, un aptamère, une nanoparticule ou un liposome ;

l'agent cytotoxique est choisi parmi l'auristatine monométhyle E, le maytansinoide DM1, la Duocarmycine, la Calicheamicine, Γ alpha- amanitine, un groupe portant un radiométal, une nanoparticule de silice ou une nanoparticule d'or ;

le groupe d'affinité est choisi parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine et un peptide hexa-histidine ; et

le groupe de solubilisation est choisi parmi des chaînes linéaires ou ramifiées poly(éthylène glycol), des chaînes linéaires ou ramifiées poly(acide glutamique) et le cholestérol.

L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant un composé de formule (I) selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention concerne également l'utilisation du composé de formule (I) selon l'invention en tant que médicament et/ou pour de l'imagerie médicale.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) L'invention concerne aussi une méthode de synthèse d'un composé de formule (I) selon l'invention, comprenant la mise en contact d'une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) :

dans laquelle X 1 , L1 , L2 , R 1 et R2 sont tels que définis ci-après, en particulier R 1 et R représentent chacun indépendamment un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R 2 représente un groupe détectable ; avec un alcyne ou un alcène de formule (III)

^==ï (III) dans laquelle le cycle A, L 3 et R 3 sont tels que définis ci-dessous, en particulier R 3 représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 2 et R 3 représente un groupe bioactif. Selon un mode de réalisation, la méthode de synthèse de l'invention comprend en outre une étape préliminaire de formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) par substitution nucléophile sur une tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) :

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) dans laquelle Y ² , X ¹ , L ¹ et R ¹ sont tels que définis ci-après, en particulier R ¹ représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; en présence d'un thiol de formule (V)

R ² — L ² — SH (V)

dans laquelle L 2 et R 2 sont tels que définis ci-après, en particulier R 2 représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R 2 représente un groupe détectable.

Selon un mode de réalisation, la méthode de synthèse de l'invention comprend en outre une étape préliminaire de formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) par mono substitution nucléophile d'une tétrazine de formule (VI) :

dans laquelle Y 1 et Y 2 sont tels que définis ci-après, en présence d'un nucléophile de formule (VII) :

R ¹ L ¹ — X ¹ -H (Vil) dans laquelle X , L et R sont tels que définis ci-après, en particulier R représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation.

L'invention concerne en outre un composé intermédiaire de formule (II)

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) dans laquelle X 1 , L1 , L2 , R 1 et R2 sont tels que définis ci-après, en particulier R 1 et R représentent chacun indépendamment un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R 2 représente un groupe détectable. L'invention concerne aussi un composé intermédiaire de formule (IV)

dans laquelle Y ² , X ¹ , L ¹ et R ¹ sont tels que définis ci-après, en particulier R ¹ représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation. L'invention concerne également l'utilisation du composé de formule (IV) dans lequel X ¹ est S, pour fonctionnaliser de manière sélective les fonctions thiol des cystéines d'une biomolécule sélectionnée parmi des peptides, des polypeptides, des protéines ou des anticorps.

L'invention concerne également l'utilisation du composé de formule (II) ou d'un composé de formule (IV), en tant qu'intermédiaire de synthèse pour obtenir le composé de formule (I).

DÉFINITIONS

Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : Le terme « alcényle » fait référence à toute chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, portant au moins une double liaison, de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 2 à 6 atomes de carbone, tel que par exemple éthényle, 2-propényle, 2-butényle, 3-butényle, 2-pentényle et ses isomères, 2-hexényle et ses isomères, 2,4-pentadiényle.

Le terme « alcoxy » se réfère à un groupe -O-alkyle.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Le terme « alcynyle » fait référence à toute chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, portant au moins une triple liaison, de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 2 à 6 atomes de carbone, tel que par exemple éthynyle, 2-propynyle, 2-butynyle, 3- butynyle, 2-pentynyle et ses isomères, 2-hexynyle et ses isomères. Le terme « agent chélatant » se réfère à une molécule polydentate capable de former des liaisons de coordination avec un ion métallique pour former un complexe métallique, aussi appelé chélate.

Le terme « alkylaryle » fait référence à un groupe aryle substitué par un groupe alkyle et peut s'écrire : -aryle-alkyle. Le terme « alkyle » fait référence à toute chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée saturée, de 1 à 12 atomes de carbone, de préférence de 1 à 6 atomes de carbone, tel que par exemple méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tertio-butyle, pentyle et ses isomères (e.g. n-pentyle, iso-pentyle), hexyle et ses isomères (e.g. n-hexyle, iso-hexyle). Le terme « alkylhétéroaryle » fait référence à un groupe hétéroaryle substitué par un groupe alkyle et peut s'écrire : -hétéroaryle-alkyle.

Le terme « anticorps » fait référence à des protéines gamma globulines que l'on trouve dans le sang ou d'autres fluides corporels de vertébrés, et sont utilisées par le système immunitaire pour identifier et neutraliser des corps étrangers, tels que des bactéries et des virus. Les anticorps se composent de deux paires de chaînes polypeptidiques, appelées chaînes lourdes et chaînes légères, qui sont disposées sous forme d'un Y. Le terme « anticorps » tel qu'il est utilisé ici, comprend des anticorps monoclonaux, des anticorps polyclonaux, des anticorps multispécifiques (par exemple, des anticorps bispécifiques), des fragments d'anticorps, des anticorps chimériques ou hybrides, des anticorps à domaine unique, des produits d'assemblage de fragments d'anticorps dimères ou trimères ou minicorps.

Le terme « arylalkyle » fait référence à un groupe alkyle substitué par un groupe aryle et peut s'écrire : -alkyle- aryle.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Le terme « aryle » fait référence à un groupe polyinsaturé hydrocarbyle aromatique ayant un seul cycle (par exemple phényle) ou plusieurs cycles aromatiques fusionnés (par exemple naphtyle) ou lié par covalence (par exemple biphényle), contenant typiquement 5 à 15 atomes de carbone ; de préférence 6 à 10, dans lequel au moins un cycle est aromatique. Le cycle aromatique peut éventuellement inclure un à deux cycles supplémentaires (soit cycloalkyle, hétérocyclyle ou hétéroaryle) fusionnés à celui-ci. Des exemples non limitatifs de groupes aryles comprennent les groupes phényle, biphénylyle, biphénylényle, 5 ou 6 tétralinyle, naphtalène-1- ou -2-yle, 4, 5, 6 ou 7- indényle, 1- 2-, 3-, 4- ou 5- acénaphtylényl, 3-, 4- ou 5-acénaphtényl, 1- ou 2-pentalényle, 4- ou 5- indanyle, 5-, 6-, 7- ou 8-tétrahydronaphtyle, 1,2,3,4-tétrahydronaphtyle, 1,4- dihydronaphtyle, le 1-, 2-, 3-, 4- ou 5-pyrényle.

Le terme « chélate » fait référence à une molécule comprenant un ion métallique. La chélation (ou complexation) implique la formation ou la présence de deux ou plusieurs liaisons de coordination distinctes entre une molécule polydentate (permettant des liaisons multiples) et un seul atome métallique central. Les molécules polydentates sont souvent des composés organiques, et sont appelés agents chélateurs, chélatants, ligands, ou agents séquestrants.

Le terme « contraint », dans l'expression « alcyne ou alcène cyclique contraint » signifie que alcyne ou alcène, présent dans ce cycle, subit un stress appelé tension de cycle, qui augmente son énergie interne, le rendant ainsi plus réactif que son équivalent acyclique.

Le terme « cycloalcène » fait référence à un groupement alcène cyclique ou polycyclique non aromatique, optionnellement ponté, optionnellement fusionné avec un ou plusieurs groupes aryles ; de préférence un groupement cyclooctèyne, bicyclo[6.1.0]nonèyne, norbornèyne, 5,6-dihydrodibenzo[a,e][8]annulèyne.

Le terme « cycloalkyle » fait référence à un groupement alkyle cyclique ou polycyclique, optionnellement ponté, optionnellement fusionné avec un ou plusieurs groupes aryles ; de préférence un groupement cyclopropyle, cyclopentyle, cyclohexyle, cyclooctyle, norbornyle, bicyclo[6.1.0]nonyle.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Le terme « diénophiles » fait référence à un groupe d'atomes susceptibles de réagir avec un diène via une réaction de cycloaddition [4+2] ; de préférence un alcyne ou un alcène.

Le terme « espaceur » se réfère à une liaison covalente ou un groupement comprenant une série de liaisons covalentes stables, le groupement comportant de 1 à 40 atomes plurivalents choisis dans le groupe constitué de C, N, O, S et P ; liant de façon covalente deux parties des composés de l'invention. Le nombre d'atomes plurivalents dans un espaceur peut être, par exemple, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25 ou 30. Un espaceur peut être linéaire ou non-linéaire ; certains espaceurs ont des chaînes latérales ou des groupes fonctionnels pendants (ou les deux). Des exemples de telles chaînes latérales sont des modificateurs d'hydrophilicité, par exemple des groupes solubilisants comme, par exemple, sulfo (-SO ₃ H ou -SO ₃ ^" ) ou carboxylate (-COO ).

Dans un mode de réalisation, un espaceur est composé de toute combinaison de liaisons simples, doubles, triples ou aromatiques carbone-carbone, carbone-azote, azote-azote, carbone-oxygène et carbone-soufre. Les espaceurs peuvent à titre d'exemple consister en une combinaison de groupements choisis parmi les groupes alkyle, -C(0)NH-, -NHC(O)-, -C(0)Ar-, -ArC(O)-, -C(0)0-, -NH-, -S-, -O-, -C(O)-, -S(0) _n - où n est égal à 0, 1 ou 2 ; cycles à 5 ou 6 chaînons monocycliques et chaînes latérales fonctionnelles (par exemple sulfo, hydroxy ou carboxy).

Le terme « groupe partant » fait référence à un groupe qui emmène les deux électrons de la liaison sigma le reliant avec l'atome de carbone aromatique lors de la réaction de substitution par le nucléophile.

Le terme « halogène » ou « halo » fait référence aux groupes fluoro, chloro, bromo, iodo ou astato, de préférence chloro.

Le terme « hétéroaryle » désigne des cycles aromatiques de 5 à 15 atomes de carbone ou des systèmes cycliques contenant de 1 à 3 cycles qui sont fusionnés ensemble ou liés de manière covalente, contenant typiquement 5 à 6 atomes de carbone et dont au moins un cycle est aromatique ; dans lesquels un ou plusieurs atomes de carbone dans un ou plusieurs de ces cycles sont remplacés par des atomes d'oxygène, d'azote et/ou de soufre ; les atomes d'azote et de soufre pouvant optionnellement être oxydés et les atomes d'azote pouvant optionnellement être quaternisés. De tels cycles peuvent être

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) condensés à un groupe aryle, cycloalkyle, hétéroaryle ou hétérocyclyle. Des exemples non limitatifs de groupes hétéroaryles comprennent les groupes furanyle, thiophényle, pyrazolyle, imidazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, thiazolyle, isothiazolyle, triazolyle, oxadiazolyle, thiadiazolyle, tétrazolyle, oxatriazolyle, thiatriazolyle, pyridinyle, pyrimidyle, pyrazinyle, pyridazinyle, oxazinyle, dioxinyle, thiazinyle, triazinyle, imidazo [2, l-b][l, 3]thiazolyle, thiéno[3, 2-b]furanyle, thiéno[3, 2-b]thiophényle, thiéno [2,3-d][l, 3] thiazolyle, thiéno[2,3-d]imidazolyle, tétrazolo[l, 5-a]pyridinyle, indolyle, indolizinyle, iso-indolyle, benzofuranyle, isobenzofuranyle, benzothiophényle, isobenzothiophényl, indazolyle, benzimidazolyle, benzoxazolyle, 1,3,1,2- benzisoxazolyle, 2,1-benzisoxazolyle, 1,3-benzothiazolyle, 1,2-benzoisothiazolyle, 2,1- benzoisothiazolyle, benzotriazolyle, 1,2,3-benzoxadiazolyle, 2,1,3-benzoxadiazolyle, 1,2,3-benzothiadiazolyle, 2,1,3-benzothiadiazolyle, thiénopyridinyle, purinyle, imidazo[l, 2-a] pyridinyle, 6-oxo-pyridazine-l(6H)-yl, 2-oxopyridine-l(2H)-yl, 6-oxo- pyridazine-l(6H)-yl, 2-oxopyridin-l(2H)-yl, 1,3-benzodioxolyle, quinolinyle, isoquinolinyle, cinnolinyle, quinazolinyle, quinoxalinyle.

Le terme « hétéroarylalkyle » fait référence à un groupe alkyle substitué par un groupe hétéroaryle et peut s'écrire : -alkyle-hétéroaryle.

Le terme « hétérocycloalcène » fait référence à un groupe cycloalcène tel que défini ci- dessus, dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone sont remplacés par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S, N ; de préférence le groupe hétérocycloalcène est le 5,6-dihydrodibenzo[b,f]azocine.

Le terme « imagerie médicale » fait référence à un ensemble de techniques consistant à mettre en image différentes régions ou différents organes de l'organisme à partir de différents phénomènes physiques tels que l'absorption des rayons X, la fluorescence, la résonance magnétique nucléaire, la réflexion d'ondes ultrasons ou la radioactivité.

Le terme « lipide » fait référence à des molécules hydrophobes ou amphiphiles, comprenant entre autres les graisses, les cires, les stérols, les vitamines liposolubles, les mono-, di- et triglycérides, ou encore les phospholipides.

Le terme « liposome » fait référence à une vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux. Une

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) grande variété de lipides amphiphiles peut être utilisée pour former des liposomes, les plus couramment utilisés étant les phospholipides.

Le terme « peptide » désigne un polymère linéaire d'acides aminés dans lequel les acides aminés sont liés ensemble par des liaisons peptidiques. Le terme « peptidomimétique » désigne un composé conçu pour imiter un peptide biologiquement actif mais présentant des différences structurelles lui conférant plus d'avantages pour sa fonction en tant que médicament.

Le terme « protéine » fait référence à une entité fonctionnelle formée d'un ou plusieurs peptides et éventuellement des co-facteurs non-peptidiques. Le terme « nanoparticule » fait référence à une particule ayant une taille allant de 1 à 100 nm ; en particulier la nanoparticule peut être un liposome, une nanoparticule d'oxyde de fer, une nanoparticule de silice (par exemple, une nanoparticule AGuIX) ou une nanoparticule d'or.

Le terme « tétrazine » se réfère à la fonction réactive constituée d'un noyau aromatique à six atomes contenant quatre atomes d'azote et deux atomes de carbone. Cet hétérocycle possède trois isomères distincts par la position relative des atomes de carbone et d'azote : la 1,2,3,4-tétrazine, la 1,2,3,5-tétrazine et la 1,2,4,5-tétrazine. Dans la présente invention, tétrazine se réfère à la 1,2,4,5-tétrazine.

Le terme « véhicule » fait référence à une substance qui porte le produit d'intérêt dans une composition, en particulier ce peut être une substance qui permet de le dissoudre. Le véhicule peut par exemple être de l'eau. Le terme « véhicule pharmaceutiquement acceptable » fait référence à un véhicule ou un support inerte utilisé en tant que solvant ou diluant dans lequel l'agent actif est formulé et/ou administré, et qui ne produit pas une réaction indésirable, allergique ou autre lorsqu'il est administré à un animal, de préférence un être humain. Cela comprend tous les solvants, milieux de dispersion, revêtements, agents antibactériens et antifongiques, agents isotoniques, retardants d'absorption et autres ingrédients similaires. Pour l'administration humaine, les préparations doivent répondre à des normes de stérilité, de sécurité générale et de pureté, telles que requises par les offices de régulation, tels que par exemple la FDA ou l'EMA.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) DESCRIPTION DÉTAILLÉE

Plateforme trifonctionnalisée (I)

En particulier, l'invention concerne une plateforme trifonctionnalisée, de préférence de formule (I) telle que décrite ci-dessous, fonctionnalisée par au moins une biomolécule (ou plus généralement d'un groupe bioactif) et au moins une sonde d'imagerie, et dont la troisième fonctionnalité peut être une autre sonde d'imagerie (application en imagerie bimodale), un agent cytotoxique (application en théragnostique), un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation.

Ainsi, l'invention concerne une lateforme trifonctionnalisée de formule (I) :

ou un de ses tautomères ;

dans laquelle

représente une double liaison ou une simple liaison, de préférence une double liaison ; le cycle A représente un groupe cycloalkyle, cycloalcène ou hétérocycloalcène, optionnellement substitué par un ou plusieurs groupes sélectionnés parmi alkyle, aryle, halo, hydroxy et hétéroaryle; de préférence A représente un groupe bicyclo[6.1.0]nonane, cyclooctane, bicyclo[6.1.0]nonène, cyclooctène, difluorocyclooctène, hydroxycyclooctène, methylcyclopropane, norbornène, 5,6- dihydrodibenzo[a,e][8]annulène, 5,6-dihydrodibenzo[b,f]azocine ;

X représente S, NH ou O ; de préférence X représente S ou NH ;

L 1 , L2 et L 3 représentent chacun indépendamment une liaison simple ou un espaceur choisi parmi les groupes alkyle, alcoxy, aryle, arylalkyle, alkylaryle,

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) hétéroaryle, hétéroarylalkyle, alkylhétéroaryle, alcényle et alcynyle, dans lesquels les groupes alkyles sont optionnellement interrompus et/ou terminés par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(0)NH- et -

NHC(O)- ; de préférence L 1 , L2 et L 3 représentent chacun indépendamment un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -C(O)-, -NH- et -NHC(O)- ; encore plus préférentiellement L 1 , L2 et L 3 représentent chacun indépendamment un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-,

CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-,- CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et -CH ₂ CH ₂ NHCO-/?-Ph- ;

R 1 , R2 et R 3 représentent chacun indépendamment un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R 2 représente un groupe détectable, et au moins l'un de R 2 et R 3 représente un groupe bioactif.

Le cycle A est obtenu par réaction de Diels-Alder à demande inverse d'électrons entre une 1,2,4,5-tétrazine de formule (II) et une molécule diénophile de formule (III) telles que décrites ci-dessous. La réaction de Diels-Alder à demande inverse d'électrons entre une 1,2,4,5-tetrazine et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne) produit un cycloadduit instable qui subit spontanément une réaction de retro-Diels Aider pour former une molécule de diazote et une dihydropyridazine (après réaction avec un alcène) ou une pyridazine (après réaction avec un alcyne). Le produit dihydropyridazine peut éventuellement subir une réaction d'oxydation additionnelle pour former la pyridazine correspondante. Les diénophiles utiles pour cette invention incluent, sans y être limités, des diénophiles carbonés comme les alcènes ou les alcynes, préférentiellement un alcyne ou un alcène cyclique « contraint ». Selon un mode de réalisation préféré, le diénophile est préférentiellement un bicyclononyne ou un trans- cyclooctène.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Le terme « groupe détectable » se réfère à un groupement chimique qui peut être détecté, directement ou après modification, en utilisant des techniques d'imagerie connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation, le groupe détectable est choisi parmi les fluorophores ; les chromophores ; les sondes pour l'imagerie nucléaire ; les sondes IRM.

Selon un mode de réalisation les techniques d'imagerie permettant de détecter un tel groupe détectable comprennent : l'imagerie nucléaire, incluant la tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l'imagerie par Cerenkov Luminescence (CLI) ; l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ; l'imagerie optique ; l'imagerie par fluorescence.

Selon un mode de réalisation, le groupe détectable peut être détecté directement, tel que présent sur le composé de l'invention par une technique d'imagerie.

Selon un autre mode de réalisation, le groupe détectable doit être préalablement modifié avant de pouvoir être détecté par une technique imagerie. C'est le cas lorsque le groupe détectable se présente sous la forme d'un agent chélatant. Dans ce cas une étape préalable de complexation avec un ion métallique est nécessaire pour pouvoir ensuite le détecter par une technique imagerie, de préférence par imagerie nucléaire ou par l'imagerie par résonance magnétique.

Le terme « fluorophore » fait référence à une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. De préférence, les fluorophores sont des molécules comprenant plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou des molécules planes et cycliques possédant une ou plusieurs liaisons π.

Selon un mode de réalisation, les fluorophores sont sélectionnés parmi des dérivés cyanines (Cyanine3, Cyanine5, Cyanine5.5, Cyanine7, Cyanines sulfonées) ; l'Alexa fluor 647 ; une coumarine (hydroxycoumarine, aminocoumarine, méthoxycoumarine) ; une rhodamine (X-rhodamine, rhodamine B) ; une fluorescéine ou un BODIPY. De préférence le fluorophore est sélectionné parmi la Cyanine5, une Cyanine sulfonée, une rhodamine ou un BODIPY.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Le terme « chromophore » fait référence à un groupement d'atomes comportant une ou plusieurs doubles liaisons, et formant avec le reste de la molécule une séquence de doubles liaisons conjuguées, donnant ainsi sa couleur à la molécule le comprenant. Un chromophore est détectable par mesure d'absorbance. Selon un mode de réalisation, les chromophores sont sélectionnés parmi la phénolphtaléine, le violet de gentiane ou le Congo Red.

Par « sondes pour l'imagerie nucléaire », il est fait référence à des sondes pouvant être détectées par les techniques d'imagerie nucléaires.

Selon un mode de réalisation, les sondes pour l'imagerie nucléaire sont sélectionnées parmi les radioisotopes, les groupes organiques marqués par un radioisotope, les agents chélatants, les chélates de radioisotopes.

Un exemple de radioisotope pour l'imagerie nucléaire est le fluor 18.

Selon un mode de réalisation, les agents chélatants, linéaires ou cycliques, sont par exemple le DOTA, le NOTA, la déféroxamine, et leurs dérivés. Des dérivés préférentiels du DOTA et du NOTA sont par exemple respectivement le DOTAGA et le (R)-NODAGA.

Les chélates de radioisotopes correspondants peuvent être obtenus par complexation de ces agents chélatants avec des ions métalliques tels que par exemple : ^Cu, ⁶⁸ Ga, ^lu In, ⁸⁹ Zr, ¹⁷⁷ Lu. Ainsi, le « groupe détectable » comprend à la fois les chélates de radioisotopes directement détectables mais aussi les agents chélatants ne complexant pas encore le radioisotope. Dans ce dernier cas, la complexation peut être réalisée juste avant utilisation de la plateforme de l'invention pour une application d'imagerie. Cela permet notamment de pouvoir stocker la plateforme prête à chélater et de n'y ajouter le radioisotope, qui peut avoir une demi vie très courte, seulement au dernier moment avant utilisation.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Le terme « sonde IRM » (Imagerie par Résonance Magnétique) fait référence à des agents de contraste paramagnétiques (par exemple comprenant du gadolinium) ou superparamagnétiques (par exemple comprenant des nanoparticules d'oxyde de fer) destinés à augmenter artificiellement le contraste et permettant de visualiser des structures anatomiques (par exemple, un organe) ou pathologiques (par exemple, une tumeur) naturellement peu ou pas contrastées, et que l'on aurait donc du mal à distinguer des tissus voisins.

Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation des composés 1-1, 1-2 et/ou 1-3 tels que décrits précédemment, pour cibler des tumeurs telles que par exemple des tumeurs mammaires. Selon un mode de réalisation, les composés 1-1, et/ou 1-3 tels que décrits précédemment, ciblent spécifiquement une tumeur, de préférence une tumeur mammaire.

Selon un mode de réalisation, les sondes IRM sont sélectionnées parmi les agents chélatants, les chélates, les nanoparticules. Selon un mode de réalisation, les agents chélatants sont par exemple le DOTA et la DTP A.

Selon un mode de réalisation, les chélates correspondants peuvent être obtenus par complexation de ces agents chélatants avec des ions métalliques tels que par exemple : Gd ou Mn ; ou avec de l'oxyde de fer. Préférentiellement les nanoparticules sont des nanoparticules d'oxyde de fer ou des nanoparticules de silice de type AGuIX.

Les termes « groupe bioactif » ou « biomolécule » se réfèrent à toute molécule naturelle biologique ou toute molécule dérivée synthétiquement qui imite ou est un analogue d'une molécule naturelle biologique. Les biomolécules comprennent des nucléotides, des polynucleotides (par exemple l'ARN, l'ADN), des acides aminés, des peptides, des polypeptides, des protéines, des anticorps, des polysaccharides, des lipides, des glycanes et de petites molécules (par

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) exemple vitamines, métabolites primaires et secondaires, hormones, neuro transmetteurs). Les acides aminés peuvent comprendre des fragments autres que ceux trouvés dans les 20 acides aminés naturels. Les acides aminés peuvent également comprendre des groupes fonctionnels non protéinogènes (par exemple CF ₃ , N ₃ , F, N0 ₂ ). De même, les polypeptides et les protéines peuvent contenir de tels acides aminés. Les « polysaccharides » comprennent les mono-, di- et oligosaccharides comprenant les liaisons O- et N- glycosyle. Les polysaccharides peuvent comprendre des groupes fonctionnels qui ne sont pas couramment trouvés dans un environnement cellulaire (par exemple cyclopropène, halogènes et nitriles). Les lipides comprennent les lipides amphipathiques, phospho- et glycoliques et les stérols tels que le cholestérol. Un « lipide amphipathique » désigne un lipide ayant des caractéristiques hydrophiles et hydrophobes. Un « phospholipide » désigne un lipide lié à un groupe phosphate et porte une charge. Des exemples de phospholipides comprennent l'acide phosphatidique, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine et le phosphatidylinositol. Un « glycolipide » désigne un lipide lié à un poly- ou oligosaccharide. Des exemples de glycolipides comprennent les galactolipides, les sulfolipides, les glycosphingolipides et le glycosylphosphatidylinositol. Les lipides peuvent comprendre des substituants rarement trouvés dans l'environnement cellulaire (par exemple cyclopropène, halogènes et nitriles). Une « petite molécule » telle qu'utilisée ici désigne toute petite molécule produite naturellement dans un environnement biologique et peut contenir des fragments ou des liaisons non naturels qui ne sont pas typiquement trouvés dans une cellule mais tolérés pendant le traitement au sein d'une cellule (par exemple cyclopropène, halogènes, nitriles).

Selon un mode de réalisation, le groupe bioactif est de préférence sélectionné parmi un anticorps, un peptide, un peptidomimétique, une protéine, une petite molécule telle que l'acide folique, un aptamère, de préférence un aptamère acide nucléique, une nanoparticule ou un liposome ; plus préférentiellement le groupe bioactif est choisi parmi les anticorps (tel que par exemple le Trastuzumab) ou les peptides. Selon un mode de réalisation, le groupe bioactif est l'albumine de sérum bovin (« Bovin Sérum Albumin », BSA).

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Des exemples de groupes bioactifs et leurs cibles biologiques sont donnés dans le tableau ci-dessous :

Le terme « agent cytotoxique » se réfère à une substance capable de tuer des cellules, y compris des cellules cancéreuses. Ces agents peuvent empêcher les cellules de se diviser et dans le cas de cellules cancéreuses peuvent induire une réduction de la taille des tumeurs.

Selon un mode de réalisation, l'agent cytotoxique est sélectionné parmi l'auristatine monométhyle E, le maytansinoide DM1, la Duocarmycine, la Calicheamicine, l'alpha- amanitine ou un groupe portant un radiométal (par exemple un groupe marqué à 131 I, un chélate de radiométal tel que ⁹⁰ Y, ²²³ Ra, ²²⁵ Ac, ¹⁷⁷ Lu).

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un autre mode de réalisation, l'agent cytotoxique est une nanoparticule, de préférence, une nanoparticule de silice ou une nanoparticule d'or. Dans ce cas, la nanoparticule peut servir de radio-sensibilisant.

Des exemples d'agents cytotoxiques et leurs cibles biologiques et/ou mécanisme d'action sont donnés dans le tableau ci-dessous :

Le terme de « groupe d'affinité » se réfère à un groupement chimique, parfois appelé étiquette, qui peut être lié de façon sélective et non covalente à un autre groupement chimique partenaire, en utilisant des techniques connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation particulier, le groupe d'affinité est sélectionné parmi la biotine (partenaire : streptavidine ou avidine), l'avidine (partenaire : biotine), la steptavidine (partenaire : biotine) ou un peptide hexa-histidine (partenaire : nickel).

Le terme de « groupe de solubilisation » se réfère à un groupement chimique, synthétique ou naturel, permettant de modifier les propriétés physicochimiques de la plateforme trifonctionnelle, notamment son caractère hydrophile/lipophile, son volume moléculaire ou sa charge électrique globale en milieu tamponné. La nature du groupe de solubilisation peut influer sur la biodistribution de la plateforme (I), sa pharmacocinétique ou encore sur sa biodisponibilité chez l'animal.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, le groupe de solubilisation est sélectionné parmi des chaînes linéaires ou ramifiées poly(éthylène glycol), des chaînes linéaires ou ramifiées poly(acide glutamique), ou le cholestérol.

Selon un mode de réalisation, R 1 représente un groupe détectable, R 2 représente un groupe bioactif et R représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation, de préférence R représente un groupe détectable.

Selon un mode de réalisation, R 2 représente un groupe détectable, R 3 représente un groupe bioactif et R ¹ représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation, de préférence R ¹ représente un groupe détectable.

Selon un mode de réalisation, R 1 représente un groupe détectable, R 3 représente un groupe bioactif et R représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation, de préférence R représente un groupe détectable.

Selon un mode de réalisation, X ¹ représente S, NH ou O, de préférence X ¹ représente S ou NH. Selon un mode de réalisation particulier, X ¹ représente S. Selon un autre mode de réalisation particulier, X ¹ représente NH.

Selon un mode de réalisation, L ¹ représente un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -C(O)-, -NH- et -NHC(O)- ; de préférence L ¹ représente un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCO- CH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et - CH ₂ CH ₂ NHCO-/?-Ph-. Selon un mode de réalisation, L représente un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi - O-, -C(O)-, -NH- et -NHC(O)- ; de préférence L représente un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ -,

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et -CH ₂ CH ₂ NHCO-/?-Ph- ; plus préférentiellement, L représente -CH ₂ CH ₂ NH-.

Selon un mode de réalisation, L représente un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -C(O)-, -NH- et -NHC(O)- ; de préférence L représente un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCO- CH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et

-CH ₂ CH ₂ NHCO-/?-Ph- ; plus préférentiellement, représente -NHCH2CH2NHCOCH2-

Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (la) :

1 1 2 3 1 2 3

ou un de ses tautomères, dans laquelle X , L , L , L, R , R etR sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (Ib) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle X 1, L1, L2, L 3, R 1, R2 et R 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus et

R ⁴ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁵ représentent chacun indépendamment H, hydroxy, halo.

Selon un mode de réalisation, R ⁴ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁵ représentent tous H. Selon un autre mode de réalisation, R ⁴ et R ⁴ représentent H et R ⁵ et R ⁵ représentent halo, de préférence F. Selon un autre mode de réalisation, R ⁵ et R ⁵ représentent H et R ⁴ et R ⁴ représentent halo, de préférence F. Selon un autre mode de réalisation, R ⁴ , R ⁴ et R ⁵ représentent H et R ⁵ représente hydroxy.

Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (le) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle X 1, L1, L2, L 3, R 1, R2 et R 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (Id) :

de ses tautomères, dans laquelle X 1,L1,L2, L 3,R 1,R2 etR 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (le) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle X 1,L1,L2, L 3,R 1,R2 etR 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (If) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle X 1 , L1 , L2 , L 3 , R 1 , R2 et R 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (Ig) :

de ses tautomères, dans laquelle X 1 , L1 , L2 , L 3 , R 1 , R2 et R 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de formules (I) sont de formule (Hi) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle X 1,L1,L2, L 3,R 1,R2 etR 3 sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) est sélectionnée parmi :

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

triazonane-l,4-diyl)diacétique

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

Les composés décrits dans la présente demande ont été nommés en utilisant ChemBioDraw® Ultra version 12.0 (PerkinElmer).

Utilisations des plateformes trifonctionnalisées (I)

L'invention concerne également l'utilisation des plateformes trifonctionnalisées de formule (I) en tant que médicament et/ou pour de l'imagerie médicale.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation des plateformes trifonctionnalisées de l'invention en imagerie médicale. En particulier les méthodes suivantes de détection peuvent être utilisées pour détecter les composés de l'invention : imagerie nucléaire, comprenant la tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l'imagerie par Cerenkov Luminescence (CLI) ; l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ; l'imagerie optique ; l'imagerie par fluorescence. Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation des composés 1-1 et/ou 1-3 tels que décrits précédemment, en imagerie médicale. Selon un mode de réalisation, les méthodes suivantes de détection peuvent être utilisées pour détecter les composés 1-1 et/ou 1-3 tels que décrits précédemment : imagerie nucléaire, comprenant la tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l'imagerie par Cerenkov Luminescence (CLI) ; l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ; l'imagerie optique ; l'imagerie par fluorescence ; de préférence la tomographie par émission monophotonique (TEMP) ; l'imagerie optique et/ou l'imagerie par fluorescence.

Lorsque les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent comporter deux groupes détectables indépendamment, notamment par des techniques d'imagerie différentes, de l'imagerie bimodale peut être effectuée. L'imagerie bimodale inclue par exemple l'imagerie TEP/IRM, l'imagerie TEMP/IRM, l'imagerie TEP/optique, l'imagerie TEMP/op tique ou l'imagerie IRM/op tique.

Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation des plateformes trifonctionnalisées de l'invention en tant que médicament. C'est le cas notamment lorsque la plateforme est fonctionnalisée par un agent cytotoxique.

Lorsque les plateformes trifonctionnalisées de l'invention comportent un groupe détectable et un agent cytotoxique, alors des applications en tant que médicament et en théragnostique peuvent être réalisées.

Par « théragnostique » il est fait référence à l'utilisation de techniques d'imagerie médicale pour détecter et/ou quantifier la présence de l'agent cytotoxique dans l'organisme ou sur des biopsies.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent également être utilisées comme outil d'assistance à la chirurgie dans le cas de la chirurgie assistée par imagerie.

Les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent également être utilisées comme outil d'aide à la prise de décision. En particulier, elles peuvent être utilisées comme outils compagnon pour la sélection de patients susceptibles de répondre à une thérapie ciblée.

Les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent en outre être utilisées pour identifier de nouvelles cibles biologiques ou suivre des biomarqueurs. A titre d'exemple, l'association d'une sonde optique, d'un groupe bioactif et d'un groupe d'affinité tel qu'une biotine, peut permettre de localiser (par microscopie) et d'isoler (par chromatographie d'affinité) les différentes cibles d'un groupe bioactif.

Les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent également être utilisées comme outil d'aide au développement de nouveaux agents thérapeutiques. En effet, le caractère modulable de la plateforme permet de détecter aisément in vivo un agent thérapeutique complexe, qui associe un agent bioactif à un cytotoxique ou un groupe de solubilisation. De par son caractère modulable, la plateforme permet de faire varier rapidement les partenaires afin d'identifier un agent thérapeutique aux propriétés pharmacologiques optimales in vivo.

Les plateformes trifonctionnalisées de l'invention peuvent également être utilisées en tant qu'outil préclinique pour des études pharmacologiques. Il peut s'agir notamment de l'emploi de technique d'imagerie pour identifier au niveau tissulaire, cellulaire ou subcellulaire le devenir d'agents thérapeutiques tels que les ADC (antibody drug conjugates).

L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant un composé de formule (I) selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, les plateformes trifonctionnalisées de l'invention, de préférence les composés 1-1 et/ou 1-3 tels que décrits précédemment, peuvent être utilisées comme agent d'imagerie multimodal ex vivo ou in vivo.

Selon un mode de réalisation, lorsqu'ils sont utilisés comme agent d'imagerie, les composés 1-1 et/ou 1-3 tels que décrits précédemment, sont accumulés préférentiellement dans la tumeur par rapport aux autres organes tels que le foie, les reins, les muscles, le sang, la rate et/ou la vessie.

Méthode de synthèse des plateformes trifonctionnalisées (I)

L'invention porte également sur la méthode de synthèse des plateformes trifonctionnalisées de formule (I) de l'invention.

La méthode de synthèse de l'invention met en œuvre une réaction de Diels-Alder à demande électronique inverse à partir d'une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) pouvant être elle-même obtenue à partir d'une tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) (Figure 1).

Tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV)

Ainsi, selon un mode de réalisation, la méthode de synthèse de l'invention comprend une étape préliminaire de formation d'une tétrazine monofonctionnalisée de formule

(IV) :

dans laquelle X , L et R sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus ; et Y représente un halogène ou un groupe partant sélectionné parmi les groupements mésylate, tosylate, triflate et 3,5-diméthyl-lH-pyrazol-lyl ; de préférence Y représente un halogène, plus préférentiellement le chlore ;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) comprenant la monosubstitution nucléophile d'une tétrazine de formule (VI) :

dans laquelle Y 1 et Y 2 représentent chacun indépendamment un halogène ou un groupe partant sélectionné parmi les groupements mésylate, tosylate, triflate et 3,5-diméthyl-lH-pyrazol-lyl; de préférence Y 1 et Y 2 représentent un halogène, plus préférentiellement le chlore ; par un nucléophile de formule (VII) :

R ¹ — L ¹ — X ¹ -H (vu) dans laquelle X ¹ , L ¹ et R ¹ sont tels que définis dans la formule (I). Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) a lieu dans un solvant polaire aprotique, de préférence l'acétonitrile ou le N,N-diméthylformamide (DMF) anhydre.

Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) a lieu en présence d'un tampon, de préférence un tampon fixant le pH à une valeur allant de 5 à 9, de préférence un pH d'environ 8 ; préférentiellement le tampon est un tampon borate (2,5 mol/L, pH 8).

Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) a lieu en présence d'une base, préférentiellement la N,N- diisopropyléthylamine (DIPEA). Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) s'effectue à une température allant de 0°C à 37°C, de préférence à température ambiante.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, l'étape de formation de la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) est conduite pendant une durée allant de 1 min à 5 heures, de préférence de 5 min à 1 heure.

Avantageusement, l'intermédiaire (IV), lorsque X ¹ est S, présente une excellente sélectivité en particulier en solution aqueuse tamponnée à un pH compris entre 3,5 et 8, pour les fonctions thiol des cystéines par rapport aux fonctions amine ou hydroxy des lysines et des sérines respectivement, ou d'autres fonctions potentiellement réactives, présentes sur des groupes bioactifs tels que des peptides ou des anticorps.

Tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) Selon un mode de réalisation, la méthode de synthèse de l'invention comprend une étape intermédiaire de formation d'une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) :

dans laquelle X 1 , L1 , L2 , R 1 et R 2 sont tels que définis dans la formule (I) ci- dessus ; comprenant une substitution nucléophile sur une tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) :

dans laquelle X ¹ , L ¹ et R ¹ sont tels que définis dans la formule (I) ci-dessus ; et Y représente un halogène ou un groupe partant sélectionné parmi les groupements mésylate, tosylate, triflate et 3,5-diméthyl-lH-pyrazol-lyl ; de préférence Y ² représente un halogène, plus préférentiellement le chlore ;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) par un thiol de formule (V) :

R ² — L ² — SH (y) dans laquelle L 2 et R 2 sont tels que définis dans la formule (I).

Selon un mode réalisation, la formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) a lieu dans un solvant polaire, de préférence le N,N-diméthylformamide (DMF) anhydre ou l'eau distillée.

Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) a lieu en présence d'un tampon, de préférence un tampon fixant le pH à une valeur allant de 3,5 à 8, de préférence un pH d'environ 7 ; préférentiellement le tampon est un tampon phosphate.

Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) a lieu en présence d'une base, préférentiellement la N,N- diisopropyléthylamine (DIPEA).

Selon un mode de réalisation, la formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II), préférentiellement lorsque X ¹ est S, s'effectue à une température allant de 4°C à 37 °C, préférentiellement à température ambiante de 25 °C.

Selon un autre mode de réalisation, la formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II), préférentiellement lorsque X ¹ est NH, s'effectue à une température allant de 50°C à 90 °C, préférentiellement à une température allant de 70° à 80°C, plus préférentiellement à une température de 75 °C.

Selon un mode de réalisation, l'étape de formation de la tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) est conduite pendant une durée allant de 10 secondes à 5 heures, de préférence de 3,5 minutes à 0,5 heure.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Tétrazine trifonctionnalisée de formule (I)

La méthode de synthèse de l'invention comprend une étape de formation de la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) :

ou un de ses tautomères, dans laquelle A, X 1, L1, L2, L 3, R 1, R2, et R 3 sont tels que décrits précédemment ; comprenant la mise en contact d'une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) :

dans laquelle X 1 , L1 , L2 , R 1 et R 2 sont tels que décrits dans le formule (I) ; avec un alcyne ou un alcène de formule (III)

dans laquelle L 3 et R 3 sont tels décrits dans la formule (I) ;

représente une triple liaison ou une double liaison, de préférence une triple liaison ; et

le cycle A représente un groupe cycloalkène, cycloalcyne ou hétérocycloalcyne, optionnellement substitué par un ou plusieurs groupes sélectionnés parmi alkyle, aryle, halo, hydroxy et hétéroaryle; de préférence A représente un groupe trans-

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) bicyclo[6.1.0]nonène, iraws-cyclooctène, bicyclo[6.1.0]nonyne, cyclooctyne, difluorocyclooctyne, hydroxycyclooctyne, methylcyclopropène, norbornène, 5,6- didéhydro-1 l,12-dihydrodibenzo[a,e][8]annulène, 1 l,12-didéhydro-5,6- dihydrodibenzo [b ,f] azocine . Selon un mode de réalisation, le produit dihydropyridazine obtenu lorsque (III) est un alcène peut optionnellement subir une réaction d'oxydation additionnelle pour former la pyridazine correspondante.

Selon un mode de réalisation, les composés de formules (III) sont ceux de formule ma), (IIIb-1), (IIIb-2), (IIIb-3), (IIIc), (Illd), (Ille), (Illf), (Illg), (Illh) :

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26)

dans lesquelles L 3 et R 3 sont tels que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, la formation de la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) a lieu dans un solvant polaire aprotique, de préférence le diméthylsulfoxyde (DMSO). Selon un mode de réalisation, la formation de la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) a lieu en présence d'un tampon, de préférence un tampon fixant le pH à une valeur allant de 4 à 9, de préférence un pH d'environ 7,4 ; préférentiellement le tampon est un tampon phosphate salin (PBS).

Selon un mode de réalisation, la formation de la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) s'effectue à des températures allant de 20°C à 50°C, de préférence d'une température ambiante à une température physiologique d'environ de 37 °C.

Selon un mode de réalisation, l'étape de formation de la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) est conduite pendant une durée allant de 30 minutes à 20 heures, de préférence de 50 minutes à 16 heures.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Intermédiaires de synthèse : plateformes tétrazines bifonctionnalisées (II)

L'invention concerne également une plateforme tétrazine bifonctionnalisée de formule (II), telle que décrite ci-dessous, fonctionnalisée par au moins un groupe détectable par imagerie. Une telle plateforme tétrazine bifonctionnalisée peut être utilisée pour obtenir la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) selon l'invention.

L'invention concerne donc une tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) :

dans laquelle

X ¹ représente S, NH ou O ;

L 1 et L 2 représentent chacun indépendamment une liaison simple ou un espaceur choisi parmi les groupes alkyle, alcoxy, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle, hétéroarylalkyle, alkylhétéroaryle, alcényle et alcynyle, dans lesquels les groupes alkyles sont optionnellement interrompus et/ou terminés par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(0)NH- et -NHC(O)- ; de préférence L ¹ et L ² représentent chacun indépendamment un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -C(O)-, -NH- et -NHC(O)- ; encore plus préférentiellement L ¹ et L ² représentent chacun indépendamment un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et -CH ₂ CH ₂ NHCO-/?- Ph- ;

R 1 et R 2 représentent chacun indépendamment un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation ; à la condition que au moins l'un de R 1 et R 2 représente un groupe détectable.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Selon un mode de réalisation, la plateforme bifonctionnalisée de formule (II) est sélectionnée armi :

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

éthyl-3 , 3 -diméthyl- 3H-indol- 1 -ium- 5 - suif onate

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

carboxy-4-oxobutyl)- 1 ,4,7-triazonane- 1 ,4-diyl)diacétique

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

Intermédiaires de synthèse : plateformes tétrazines monofonctionnalisées (IV)

L'invention concerne également une plateforme tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV), telle que décrite ci-dessous. Une telle plateforme tétrazine monofonctionnalisée peut être utilisée pour obtenir la plateforme tétrazine bifonctionnalisée de formule (II) décrite ci-dessus et d'avoir ainsi accès à la plateforme trifonctionnalisée de formule (I) selon l'invention.

L'invention concerne donc une tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) :

dans laquelle

Y représente un halogène ou un groupe partant sélectionné parmi les groupements mésylate, tosylate, triflate et 3,5-diméthyl-lH-pyrazol-lyl ; de préférence Y ² représente un halogène, plus préférentiellement le chlore ;

X ¹ représente S, NH ou O ;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) L ¹ représente une liaison simple ou un espaceur choisi parmi les groupes alkyle, alcoxy, aryle, arylalkyle, alkylaryle, hétéroaryle, hétéroarylalkyle, alkylhétéroaryle, alcényle et alcynyle, dans lesquels les groupes alkyles sont optionnellement interrompus et/ou terminés par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(0)NH- et -NHC(O)- ; de préférence L ¹ représente un espaceur alkyle ou alkylaryle, optionnellement interrompu et/ou terminé par un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -C(O)-, -NH- et - NHC(O)- ; encore plus préférentiellement L ¹ représente un espaceur sélectionné parmi -CH ₂ CH ₂ NH-, -NHCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ OCONHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ OCO-, -COCH ₂ CH ₂ NH-, -CH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ CH ₂ - et -CH ₂ CH ₂ NHCO-/?-

Ph- ; et

R ¹ représente un groupe détectable, un groupe bioactif, un agent cytotoxique, un groupe d'affinité ou un groupe de solubilisation.

Selon un mode de réalisation, la tétrazine monofonctionnalisée de formule (IV) est sélectionnée armi :

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26)

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 représente un schéma de synthèse des plateformes trifonctionnalisées (I) de l'invention faisant intervenir les intermédiaires tétrazines mono- et bi-fonctionnalisées (IV) et (II). Figure 2 présente l'image multimodale TEMP/CT d'une souris xénogreffée par des cellules BT- 474 (tumeur mammaire) traitée par le composé 1-1 radiomarqué à indium 111 (Figure 2A), et par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium co-injecté avec un excès de trastuzumab non marqué (Figure 2B).

Figure 3 représente un histogramme montrant le pourcentage moyen de dose injectée par gramme d'organe déterminé par comptage gamma dans différents organes des souris traitées par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium (lot A - gris clair) ou des souris traitées par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium avec un excès de trastuzumab (lot B - gris foncé).

Figure 4 présente la photographie avec (b) ou sans (a) fluorescence, d'une souris traitée par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111.

Figure 5 présente la photographie avec fluorescence ex vivo de la tumeur et de divers organes d'une souris traitée par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111.

Figure 6 représente un histogramme montrant la biodistribution moyenne du composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 dans la tumeur et divers organes pour les souris du lot A (gris clair) ou les souris du lot B (gris foncé).

Figure 7 présente la photographie avec fluorescence in vivo, d'une souris traitée par le composé 1-3 après lh, 4h ou 24h post-injection.

Figure 8 présente la photographie avec fluorescence ex vivo de la tumeur et de divers organes d'une souris traitée par le composé 1-3 après 24h post-injection. Figure 9 représente un histogramme montrant la biodistribution moyenne du composé 1-3 dans la tumeur et divers organes pour les souris du lot C.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) EXEMPLES

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l'invention. Abréviations

ACN : acétonitrile

BCN : bicylononyne

BODIPY : bore-dipyrométhene

DCM : dichlorométhane

DIPEA : diisopropyléthylamine

DMF : diméthylformamide

DMSO : diméthylsulfoxyde

DODT : 3,6-dioxa-l,8-octanedithiol

DOTAGA : acide 2-(4,7,10-tris(carboxyméthyl)-l,4,7,10-tétraazacyclododéc an-l- yl)pentanedioïque

Fab' : fragment Fab' de pertuzumab (anti-HER2)

HATU : l-[Bis(diméthylamino)méthylène]-lH- l,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate

HPLC : chromato graphie liquide haute performance

MeOH : méthanol

NODAGA : acide 2-(4,7-bis(carboxyméthyl)-l,4,7-triazonan-l-yl)pentanedioï que

PBS : « phosphate buffered saline », i.e. tampon phosphate salin

rpm : « round per minute », i.e. tours par minutes

TCO: trans-cyclooctène

TFA : acide trifluoroacétique

TIS : triisopropylsilane

TSTU : N _^ N'.N'-tétraméthyl-O-lN-succinimidy uronium tétrafluoroborate

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Matériel

Sauf mention contraire, les réactifs chimiques et solvants proviennent de fournisseurs usuels de produits chimiques (Sigma-Aldrich, Alfa-Aesar, Fisher Scientic, BioSolve) et ont été utilisés sans purification préalable. Les polyazamacrocycles utilisés proviennent de chez Chematech (Quetigny, France). Les sondes optiques de la famille des Cyanines ont été gracieusement fournies par le Prof Anthony Romieu (Université de Bourgogne) et synthétisées suivant les protocoles décrits dans la littérature.

Les purifications par HPLC semi-préparative ont été réalisées sur un système UltiMate 3000 Dionex (Thermo Scientific) équipé d'un détecteur UV-visible sur une colonne phase inverse (Cl 8).

Les purifications par flash chromatographie ont été effectuées sur un système puriFlash® 430 (Interchim) au moyen de colonnes Interchim pré-packées en phase normale ou phase inverse (taille des particules 15 μιη ou 25 μιη).

Les analyses LC-MS ont été effectuées sur un système de chromatographie liquide UltiMate 3000 équipé d'un détecteur DAD et couplé à un détecteur de masse MSQ Plus (Thermo Scientific), en mode ESI. Les chromatographies ont été effectuées sur une colonne Kinetex™ C ₁₈ , 2,6 μιη, 100 A, 50 x 2,1 mm (Phenomenex) avec des éluants qualité HPLC (Eluant A : H ₂ O 0,l% acide formique (FA) ; éluant B : acétonitrile 0,1% FA) avec un gradient de 5% à 100% de B en 5 min, un plateau à 100% pendant 1,5 min. La pureté des composés a été déterminée à partir des chromatogrammes LC- MS à la longueur d'onde 214 nm.

Les spectres de masses haute résolution (HRMS ESI) des composés finaux ont été réalisés, par la plateforme PACSMUB (DIJON, France), sur un spectromètre de masse LTQ Orbitrap XL, équipé d'une source ESI (Thermo Scientific). Les spectres RMN 1H ont été obtenus sur spectromètre RMN Bruker Avance III NanoBay. Les spectres ont été réalisés à température ambiante. Les abréviations suivantes ont été utilisées pour décrire la multiplicité des signaux : s = singulet, d = doublet, t = triplet, m = multiplet.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) PARTIE I. SYNTHESE CHIMIQUE

1. Intermédiaires aminés de formule (VII)

1.1. Cyanine 5.0-NH ₂

2-( ( 1Ε,3Ε,5Ε)-5-(1-( 6-( ( 2-ammonioéthyl)amino )-6-oxohexyl)-3,3-diméthylindolin-2- ylidène)penta-l,3-dièn-l-yl)-l-éthyl-3,3-diméthyl-3H-ind ol-l-ium

La cyanine 5.0 (20.0 mg, 32.7 μηιοΐ), le TSTU (11.8 mg, 39.3 μηιοΐ, 1.2 eq) et la DIPEA (6.9 μί, 39.3 μιηοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 100 μL· de DMF anhydre. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 1 h, puis l'éthylènediamine (21.8 μί, 327 μιηοΐ, 10.0 eq) et la DIPEA (5ΊΑ μΙ,, 327 μηιοΐ, 10.0 eq) sont ajoutées. Après 25 min, le solvant est éliminé sous

pression réduite. La purification du produit brut est réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). La cyanine 5.0-NH ₂ est obtenue sous la forme d'une poudre bleue (11.1 mg, 52%, sel de TFA). RMN 1H (500 MHz, CDC1 ₃ ) d: 1.36 (t, 3H; CH ₃ ), 1.41 (m, 2H; CH ₂ ), 1.64 (s, 6H; CH ₃ ), 1.65 (s, 6H; CH ₃ ), 1.67 (m, 2H; CH2), 1.74 (m, 2H; CH ₂ ), 2.24 (t, 2H; CH ₂ ), 3.13 (m, 2H; CH ₂ ), 3.51 (m, 2H; CH ₂ ), 3.94 (t, 2H; CH ₂ ), 4.01 (q, 2H; CH ₂ ), 6.13 (d, 1H; CH), 6.16 (d, ³ J = 13.5 Hz, 1H; CH), 6.58 (t, 2H; CH), 7.07 (m, 2H; CHA _T ), 7.19 (m, 2H; CHA _T ), 7.32 (m, 4H; CHA _T ), 7.81 (dd, 2H; CH), 8.26 (t, 1H; CONH), 8.38 (m, 3H; NH ₃ ⁺ ); MS: C ₃₅ H ₄₇ N ₄ 0 ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée: 539.4; expérimentale: 539.4.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 2. Intermédiaires thiol de formule (V) et (VII)

2.1. Rhodamine B-SH

N-( 6-(diéthylamino )-9-( 2-(( 2-mercaptoéthyl)carbamoyl)phényl)-3H-xanthèn-3- ylidène)-N-éthyléthanaminium.

La rhodamine B (200 mg, 418 μιηοΐ), le HATU

(191 mg, 502 μπιο1, 1.2 eq) et la DIPEA (87 μΙ_, 502 μιηοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 2 mL de DMF anhydre. La solution est agitée à température ambiante pendant 2 h, puis l'hydrochlorure de 2- aminoéthanethiol (95 mg, 836 μιηοΐ, 2.0 eq) et la DIPEA (139 μΐ,, 836 μιηοΐ, 2.0 eq) sont introduits dans le milieu réactionnel. Après 2 h, le DMF est éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par chromatographie flash sur silice (éluants : DCM/MeOH). La rhodamine B-SH a été obtenue sous la forme d'une poudre violette (179.3 mg, 85%). RMN 1H (300 MHz, CDC1 ₃ ) : Equilibre entre les formes non-cyclique et cyclique de la rhodamine; MS : C ₃ oH ₃ 6N ₃ 0 ₂ S ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée : 502.3; expérimentale: 502.2.

2.2. BODIPY-SH

2,8-diéthyl-5,5-difluoro-10-(4-((2-mercaptoéthyl)carbam oyl)phényl)-l,3,7,9- tétraméthyl-5H-dipyrrolo[l,2-c:2 l '-f][l,3,2]diazaborinin-4-ium-5-uide

BODIPY-COOH (100 mg, 235 μπιοΐ) carbonyldiimidazole (46 mg, 282 μιηοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 1 mL de DMF anhydre. La solution est agitée à température ambiante pendant lh, puis l'hydrochlorure de 2- aminoéthanethiol (54 mg, 470 μιηοΐ, 2.0 eq) est ajouté. Après 20 min, le DMF est éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par chromatographie flash sur silice (éluants : DCM/MeOH). Le BODIPY-SH est obtenu sous la forme d'une poudre rouge (65.0 mg, 57%). RMN 1H (300 MHz, CDC1 ₃ ) : d = 0.95 (t, 6H; CH ₃ ), 1.23 (s, 6H; CH ₃ ), 1.43 (t,

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 1H; SH), 2.27 (q, 4H; CH ₂ ), 2.51 (s, 6H; CH ₃ ), 2.81 (dt, 2H; CH ₂ ), 3.66 (dt, 2H; CH ₂ ), 6.70 (t, 1H; NH), 7.37 (d, 2H; CH _AT ), 8.18 (d, 2H; CH _AT ); MS : C ₂₆ H ₃₂ BFN ₃ OS ⁺ ([M- F] ⁺ ) m/z calculée : 464.2; expérimentale : 464.1.

2.3. Cyanine 3.0 disulfonatée-SH l-Éthyl-2-( ( 1Ε,3Ε)-3-( l-( 6-((2-mercaptoéthyl)amino )-6-oxohexyl)-3,3-diméthyl-5- sulfoindolin-2-ylidène)prop-l-èn-l-yl)-3,3-diméthyl-3H ndol-1 um-5-sulfonat^

La cyanine 3.0 disulfonatée (24.5 mg, 38.8 μιηοΐ), le TSTU (16.1 mg, 53.5 μηιοΐ, 1.4 eq) et la DIPEA (10.0 μί, 57.3 μιηοΐ, 1.5 eq) sont dissous dans 1 mL de DMF anhydre. La solution est agitée à température ambiante pendant 15 min, puis l'hydrochlorure de 2-aminoéthanethiol (l l.O mg, 96.8 μηιοΐ, 2.5 eq) et la DIPEA (13.6 μΐ,, 77.7 μιηοΐ, 2.0 eq) sont ajoutés. Après 25 min à température ambiante la réaction est complète. Le dithiothréitol (15.5 mg, 100 μιηοΐ, 2.6 eq) et de l'eau (400 μί) sont ajoutés et la solution est agitée pendant 3 h à température ambiante. Les solvants ont ensuite été éliminés sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ O 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). La cyanine 3.0 disulfonatée-SH est obtenue sous la forme d'une poudre rose (18.2 mg, 68%). RMN 1H (300 MHz, D ₂ 0) : d = 1.27 (m, 4H; CH ₂ ), 1.56 (m, 2H; CH ₂ ), 1.62 (s, 12H; CH ₃ ), 1.73 (m, 3H; CH ₃ ), 2.17 (m, 2H; CH ₂ ), 2.43 (t, ³ J = 7.0 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.18 (t, ³ J = 7.0 Hz, 2H; CH ₂ ), 4.02 (m, 4H, CH ₂ ), 6.32 (t, ³ J = 11.5 Hz, 2H; CH), 7.27 (m, 2H, CH _AT ), 7.80 (m, 2H, CH _AT ), 7.85 (s, 2H, CH _AT ), 8.37 (t, ³ J = 11.5 Hz, 1H, CH); MS: C ₃₃ H ₄₄ N ₃ 0 ₇ S ₃ ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée: 690.2; expérimentale: 690.3.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 2.4. Cyanine 5.0-SH l-Éthyl-2-((lE,3E,5E)-5-(l-(6-((2-mercaptoéthyl)amino)-6-o xohexyl)-3,3- diméthylindolin-2-ylidene)penta-l,3-dièn-l-yl)-3,3-diméth yl-3H ndol-1 um

(13.1 mg, 85.0 μιηοΐ, 2.6 eq) et de l'eau (400 μί) sont ajoutés. La solution est agitée pendant 7 h à température ambiante puis le DMF est éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). La cyanine 5.0-SH est obtenue sous la forme d'une poudre bleue (22.2 mg, pureté : 88%, produit oxydé en pont disulfure : 9%)). RMN 1H (500 MHz, CD ₃ CN): d = 1.34 (t, ³ J = 7.0 Hz, 3H; CH ₃ ), 1.42 (m, 2H; CH ₂ ), 1.60 (m, 1H; SH), 1.63 (m, 2H; CH ₂ ), 1.66 (s, 12H; CH ₃ ), 1. 78 (m, 2H; CH ₂ ), 2.13 (t, ³ J = 6.9 Hz, 2H; CH ₂ ), 2.54 (m, 2H, CH ₂ ), 3.27 (m, 2H, CH ₂ ), 4.00 (t, ³ J = 7.5 Hz, 2H; CH ₂ ), 4.06 (q, ³ J = 7.0 Hz, 2H, CH ₂ ), 6.22 (d, ³ J = 13.7 Hz, 2H; CH), 6.55 (t, ³ J = 12.5 Hz, 1H; CH), 6.74 (s large, 1H, NH), 7.25 (m, 4H, CHA _T ), 7.40 (m, 2H, CHA _T ), 7.48 (m, 2H, CHA _T ), 8.08 (dd, ³ J = 13.7, 12.5 Hz, 2H, CH) ; MS: C ₃₅ H ₄₆ N ₃ OS ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée : 556.3; expérimentale : 556.5.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 2.5. Cyanine 5.0 disulfonatée-SH l-Éthyl-2-((lE,3E,5E)-5-(l-(6-((2-mercaptoéthyl)amino)-6-o xohexyl)-3,3-diméthy sulfoÎndolin-2-yUdène)penta-l,3-dÎèn-l-yl)-3,3-dÎméthy l-3H ndo

(3.2 μί, 18.4 μιηοΐ) sont introduits. Après 1 h à température ambiante, du dithiothréitol (6.8 mg, 43.8 μιηοΐ, 1.8 eq) est ajouté et le milieu réactionnel est agité pendant la nuit à température ambiante. Les solvants sont éliminés sous pression réduite et la purification du produit brut est réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). La cyanine 5.0 disulfonatée-SH est obtenue sous la forme d'une poudre bleue (7.3 mg, 42%). MS : C ₃₅ H ₄₆ N ₃ 0 ₇ S3 ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée : 716.2; expérimentale : 716.4. 2.6. (R)-NODAGA-SH

Acide (S)-2,2 '-(7-( l-carboxy-4-( ( 2-mercaptoéthyl)amino )-4-oxobutyl)-l,4, 7- triazonane-l,4-diyl)diacetique

Le (R)-NODAGA(iBu) ₃ (159 mg, 292 μπιοΐ), le TSTU (97.0 mg, 321 μπιοΐ, 1.1 eq) et la DIPEA (61.0 μί, 350 μπιοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 2 mL de DMF anhydre. La solution est agitée à température ambiante pendant 40 min, puis la 2-(tritylsulfanyl)éthanamine (102 mg, 321 μιηοΐ, 1.1 eq) est introduite. Après 5 h, le

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) DMF est éliminé sous pression réduite et 10 mL d'une solution de déprotection TFA/DODT/TIS, 90/5/5 (v/v/v) sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité pendant la nuit à température ambiante, puis le solide blanc formé est éliminé par filtration et le TFA évaporé sous flux d'azote. Le produit est précipité dans de l'éther diéthylique à 4°C et isolé par centrifugation (4000 rpm, 4 °C). La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). Le (R)-NODAGA-SH est obtenu sous la forme d'une poudre blanche hygroscopique (89.5 mg, 71%, pureté : 95%). RMN 1H (300 MHz, D ₂ 0) : d (ppm) = 2.10 (m, 1H; CH ₂ ), 2.19 (m, 1H; CH ₂ ), 2.51 (t, ³ J = 7.8 Hz, 2H; CH ₂ ), 2.68 (t, ³ J = 6.3 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.11 à 3.22 (m, 4H; CH ₂ ), 3.22 à 3.31 (m, 2H; CH ₂ ), 3.34 (s, 2H; CH ₂ ), 3.40 (t, ³ J = 6.3 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.70 (dd, 1H; ³ J = 6.0, 7.8 Hz, 1H; CH), 3.98 (s, 4H; CH ₂ ); MS: Ci ₇ H ₃₁ N ₄ 0 ₇ S ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 435.2; expérimentale : 435.1.

3. Tétrazines monofonctionnalisées de formule (IV)

3.1. NODAGA-NH-Tz-Cl (IV-1)

Acide (S)-2,2 '-(7-(l-carboxy-4-( ( 2-( ( 6-chloro-l,2,4,5-tétrazin-3- yl)amino )éthyl)amino )-4-oxobutyl)-l,4, 7-triazonane-l,4-diyl)diacetique

Le (R)-NODAGA-NH ₂ (95.3 mg, 228 μηιοΐ) est dissout dans 1 mL de tampon borate (2.5 M, pH 8) et le pH est ajusté à pH 8 par ajout de NaOH 2.5 M. La s-dichlorotétrazine (34.5 mg, 228 μηιο1, 1.0 eq) dans 300 d'ACN est ajoutée. Après 2 h d'agitation à température

ambiante, les solvants sont éliminés sous pression réduite. La purification du produit brut est réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le

NODAGA-NH-Tz-Cl est obtenu sous la forme d'une poudre orange (43.8 mg, 36%). RMN 1H (500 MHz, D ₂ 0) : d = 1.20 (m, 1H; CH ₂ ), 2.05 (m, 1H; CH ₂ ), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.01 à 3.15 (m, 4H; CH ₂ ), 3.22 (m, 2H; CH ₂ ), 3.29 (s, 4H; CH ₂ ), 3.46

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) à 3.59 (m, 3H; CH, CH ₂ ), 3.71 (m, 2H; 2H; CH ₂ ), 3. 58 (s, 4H; CH ₂ ) ; MS Ci ₉ H3iClN ₉ 0 ₇ ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 532.2; expérimentale : 532.1.

3.2. DOTAGA-NH-Tz-Cl (IV-2)

Acide 2,2 ',2 ' '-(10-(l-carboxy-4-((2-((6-chloro-l,2,4,5-tétrazin-3- yl)amino)éthyl)amino)-4-oxobutyl)-l,4,7,10-tétraazacyclodo décane-l,4,7- triyl)triacetique Le DOTAGA-NH ₂ (243 mg, 443 μmol) est dissous dans 7 mL de tampon borate (2.5 M, pH 8) et le pH est ajusté à pH 8 par ajout de NaOH 2.5 M. La s-dichlorotétrazine (68 mg, 443 μηιοΐ, 1.0 eq) dans 2 mL d'ACN est ajoutée. Après 2h d'agitation à température ambiante, les solvants sont éliminés sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi- préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). Le DOTAGA-NH-Tz-Cl est obtenu sous la forme d'une poudre orange (154 mg, pureté : 99%). RMN 1H (500 MHz, D ₂ 0) : d = 1.20 (m, 1H; CH ₂ ), 2.05 (m, 1H; CH ₂ ), 2.43 (t, ³ J = 7.5 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.01 à 3.15 (m, 4H; CH ₂ ), 3.22 (m, 2H; CH ₂ ), 3.29 (s, 4H; CH ₂ ), 3.46 à 3.59 (m, 3H; CH, CH ₂ ), 3.71 (m, 2H; 2H; CH ₂ ), 3.58 (s, 4H; CH ₂ ) ; MS : Ci ₉ H ₃ iClN ₉ 0 ₇ ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 532.2; expérimentale : 532.1.

3.3. (R)-NODAGA-S-Tz-Cl (IV-3)

Acide (S)-2,2'-(7-(l-carboxy-4-((2-((6-chloro-l,2,4,5-tétrazin-3- yl)thio)éthyl)amino)-

4-oxobutyl)-l,4,7-triazonane-l,4-diyl)diacetique L ^e (R)-NODAGA-SH (40 mg, 92 μ ^η ιοΐ) et la s- dichlorotétrazine (41.7 mg, 276 μιηοΐ, 3 eq) sont dissous dans 3 mL de DMF anhydre. Après 10 min

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) d'agitation à température ambiante, le DMF est éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide trifluoroacétique ACN 0.1% acide trifluoroacétique). Le (R)- NODAGA-S-Tz-Cl est obtenu sous la forme d'une poudre orange (46 mg, 91%, pureté : 96%). RMN 1H (500 MHz, D ₂ 0): d = 2.04 (m, 1H; CH ₂ ), 2.11 (m, 1H; CH ₂ ), 2.46 (m, 2H; CH ₂ ), 3.08 à 3.11 (m, 4H; CH ₂ ), 3.23 (m, 4H; CH ₂ ), 3.29 (s, 4H, CH ₂ ), 3.55 (t, ³ J = 7.1 Hz, 1H; CH), 3.58 (m, 2H; CH ₂ ), 3.67 (m, 2H; CH ₂ ), 3.826 (s, 2H; CH ₂ ), 3.831 (s, 2H; CH ₂ ); MS : Ci ₉ H ₃ oClN ₈ 0 ₇ S ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 549.2; expérimentale : 548.9. 3.4. BODIPY-S-Tz-Cl (IV-4)

10-(4-((2-((6-chloro-l,2,4,54étrazin-3-yl)thio)éthyl)ca rbamoyl)phényl)-2

5,5-difluoro-l,3, 7,9-tétraméthyl-5H-dipyrrolo[l,2-c:2 ',1 '-f][l,3,2]diazaborinin-4-ium- 5-uide

Le BODIPY-SH (29.1 mg, 60.2 μηιοΐ) et la s- dichlorotétrazine (10.6 mg, 70.2 μιηοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 1.5 mL d'un mélange DMF/ ACN 0.6/0.4 (v/v) et la DIPEA (12.5 μί, 72.2 μηιοΐ, 1.2 eq) est ajoutée au milieu réactionnel. Après 1 h d'agitation à température ambiante, les solvants sont éliminés sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le BODIPY-S-Tz-Cl est obtenu sous la forme d'une poudre rouge (24.1 mg, pureté : 90%, produit réduit en dihydrotetrazine : 10%). RMN 1H (300 MHz, CDC1 ₃ ): d = 0.96 (t, ³ J = 7.5 Hz, 6H; CH ₃ ), 1.23 (s, 6H; CH ₃ ), 2.28 (q, ³ / =7.5 Hz, 4H;

CH ₂ ), 2.51 (s, 6H; CH ₃ ), 3.65 (t, ³ J = 6.3 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.92 (dt, ³ J = 5.7, 6.3 Hz, 2H; CH ₂ ), 6.71 (t, ³ J = 5.7 Hz, 1H; NH), 7.39 (d, ³ J = 8.2 Hz, 2H; CH _AT ), 8.18 (d, ³ J = 8.2 Hz, 2H; CH _AT ) ; HRMS : C ₂₈ H ₃₁ BC1FN ₇ 0S ⁺ ([M-F] ⁺ ) m/z calculée : 578.20709; expérimentale : 578.20828.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 3.5. Rhodamine B-S-Tz-Cl (IV-5)

N-(9-(2-((2-((6-chloro-l,2,4,5-tétrazin-3-yl)thio)éthyl )carbamoyl)phényl)-6- ( diéthylamino )-3H-xanthen-3-ylidene)-N-éthylethanaminium

La rhodamine B-SH (200 mg, 399 μηιοΐ) et la s-dichlorotétrazine (60.3 mg, 399 μιηοΐ, 1.0 eq) ont été dissous dans 2 mL d'ACN et la DIPEA (69.5 μί, 399 μηιοΐ, 1.0 eq) a été

introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation 5 h à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). La rhodamine B-S-Tz-Cl a été obtenue sous la forme d'une poudre rose (47.8 mg, 19%). RMN 1H (300 MHz, CDC1 ₃ ) : équilibre entre les formes cyclique et non-cyclique de la rhodamine ; HRMS : C ₃₂ H ₃₅ C1N ₇ 0 ₂ S ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée : 616.22560; expérimentale : 616.22622; C ₃₂ H ₃₄ ClN ₇ Na0 ₂ S ⁺ (cyclic form) ([M-H+Na] ⁺ ) m/z calculée : 638.20754; expérimentale : 638.20749.

3.6. Cyanine 3.0 disulfonatée-S-Tz-Cl (IV-6)

2-( ( 1Ε,3Ε)-3-( l-( 6-((2-(( 6-chloro-l,2,4,5-tétrazin-3-yl)thio )éthyl)amino )-6-oxohexyl)- 3,3-diméthyl-5-sulfoindolin-2-ylidène)prop-l-èn-l-yl)-l-� �thyl-3,3-diméthy

l-ium-5-sulfonate

La cyanine 3.0 disulfonatée-SH (15.8 mg, 22.9 μιηοΐ) et la s-dichlorotétrazine (4.3 mg, 28.5 μιηοΐ, 1.2 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (5.5 μί, 31.8 μπιοΐ,

1.4 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel sous agitation à température ambiante. Après 1 h, la réaction était complète et le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). La cyanine 3.0 disulfonatée-S-Tz- Cl a été obtenue sous la forme d'une poudre rose (6.0 mg). HRMS (mode négatif) : C ₃₅ H ₄₁ CIN ₇ O ₇ S ₃ ^" ([M-H] ^" ) m/z calculée : 802.19236; expérimentale : 802.18923. 4. Tétrazines bifonctionnalisées de formule (Ha)

4.1. DOTAGA-NH-Tz-S-Rhodamine B (II I)

N-(9-(2-((2-((6-((2-(4-carboxy-4-(4 ,10-tris(carbox

tétraazacyclododécan-l-yl)butanamido)éthyl)amino)-l,2, 4,5-tétrazin-3- yl)thio)éthyl)carbamoyl)phényl)-6-(diéthylamino)-3H-xanth èn-3-ylidène)-N- éthyléthanaminium 2,2,2-trifluoroacetate

La rhodamine B-SH (39.7 mg, 79.0 μηιοΐ) et le DOTAGA-NH-Tz-Cl (50.0 mg, 79.0 μιηοΐ, 1.0 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (65.7 μί, 395 μιηοΐ, 5.0 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation à 75 °C pendant 3h, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le DOTAGA-NH- Tz-S-Rhodamine B a été obtenu sous la forme d'une huile rouge (37.0 mg, 43%) RMN 1H (500 MHz, D ₂ 0) d: 1.13 (m, 12H; CH ₃ ), 2.01 (m, 2H; CH ₂ ), 2.56 (m, 2H; CH ₂ ), 2.96 (m, 2H; CH ₂ ), 3.00 à 3.48 (m, 12H; CH ₂ ), 3.48 à 3.63 (m, 8H; CH ₂ ), 3.69 (m, 10H;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) CH ₂ ), 3.74 à 4.37 (m, 6H; CH ₂ ), 3.99 (m, 1H; CH), 7.1 1 (m, 2H; CH _AT ), 7.24 (m, 3H: CHAT), 7.63 (m, 2H; CHAT), 7.72 (m, 2H; CHAT), 8.02 (m, 1H; CHAT) ; HRMS C ₅ 3H ₇₂ Ni ₃ 0iiS ⁺ ([M] ⁺ ) m/z calculée : 1098.51895; expérimentale : 1098.52126: C ₅₃ H ₇₁ Ni ₃ NaOiiS ⁺ ([M-H+Na] ⁺ ) m/z calculée : 1 120.50089; expérimentale 1 120.50291 ; C ₅₃ H ₇ oKNi ₃ NaOiiS ⁺ ([M-2H+Na+K] ⁺ ) m/z calculée : 1 158.45677: expérimentale : 1 158.45431 1.

4.2. DOTAGA-NH-Tz-S-BODIPY (II-2)

10-(4-((2-((6-((2-(4-carboxy-4-(4 ,10-tris(carboxym

tétraazacyclododécan-l-yl)butanamido)éthyl)amÎno)-l,2 ,4,5-tétrazÎn-3- yl)thio)éthyl)carbamoyl)phényl)-2,8-diéthyl-5,5-dÎfluoro -l,3,7,9-tétramé

dipyrrolo[ l,2-c:2 ', 1 '-f][ l,3,2]diazaborinin-4-ium-5-uide

Le BODIPY-SH (11.7 mg, 24.2 μηιοΐ) et le DOTAGA-NH-Tz-Cl (15.3 mg, 24.2 μιηοΐ, 1.0 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (22.8 μί, 121.0 μιηοΐ, 5.0 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation à 75 °C pendant lh30, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le DOTAGA-NH-Tz-S-BODIPY a été obtenu sous la forme d'une poudre rouge (18.0 mg, 69%, pureté : 95%). RMN 1H (500 MHz, MeOD) d: 0.99 (m, 6H; CH ₃ ), 1.32 (s, 6H; CH ₃ ), 2.35 (m, 4H; CH ₂ ), 2.48 (s, 6H; CH ₃ ), 3.01 à 4.13 (m, 27H; C¾ _maCTO cycie), 3.52 (m, 2H; CH ₂ ), 3.80 (m, 2H; CH ₂ ), 7.46 (m, 2H; CH _AT ), 8.01 (m, 2H; CH _AT ) ;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) HRMS: C ₄₉ H ₆₉ BF ₂ Ni ₃ 0ioS ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 1080.50667; expérimentale : 1080.50639; C ₄₉ H ₆₈ BF ₂ Ni ₃ NaOioS ⁺ ([M+Na] ⁺ ) m/z calculée : 1102.48861; expérimentale : 1102.48834; C ₄₉ H ₆₇ BF ₂ Ni ₃ Na ₂ OioS ⁺ ([M-H+2Na] ⁺ ) m/z calculée : 1124.47056; expérimentale : 1124.46975. 4.3. DOTAGA-NH-Tz-S-cyanine 5.0 (II-3)

2-((lE,3E,5E)-5-(l-(6-((2-((6-((2-(4-carboxy-4-(4 0 r^

tétraazacyclododécan-l-yl)butanamido)éthyl)amÎno)-l,2 ,4,5-tétrazÎn-3- yl)thio)éthyl)amino)-6-oxohexyl)-3,3-diméthylindolin^

l-éthyl-3,3-diméthyl-3H-indol-l-ium

La cyanine 5.0-SH (14.9 mg, 26.8 μπιοΐ) et le DOTAGA-NH-Tz-Cl (19.5 mg, 30.8 μιηοΐ, 1.1 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (28.0 μί, 149.5 μιηοΐ, 5.6 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation à 75°C pendant lh, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le DOTAGA-NH- Tz-S-cyanine 5.0 a été obtenu sous la forme d'une poudre bleue (15.1 mg, 49%). RMN 1H (500 MHz, CD ₃ CN): d = 1.33 (t, ³ J = 7.0 Hz, 3H; CH ₃ ), 1.42 (m, 2H; CH ₂ ), 1.61 (m, 2H; CH ₂ ), 1.67 (s, 12H; CH ₃ ), 1. 76 (m, 2H; CH ₂ ), 2.12 (t, 2H; CH ₂ ), 2.76 à 3.97 (m, 35H; macrocycle + CH ₂ ), 4.00 (t, 2H; CH ₂ ), 4.06 (q, ³ J = 7.0 Hz, 2H, CH ₂ ), 6.21 (d, ³ / = 13.0 Hz, 2H; CH), 6.53 (t, ³ J = 13.0 Hz, 1H; CH), 7.25 (m, 4H, CH^), 7.40 (m, 2H, CH _AT ), 7.47 (m, 2H, CH^), 8.07 (dd, 2H, CH) ; HRMS : C ₅₈ H ₈₂ Ni ₃ OioS ⁺

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) ([M] ⁺ ) m/z calculée : 1152.60228; expérimentale : 1152.60445; C ₅ 8H ₈₂ Ni ₃ NaOioS ^; ([M+Na] ²⁺ ) m/z calculée : 587.79575; expérimentale : 587.79558.

4.4. DOTAGA-NH-Tz-S-cyanine 5.0 disulfonatée (II-4)

2-((lE,3E,5E)-5-(l-(6-((2-((6-((2-(4-carboxy-4-(4 ,104 ^^

tétraazacyclododecan-l-yl)butanamido )éthyl)amino )-l,2,4,5-tétrazin-3- yl)thio)éthyl)amino)-6-oxohexyl)-3,3-diméthyl-5-sulfoindol in-2-ylidène)pen^ dièn-l-yl)-l-éthyl-3,3-diméthyl-3H-indol-l-ium-5-sulfonat e

La cyanine 5.0 disulfonatée- SH (5.4 mg, 7.54 μηιο1) et le DOTAGA-NH-Tz-Cl

(5.7 mg, 9.05 μιηοΐ, 1.2 eq) ont été dissous dans 800 μΐ _^ de DMF anhydre et la DIPEA (8.47 μί, 45.25 μιηοΐ, 6.0 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation à 75°C pendant 5h, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le

DOTAGA-NH-Tz-S-cyanine 5.0 disulfonatée a été obtenu sous la forme d'une poudre bleue (3.75 mg). RMN 1H (500 MHz, D ₂ 0) 5: 1.31 (m, 5H; CH ₂ + CH ₃ ), 1.59 (m, 2H; CH ₂ ), 1.61 (s, 6H; CH ₃ ), 1.67 (s, 6H; CH ₃ ), 1.81 (m, 2H; CH ₂ ), 1.88 (m, 2H; CH ₂ ), 2.20 (t, 2H; CH ₂ ), 2.44 (m, 2H; CH ₂ ), 2.97 à 3.63 (m, 26H; 2 CH ₂ + 11 C¾ _macrocyc i _e ), 3.82 (m, 5H; 2 CH ₂ + CH), 4.07 (m, 4H; CH ₂ ), 6.15 (d, 1H; CH), 6.23 (d, 1H; CH), 6.48 (t,

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 1H; CH), 7.33 (d, 2H; CH _AT ), 7.79 à 7.88 (m, 4H; CH _AT ), 7.96 (m, 1H; CH), 8.01 (m, 1H; CH) ;

4.5. (R)-NODAGA-NH-Tz-S-BODIPY (II-5)

(S)-10-(4-((2-((6-((2-(4-(4 -bis(carboxyméthyl)-l,4^^

carboxybutanamido )éthyl)amino )-l,2,4,5-tétrazin-3-yl)thio )éthyl)carbamoyl)phényl)- 2,8-diéthyl-5,5-difluoro-l,3, 7,9-tétraméthyl-5H-dipyrrolo[l,2-c:2 ',1 '-][ l,3,2]diazaborinin-4-ium-5-uide

Le BODIPY-SH (17.0 mg, 40.1 μπιοΐ) et le (R)-NODAGA-NH-Tz-Cl (27.4 mg, 51.5 μιηοΐ, 1.3 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (48.3 μΐ,, 275.5 μιηοΐ, 5.0 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation à 75 °C pendant lh, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le (R)-NODAGA- NH-Tz-S-BODIPY a été obtenu sous la forme d'une poudre rouge (8.1 mg). HRMS : C ₄₅ H ₆₂ BF ₂ Ni ₂ 0 ₈ S ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 979.45899; expérimentale : 979.45948; C ₄₅ H ₆ iBF ₂ Ni ₂ Na0 ₈ S ⁺ ([M+Na] ⁺ ) m/z calculée : 1001.44094 ; expérimentale : 1001.44055.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 5. Tétrazines bifonctionnalisées de formule (Ilb)

5.1. (R)-NODAGA-S-Tz-S-peptide (II-6)

Acide 2,2'-(7-((S)-4-((2-((6-(((2S,5S,llS,17S,20S,23S,26R)-17-(( ^ yl)méthyl)-26-acétamido-l-amino-23-(4-aminobutyl)-5-(carbo xyméthyl)-ll-(3- guanidinopropyl)-20-(4-hydroxybenzyl)-2-(hydroxyméthyl)-l,4 ,7,10,13,16,19,22,25- nonaoxo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaazaheptacosan-27-yl)thio)-l ,2,4,5-tétrazÎn-3- yl)thio )éthyl)amino )-l-carboxy-4-oxobutyl)-l,4, 7 -triazonane-l,4-diyl)diacetique

Le (R)-NODAGA-S-Tz-Cl (8.5 mg, 15.5 μπιοΐ) et le peptide Ac-CKYWGRGDS- NH ₂ , 2 TFA (25 mg, 18.7 μιηοΐ, 1.2 eq) sont dissous dans 600 μΐ _^ d'eau ultrapure. La solution est agitée à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 30 min. La purification du produit brut est réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ O 0.1% acide formique, ACN 0.1% acide formique). Le produit (R)- NODAGA-S-Tz-S-peptide, pouvant aussi s'écrire Ac-C(Tz-S- NODAGA)KYWGRGDS-NH ₂ , est obtenu sous la forme d'une poudre orange (5.8 mg, 55%, pureté : 82%). HRMS : C ₆ 7H ₉₈ N ₂₃ 0 ₂ iS ₂ ⁺ ([M+H] ⁺ ) m/z calculée : 1624.67;

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) expérimentale : 1624.57; ([M+Na] ⁺ ) m/z calculée : 1646.66; expérimentale : 1646.49.

5.2. BSA-S-tétrazine-S-NODAGA (II-7) De l'albumine de sérum bovin (« Bovin Sérum

Albumin », BSA) a été incubé avec la (R)- chlorotétrazine-NODAGA (10 équiv.) pendant 1 heure à température ambiante (pH=5, 15). Après purification par ultracentrifugation, le composé BSA-

S-tétrazine-S-(R)-NODAGA (II-7) est obtenu. LC-HRMS après déconvolution du spectre de masse : 67004 (correspond au composé 1-3) et 66430 (correspond au résidu de protéine sans sonde).

5.3. Fab'-S-tétrazine-S-DOTAGA (II-8) ' Le fragment Fab' a été incubé avec la (R)- chlorotétrazine-NODAGA (50 équiv.) pendant 30 minutes à 37°C (pH=7,3). LC-HRMS de la réaction après déconvolution du spectre de masse : 49687 (correspond au composé 1-3) et 48660 (correspond au résidu de Fab' sans sonde). Le composé n'est pas purifié avant d'être engagé dans la formation du composé (cyanine 5.0 disulfonatée-BCN-pyridazine, S-(R)- NODAGA) ₂ , S-Fab' (1-4).

5.4. Sélectivité de la réactivité de (R)-NODAGA-S-Tz-Cl avec les thiols versus les aminés d'un peptide

La chimiosélectivité de la réaction des chlorotétrazines mono-substituées par un nucléophile de type thiol, vis-à-vis des nucléophiles présents sur les protéines a été évaluée au moyen de deux peptides modèles : Ac-CKYWGRGDS-NH ₂ et Ac- MKYWGRGDS-NH ₂ . Ces peptides contiennent les acides aminés les plus courants possédant des chaînes latérales nucléophiles comme la lysine (amine), la sérine (alcool)

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) et la tyrosine (phénol). Ils différent par la présence d'une cystéine (thiol) dans l'un, qui est substituée par une méthionine (thioéther) dans l'autre.

Les peptides (20 μΜ), en solution dans un tampon phosphate (0,01 M ; différents pH), sont incubés en présence de 2,5 équivalents de (R)-NODAGA-S-Tz-Cl à 25°C. Le taux de conversion en produit résultant de la substitution du chlore de (R)-NODAGA-S-Tz- Cl par les peptides est déterminé par LC-MS à 214 nm. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.

Taux de conversion des peptides en présence de 2.5 equiv of (R)-NODAGA-S-Tz-Cl à différent pH. (quant.: quantitatif ; <1% : limite de détection de la méthode utilisée)

Ces résultats montrent que les chlorotétrazines mono-substituées par un nucléophile de type thiol réagissent sélectivement avec les nucléophiles de type thiol porté par le peptide Ac-CKYWGRGDS-NH ₂ , en l'espace de quelques minutes, dans des conditions douces (solution aqueuse tamponnée, 25°C, pH neutre). En l'absence de cystéine, aucune réaction n'est observée. 6. Intermédiaires de formule (III)

6.1. Cyanine 5.0-BCN

2-((lE,3E,5E)-5-(l-(6-((2-((((lR,8S,9s)-bicyclo[6AM]no

ylméthoxy )carbonyl)amino )éthyl)amino )-6-oxohexyl)-3,3-diméthylindolin-2- ylidène)penta-l,3-dièn-l-yl)-l-éthyl-3,3-diméthyl-3H-ind ol-l-ium 2,2,2- trifluoroacétate

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) La cyanine 5.0-NH ₂ (25.7 mg, 33.5 μιηοΐ) et le bicyclononyne-N-hydroxysuccinnimide (16.3 mg, 55.8 μιηοΐ, 1.7 eq) ont été dissous dans 1 mL de DMF anhydre et la DIPEA (8.41 μί, 48.6 μιηοΐ, 1.5 eq) a été introduite dans le milieu réactionnel. La solution a été laissée sous agitation 40 min à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. La purification du produit brut a été réalisée par HPLC semi-préparative en phase inverse (éluants : H ₂ 0 0.1% TFA, ACN 0.1% TFA). La cyanine 5.0-BCN, TFA a été obtenue sous la forme d'une poudre bleue (11.5 mg, 41%, sel de TFA, pureté : 90%). RMN 1H (500 MHz, CDC1 ₃ ): d = 0.86 (m, 2H; CH), 1.31 (m, 1H; CH), 1.39 (t, ³ / = 7.5 Hz, 3H; CH ₃ ), 1.47 (m, 2H; CH ₂ ), 1.53 (m, 2H; CH ₂ ), 1.66 (s, 6H; CH ₃ ), 1.67 (s, 6H; CH ₃ ), 1.71 (m, 2H; CH ₂ ), 1.79 (m, 2H; CH ₂ ), 2.08 à 2.27 (m, 6H; CH ₂ ), 2.30 (t, ³ / = 7.3 Hz, 2H; CH ₂ ), 3.31 (m, 2H; CH ₂ ), 3.54 (m, 2H; CH ₂ ), 3.99 (t, ³ J = 7.6 Hz, 2H; CH ₂ ), 4.04 (q, ³ J = 7.2 Hz, 2H; CH ₂ ), 4.07 (d, ³ J = 8.4 Hz, 2H; CH ₂ ), 6.04 à 6.22 (m, 1H; OCONH), 6.17 (d, ³ J = 13.5 Hz, 1H; CH), 6.26 (d, ³ J = 13.5 Hz, 1H; CH), 6.66 (t, ³ J = 12.5 Hz, 1H; CH), 7.05 (d, 3J = 7.9 Hz, 1H; CHA _T ), 7.10 (d, ³ J = 8.0 Hz, 1H; CHA _T ), 7.22 (m, 2H; CHA _T ), 7.35 (m, 4H; CHA _T ), 7.78 (dd, ³ J = 12.0, 13.5 Hz, 1H; CH), 7.79 (dd, ³ J = 12.0, 13.5 Hz, 1H; CH), 8.26 (m, 1H; CONH) ; HRMS: C ₄₆ H ₅₉ N ₄ O ([M] ⁺ ) m/z calculée : 715.45817; expérimentale : 715.45752.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 6.2. Trastuzumab-BCN

26.7 d'une solution stock de BCN-NHS à 2 mM dans le DMSO (53.3 nmol, 4.0 eq) sont ajoutés à l'anticorps trastuzumab (Herceptin; Roche, U.K.) (2 mg, 13.3 nmol) en solution dans un tampon bicarbonate (0.2 M, pH 8.5) en présence de 10% (v/v) de DMSO (concentration en trastuzumab : 2 mg/mL). La solution est agitée dans un thermomixer (800 rpm, 25 °C) durant 2 h. L'excès de BCN est éliminé par ultrafiltration sur Amicon Ultra Ultracel-30 kDa (Merck Millipore). Lors de l'étape d'ultrafiltration, le produit est concentré et le tampon bicarbonate est échangé par un tampon PBS (0,01 M, pH 7.4). Le trastuzumab-BCN est isolé en solution dans 51 de PBS à la concentration de 35.5 mg/mL (1.81 mg, 12.1 nmol, rendement de marquage : 91%). Le ratio BCN/anticorps est de 3.3 (déterminé par spectrométrie de masse MALDI/TOF).

7. Plateformes trifonctionnalisées de formule (I)

7.1. Trastuzumab-BCN-pyridazine, NH-DOTAGA, S-cyanine 5.0 disulfonatée (I I)

75.3 μL· d'une solution stock de DOTAGA-NH-Tz-S-cyanine 5.0 disulfonatée à

5 mM dans l'eau ultrapure (376.6 nmol, 33.0 eq) est ajouté au trastuzumab-BCN (1.71 mg, 11.4 nmol) en solution dans le PBS (pH 7.4) + 10% (v/v) DMSO

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) (concentration finale en trastuzumab-BCN : 10 mg/mL). La solution est agitée dans un thermomixer (800 rpm, 37 °C) durant 16 h. L'excès de sonde est éliminé par purification en FPLC (Akta Pure Healthcare, GE) sur une colonne de dessalage (Hitrap desalting, 5 mL, pré-packée avec Sephadex G-25 Superfine) avec le tampon AcONH ₄ (0.1 M, pH 5.8, Trace Select) comme éluant. Le trastuzumab-BCN-pyridazine, NH- DOTAGA, S-Cyanine 5.0 disulfonatée (1-1) est obtenu en solution dans 484 de tampon acétate d'ammonium à la concentration de 2.1 mg/mL (facteur de correction = 0.095) (1.02 mg, 6.8 nmol, 59%). Le ratio sonde/anticorps est de 1.7 (déterminé par spectrophotométrie). L'analyse par gel d'électrophorèse en condition dénaturante montre un signal fluorescent pour la masse moléculaire correspondant au composé 1-1, indiquant une liaison de type covalente entre la sonde et l'anticorps trastuzumab. La stabilité du composé 1-1 est vérifiée par incubation à 37 °C dans le noir dans du plasma humain (analyse par gel d'électrophorèse d'un échantillon après 1, 2, 4, 8, 24 et 48 h d'incubation). 7.2. NODAGA-BCN-pyridazine, S-(R)-NODAGA, S-peptide (1-2)

Acide 2,2 '-(7-((lS )-4-((2-((((l-(((2S,5S,llS,17S,20S,23S,26R )-l 7-((lH-indol-3- yl)méthyl)-26-acétamido-l-amino-23-(4-aminobutyl)-5-(carbo xyméthyl)-ll-(3- guanidinopropyl)-20-(4-hydroxybenzyl)-2-(hydroxyméthyl)-l,4 ,7,10,13,16,19,22,25- nonaoxo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaazaheptacosan-27-yl)thio)-4 -((2-((S)-4-(4, 7- bis( carboxyméthyl)-l,4, 7-triazonan-l-yl)-4-carboxybutanamido )éthyl)thio )- 6, 6a, 7, 7a,8, 9-hexahydro-5H-cyclopropa[5, 6]cycloocta[ l,2-d]pyridazin-7- yl)méthoxy )carbonyl)amino )éthyl)amino )-l-carboxy-4-oxobutyl)-l,4, 7-triaz nane- l,4-diyl)diacetique

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2 μΐ, d'une solution stock de (R)-NODAGA-S-Tz-S-peptide à 30 mM dans le DMSO (60 nmol) et 12 μΐ. d'une solution stock de NODAGA-BCN à 50 mM dans le PBS (600 mmol, 10 eq) sont combinés dans le PBS à température ambiante (concentration finale en (R)-NODAGA-S-Tz-S-peptide : 2 mM et en DMSO : 6.7%). L'avancement de la réaction est suivi par spectrophotométrie UV-Vis. Après 50 min de réaction, le taux de conversion en NODAGA-BCN-pyridazine, S-(R)-NODAGA, S-peptide (1-2) est de 98% (déterminé par LC-MS à 214 nm). MS: C ₉₅ H ₁₄₀ N ₂₆ O ₃₀ S ₂ ([M+2H] ²⁺ ) m/z calculée: 1095.5; expérimentale : 1096.0

7.3. Cyanine 5.0 disulfonatée-BCN-pyridazine, S-(R)-NODAGA, S-BSA (1-3)

Le composé (R)-NODAGA-S-tétrazine- S-BSA est combiné avec la cyanine 5.0 disulfonatée -BCN lors d'une réaction de chimie « click » pendant une nuit, en solution aqueuse (tampon phosphate, pH

=7,13) à 37°C. Le produit final cyanine

5.0 disulfonatée-BCN-pyridazine, S-(R)- NODAGA, S-BSA (1-3) est purifié par chromato graphie d'exclusion stérique. Le ratio sonde/protéine est de 0.7 (déterminé

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) par spectrophotométrie). LC-HRMS après déconvolution du spectre de masse : 67851 (correspond au composé 1-3) et 66430 (correspond au résidu de protéine sans sonde). L'analyse par gel d'électrophorèse en condition dénaturante montre un signal fluorescent pour la masse moléculaire correspondant au composé 1-3, indiquant une liaison de type covalente entre la sonde et l'albumine. La stabilité du composé 1-3 est vérifiée par incubation à 37 °C dans le noir dans du plasma humain (analyse par gel d'électrophorèse d'un échantillon après 1, 2, 4, 8, 24 et 48 h d'incubation).

51503 (correspond au composé 1-4 + 2 cations cuivre) et 48659 (correspond au résidu de protéine sans sonde).

PARTIE II. RESULTATS EN IMAGERIE

Le composé 1-1 après radiomarquage à l'indium 111 a été étudié pour l'imagerie multimodale par tomo graphie par émission monophotonique (TEMP/CT) et pour l'imagerie optique (fluorescence). Le composé 1-3 a été étudié par imagerie optique. L'expérimentation in vivo a été menée sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur mammaire xénogreffée (modèle BT-474).

8.1. Imagerie à partir du composé I I radiomarqué à l'indium 111

Le but de cette expérience est de mettre en évidence le caractère spécifique du composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 utilisé comme agent d'imagerie.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) Pour cela, deux lots de souris ont été étudiés :

- lot A : souris traitées avec le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 (n=4) ; et

- lot B : souris traitées avec le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 et un excès de trastuzumab non marqué (n=3). 24h après injection, des images des souris des lots A et B, ont été enregistrées par tomographie par émission monophotonique (TEMP/CT) et par imagerie optique. L'injection d'un large excès de trastuzumab non marqué (qui sature les récepteurs HER2) permet de mettre en évidence la spécificité de l'agent d'imagerie.

En effet, si aucune évolution significative n'est observée entre les images des lots A et B alors l'accumulation de l'agent d'imagerie dans le tissu étudié n'est pas spécifique. Au contraire, si le signal observé avec le lot A diminue ou disparait sur l'image obtenue avec le lot B, alors l'accumulation de l'agent d'imagerie dans le tissu étudié est spécifique.

Tomographie par émission monophotonique (TEMP/CT) Des exemples d'images TEMP/CT illustratives sont présentés pour le lot A, Figure 2A et pour le lot B, Figure 2B.

Ces résultats montrent que :

- dans le cas du traitement avec le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 1 11 (lot A), la tumeur est visible par imagerie TEMP/CT (Cf. marque blanche sur la Figure 2A) ; - lorsque la souris est traitée par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 avec un large excès de trastuzumab non marqué, une disparition du signal est observée par rapport au lot A.

Cette expérience met donc en évidence l'accumulation spécifique de l'agent d'imagerie dans le tissu tumoral. Par ailleurs, la Figure 3 présente la biodistribution de la radioactivité (pourcentage moyen de dose injectée par gramme d'organe) dans différents organes de souris traitées (n = 4) par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 (lot A - gris clair) ou de souris

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) traitées (n = 3) par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 avec un excès de trastuzumab (lot B - gris foncé).

Sur la Figure 3, une nette différence est observée entre les lots A et B, pour la tumeur comparativement aux autres organes. Ces résultats démontrent la spécificité du composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 utilisé comme agent d'imagerie, à l'égard de la tumeur dans le modèle étudié.

Imagerie optique (fluorescence)

Des images optiques in vivo et ex vivo ont également été réalisées pour des souris traitées par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111. La Figure 4 présente la photographie in vivo d'une souris traitée par le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 (Figure 4(a)) sur laquelle la localisation de la tumeur est nettement visible (protubérance en haut, à gauche du dos de l'animal).

La même image prise en superposant le signal de fluorescence (Figure 4(b)) montre qu'un signal intense (blanc) coïncide avec la localisation de la tumeur. Ces résultats in vivo confirment l'efficacité du composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 comme agent d'imagerie, notamment pour cibler des tumeurs.

Les Figures 5 et 6 présentent les résultats obtenus sur organes isolés (ex vivo). Sur la Figure 5, l'intensité de fluorescence émanant de la tumeur est beaucoup plus intense que celle issue des autres organes isolés. La Figure 6 confirme que le composé 1-1 radiomarqué à l'indium 111 agit comme un agent d'imagerie spécifique vis-à-vis de la tumeur. En effet, une nette différence de biodistribution est observée entre les lots A et B pour la tumeur comparativement aux autres organes pour lesquels les signaux sont comparables.

En conclusion, les résultats de fluorescence confirment les résultats obtenus en imagerie nucléaire. L'intérêt du double marquage site spécifique du trastuzumab est ainsi démontré pour des applications en imagerie multimodale TEMP/CT/op tique.

FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) 8.2. Imagerie à partir du composé 1-3

Une étude a été menée à partir du composé 1-3 en imagerie optique sur un lot de souris préalablement xénogreffées avec de cellules tumorales mammaires BT-474 puis traitées avec le composé 1-3 (n=3, lot C).

Après traitement (t ₀ ), des images de fluorescence in vivo des souris du lot C ont été acquises à t=lh, 4h, et 24h (Figure 7) ; et ex vivo sur organes isolés après 24h (Figures 8 et 9).

La Figure 7 présente l'évolution du signal de fluorescence in vivo chez une souris du groupe du lot C. Elle montre qu'après injection du composé 1-3 les signaux de fluorescence sont intenses (zones claires) dans la région tumorale même après 24h, par rapport au reste de l'organisme.

La Figure 8 illustre les résultats obtenus sur organes isolés et la tumeur (ex vivo) pour une souris du lot C. Un signal de fluorescence plus intense dans la tumeur par rapport aux autres organes, est observé.

La quantification relative à la Figure 8 est présentée Figure 9.

En conclusion, comme pour le composé 1-1, les expériences montrent que le composé 1-3 est efficace comme agent d'imagerie.

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