【발명의 명칭】

생체적합성 나노입자 및 이의 용도

[기술분야】

본 출원은 2016년 1월 20일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0007104 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 생체적합성 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게 는 다당 (polysacchar ide) , 이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질의 수용액에 전자빔을 조사하여 분자 간 가교결합 ( inter-molecular cross-l inking) 또는 분자 내 가교결합 ( intra ^¬ molecular cross-l inking)을 유도하여 형성된 생체적합성 나노입자 및 이의 약물 전달체， 조영제， 진단제， 장유착방지제 또는 질병의 예방 및 치료용도에 관한 발명 이다.

【배경기술】

매우 작고 일정한 크기를 유지하는 입자를 빠르고 효과적으로 제조하는 기술 은 여러 산업 분야에서 요구되고 있다. 일정한 크기를 유지하는 작은 입자들은 많 은 장점들을 지니고 있으며， 그 중에서도 특히, 흐름성이 좋고 입자간 상호작용에 있어서 편차가 거의 없다는 점은 산업적으로 매우 유용한 장점이 된다. 예를 들면， 의약산업에 있어서 치료제 입자의 크기는 분해속도， 생물학적 능력， 제형 ( formulat ion) 등에 있어서 매우 중요한 요소가 되는 바， 치료제 입자간 상호작용 에 있어서 편차가 적어질수록 치료제의 전체적인 안정성은 좋아지게 된다. 의약품에 있어서， 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면 다음과 같은 장점 들이 있다. 먼저， 경구투여시 장내에서의 흡수율이 작은 약물에 있어서， 입자의 크 기가 큰 경우보다 더 많이 흡수될 수 있어， 결과적으로 치료제의 생물학적 효율을 증가시킬 수썼다. 또한， 경구투여만이 가능했던 약물을 흡입형으로 환자에게 투여 할 수 있게 되는 것과 같이， 치료제 제형의 형태를 다양하게 할 수 있다. 또한， 치 료제의 방출속도는 서방형 치료제의 제형에 있어서 매우 중요한 요소인 바, 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면， 그 크기가 상대적으로 균일해짐에 따라 치료제의 방출속도가 예측가능 해져서， 보다 효과적인 치료제를 제조할 수 있게 된다. 상기한 바와 같이， 균일한 나노입자는 여러 가지 장점들을 가지기 때문에, 활성물질을 나노입자로 제조하기 위한 다양한 시도들이 지금까지 이어져 왔다. 예 를 들면， Hi rokawa , Takashi . 등은 국제특허 W0 2008/126797에서 염화나트륨과 폴 리올화합물을 활성물질과 흔합하여 gr inding medi a없이 wet-mi 1 1 ing공정을 수행함 으로써 나노단위의 활성물질을 얻는 공정을 제시하였다. 이들 공정에서는 많은 양 의 염화나트륨 및 폴리을화합물을 사용함으로써， 얻어진 나노입자들을 의약품으로 사용하기위해서는 염화나트륨 및 폴리을화합물을 제거하는 공정이 필연적으로 수행 되어져야만 하는 문제가 있다. 미국특허 5 , 202 , 129호에서는 난용성 의약품에 2.5배 이상의 저분자의 당 또는 당-알코을을 흔합하고 이를 건삭분쇄하여 난용성 의약품 의 미세입자를 제조하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 그러나 이 방법에서는 많은 양의 당을 사용함으로， 실제 의약품에 적용하기 위해서는 분쇄된 흔합물을 물에 분 산한 후 여과하여 당을 제거하고 이를 다시 건조하여야만 하는 문제점이 있다. 미 국특허 제 2004/0067251 A1호는 활성물질을 유기용매에 녹이고, 이를 계면활성제가 녹아 있는 수용액에 분사하므로써 미세입자를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 또한， 치료용 단백질이나 약물들을 생체 내로 전달하기 위해 사용되는 대부 분의 나노입자들은 유기 용매를 사용하는 유제증발 (emul s ion evaporat ion) 방법을 통하여 제조되기 때문에， 제조부터 건조 시까지의 제조 공정의 복잡성과 시간이 많 이 걸리고 유기 용매의 사용에 따른 비용도 증가하며 또한 유기 용매의 사용에 따 른 생체 내에 문제점을 야기시킬 수 있다 (T. G. Park, et al . , Biomacromolecules 8 (2007) 650-656； Τ. G. Park , et al . , Biomacromolecules 7 (2006) 1864-1870； D . T. Bi rnbaum , et al . , J . Control . Rel . 65 (2000) 375-387) . 한편， 수화겔 (hydrogel )은 고분자가 가교결합된 3차원 망상구조 (polymer ic network)의 고분자물질로서 외부로부터 유체를 흡수하는 팽윤특성을 갖는다. 따라 서， 생체 조직처럼 수분이나 생체액을 다량 함유할 수 있으며 다른 합성물질 보다 부드럽고 생체 적합성이 뛰어나므로 의료 및 제약 분야에서 널리 연구되어 왔다. 이러한 수화겔은 일반적으로 고분자 물질에 가교제 및 /또는 경화제 둥의 화학물질 을 첨가하여 가교하는 방법으로 제조되어 왔다. 그러나， 상기 가교반웅에 사용되는 가교제 및 /또는 경화제 자체가 생체에 유해하므로 이러한 가교제 및 /또는 경화제를 사용하여 제조된 수화겔이 생체에 사용되는 경우에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 특히， 이러한 수화겔은 의료 및 제약용 재료, 예를들어， 상처용 드레 싱 (wound dressings), 약물 전달 캐리어 (drug delivery carrier), 콘택트 렌즈， 연 골, 장 유착 방지제 등으로 사용하기 부적합하다. 또한， 가교제 및 /또는 경화제가사용되는 경우에는 수화겔 제조 후에 수화겔 내의 잔류 가교제 및 /또는 경화제를 회수하여야 하므로 제조공정이 복잡할 뿐만 아 니라 비용이 상승되는 문제가 있다. 이에, 가교제 및 /또는 경화제를 사용하지 않고 도 나노미터 크기의 고분자 유래 하이드로겔을 제조하기 위한 노력이 계속되고 있 으며, 이러한 노력의 성과로 합성 고분자 (synthetic polymer)에 방사선을 조사함으 로써 나노미터 크기의 하이드로겔을 제조한 성과가 보고된 바 있다. 하지만, 합성 고분자 (synthetic polymer) 유래의 나노하이드로겔은 생체적합 성 (biocompatibility) 및 생분해성 (biodegradable) 측면에서 의약학적인 용도로 활 용되기에는 적합하지 않기 때문에， 가교제， 경화제， 유기용매 등을 사용하지 않고 도 다당 (polysaccharide) 또는 을리고당 (ol igosaccharide)의 분자내 (intra ^¬ molecular) 또는 분자간 (inter-molecular) 가교결합에 의해서만 형성된 나노입자의 개발이 요구되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명자들은， 다당 (polysaccharide), 이의 유도체 또는 폴리에틸렌글 리콜 (polyethylene glycol, PEG) 이외에 어떠한 인공적인 가교제 또는 유기용매를 사용하지 않고 단지 전자범만을 이용하여 나노입자를 제조함으로써， 다당 (polysaccharide), 이의 유도체 및 PEG로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 의 분자간 (inter-molecular) 또는 분자 내 ( intra-molecule) 결합만으로 이루어진 순수한 생체적합성 나노입자를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되 었다. 따라서， 본 발명의 목적은 다당 (polysaccharide), 이의 유도체 및 폴리에틸 렌글리콜 (polyethylene glycol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분자 간 가교결합 (inter— molecular cross— 1 inking) 또는 분자 내 .가교결합 (intra、― molecular cross— l inking)만으로 형성된 것을 특징으로 하는 생체적합성 나노입자 를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 생체적합성 나노입자에 핵산， 단백질， 다당류 및 약물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 결합된 것올 특징으로 하는 약물전달체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조 성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자에 방사성 동위원소， 유기 형광물질， 무기물질인 양자점 (Quantum dots) , 자기공명영상 (MRI )조영제， 컴퓨터단층촬영 (CT) 조영제， 양전자단층촬영 (PET)조영제， 초음파 조영제 및 형광조영제로 이루어진 군 에서 선택된 하나 이상의 표지물질을 표지한 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담 체 또는 첨가제를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 물에 다당 (polysacchar ide) ,이의 유도체 및 폴리 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질올 첨가하여 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 전자빔을 조사하여 상기 물질을 가교결합 (cross-l inking)시키는 단계를 포함하는 생체적합성 나노입자 제조 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다당 (polysacchar ide) , 이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol )로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분자 간 가교결합 ( inter-molecular cross-l inking) 또는 분자 내 가교결합 ( intra-molecular cross-1 inking)만으로 형성된 것을 특징으로 하는 생체 적합성 나노입자를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 생체적합성 나노입 자에 핵산, 단백질, 다당류 및 약물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물전달체를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 약물전달체를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 나노입자에 방사성 동위원소， 유기 형광물질， 무기물질인 양자점 (Quantum dots) , 자기공명영상 (MRI )조 영제 , 컴퓨터단층촬영 (CT)조영제， 양전자단층촬영 (PET)조영계， 초음파 조영제 및 형광조영제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지물질을 표지한 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 물에 다당 (polysacchar ide)，이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어 느 하나 이상의 물질을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 전자범을 조사하여 상기 물질을 가교결합 (cross-l inking)시키는 단 계를 포함하는 생체적합성 나노입자 제조방법을 제공한다. 이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다당 (polysacchar ide) , 이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol )로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분자 간 가교 결합 ( inter— molecul ar cross— 1 inking) 또는 분자 내 가교결합 ( intra—molecular cross-l inking)만으로 형성된 것을 특징으로 하는 생체적합성 나노입자를 제공한 다. 본 발명에서 상기 나노입자란 크기가 수 내지 수백 나노미터 (nm, 10억분의 1 미터인 물질)인 입자를 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 나노입자는 입자 의 크기가 1 내지 700nm인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니 며， 나노입자의 형상은 특별히 제한되지 않으나 바람직하게는 구 형상일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 나노입자란 나노겔 또는 나노하이드로겔도 포함하는 개념 으로， 이하에서 나노입자, 나노겔 또는 나노하이드로겔은 모두 본 발명에 따른 나 노입자를 의미하는 것으로 사용된다. 고분자 재료뿐만 아니라 모든 의료용 재료는 생체적합성을 반드시 필요로 하 며， 이러한 생체적합성은 두 가지 면에서 의미를 구분할 수 있다. 넓은 의미의 생 체적합성은 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성올 겸비한 것올 말하며， 좁은 의미ᅵ 의 생체적합성은 생체에 대한 생물학적 안전성， 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것 을 의미한다. 따라서 본 발명에서 상기 생체적합성 나노입자라 함은 생체에서 목적 하는 기능을 발휘하며， 재료자체의 독성이 없고 멸균 가능한 나노입자라고 할 수 있다. 한편, 본 발명에서 생체적합성 나노입자의 원료가 되는 다당

(polysacchar ide) 또는 이의 유도체는 이들의 화학구조 내에 존재하는 다 기능성 관능기로 인해 약물 등의. 담체 (carr ier )로서 활용가치가 매우 높을 뿐만 아니라, 생체적합성 (biocompat ibi l i ty) 및 생분해성 (biodegradabi l i ty) 등과 같은 물리화학 적 특성으로 인해 의약학분야에서 합성 고분자보다 활용가능성이 더 우수하다 (Materi al s Science and Engineering C 68 (2016) 964.981) . 본 발명에서 상기 다당 (polysacchar ide)이란 단당류 3개 이상이 글리코시드 결합을 통해서 연속적인 체인 (chain)을 만들고 있는 큰 분자를 의미한다. 본 발명 의 상기 다당에는 단당류가 소량 축합되어 있는 올리고당도 포함이 된다. 다당류는 그 구조내에 반웅성이 매우 좋은 히드록실기 (hydroxy 1 group) , 아미노기 (amino group) , 카복실산기 (carboxyl i c acid group) 등이 존재하기 때문에 다른 화합물과 반웅시켜 유도체를 쉽게 제작할 수 있으며， 본 발명의 유도체는 다당류에 존재하는 이러한 관능기에 알킬， 알케닐， 카르복시메틸， 히드록시알킬， 아세틸 등이 결합된 유도체들을 포함하는 것으로 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 다당은 기본적으로는 물에 용해되는 수용성을 나타낼 수 있으며， 불용성이라 하더라도 유도체화， 예컨대 히드록시알킬화나 알킬화， 카르복 시알킬화 등해 의해 수용성화 된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 다당은 키토산， 젤라틴, 콜라겐， 마난 (Mannan) , 덱스트란설페이트, α -사이클로덱스트린， β -사이 클로덱스트린， 사이클로덱스트린, 프룩토올리고당， 이소말토올리고당, 이눌린 ( inul in) , 히알루론산， 알지네이트 (alginate)， 글리코겐， 아밀로오즈， 카르복시메 틸덱스트란， 베타글루칸, 히드록시에틸셀를로오즈， 카르복시메틸샐를로오즈, 후코 이단 또는 콘드로이틴일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 즉， 본 발명에서 상기 생체적합성 나노입자는 다당 또는 이의 유도체의 분자 간 가교결합 또는 분자 내 가교결합만으로 형성되기 때문에, 나노입자의 제조과정 중에 흔입될 수 있는 외부물질이 전혀 포함되어 있지 않아 체내에서 쉽게 분해되고 체내 축적에 따른 부작용 및 독성에 대한 우려가 전혀 없다는 장점을 가지고 있다. 한편, 고분자를 이용하여 나노입자 또는 나노겔을 제조하는 방법에는 고분자 의 가교결합을 유도하기 위하여 가교제가 이용이 되는 것이 일반적이다. 가교제를 이용하여 고분자의 가교결합을 유도하는 방법의 경우, 가교제가 고분자 간 또는 고 분자 내의 결합을 매개하기 때문에 가교제가 나노입자 내부에 흔입되어 있을 수 있 고， 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반웅물에 남아 있을 수 있거나， 또는 반웅 후 남아 있는 미반웅물이 존재하여 나노입자 제조공정 중 정제과정을 필수적으로 거쳐야 한다는 문제점이 있을 수 있다. 또한, 나노입자 내에 잔존하는 가교제는 체 내에 투여된 후 여러 가지 부작용을 야기할 수 있다. 그러나, 본 발명자는 특정한 조건에서 다당에 전자범을 조사함으로써 다당 분자간 또는 분자 내 가교결합이 유 도되어 나노미터 크기의 하이드로겔이 형성되는 것을 확인하였다. 분자 내부에 가 교제나 금속 양이온과 같은 외부물질이 포함이 되어 있지 않고 오로지 다당 자체의 결합에 의해서만 형성된 나노입자는 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 것이다. 본 발명의 상기 생체적합성 나노입자는 다당 자체의 분자 간 또는 분자 내 가교결합에 의해서만 형성이 되기 때문에 종래 방법에 따라 제조된 나노입자가 갖 고 있는 상기 문제점이 없다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노입자를 제조하는 과정에 서 일체의 유기용매가 사용되지 않고 수용액 상태에서 전자범을 조사함으로써 제조 가 가능하기 때문에， 제조과정에서 발생할 수 있는 오염이나 복잡한 공정이 요구되 지 않아 산업적으로도 매우 활용도가 크다 . 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자는 히알루론산， 만난， 베타-사이클 로덱스트린， 알지네이트, 프럭토올리고당， 이소말토올리고당， 후코이단， 키토산 또 는 카르복시메틸-텍스트란 수용액에 전자빔을 조사함으로써 나노미터 크기의 입자 를 제조하였다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 카르복시메틸-덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 수용액에 전자범을 조사하여 나노입자가 형성되는 것을 확인하였으며， 또 한， 카르복시메틸-텍스트란과 폴리에틸렌글리콜 흔합 수용액에 전자빔을 조사한 경 우에도 목적하는 나노입자가 잘 형성됨을 확인하였다.

. 즉， 본 발명의 생체적합성 나노입자는 1종 이상의 다당과 폴리에틸렌글리콜 의 복합 나노입자일 수 있다. 본 발명의 "폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol ) ; PEG) "은 나노입자 표면의 친수성을 증가시키고 인체 내 면역기능으로 인 한 빠른 분해를 방지하여 혈중 체류 시간을 향상시키기 위하여 도입된 고분자 물질 이다. 이와 같이 폴리에틸렌글리콜로 개질시키는 것을 페길화 (pegylat ion)라 한다. 상기 페길화 과정을 통해 간 축적이 감소되고 혈중 체류 시간이 증가된 고분자 나 노입자를 제조할 수 있다. 즉, 나노입자 표면에 폴리에틸렌 글리콜을 도입함으로 입자의 친수성이 증가되고， 병원균， 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시 키는 인체 내의 대식세포 (macrophage) 등을 포함하는 면역기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과 (stealth ef fect )를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방 지될 수 있고, 나노입자의 혈중 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 본 발명자는 별도 의 페길화를 진행하지 않고도, 다당과 폴리에틸렌글리콜 흔합 수용액에 전자범을 조사함으로써 다당 분자와 폴리에틸렌글리콜 분자가 분자간 가교결합을 형성하여 나노입자가 생성되는 것을 확인하였다. 이때， 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 바람직 하게는 100 내지 150,000 사이의 분자량을 가지며, 선형 또는 가지형 등의 다양한 구조를 가질 수 있다. 이상과 같이， 본 발명의 상기 생체적합성 나노입자는 바람직하게는 다음과 같은 것일 수 있다:

( i ) 다당 또는 이의 유도체 분자 간 또는 분자 내 가교결합만으로 이루어진 나노입자,

( i i ) 다당 또는 이의 유도체가 폴리에틸렌글리콜과 분자 간 가교결합을 형성 하여 생성된 나노입자. 본 발명에서 상기 나노입자는 다음과 같은 방법에 의해 제조되는 것을 특징 으로 할 수 있다:

(a) 물에 다당 (polysaccharide)，이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어 진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 첨가하여 용액을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 전자빔을 조사하여 상기 물질을 가교결합 (cross-linking)시키는 단계.

(a) 물에 다당 (polysaccharide)，이의 유도체 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어 진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 첨가하여 용액을 제조하는 단계;

치료용 단백질이나 약물들을 생체 내로 전달하기 위해 사용되는 대부분의 나 노입자들은 유기 용매를 사용하는 유제증발 (emulsion evaporation) 방법을 통하여 제조되기 때문에， 제조부터 건조 시까지의 제조 공정의 복잡성과 시간이 많이 걸리 고 유기용매의 사용에 따른 비용도 증가하며 또한 유기용매의 사용에 따른 생체 내 에 문제점을 야기시킬 수 있다 (T. G. Park, et al . , Biomacromolecules 8 (2007) 650-656； Τ. G. Park, et al ..Biomacromolecules 7 (2006) 1864-1870； D. T. Birnbaum, et al. , J. Control. Rel. 65 (2000) 375-387). 그러나， 본 발명의 나노입자를 제조하는 과정에서는 유기용매가 전혀 사용되 지 않고 용매로서 오로지 물만을 사용하기 때문에， 유기용매의 잔류에 따른 다양한 부작용이 발생할 염려가 없을 뿐만 아니라， 유기용매를 제거하가 위해 거쳐야 하는 정제공정이 포함되지 않아 나노입자 합성공정을 단순화하고, 제조효율을 높일 수 있다는 장점이 있다. 본 발명에서 다당 (polysaccharide) 또는 이의 유도체의 분자량은 특별히 제 한되지 않으나， 바람직하게는 5kDa 내지 3000kDa 일 수 있다. 본 발명의 나노입자를 제조하기 위해 사용되는 다당 (polysaccharide) 또는 이의 유도체 수용액의 농도는 0.1%(w/v) 내지 15¾>(w/v)일 수 있다. 본 발명의 일실 시예에 따르면， 다당류의 종류에 따라서 나노입자가 형성되는 구체적인 수용액의 농도는 모두 동일하지는 않았지만, 0.1 내지 15%(w/v)의 범위 내에서 나노입자가 형성된다는 것을 알 수 있었다. 다당 수용액의 농도가 0.1% 미만인 경우에는 분자 간 가교결합의 형성이 용 이하지 않아 나노입자가 형성이 되지 않고, 생성된 나노입자의 크기가 균일하지 않 다는 문제가 발생할 수 있으며， 15%를 초과하는 경우에는 분자 간 결합이 과발생하 여 벌크겔이 형성되어 나노입자를 제조할 수 없다는 문제가 발생할 수 있으며, 고 분자 수용액을 제조할 때 열을 가해주며 녹여야 하는 번거로움이 있을 수 있다는 점에서 바람직하지 않다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 상기 다당류 수용액의 농도는 0. 1 내지 10% 일 수 있다.

보다 더 바람직하게는,

( 1) 히알루론산의 경우 0.5 내지 7%， 가장 바람직하게는 1 내지 5¾ ;

(2) 만난의 경우 0.5 내지 7¾， 가장 바람직하게는 0.5 내지 3%;

(3) β -사이클로덱스트린의 경우 0.5 내지 3¾， 가장 바람직하게는 1 내지

3%；

(4) 알지네이트의 경우 0.5 내지 10%， 가장 바람직하게는 0.5 내지 Ί \

(5) Fructo-올리고당의 경우 0.5 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.5 내지 3%;

(6) Isomal to-올리고당의 경우 3 내지 10%, 가장 바람직하게는 3 내지 Ί

(7) 키토산의 경우 0. 1 내지 3%, 가장 바람직하게는 0.3 내지 1%;

(8) 후코이단의 경우 0.5 내지 3¾; 및

(9) 카르복시메틸 -덱스트란의 경우 3 내지 10¾>, 가장 바람직하게는 5 내지 10% 일 수 있다.

(b) 상기 (a) 단계에서 생성된 용액에 전자범을 조사하여 상기 물질을 가교 결합 (cross-l inking)시키는 단계. 상술한 바와 같이， 본 발명에서는 생체적합성 나노입자를 제조하기 위해서 가교제 등의 개시제를 전혀 사용하지 않으며， 다당 또는 이의 유도체 분자 간 또는 분자 내 가교결합을 유도하기 위해서 전자빔을 이용한다. 전자빔을 이용하여 가교결합을 유도하는 방법은 다른 일반적인 화학 첨가제 에 의한 반웅과 비교하여 유해한 촉매 등이 필요 없어 깨끗한 수단임과 동시에, 단 시간에 처리가 가능하기 때문에 에너지 소비가 적고， 제조공정이 단순화 될 수 있 다는 장점이 있다. 고분자 물질에 전자범과 같은 방사선을 조사하면 고분자물질 내에 존재하는 공유결합들이 끊 _, 어져 비공유 전자쌍을 함유한 라디컬이 형성되며， 이러한 라디컬들 은 비규칙적으로 상호작용을 하게 된다. 분자 내 공유결합의 절단 및 재결합의 상 대적인 속도에 따라서 가교결합이 형성될 수도 있고， 또는 고분자 물질이 저분자량 분획으로 분해가 될 수도 있다. 전자빔의 조사가 고분자 물질에 미치는 영향은 고 분자 물질의 구조에 의해 결정이 된다. 구체적으로， Rados l aw A. Wach 등에 따르면 (Carbohydrate Polymers 112 (2014) 4127415) , 방사선을 조사하여 고분자 물질의 가교결합을 유도하는 radi at ion method의 경우 합성 고분자 (synthet i c polymer)에는 잘 적용이 되는 반 면에, 다당류에 방사선을 조사하는 것은 분자의 절단을 유도하여 분자량이 감소된 물질이 생성될 뿐 교차결합이 형성되지 않는 문제점이 있다. 이러한 문제를 극복하 고 radiat ion method를 이용하여 다당류를 교차결합 시키기 위해서는 alkyne gas 또는 사염화탄소와 같이 교차결합 반웅을 촉진시키는 첨가제를 이용하는 방법이 고 안된 바 있으며 (Journal of Polymer Science PartA: Polymer Chemi stry, 42 , 389773909. Nuc 1 ear Instruments and Methods in Physics Research Sect ion B , 265,37743. ) , 또는 용액의 pH를 조절하여 교차결합을 유도하는 방법이 시도된 바 있다 (Carbohydrate Polymers 112 (2014) 4127415) . 그러나， 종래 보고된 방법들에 따라 다당류의 교차결합을 유도한다고 하더라도 나노미터 크기의 입자가 생성이 된 예는 찾아볼 수 없다. 한편， 다당 또는 이의 유도체에 전자범을 조사하여 유도되는 가교결합의 정 도는 전자범 조사시 실험 조건에 따라 변화하게 된다. 즉， 전자빔이 조사된 다당류 수용액의 농도, 온도， 전자범의 조사량 등의 조건에 따라 입자의 크기, 균일도 등 이 변화하게 된다. 본 발명에서 상기 조사되는 전자범의 에너지 강도는 5 내지 250kGy일 수 있 으며, 바람직하게는 ₁₀ 내지 250kGy 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 조 사되는 전자범의 에너지 강도는 다당류 수용액의 농도, 다당의 종류 등을 고려하여 쩨조하고자 하는 나노입자의 크기에 따라 당업자가 적절하게 조절하여 선택할 수 있다. - 보다 더 바람직하게는， ( 1) 히알루론산의 경우 30 내지 230 kGy ;

(2) 만난의 경우 30 내지 230 kGy :

(3) β -사이클로덱스트된의 경우 10 내지 100 kGy , 가장 바람직하게는 30 내 지 70 kGy

(4) 알지네이트의 경우 10 내지 230 kGy

(5) Fructo-올리고당의 경우 10 내지 230 kGy , 가장 바람직하게는 150 내지 230 kGy ;

(6) Isomal to-을리고당의 경우 10 내지 230 kGy , 가장 바람직하게는 30 내지

70 kGy;

(7) 후코이단의 경우 100 내지 230 kGy , 가장 바람직하게는 150 내지 230 kGy ;

(8) 키토산의 경우 10 내지 230 kGy, 가장 바람직하게는 150 내지 230 kGy ;

(7) 카르복시메틸 -덱스트란의 경우 100 내지 230 kGy , 가장 바람직하게는 150 내지 230 kGy일 수 있다. 본 발명에서 상기 전자범이 조사되는 시간은 1초 내지 2시간일 수 있다. 본 발명에서 나노입자를 제조하기 위한 전자빔 조사장치로 선형 전자범 가속기를 사용 하였고, 일정한 속도로 이동하는 컨베이어 위의 다당류 수용액에 빔전류 및 조사 시간을 조절하는 형식으로 전자빔 조사 조건이 달라지도록 조절하여 5kGy , lOkGy , 50kGy , 100kGy, 200kGy 선량으로 전자빔을 조사하였다. 전자범을 조사하는 시간과 빔전류는 샘폴의 농도， 조사되는 전자범의 에너지 강도 등을 고려하여 제조하고자 하는나노입자의 크기에 따라 당업자가 적절하게 조절하여 선택할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 (b) 단계 이후에 (c) 핵산， 단백질, 다당류， 방사성 물 질 및 약물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 상기 (b) 단계의 생체적합 성 고분자 나노입자가 포함된 용액에 첨가한 후 교반하는 단계를 추가적으로 포함 하는 것을 특징으로 하는 나노입자를 제조할 수 있다. 상기 방법에 따라 제조된 나노입자는 그 내부에 핵산, 단백질， 다당류, 방사 성 물질 또는 약물이 봉입되어 약물전달체 또는 조영제로서 그 효과가 발휘될 수 있다. 따라서， 본 발명은 상기 나노입자에 핵산， 단백질， 다당류， 방사성 물질, 및 약물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 전달체를 제공한다. 약물을 체내에 정확하게 전달하는 가장 이상적인 방법 증의 하나는 환부와 같은 특정 부위에 약물을 직접 전달하는 것이다. 약물을 전달하기 위한 목표 지점 은 체내에 있는 폐， 심장， 신장, 간 등의 장기일 수도 있고, 근육， 뼈， 연골 등의 조직일 수도 있으며, 암세포 등 특정한 세포의 단위일 수도 있다. 질병이 있는 곳 에만 약물을 전달하게 되면 투여한 약물의 효율올 높일 수 있을 뿐만 아니라 질병 이 없는 다른 부위로 약물이 전달되는 것을 방지할 수 있어 부작용을 줄일 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점에 의해 약물 전달체의 연구는 재료 분야에서 활발한 연 구가 이루어지고 있다. 특히 나노 기술이 발전함에 따라서 그 연구는 더 활성화되 어 가고 있다. 본 발명에서 "약물전달체 "는 장기간 동안 약물의 지속성 방출뿐만 아니라 예 보성 및 재생성의 개념을 포함하는 약물전달체를 의미한다. 따라서， 본 발명에서 상기 약물전달체에 탑재된 약물은 예정된 부위에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게 재생시킬 수 있는 속도로 방출될 수 있다. 이런 조절형 약물 전달체는 생체적 이용 률이 낮거나 약물의 흡수성이 매우 커서 체외로 지나치게 빨리 소실되는 경우에 약 물의 방출 속도를 조절함으로써 약물의 혈중 농도를 오랫동안 치료 영역에 유지시 킬 수 있는 장점이 있다. 이런 제제의 약물 방출 조절 기전은 확산， 용해， 삼투압 또는 이온교환들이 사용되며 대부분 이들 방법이 복합되어 사용된다. 본 발명의 생체적합성 나노입자는 인체 내에서 독성이 적고 수용해성이 우수 하기 때문에 약물을 목적하는 부위까지 효과적으로 전달할 수 있으며， 다양한 제제 학적 기술과 접합되어 약물의 방출 속도를 조절하는 서방출성 약물전달체로서 활용 될 수도 있다. 또한， 본 발명의 나노입자에 특정 항원을 인식하는 항체 또는 특정 수용체에 리간드로 작용하는 펩타이드 등올 융합함으로써 표적지향적 약물전달체로 서도 활용될 수 있다. 본 발명의 나노입자에 봉입될 수 있는 물질의 종류는 특별히 제한되지 아니 하며， 바람직하게는 핵산, 단백질， 다당류 또는 약물일 수 있다. 본 발명에서 상기 약물은 항생제， 항암제, 진통제， 소염제， 진해제 ,거담제, 진정제， 근육 이완제， 간질 치료제, 궤양 치료제， 항우울제, 항알레르기제, 강심 제, 항 부정맥제， 혈관 확장세， 강압이뇨제， 당뇨병 치료제， 웅고 방지제， 지혈제， 항 결절제， 호르몬제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한， 본 발명의 상기 약물전달체는 방사성 동위원소， 유기 형광물질， 무기 물질인 양자점 (Quantum dots) , 자기공명영상 (MRI )조영제， 컴퓨터단층촬영 (CT)조영 제 , 양전자단층촬영 (PET)조영제， 초음파 조영제， 형광조영제 등과 같은 진단 표지 자가 추가로 접합되어 있을 수 있다. 따라서 , 나노입자에 봉입되어 있는 약물과 추 가로 접합되어 있는 진단 표지자가 그 효과를 발휘하여 질병의 치료 및 진단을 동 시에 수행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 카르복시메틸-덱스트란 나노입자에 항암제로 널리 사용되고 있는 독소루비신을 결합시켜본 결과， 봉입 효율이 약 79%에 이를 정 도로 우수한 약물 탑재율을 나타내었다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 폴리 에틸렌 글리콜 및 카르복시메틸 -덱스트란의 흔합 나노입자에 독소루비신을 결합시 켜본 결과， 그 봉입 효율이 약 72%로 매우 우수함을 확인하여, 본 발명의 나노입자 가 약물 전달체로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 또한 상기 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물의 치료 용도는 나노입자에 봉입되는 약물의 종류에 따라 선택적으로 적용이 가능하다. 즉， 본 발명의 약학적 조성물은 생체적합성 고분자의 내부에 봉입되는 약물의 종류에 따라서 세균감염 예방 및 치료용 조성물， 암 예방 및 치료용 조성물， 통증 예방 및 치료용 조성물, 염증성 질환 예방 및 치료용 조성 물， 간질성 질환 예방 및 치료용 조성물， 궤양 예방 및 치료용 조성물， 우울증 예 방 및 치료용 조성물, 알레르기성 질환 예방 및 치료용 조성물, 부정맥 예방 및 치 료용 조성물， 고혈압 예방 및 치료용 조성물, 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 또는 심장병 예방 및 치료용 조성물 등으로 활용이 가능하다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 독소루비신이 결합된 폴리에틸렌글리콜 및 카 르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투 여한 동물모델에서， 유리형 독소루비신 ( free doxorubicin)올 투여한 동물군과 비교 해 종양의 성장이 더 저해되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 약물 전달체 를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 경우， 약물이 체내에서 쉽게 분해되어 배설되는 것을 방지하는 효과 또는 약물을 목적하는 부위에서 서방출하는 효과를 나타내어 유리형 약물과 비교해 더 우수한 약리활성을 나타낼 수 있는 것으로 판단 된다. 본 발명의 약학적 조성물은， 약물을 봉입하고 있는 약물전달체 이외에 약학 적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 약제학적으로 허용 가능한 첨 가제로는 전분, 젤라틴화 전분， 미결정셀롤로오스， 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘 디옥사이드, 인산수소칼슴, 락토스, 만니를， 엿， 아라비아고무, 전호화전분， 옥수 수전분， 분말셀를로오스， 히드록사프로필셀를로오스， 오파드라이， 전분글리콜산나 트륨, 카르나우바 납， 합성규산알루미늄， 스테아린산， 스테아린산마그네슴, 스테아 린산알루미늄， 스테아린산칼슴； 백당， 덱스트로스， 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0. 1-90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결 합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함 되며， 이러한 고형제제는 생체적합성 고분자 나노입자에 약물이 봉입된 약물 전달 체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 칼슴 카보네이트， 수크로오스， 락토오스 또는 젤라탄 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그 네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로 는 현탁제, 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제 인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제, 방향 제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제， 현탁제， 유제， 동 결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크 로골 ^' ， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 한편， 주사제에는 용해제， 등장화제 , 현탁화제 , 유화제， 안정화제 , 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이 , 몸무게， 성 별， 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 일반적으로 0.01

- 100 mg/kg/day이며， 바람직하게는 0. 1 - 20 mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 5

- 10 mg/kg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약 3사의 판단에 따라.일정 간격으로 분 할 투여할 수도 있다. 본 발명은 또한 생체적합성 나노입자에 방사성 동위원소， 유기 형광물질， 무 기물질인 양자점 (Quantum dots) , 자기공명영상 (MRI )조영제， 컴퓨터단층촬영 (CT)조 영제 , 양전자단층촬영 (PET)조영제, 초음파 조영제 및 형광조영제로 이루어진 군에 서 선택된 하나 이상의 표지물질을 표지한 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다. 본 발명의 나노입자에는 영상진단에 사용될 수 있는 다양한 표지물질이 부착 될 수 있고， 이를 이용하여 조영제 조성물로 활용될 수 있다. 본 발명에서 생체적합성 나노물질에 결합될 수 있는 표지물질로는 방사성 동 위원소, 유기 형광물질 , 무기물질인 양자점 (Quantum dots) , 자기공명영상 (MRI )조영 제， 컴퓨터단층촬영 (CT)조영제， 양전자단층촬영 (PET)조영제， 초음파 조영제 또는 형광조영제 등을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 방사성 동위원소를 이용한 방법에서 방사성 표지물질 (Radioactive isotope)

99m 123 111 67 177 201 로는 단일광자방줄 컴퓨터단증촬영용 덱종인 Tc, I In, Ga, Lu, Tl ,

117πᄂ、 125 _Ί 11 13 15 18 38 62 64 68

Sn, I 과 양전자단중촬영용 핵종인 C, N, 0, F, K, Cu, Cu, Ga,

82 124 89 . 131 166 188 67 89 90 225 213 211

Rb, I, Zr과 치료용 핵종인 I Ho, Re, Cu, Sr, Y, Ac, Bi At 을 사용할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 방사성 동위원소들은 비 방사성 의 동위체와 화학적 성질이 거의 비슷하여 임의로 치환이 가능하고， 방출 에너지가 비교적 커서 소량의 검출도 가능하다는 장점이 있기 때문에 오랫동안 사용되어 왔 다. 방사성 동위원소에 대한 대안으로 널리 사용되는 것은 유기 형광물질 (Organic fluorescent dyes)이다. 형광물질들은 특정 파장에 의해서 활성이 되면 고유의 파장을 갖는 빛을 발광하게 된다. 특히， 검색법이 소형화됨에 따라， 방사성 물질 역시 검출 한계를 나타내어 검색에 오랜 시간이 요구된다. 이에 비해 형광물 질의 경우 적절한 조건에서 분자당 수천 개의 광자를 방출할 수 있어 단일분자 수 준의 검출까지도 이론적으로 가능하다. 본 발명에서 생체적합성 고분자 나노물질에 봉입 또는 결합될 수 있는 유기 형광물질의 종류는 당업계에서 사용되고 있는 또는 향후 사용될 물질을 모두 포함하는 개념으로 이해된다. 또한， 반도체 나노 물질인 양자점 (Quantum dot)은 CdSe, CdS, ZnS, ZnSe 등 으로 구성되어 있으며 크기 및 종류에 따라서 각각 다른 색의 빛을 발광한다. 유기 형광물질에 비하여 넓은 활성 파장을 가지고 있으며 좁은 발광 파장을 나타내기 때 문에 다른 색을 발광하는 가짓수가 유기 형광물질보다 많다. 따라서， 최근 들어 유 기 형광물질의 단점들을 극복하기 위한 방법으로 양자점이 많이 사용되고 있다. 본 발명에서 생체적합성 고분자 나노입자에 봉입 또는 결합될 수 있는 양자점은 당업 계에서 현재 사용되고 있는 또는 향후 사용될 물질을 모두 포함하는 개념으로 이해 된다. 상기 자기공명영상 (MRI) 조영제는 구체적으로， 가돌리늄 (Gd), 망간 (Mn), 철 (Fe), 구리 (Cu) 및 크롬 (Cr)을 포함하는 전이금속 이온; 가도펜테테이트 디메글루 민 (Gd-DTPA), 가도테레이트 메글루민 (Gd-DOTA)을 포함하는 상기 전이금속 이온의 소수성 착화합물; 퍼플루오로카본 (perfluorocarbon), 퍼플루오로프로판 (perfluoropropan)을 포함하는 불소함유 화합물; 산화철계, 망간계, 구리계 및 크 롬계 나노 입자; 상기 나노입자의 표면을 소수성 물질로 수식한 화합물 등을 예로 들 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 컴퓨터단층촬영 조영제로는 구체적으로, 요오드화 양귀비씨 기름 유래 의 요오드화 소수성 물질; 비스무스 (Bi); 금 (Au) 및 은 (Ag)을 포함하는 금속 원소 로 구성된 나노 입자 등이 사용될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단일광자방출 컴퓨터단층촬영 조영제로는 ⁹ Tc, ¹²³ 1， ^m in, ⁶ a, ^Lu,

²⁰¹ T1 , ^n7m Sn, ¹²⁵ Ι 을 포함하는 방사선 동위원소， 상기 방사선 동위원소의 소수성 착 화합물 등이 사용될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.

， _Ί 세 ， - -， , 11 13 15 _Λ 18 38 62 64 68 상기 양전자단중좔영 조영제로는 C, Ν, 0， F, Κ, Cu, Cu, Ga,

Rb, I， Zr을 포함하는 방사선 동위원소， 상기 방사선 동위원소의 소수성 착화 합물 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

131 166 188 67 89 90 225 213 211 치료를 위한 목적으로는 I Ho, Re, Cu, Sr, Y, Ac, Bi , At 을 포함하는 방사선 동위원소， 상기 방사선 동위원소의 소수성 착화합물 등이 사용 될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 초음파 조영제는 구체적으로, 퍼플루오로프로판 (perfluoropropan), 퍼 플루오로헥산 (perfluorohexane), 설퍼 핵사플루오라이드 (sulfur hexaf luoride) , 퍼 폴루오로펜탄 (perfluoropentane), 데카플루오로부탄 (decaf luorobutane) 등이 사용 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 상기 형광 조영제는 구체적으로， 플루오로세인 (fluorescein), 로다민 (rhodamine), 나일 레드 (Nile Red), Cy-3 및 Cy— 5을 포함하는 저분자량 형광 물질; 상기 저분자량 형광 물질을 공유결합으로 도입한 소수성 물질; 5 nm 내지 20 nm크 기의 CdSe, CdS 및 CdTe로 이루어진 군으로부터 선택되는 무기물 발광 반도체로 이 루어져 있으며， ZnS로 된 이종 접합체가 외부를 둘러싸고 있는 양자점 (quantum dots); 상기 양자점의 표면을 소수성 물질로 수식한 형태의 물질 등이 사용될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 조영제 조성물에 사용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용 되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환, 알루미나， 알루미늄 스테 아레이트 레시틴， 혈청 단백질 (예， 사람 혈청 알부민)， 완충 물질 (예， 여러 인산 염， 글리신， 소르브산， 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라 이드 흔합물)， 물， 염 또는 전해질 (예 , 프로타민설페이트， 인산수소이나트륨， 인산 수소캄륨， 염화나트륨 및 아연 염)， 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트， 폴 리비닐피를리돈， 셀를로즈계 기질， 폴리에틸렌 글리콜， 나트륨 카르복시메틸셀를로 즈, 폴리아릴레이트， 왁스， 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제 한되지 않는다. 본 발명의 조영제 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤 제, 유화제， 현탁제， 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조 할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액 (Hank' s solut ion) , 링거 용액 (Ringer' s solut ion) 또는 물리적으로 완층된 염수와 같은 완층 용액을 사용할 수 있다. 수용 성 주입 ( inject ion) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀를로즈， 솔비를 또는 덱스트란 과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질올 첨가할 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 형태는 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 ( 예를 들면 트원 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화 할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 회석제 또 는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액 (예를 들면 1 ,3-부탄디을 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니를， 물， 링거 용액 및 등장성 염 화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물은 구연산， 구연산나트륨 등의 기타 통상으로 pH 조 절제로 사용하는 물질 및 /또는 아스파탐， 아세설팜 칼륨， 단미시럽， 삭카린나트륨， 삭카린칼슘， 설탕 등의 기타 통상으로 감미제로 사용하는 물질 및 /또는 규소수지 등의 기타 통상으로 소포제로 사용하는 물질 및 /또는 알코올류， 페놀류， 유기산 및 그 염류， 유기 수은화합물， 파라벤류 등의 기타 통상으로 보존제로 사용하는 물질 및 /또는 파인애플향， 딸기향, 오렌지향, 레몬향， 초콜릿향， 콜라향， 포도향, 소나 무향 등의 기타 통상으로 착향제로 사용되는 물질 중에서 선택된 1종 이상의 첨가 제를 추가로 함유할 수 있다. 【유리한 효과】

본 발명의 생체적합성 나노입자는 전자빔을 통해 다당 또는 이의 유도체 분 자 간 또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에， 유기용매 또는 가 교제의 흔입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고， 그 제조과정 중 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능 하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한， 본 발명의 나노입자는 약물전달체， 약학적 조성물， 조영제 조성물 또는 장유착 방지제 등 다방면으로 활용될 수 있다 는 점에서 매우 유용하다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 카르복시메틸-덱스트란 수용액에 전자범을 조사하여 나노입자를 제조 하는 방법에 관한 모식도이다.

도 2는 10% 농도의 카르복시메틸-덱스트란 수용액에 200kGy의 전자범을 조사 하였을 때 생성된 나노입자에 대한 DLS 및 TEM사진을 나타낸 도면이다.

도 3은 다양한 농도의 카르복시메틸-덱스트란 수용액에 전자범을 조사한 후 나노입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 4는 다양한 조건에서 히알루론산 수용액에 전자범을 조사하였을 때 나노 입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 5는 다양한 조건에서 만난 수용액에 전자빔을 조사하였을 때 나노입자 생 성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 6은 다양한 조건에서 β -사이클로텍스트린 수용액에 전자범을 조사하였을 때 나노입자 생성여부를 DLS를 통해 확언한 결과이다.

도 7은 다양한 조건에서 알지네이트 수용액에 전자범을 조사하였을 때 나노 입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 8은 다양한 조건에서 Fructo-올리고당 수용액에 전자빔을 조사하였을 때 나노입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 9는 다양한 조건에서 Isomal to-올리고당 수용액에 전자범을 조사하였을 때 나노입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다. 도 10은 다양한 조건에서 후코이단 수용액에 전자빔을 조사하였을 때 나노입 자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

도 11은 다양한 조건에서 키토산 수용액에 전자빔을 조사하였을 때 나노입자 생성여부를 DLS를 통해 확인한 결과이다.

_, 도 12는 카르복시메틸-덱스트란 나노입자의 농도에 따른 원심분리 이후 튜브 바닥에 남아있는 물의 양 차이를 비교함으로써 하이드로겔의 특성이 있음을 확인한 도면이다.

도 13은 폴리에틸렌글리콜과 카르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자를 전자범 을 이용하여 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 14은 다양한 에너지 세기의 전자범을 조사하였을 때 PEG 나노입자의 형성 여부 및 입자크기를 확인한 도면이다.

도 15은 10% 카르복시메틸-텍스트란 및 1% 폴리에틸렌글리콜 흔합 수용액에 전자범을 조사하여 형성된 나노입자에 대한 DLS 결과이다.

도 16는 폴리에틸렌글리콜 및 카르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자의 1H- NMR 결과를 나타낸 도면이다.

도 17은 폴리에틸렌글리콜 및 카르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자의 13C- NMR 결과를 나타낸 도면이다.

도 18은 카르복시메틸-덱스트란 나노입자에 킬레이트가 컨쥬게이션 된 구조 를 나타낸 도면이다.

도 19는 킬레이트가 컨쥬게이션 된 카르복시메틸-덱스트란 나노입자에 대한 Cu-64 표지 TLC 결과를 나타낸 도면이다.

도 20은 Cu-64 표지된 카르복시메틸-텍스트란 나노입자에 대한 TLC 결과를 나타낸 도면이다.

도 21는 Bol ton-Hunter Reagent를 사용한 카르복시메틸-덱스트란 나노입자의 방사성요오드 표지 과정을 나타낸 모식도이다.

도 22는 1-131로 표지된 카르복시메틸-덱스트란 나노입자에 대한 반웅 및 정 제 후의 Radio-TLC 결과를 나타낸 도면이다.

도 23은 독소루비신에 대한 standard curve 및 원심분리를 통해 확인한 독소 루비신이 결합된 카르복시메틸-덱스트란 나노입자를 관찰한 도면이다.

도 24은 독소루비신이 결합된 카르복시메틸-덱스트란 나노입자 (CM-DNP) 및 독소루비신이 결합된 폴리에틸렌글리콜과 카르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자 (PEG-DNP)의 독소루비신 방출 속도를 확인한 결과이다. 도 25은 독소루비신이 결합된 나노입자의 in vivo 항종양 활성을 평가한 결 과이다 (PBS를 처리하는 Blank 그룹， Free 독소루비신을 처리하는 그룹 (free DOX) , 독소루비신이 결합된 PEG-D P (D0X@PEG-DNP)를 처리하는 그룹) .

도 26는 독수루비신이 결합된 나노입자의 in vivo 항종양 활성을 평가한 동 물모델에서 각 약물의 투여에 따른 동물이 체중변화를 관찰한 도면이다 (PBS를 처리 하는 Blank 그룹， Free 독소루비신을 처리하는 그룹 ( free DOX) , 독소루비신이 결합 된 PEG-DNP (D0X@PEG-DNP)를 처리하는 그룹) .

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명올 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

전자범 가속기를 사용한 전자빔 조사 조건 및 준비

전자범을 조사하고자 하는 용액에 다양한 조건의 전자범 선량올 조사하며 실 험을 진행해보았다. 실험에는 선형 전자범 가속기를 사용하였고， 일정한 속도로 이 동하는 컨베이어 위의 샘플에 범 전류 및 조사 시간을 조절하는 형식으로 전자범을 조사함으로써, 5kGy, lOkGy, 50kGy, lOOkGy, 200kGy 선량으로 전자범을 조사하였 다. 전자범을 조사하는 시간과 조사량은 전자범 조사 시 은도조건, 샘플의 농도， 조사되는 전자범의 에너지 강도 등을 고려하여 제조하고자 하는 나노입자의 크기에 따라 당업자가 적절하게 조절하여 선택할 수 있다.

<실시예 2>

저자빔 조사에 의하 나노입자의 제조

<2-1> 카르복시메틸-덱스트란 용액 및 전자범 조사조건

카르복시메틸 -덱스트란을 사용하여 나노입자를 합성하는 실험을 진행해보았 고， 직류형 전자범 가속기를 사용하여 조사 샘플에 전자빔을 조사하되, 빔전류 및 조사 시간을 조절하는 형식으로 전자범 조사 조건이 달라지도록 하였다.

보다 구체적으로, 카르복시메틸-덱스트란 (분자량 lOkDa)을 물에 용해하여 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20% (w/v)의 농도가 되도록 용액을 제조하였고, 제조된 카르복시메틸-텍스트란 용액에 전자범 조사 에너지량을 5kGy, lOkGy, 50kGy, lOOkGy, 200kGy로 달리해가며 상온에서 실험을 진행해보았다. 상기 제조된 카르복 시메틸-덱스트란 용액에 유기용매, 가교제， 무기물 등 어떠한 첨가물도 추가하지 않았다.

<2-2> 전자범 조사에 의한 카르복시메틸-덱스트란 나노입자의 제조

다양한 농도와 다양한 전자빔 선량 조건에서 실험을 진행해보았고， 제조된 나노겔의 입자 크기를 DLS(Dynamic light scattering)로 확인해본 결과， 10%의 농 도의 카르복시메틸 덱스트란 용액에 200kGy의 전자빔을 조사하였을 때에만 lOnm 정 도의 균일한 크기의 나노입자가 합성되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

20%의 농도에 200kGy의 전자빔을 조사하였을 때는 DLS 측정시에 여러 개의 피크를 보여주는 결과를 얻었고， 다른 조건들에서는 측정이 잘 이루어지지 않아 나 노입자가 잘 형성이 되지 않는 것으로 확인이 되었다 (도 3).

<2-3> 전자빔 조사에 의한 다당류 또는 올리고당류 유래의 나노입자의 제조 상기 카르복시메틸-덱스트란 나노입자 이외에 다른 다당류 또는 올리고당류 를 이용하여 나노입자를 제조해 보았다. 상기 실시예 2-1에서의 방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하되， 카르복시 메틸-덱스트란 대신에 다양한 다당류 또는 을리고당류를 물에 용해한 후 전자범을 조사하여 나노입자가 형성이 되는지 여부를 확인하였다.

(1) Hyaluronic acid(lOkDa)에 대한 결과

1%, 5%, 10% (w/v%) 농도의 히알투론산 용액에， lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전 자범올 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이， 1%， 50kGy의 조건에서 380 nm, 5% ,200kGy 조건에서 108 nm의 입자크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것올 확인할 수 있 었다. 나머지 조건에서는 입자의 크기가 매우 크거나 또는 여러 개의 Peak가 나타 나 균일한 입자크기의 나노겔이 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) Mannan(0.7kDa)에 대한 결과 1%， 5%, 10% (w/v%) 농도의 만난 용액에, lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전자범을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이， 1¾, 50kGy의 조건에서 162 nm, 1% ,200kGy 조건에서 305 nm의 입자크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인할 수 있 었다ᅳ 나머지 조건에서는 입자의 크기가 매우 크거나 또는 여러 개의 p _ea k가 나타 나 균일한 입자크기의 나노겔이 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

(3) p-cyclodextrin(l.lkDa)에 대한 결과

0.1%, 1%, 5% (w/v%) 농도의 β-cyclodextrin 용액에， lOkGy, 50kGy, 200kGy 의 전자빔을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, i¾, 50kGy의 조건에서 486 nm의 입 자크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 조건에서는 여러 개의 Peak가 나타나 균일한 입자크기의 나노겔이 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

(4) Alginate(33kDa)에 대한 결과

1%, 5%, 10% (w/v%) 농도의 알지네이트 용액에， lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전 자범을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 , , lOkGy의 조건에서 283 nm, 1% ,50kGy 조건에서 3¾ nm, 5%, 1%, 200kGy의 조건에서 283 nm, 5%, lOkGy의 조건에 서 302 nm, 5%, 200kGy의 조건에서 602 nm, 10%, lOkGy의 조건에서 540 nm 의 입자 크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

(5) Fructo— ol igosacchar ides에 대한 결과

1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%(w/v%) 농도의 Fructo-ol igosacchar ides 용액에 서, lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전자범을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이 , 1¾， 200kGy의 조건에서 501 nm의 입자 크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인하였다. 한편, 10¾， 10 kGY 조건 및 10%, 200 kGY 조건에서도 입자의 크기가 균일하지는 않았지만， 나노입자가 형성이 되는 것을 확인하였다. 이외의 조건에서는 입자의 크기가 매우 크거나 여러 개의 Peak가 나타나 나노입자가 정상적으로 생성이 되지 않았다. (6) I soma It o-o 1 igosaccharides°11 대한 결과

1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%(w/v ) 농도의 Isomalto— oligosaccharides 용액 에서 , lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전자빔을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이， 5¾에서 50kGy의 조건에서 542 nm의 입자 크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인하였다. 한편， 5¾, 10 kGY 조건 및 10%, 200 kGY 조건에서도 입자의 크기가 균일하지는 않았지만， 나노입자가 형성이 되는 것을 확인하였다. 이외의 조건에서는 입자의 크가가 매우 크거나 여러 개의 Peak가 나타나 나노입자가 정상적으로 생성이 되지 않았다.

(7) Fucoidan에 대한 결과

0.5%, 1%, 5% (w/v%) 농도의 fucoidan 용액에서， lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전 자빔을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이， 1%, 200kGy의 조건에서 100 nm의 입자 크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인하였다. 이외의 조건에서는 여러 개 의 Peak가 나돠나 균일한 입자크기의 나노겔이 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었

(8) Chitosan(5kDa)에 대한 결과

0.5%, 1%, 5% (w/v%) 농도의 chitosan 용액에서 , lOkGy, 50kGy, 200kGy의 전 자범을 조사하여 실험을 진행하였다.

그 결과 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이， 0.5¾>， 200kGy의 조건에서 172 nm 의 입자크기를 갖는 나노겔이 형성되는 것을 확인하였다. 한편， 0.1¾>， 50 kGY 조 건， 0.1%, 100 kGY 조건, 0.5%, 10 kGy 조건， 1%， 10 kGy 조건 및 1%, 200 kGy 조 건에서도 입자의 크기가 균일하지는 않았지만， 나노입자가 형성이 되는 것을 확인 하였다. 이외의 조건에서는 입자의 크기가 매우 크거나 여러 개의 Peak가 나타나 나노입자가 정상적으로 생성이 되지 않았다.

<실시예 3>

카르복시메틸-텍스트란 나노입자 (CM-DNP)의 물성 평가 - 겔 (gel)의 특성 전자빔을 조사한 샘플들을 3.5kDa~6kDa 크기의 투석 멤브레인 튜브를 사용하 여 5일 동안 하루에 2차례씩 NaCl이 포함된 물을 바꾸어주면서 투석을 진행하며 입 자의 크기에 변화가 발생하는지를 DLS로 확인해보았지만 투석 과정 중에는 입자의 크기에 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 그 이후 샘플을 동결건조하여 조사된 전자빔에 의한 교차가교 형성을 통해 만들어진 나노입자 수율을 계산하였고， 43% 정도의 수율을 보여주며 총 8.2g의 나노입자를 얻을 수 있었다. 상기 실시예에 따라 제조된 나노입자를 사용하여， 이러한 나노입자가 Gel의 특징을 나타내지는 않는지를 확인해보는 실험을 진행해보았다. CM-D P Omg, lOOmg, 200mg, 300mg을 각각 400uL의 물에 녹여준 후, 3kDa의 막을 가진 원심여과기 (YM-3 f i l ter)를 사용하여 _, 13000rpm에서 30분간 원심분리를 3번 반복해서 진행하며 CM- DNP의 농도에 따른 물의 머금음 (Swel l ing) 정도가 어떻게 차이 나는지를 확인해보 았다. 그 결과 CM-DNP의 농도에 따라 원심분리 과정 이후 튜브 바닥으로 떨어지는 물의 양이 차이가 났고， CM-DNP의 농도가 높을수록 그 물의 양이 적음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를.통하여 합성되어진 CM-DNP 나노입자가 겔 (Gel )의 특징을 가 지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 12) .

<실시예 4>

전자범 조사를통한폴리에틸렌글리콜 (PEG)가 혼합된 카르복시메팀-텍스트탸 나노입자 (CM-DNP)의 합성

덱스트란 이외에 이미 임상에서 사용되고 있는 유기분자를 함께 첨가하여 유 기분자가 텍스트란 나노입자 형성 및 물성에 미치는 영향을 연구하기로 계획하였 고， 첨가하는 유기분자로 이미 임상에서 널리 사용되는 PEG(Polyethylene glycol ) 를 사용하여 연구를 진행하였다 (도 13) .

<4-1> 전자범 조사에 의한 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 나노입자의 생성

먼저 PEG 자체로서 전자빔 조사시 교차가교를 일으키는지 확인해보기 위한 실험을 진행하였고， PEG의 농도를 달리하여 여러 에너지 세기에서 전자빔을 조사해 보는 실험을 진행하였다. 실험에는 6 kDa의 PEG를 사용하였으며, 물에 용해하여 1%, 5%， 10% (w/v) 농도의 용액을 준비하였고, 전자빔의 에너지의 세기는 lOkGy, 30kGy, 50kGy, lOOkGy, 200kGy로 조사하였다. 에너지의 세기가 증가하여 30kGy 이 상이 되면， 샘플의 색깔이 탁해지며 벌크겔이 만들어지는 경향성을 확인할 수 있었 고， PEG의 농도가 낮을 때， 좀 더 커다란 크기의 나노겔이 만들어지는 경향성을 확 인할 수 있었다 (도 14) . <4-2>전자범 조사에 의한 PEG및 카르복시메틸-덱스트란 혼합물의 나노입자 생성

PEG 용액에 전자빔 조사시 교차가교를 이룬다는 사실을 직접 확인 할 수 있 었고， PEG와 카르복시메틸 덱스트란을 함께 흔합하여 전자범올 조사하여 교차가교 가 잘 이루어지는지 또한 카르복시메틸 덱스트란만을 이용하여 만든 나노입자와는 다른 크기 및 물성을 갖는 나노입자가 만들어지는지 확인해보는 실험을 진행하였 다. 서로 다른 농도의 덱스트란과 PEG를 준비하여 lOkGy, 50kGy, 200kGy로 전자 빔을 조사한 후， 그 샘플들의 크기를 DLS를 이용하여 측정해보는 방식으로 나노입 자의 형성 유무를 확인하였다. 다른 조건들과는 다르게 1OT의 카르복시메틸 덱스트란과 1¾의 PEG를 사용하 여 전자빔을 조사한 경우 나노겔이 생성되는 것을 확인하였다. 이외의 다른 조건들 에서는 벌크겔이 형성이 되었다 (결과 미도시) . 샘플들을 DLS로 크기를 측정한 결과 lOkGy에서는 63nm, 50kGy에서는 50nm, ² (i0kGy에서는 9nm로 조사된 에너지의 크기가 증가할수록 나노입자의 크기가 작아지는 경향성을 확인할 수 있었다 (도 15) .

<4-3> PEG 및 카르복시메틸-덱스트란 흔합 나노입자 (PEG-DNP)의 수율 상기한 바와 같이， 10， 50， 200kGy 에너지 세기에서 1%의 PEG를 10%의 카르 복시메틸 -텍스트란과 함께 흔합하여 전자빔을 조사하였을 경우에도 나노입자가 잘 만들어지는 결과를 얻었다. 그런 다음에는 어느 정도의 수율로 나노입자가 형성되 었는지를 확인하기 위하여 샘플들을.3.5kDa~ 5kDa 크기의 투석 멤브레인 튜브를 사 용하여 5일 동안 하루에 2차례씩 NaCl이 포함된 물을 바꾸어주면서 투석을 진행하 였고， 그 이후 각각의 샘플들을 동결건조하여 조사된 전자빔에 의한 교차가교 형성 을 통해 만들어진 나노입자 수율을 계산한 결과, 각 에너지 조건에서의 샘플들 모 두 24~36% 정도의 수율을 보여주었다. 그 중， 9~10nm의 크기를 갖는 나노입자가 생성된 200kGy 전자범 조사조건에 서 좀 더 다량의 카르복시메틸-덱스트란 나노입자 (PEG-DNP)를 합성하는 실험을 진 행해보았고, 재현성 있게 10nm 정도의 크기를 보여주었고， 대량으로 진행함으로써 각 단계에서 손실되는 양이 줄어들어， 이전보다 더 높은 52% 정도의 수율을 보여주 며 총 2g의 나노입자를 얻을 수 있었다.

<4-4> PEG-DNP의 구조분석

전자범 조사에 의한 PEG 및 CM-DNP 흔합 나노입자의 제조가 전자빔 조사로 인한 PEG만의 교차가교에 의한 나노입자의 형성 결과는 아닌지를 확인해보기 위하 여 (즉， 생성된 나노입자가 PEG와 카르복시메틸 -덱스트란의 분자간 가교결합에 의해 형성된 것인지 여부를 확인하기 위하여)， 상기 실시예 4-3에서 얻어진 CM-DNP에 대 한 NMR 분석을 진행함으로써 만들어진 나노입자에 PEG와 덱스트란이 모두 존재하는 지， PEG 또는 덱스트란에 대한 peak는 확인할 수 없는 것은 아닌지 확인해보는 실 험을 진행하였다. -NMR을 이용한 분석을 진행하기 위하여 샘플을 D ₂ 0에 녹여 분석을 진행한 결과， PEG에 대한 peak와 함께 덱스트란의 peak들도 확인할 수 있었고, 이를 통하 여 만들어진 나노입자는 PEG와 텍스트란이 함께 교차가교가 일어남으로써 만들어짐 을 확인하였다 (도 16) .

¹³ C-NMR을 이용한 분석 결과에서도 마찬가지로 PEG에 대한 peak와 함께 덱스 트란의 peak들도 확인할 수 있었고， 이를 통하여 만들어진 나노입자는 PEG와 덱스 트란이 함께 교차가교가 일어남으로써 만들어짐을 다시 한 번 더 확인할 수 있었다 (도 17) .

<실시예 5>

카르복시메 ¾ -텍스트란 나노입자의 킬레이트 컨쥬게이션 및 Cu-64방사성 표 진

합성한 CM— DNP를 사용하여 여러 가지 킬레이트를 컨쥬게이션 시켜 Cu-64로 방사성 표지하는 실험을 진행하였다. 나노입자에 Cu-64를 이용한 표지 실험을 진행 하기 위하여 먼저 나노입자에 킬레이트를 컨쥬게이션 시켜주었고， D0TA-Bn-p-N¾,

D0TA-GA-NH ₂ , TE2A-腿 ₂ 3가지 킬레이트를 사용하여 진행하였다.

CM-DNP ( lOOmg)을 먼저 둥근 플라스크에 넣고, DMS0(5mL)을 넣어 녹인 후， CDKcarbodi imidazole , lOmg)를 넣고 질소 조건하에서 .40 ^° C에서 2시간동안 교반시 키며 반웅을 진행하였다. 반웅 후, TLC를 사용하여 적절한 고장상 및 이동상 조건

18

(C ， CH ₂ Cl ₂ :MeOH=10: l)에서 반웅하지 않은 CE ⁾ I가 남아있지는 않는지를 확인해주었 고， CE ⁾ I가 모두 반응하였을 때 세 종류의 킬레이트를 각각 넣어준 후 60 ^° C에서 16 시간동안 반웅시켜 주었다. 이후 정제를 위하여 투석을 진행하였고, 그 이후 각각 의 샘플들을 동결건조하여 대략 35~45 mg 양의 킬레이트가 컨쥬게이션된 텍스트란 나노입자를 얻을 수 있었다 (도 18) · 위와 같이 킬레이트가 컨쥬게아션 된 나노입자에 Cu-64를 사용하여 방사성 표지가 잘 이루어지는지 확인하였다.

100 Li L의 0.1M NH ₄ 0Ac(pH 6.8; l 세 종류의 킬레이트가 컨쥬게이션 된 카르 복시메틸-덱스트란 나노입자 IO II L를 넣어준 후， Cu-64를 넣어주며 6( C에서 1시간 동안 반웅시켜주었다. 고정상으로는 ITLC를 이동상으로는 50mM EDTA를 사용하여 Cu-64가 얼마나 잘 표지되었는지 그 결과를 확인하였을 때， D0TA-Bn-p-NH ₂ 가 컨쥬 게이션 된 덱스트란 나노입자의 경우에는 25%, D0TA-GA-N¾가 컨쥬게이션 된 덱스트 란 나노입자의 경우에는 47%， TE2A-N¾가 컨쥬게이션 된 덱스트란 나노입자의 경우 에는 27%가 표지됨을 확인하였다 (도 19) .

그런 다음 10 kDa의 다공성막을 가진 원심여과기 (YM-10 f i l ter)를 사용하여 원삼분리를 5번 반복해서 진행하며 표지되지 않은 Free Cu-64를 제거해주고 표지된 나노입자만을 분리하는 정제과정을 진행하였고， 그 후 TLC를 통하여 분리된 나노입 자에는 Free Cu-64가모두 제거된 것을 확인할 수 있었다 (도 20) .

<실시예 6>

방사성 요오드를 이용한 카르복시메틸-텍스트란 나노입자의 표지

방사성핵종 표지를 통한 CM-DNP 기반 핵의학 영상 조영제 개발은 Cu-64 이외 에 방사성요오드를 이용하여서도 진행하였고, 방사선요오드 표지법으로 널리 활용 되고 있는 보결분자단 (prosthet i c group)인 Bol ton-Hunter 시약을 사용하여 진행 하였고， 방사성 요오드로는 반감기가 8일로 길고 가격도 상대적으로 저렴한 1-131 을 구매해서 실험을 진행하였다 (도 21) .

10nm의 크기를 가지는 CM-DNP를 사용하여 표지 실험을 진행하였고， Bolton- Hunter Reagent (1.1 pg/uL in 이 \IS0)를 1—131과 Chloramine-T (10 y /yL in D.W)와 함께 1분간 반웅시킨 후， Sodium metabisulfite를 사용하여 반웅을 멈춘 후 ， Sep-PAK C18을 사용하여 물과 에탄을로 표지된 Bolton-Hunter Reagent를 분리하 였고, 분리된 Bolton-Hunter Reagent와 카르복시메틸-덱스트란 나노입자를 0.1M Na2B407 (pH 9.2)를 사용하여 30분간 컨쥬게이션을 진행한 후， PD-10 column올 이 용하여 표지된 나노입자를 분리하였다 (도 22). 반웅 후와 PD-10 column을 이용한 정제 과정 후에 표지 수율 결과를 Radio- TLC를 사용하여 확인해보았고， 표지 수율은 43%였고 PD-10 column을 통하여 Free 1-131을 제거하여 표지된 나노입자만을 잘 분리할 수 있었다.

<실시예 7>

독소루비신이 결합된 카르복시메틸-텍스트란 기반의 나노입자 합성 <7-1> 나노입자에 독소루비신의 결합

덱스트란 나노입자에 항암제로 널리 사용되고 있는 독소루비신 (doxorubicin)을 결합시켜보는 실험을 진행하였다. 먼저 CM-DNP를 사용하여 실험을 진행해보았고， 10nm 크기의 CM-DNP 15mg을 3mL의 DW에 녹인 후， NaOH를 사용하여 pH를 8로 맞추어 준 다음， 독소루비신 (lmg/mL)을 넣어주고 빛을 차단하며 상온에 서 하루종일 교반시켜주는 방법으로 반응을 진행하였다. 반웅 후 16,000g에서 90분 간 원심분리를 진행하면 독소루비신이 결합된 덱스트란 나노입자는 바닥에 pellet 을 형성하게 되는데 , 상층액과 pel let을 분리하였다 (도 23). 분리한 상층액은 흡수스펙트럼을 측정하여 나노입자에 결합되지 못한 독소루 비신의 양을 확인할 수 있는데， 독소루비신에 대하여 흡수극대를 나타내는 481nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고， 그 값을 미리 준비해둔 481nm의 파장에서의 독소루 비신에 대한 standard curve에 대입하여 상층액에 남아있는 독소루비신의 양을 확 인하였다. 반응에 사용한 독소루비신의 양과 상층액에 남아있는 독소루비신의 양을 아래의 공식에 넣어 CM-DNP에 독소루비신이 얼마나 loading 되었는지 확인해본 결 과， LE(Loading ef f iciency)(¾)가 78.9% 인 것을 확인하였다.

PEG-DNP의 경우도 위와 동일한 방법으로 독소루비신을 결합시켜보는 실험을 진행해보았지만， LE(%)가 56. 1%로 보다 낮은 것을 확인하였다. 그래서 독소루비신 의 LE(%)를 증가시키는 조건을 찾아보는 실험올 진행해보았고， Img/mL의 독소루비 신과 반웅하는데 사용하는 PEG-DNP의 양을 3mg/mL에서 0.5mg/mL로 줄여서 반웅하였 을 때 LE(%)가 72.7%로 증가하는 것을 확인하였다. 이때 반웅하는 시간을 45분으로 줄이더라도 LE(%)에는 큰 차이가 없는 것을 확인하여 반웅시간도 단축할 수 있었 다.

<7-2> 독소루비신이 결합된 나노입자에서 약물의 방출속도

독소루비신이 결합된 카르복시메틸-덱스트란 나노입자 (CM— DNP)와 PEG 및 카 르복시메틸 -덱스트란의 흔합 나노입자 (p _EG - _DNP )를 사용하여 약물이 방출되어지는 속도는 어떠한지를 확인해보는 Ef f lux 실험을 진행해보았다. 10mg의 동일한 양의 나노입자를 사용하여 pH가 7.4인 PBS에서 독소루비신이 방출되어지는 속도를 확인 해보고자 여러 Time point에 맞추어서 샘플을 얻고 원심분리를 진행하며 상층액에 존재하는 독소루비신의 양을 확인함으로써 나노입자에서 방출되어진 독소루비신의 양을 확인해보았다. 그 결과 6일에 걸쳐서 CM-D P의 경우에는 9. 16%로 독소루비신 이 빠져나왔고， PEG-DNP의 경우에는 18.4%로 나노입자에 결합된 독소루비신이 상당 히 천천히 지속적으로 빠져나오는 것을 확인할 수 있었다 (도 24) .

<7-3> 독소루비신이 결합된 PEG-DNP의 종양성장 저해효과

독소루비신이 결합된 텍스트란 기반의 나노입자가 종양의 성장을 저해할 수 있는 치료제로 사용될 수 있을지 그 능력을 비교 확인해보는 실험을 진행해보았다. 실험에 사용된 종양모델로는 대장암 마우스 종양모델 (CT26 tumor model )을 사용하 였고, 5xl0 ⁶ 개의 세포를 마우스의 옆구리에 주사한 후 10일 후에 종양이 발생함을 확인한 후 실험에 사용하였다. PBS를 처리하는 Blank 그룹， Free 독소루비신을 처 리하는 그룹 ( free D0X) , 독소루비신이 결합된 PEG-DNP (DOX@PEG_DNP)를 처리하는 그룹으로 구분한 후 실험을 시작하였다. 각 그룹에 해당하는 마우스의 수는 3마리 였고， 각각의 투여물질을 이를 간격으로 총 3회 정맥 주사를 통하여 마우스 종양 모델에 처리하였고, 이때 Free 독소루비신을 처리하는 그룹， 독소루비신이 결합된 PEG-DNP (D0X@PEG-DNP) 그룹에 처리되어지는 독소루비신의 양은 200 이었다.

33일에 걸쳐서 종양모델에서의 종양의 크기 및 마우스의 무게를 확인해보았 고， 그 결과를 확인 및 비교해보았을 때, D0X@PEG-DNP를 처리한 그룹에서 가장 종 양의 성장이 저해되었으며 종양의 크기가 3000mm 이하로 다른 두 그룹에 비해 확실 히 작은 것을 확인할 수 있었다. Free 독소루비신을 처리한 그룹의 경우에는 3마리 증 1마리가 유독 종양의 성장 속도가 저해되지 않고， PBS를 처리한 Bl ank 그룹과 유사한 종양의 성장 속도를 보임을 확인할 수 있었고 그 종양 모델을 제외한 나머 지 2마리의 종양 모델의 경우에는 확실히 PBS를 처리한 Blank 그룹보다는 종양의 성장속도가 저해됨을 확인할 수 있었다. 종양모델의 무게의 경우에는 Free 독소루 비신이나 D0X@PEG-DNP을 처리하더라도 급격하게 체중이 감소되지 않음을 확인할 수 있었고， 시간이 지날수록 각 그룹 간에 체중이 조금 차이가 발생하기는 하였지만 이는 각 그룹에서의 종양의 크기 차이로 인하여 발생한 것으로 생각되어진다. 이러 한 결과를 통하여 D0X@PEG-DNP가 확실히 Free 독소루비신보다 종양 모델에 큰 독성 을 나타내지 않으면서 종양의 성장을 저해할 수 있음을 확인해볼 수 있었다 (도 25 및 도 26) .

【산업상 이용가능성】

본 발명의 생체적합성 나노입자는 전자빔을 통해 다당 또는 이의 유도체 분 자 간 또는 분자 내 가교결합을 유도함으로써 제조되기 때문에, 유기용매 또는 가 교제의 흔입에 따른 인체 내 독성문제가 발생할 염려가 전혀 없고， 그 제조과정 증 별도의 정제과정이 필요치 않아 짧은 시간의 전자빔 조사만으로 대량 생산이 가능 하여 생산성 측면에서도 매우 우수하다. 또한， 본 발명의 나노입자는 약물전달체， 약학적 조성물 또는 조영제 조성물， 장유착방지제 등 다방면으로 활용될 수 있다는 점에서 매우 유용하여 산업상 이용가능성이 매우 높다.