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Title:
BIOCOMPATIBLE POLYMERS, PREPARATION METHOD AND COMPOSITIONS CONTAINING SAME
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2000/005270
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention concerns a biocompatible polymer consisting of a sequence of identical or different motifs, of the general formula (I): A¿a? X¿x? Y¿y? wherein: A represents a monomer; X represents a carboxyl group fixed on a monomer A; Y represents a sulphate or sulphonate group fixed on a monomer A; a represents the number of monomers A; x represents the substitution rate of the set of monomers A by the groups X; y represents the substitution rate of the set of monomers A by the groups Y. The invention further concerns the pharmaceutical and diagnostic compositions containing at least one polymer of general formula (I).

Inventors:
Barritault, Denis (4 rue Française Paris, F-75001, FR)
Caruelle, Jean-pierre (32 rue Jules Joffrin Saint-Maur-des-Fossés, F-94100, FR)
Application Number:
PCT/FR1999/001774
Publication Date:
February 03, 2000
Filing Date:
July 20, 1999
Export Citation:
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Assignee:
Barritault, Denis (4 rue Française Paris, F-75001, FR)
Caruelle, Jean-pierre (32 rue Jules Joffrin Saint-Maur-des-Fossés, F-94100, FR)
International Classes:
A61K9/08; A61K47/48; A61P1/00; A61P3/00; A61P9/10; A61P9/12; A61P17/02; A61P17/16; A61P21/00; A61P25/00; A61P29/00; A61P31/00; A61P31/08; A61P39/00; A61P39/06; A61P43/00; C08B37/02; C08G63/688; C08G85/00; (IPC1-7): C08B37/02; C08G63/91; A61K31/715; A61K31/795
Foreign References:
DE1152396B1963-08-08
FR894508A1944-12-27
EP0557887A21993-09-01
Other References:
MAIGA-REVEL O ET AL: "NEW INVESTIGATIONS ON HEPARIN-LIKE DERIVAIZED DEXTRANS: CMDBS, SYNERGISTIC ROLE OF BENZYLAMIDE AND SULFATE SUBSTITUENTS IN ANTICOAGULANT ACTIVITY", CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 32, no. 2, 1 February 1997 (1997-02-01), pages 89 - 93, XP000686949, ISSN: 0144-8617
LEBOUCHER-DURAND M -A ET AL: "Poly(beta-malic acid) derivatives with unsaturated lateral groups: epoxidation as model reaction of the double bonds reactivity", REACTIVE & FUNCTIONAL POLYMERS, vol. 31, no. 1, 1 August 1996 (1996-08-01), pages 57-65, XP004052633, ISSN: 1381-5148
Attorney, Agent or Firm:
Breese, Pierre (Breese-Majerowicz 3, avenue de l'Opéra Paris, F-75001, FR)
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Claims:
REVENDICATIONS
1. Polymères biocompatible constitue par un enchainement de motifs identiques ou différents, de formule générale (I) suivante : Aa Xx Yy dans laquelle : A représente un monomère; X représente un groupement carboxyle fixe sur un monomere A et répondant à la formule suivante : RCOOR', ou R est une liaison ou une chaine hydrocarbonée aliphatique, eventuellement ramifiee et/ou insaturée et qui peut contenir un ou plusieurs cycles aromatiques a 1'exception de la benzylamine et de la benzylamine sulfonate, et R'represente un atome d'hydrogène ou un cation, Y représente un groupement sulfate ou sulfonate fixe sur un monomere A et repondant a 1'une des formules suivantes : ROS03R', RNS03R', R S03R', ou R est une liaison ou une chaine hydrocarbonee aliphatique, eventuellement ramifiee et/ou insaturée et qui peut contenir un ou plusieurs cycles aromatiques à 1'exception de la benzylamine et de la benzylamine sulfonate, et R'represente un atome d'hydrogène ou un cation, a represente Ie nombre de monomeres A, qui est tel que la masse desdits polymères de formule (I) est supérieure à environ 5 000 daltons x represente Ie taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par les groupements X, lequel est compris entre environ 20 et 150%, et de preference est de 1'ordre de 50%, y represente le taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par les groupements Y, qui est compris entre environ 30 et 150%, et de preference est de 1'ordre de 100%.
2. Polymere biocompatible selon la revendication 1, caracterise en ce que le radical R des groupement X et Y, est choisi parmi un groupement alkyle, allyle, aryle, lineaires ou ramifies.
3. Polymere biocompatible selon les revendications 1 ou 2, caracterise en ce que les monomeres A, identiques ou differents, sont choisis parmi les sucres, les esters, les alcools, les acides amines, les nucleotides.
4. Polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que les monomeres A, identiques ou differents, sont des oses, plus particulierement le glucose.
5. Polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 4, caracterise en ce qu'il comprend en outre des groupements chimiques fonctionnels Z, differents de X et Y, capables de conferer aux polymeres de 1'invention des proprietes biologiques ou physicochimiques supplementaires.
6. Polymere biocompatible selon la revendication 5, caracterise en ce que le taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par des groupements Z est compris entre 0 et 50 %, et de preference de 1'ordre de 30%.
7. Polymere biocompatible selon 1'une des revendications 5 ou 6, caracterise en ce que le groupement Z est une substance capable de conferer au polymere une meilleure solubilite ou lipophilie.
8. Polymere biocompatible selon la revendication 7, caracterise en ce que les groupements Z, identiques ou differents, sont des acides amines, des acides gras, des alcools gras, des ceramides, ou des derives de ceuxci, ou encore des sequences nucleotidiques d'adressages.
9. Polymere biocompatible selon 1'une des revendications 5 ou 6, caracterise en ce que les groupements Z, identiques ou differents, sont des agents agents therapeutiques ou de diagnostic.
10. Polymere biocompatible selon la revendication 9, caracterise en ce que le groupement Z est choisi parmi un antiinflammatoire, un anti microbien, un antibiotique, une enzyme, un facteur de croissance.
11. Polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que les groupements X, Y et Z sont fixes directement sur le monomère A ou bien fixes les uns aux autres, 1'un seulement étant fixé au monomere A.
12. Polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 5 a 11, caracterise en ce que les groupements Z sont fixes par covalence directement sur les monomeres A ou fixes par covalence sur les groupements X et/ou Y.
13. Polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 5 a 11, caracterise en ce que les groupements Z sont conjugues aux polymeres de formule (I) par des liaisons autres que covalentes.
14. Polymere biocompatible selon la revendication 13, caractérisé en ce que les groupements Z sont conjugues aux polymeres de formule (I) par des interactions ioniques ou hydrophiles.
15. Composition pharmaceutique ou de diagnostic, caracterisee en ce qu'elle renferme au moins un polymere selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 associe dans ladite composition avec un vehicule pharmaceutiquement acceptable.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15, caracterisee en ce que le polymère biocompatible et le véhicule pharmaceutiquement acceptable sont associes sous une forme permettant 1'administration locale, intraveineuse, intra arterielle, intra musculaire, intra peritoneenne, intra oculaire, dans le liquide cephalorachidien ou directement dans le système nerveux central, ou encore par voie orale, per os, per cutanee, sous cutanee, topique, dans tous les compartiments liquidiens de 1'organisme, ou eventuellement une combinaison de cellesci.
17. Composition selon 1'une des revendications 15 a 16, caracterisee en ce que son dosage permet une administration de 0, 001 a 1 milligramme de polymere par centimetre carre ou de 0, 005 a 1 milligramme de polymere par centimetre cube de tissu a traiter.
18. Composition selon 1'une des revendications 15 a 16, caracterisee en ce qu'elle contient entre 0, 01 et 10 milligramme de polymere par millilitre de solution physiologique de dissolution.
19. Composition selon 1'une des revendications 15 a 16, caracterisee en ce que son dosage permet une administration par voie systemique, intraperitoneale, intra oculaire, dans le liquide cephalorachidien, dans le liquide intracochleaire ou dans tous fluides peri ou intra tissulaires, de 0, 1 et 100 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal a traiter.
20. Composition selon 1'une des revendications 15 à 16, caracterisee en ce que son dosage permet une administration par voie intramusculaire, comprise entre 0, 2 et 500 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal a traiter, et de preference entre 1 et 50 mg par kg.
21. Composition selon 1'une des revendications 15 a 16, caracterisee en ce que son dosage permet une administration per os comprise entre 1 et 5000 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal a traiter, et de preference entre 10 et 500 mg par kg.
22. Composition pharmaceutique selon 1'une quelconque des revendications 15 a 21, caractérisée en ce qu'elle est depourvue d'activite anticoagulante significative.
23. Composition pharmaceutique selon 1'une quelconque des revendications 15 a 22, pour etre utilisee dans un procédé de stabilisation et de potentialisation des facteurs de croissance presentant une affinite pour 1'heparine.
24. Composition pharmaceutique selon 1'une quelconque des revendications 15 a 23, pour etre utilisee dans un procédé de protection des facteurs de croissance presentant une affinite pour 1'heparine contre des agents proteolytiques comme la trypsine.
25. Composition pharmaceutique selon 1'une quelconque des revendications 15 a 21, pour etre utilisée dans un procede d'inhibition des activites proteasiques impliquees dans le processus inflammatoire.
26. Composition pharmaceutique caracterise en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des lesions et souffrances des tissus ou des organes.
27. Composition pharmaceutique selon la revendication 26, pour le traitement et/ou la prevention des lesions des tissus musculaires, nerveux et du tractus digestif.
28. Composition pharmaceutique selon la revendication 26 pour la cicatrisation cutanee.
29. Composition pharmaceutique selon la revendication 26 pour la cicatrisation de la cornee.
30. Composition pharmaceutique selon la revendication 26 pour la cicatrisation de 1'os plat.
31. Composition pharmaceutique selon la revendication 26 pour la cicatrisation de 1'os long.
32. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention d'une inflammation.
33. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour etre utilisee dans un procédé de regulation de 1'homeostasie de la masse et de la fonctionnalite des tissus et des organes.
34. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour etre utilisee dans un procédé de regeneration, de protection, de preservation et de vieillissement tissulaire et cellulaire in vivo et ex vivo.
35. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou en association avec la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des effets délétères des ischemies, des radiations ionisantes et des produits oxydants induits lors de pathologies ou de stress ou encore apportes dans 1'alimentation.
36. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour etre utilisee dans un procédé de preservation et de protection contre les ischemies.
37. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des pathologies associees a une hypoxie, a une degenerescence cellulaire comme les neuropathies, les myopathies, les hepatopathies, les nephropathies, les cardiopathies, et aux peroxydations des molecules comme les lipides.
38. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour la consevation des tissus et organes et protheses.
39. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des maladies cardiaques et nerveuses.
40. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des maladies associees a une croissance anarchique des cellules et aux processus pathologiques en relation avec une angiogenese.
41. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des effets deleteres des radiations ionisantes.
42. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des fibroses.
43. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, pour etre utilisee dans un procédé de regulation de la proliferation des cellules mesenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hepatiques et de regulation de la qualite du type de collagene qu'elles secrefcent.
44. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour le traitement et/ou la prevention des pathologies pulmonaires renales, hepatiques, cardiaques, vasculaires, dermatologiques, des greffes et de leur integration fonctionnelle, des derives multiples liees aux parasistismes.
45. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, pour le traitement et/ou la prevention des lesions et souffrances induites par un stress oxydatif et les agents oxydants.
46. Composition caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou en association avec un autre compose pour la preservation d'aliments ou de nutriments contenant naturellement des antioxydants ou auxquels ont ete ajoutes des agents antioxydants comme la SOD animale ou végétale.
47. Composition caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 et de la SOD animale ou vegetale.
48. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des agressions, de la souffrance ou de la degenerescence des tissus nerveux.
49. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention du vieillissement.
50. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications la 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des souffrances du coeur, du cerveau, du systeme nerveux central.
51. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des lesions de la moelle epiniere ou de la retine.
52. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des insuffisances respiratoires associees a la fatigue du diaphragme, comme la dystrophie musculaires.
53. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention des effets deleteres associes au diabete comme dans les retinopathies diabetiques.
54. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention de la lepre.
55. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention du choc endotoxique.
56. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour le traitement et/ou la prevention d'une invasion par un agent pathogene, tel qu'un agent viral, microbien, parasitaire, prion.
57. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour etre utilisee dans un procédé de radiotherapie pour le traitement des cancers.
58. Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour la prevention et/ou le traitement des effets induits par les rayons ultraviolets 59) Composition pharmaceutique caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, seul ou associe a la SOD, pour la prevention et/ou le traitement de 1'hypertension.
59. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polymere biocompatible selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, pour la prevention et/ou le traitement des lesions et souffrances tissulaires rencontrees en traumatologie.
60. Utilisation d'un biopolymere selon 1'une quelconque des revendications 1 a 4 pour vehiculer un agent actif au niveau de tissus leses.
61. Utilisation selon la revendication 61, caracterisee en ce que 1'agent actif est un agent therapeutique ou de diagnostic.
Description:
POLYMERES BIOCOMPATIBLES LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT.

La présente invention concerne de nouveaux polymeres biocompatibles, leur procédé de preparation et les compositions les contenant.

On connait dans 1'art anterieur des polymeres derives de dextranes obtenus par substitution par des residus carboxymethyle, carboxymethyle- benzylamide et carboxymethyle-benzylamide-sulfonate. Ces polymeres, leur procédé de preparation et leur propriete ont ete decrits dans le brevet Franchais No. 2 461 724 ainsi que dans le brevet US No. 4 740 594. Parmi ces polymeres, certains miment les proprietes de 1'heparine et peuvent etre utilises en tant que produits de substitution du plasma grace a leurs proprietes anti- coagulante et anti-complementaire. D'autres miment une propriete differente de 1'heparine qui consiste en une stabilisation, une protection et une potentialisation de 1'activite biologique in vitro des facteurs de croissance de la famille des FGF (Tardieu et coll., Journal of Cellular Physiology, 1992,150, Pages 194 a 203).

Par ailleurs, le brevet Français No. 2 644 066 décrit l'utilisation de derives de dextrane <BR> <BR> <BR> <BR> carboxyméthyl-benzylamide-sulfonate, désignés CMDBS, seuls ou associes aux FGFs pour la cicatrisation.

Plus recemment, il a ete propose dans les brevets Français No. 2 718 023, No. 2 718 024 et No. 2 718 026 d'utiliser des polymeres capables de proteger, stabiliser et potentialiser les facteurs de croissance a affinite pour 1'heparine, tels les facteurs de croissance des fibroblastes ou FGF et du Transforming Growth Factor bêta (TGFß), comme medicament pour le traitement des lesions respectivement du tractus

digestif, du systeme nerveux, des tissus musculaires.

Pour illustrer cet effet protecteur des derives de dextrane CMDBS, ces brevets rapportent les resultats de la digestion proteolytique par de la trypsine du FGF1, du FGF2 ou du TGFß. Ces proprietes de protection, de stabilisation et de potentialisation des facteurs de croissance a affinite pour 1'heparine ont permis de caracteriser une nouvelle classe de polymeres, designes HBGFPP pour"Heparin-Binding Growth Factor Protector and <BR> <BR> <BR> <BR> Potentiator ", presentant une activite cicatrisante et reparatrice des tissus musculaires, nerveux et du tractus digestif et depourvus, aux doses utilisees, d'activites anticoagulantes.

Outre, les applications des HBGFPP ci- dessus, le brevet Français No. 2 718 025 propose 1'utilisation de ces polymeres comme medicament pour le traitement des inflammations. Cette activite anti- inflammatoire est illustree par 1'activite d'inhibition in vitro d'enzymes protéolytiques impliquées dans la reaction inflammatoire comme 1'elastase leucocytaire ou la plasmine et in vivo par des etudes histologiques demontrant une reaction cellulaire inflammatoire réduite dans les tissus traites par des dérivés de dextrane CMDBS.

Toutefois, les dérivés de dextrane CMDBS sont des composes dont la synthese est difficile et qui présentent le risque de relarguer des résidus connus pour leurs effets toxiques comme la benzylamine.

En outre, les applications des HBGFPP et donc du CMDBS proposees dans 1'art anterieur sont limitees a la reparation et a la cicatrisation de certains tissus seulement.

La presente invention vise precisement a palier ces inconvenients en offrant de nouveaux polymeres biocompatibles faciles a preparer et presentant les proprietes des HBGFPP mais aussi, de

facon inattendue, de nouvelles proprietes permettant des champs d'application notamment therapeutiques tres etendus qui ne sont pas limites a quelques types de d'organes, de tissus ou de cellules particuliers.

Les polymeres de 1'invention seront aussi designes ci-apres"RGTA"pour"ReGeneraTing Agents" (Agents de regeneration).

Les polymeres de 1'invention ont une masse molaire superieure a environ 5 000 Daltons et sont constitues par un enchainement de motifs identiques ou differents, de formule générale (I) suivante : Aa Xx Yy dans laquelle : - A represente un monomere ; - X represente un groupement carboxyle fixe sur un monomere A et répondant à la formule suivante : - R-COO-R', ou R est une liaison ou une chaine hydrocarbonee aliphatique, eventuellement ramifiee et/ou insaturée et qui peut contenir un ou plusieurs cycles aromatiques a 1'exception de la benzylamine et de la benzylamine sulfonate, et R'represente un atome d'hydrogene ou un cation, Y represente un groupement sulfate ou sulfonate fixe sur un monomere A et repondant a 1'une des formules suivantes : -R-O-SO3-R', -R-N-SO3-R', -R- S03-R', ou R est une liaison ou une chaîne hydrocarbonée aliphatique, éventuellement ramifiée et/ou insaturée et qui peut contenir un ou plusieurs cycles aromatiques à 1'exception de la benzylamine et de la benzylamine sulfonate, et R'represente un atome d'hydrogene ou un cation, - a represente Ie nombre de monomeres A, qui est tel que la masse desdits polymeres de formule (I) est superieure a environ 5 000 daltons

- x represente Ie taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par les groupements X, lequel est compris entre environ 20 et 150%, et de preference est de 1'ordre de 50%, - y represente le taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par les groupements Y, qui est compris entre environ 30 et 150%, et de preference est de 1'ordre de 100%.

Avantageusement dans la formule (I), le radical R des groupement X et Y, est choisi parmi un groupement alkyle, allyle, aryle, lineaires ou ramifies.

Dans la definition des taux de substitutions ci-dessus, on entend par un taux de substitution x de 100 %, le fait que chaque monomere A du polymere de 1'invention contient statistiquement un groupement X. De meme, on entend par un taux de substitution y de 100 %, le fait que chaque monomere du polymere de 1'invention contient statistiquement un groupement Y. Les taux de substitution superieurs a 100 % traduisent le fait que chaque monomere porte statistiquement plus d'un groupement du type considere ; a 1'inverse, les taux de substitution inferieurs a 100 % traduisent le fait que chaque monomere porte statistiquement moins d'un groupement du type considere.

Les polymères offrent l'avantage remarquable de presenter in vivo une degradabilite lente, ce qui les differencient des heparanes sulfates qui sont des produits naturellement et rapidement degrades par 1'heparinase ou 1'heparitinase. En outre, les polymeres de 1'invention ne contiennent pas ou ne liberent apres degradation des produits toxiques contrairement au CMDBS qui possedent des groupements benzylamines.

Les monomeres A qui constituent les elements de base des polymeres de formule I peuvent etre

identiques ou differents, et sont choisis parmi tout type de monomomere, comme par exemple ceux proposes pour les HBGFPP tels que des sucres, des esters, des alcools, des acides amines, des nucleotides, etc.... Parmi ceux- ci, on prefere plus particulierement les oses et notamment le glucose.

Le nombre de monomeres A est defini de façon a ce que la masse des polymeres de 1'invention soit superieure a environ 5 000 daltons. En consequence, les RGTA peuvent etre constitues de diverses structures polymerisables homomeriques comme heteromeriques comme par exemple : les copolymeres polyesters de biosynthese ou de synthese chimique comme les polyesters aliphatiques ou ceux d'origine naturelle comme les polyhydroxyalcanoates. Il peut aussi s'agir de polysaccharides et de leurs derives qu'ils soient d'origine bacterienne comme la cellulose, le xanthane, le dextrane, etc..., extraits des vegetaux unicellulaires ou pluricellulaires comme 1'amidon, la cellulose vegetale ou les alginates et leurs derives, les fucanes et leurs derives, etc... ou encore extraits des animaux comme 1'acide hyaluronique ou la chitine, etc... ou de synthese obtenu par exemple par copolymerisation. Des proteines de synthese comme des poly acides amines naturels ou chimiquement modifies, comme par exemple le collagene, peuvent egalement entrer dans la constitution des polymeres de 1'invention.

Le choix de la structure polymerique des RGTA repose sur les differentes formes de presentation susceptibles d'etre utilisees selon le tissu ou 1'organe A traiter ou des caracteristiques physico-chimiques comme la solubilite, la conformation spatiale avec des solutions, des suspensions, des gels, des poudres des eponges, des films, des matériaux modelables compacts, poreux semi-poreux ou non poreux, delitables ou non erodables ou non, colonisables ou non, etc...

L'heparine ou ses fragments a faible propriete anticoagulante et les heparanes sulfates naturels et leurs fragments sont exclus du champ de la presente invention, car : - Leur activite anti-coagulante peut etre superieure a 50 UI. En effet, les polymeres de 1'invention sont depourvus d'activite anticoagulante significative, c'est a dire qu'ils presentent une activite inferieure a 50 UI/milligramme comparee a celle de 1'heparine dont l'activité est de 1'ordre de 150 a 170 UI/milligramme.

- Us presentent une biodegradabilite trop rapide sous 1'action d'enzymes de type heparinase ou heparitinase pour permettre les effets biologiques obtenus dans le cadre de la presente invention.

Les polymeres de 1'invention peuvent egalement comprendre des groupements chimiques fonctionnels, designes Z, differents de X et Y, capables de conferer aux polymeres de 1'invention des proprietes biologiques ou physicochimiques supplementaires. Ainsi, les groupement Z sont utiles pour conferer aux RGTA une meilleure solubilite ou lipophilie permettant une meilleure diffusion ou penetration tissulaire, par exemple accroitre 1'amphiphilie, permettre le franchissement de la barriere hematoencephalique, etc... A titre d'exemple, les groupements Z, identiques ou differents, peuvent être des acides amines, des acides gras, des alcools gras, des ceramides, ou des dérivés de ceux-ci, ou encore des sequences nucleotidiques d'adressages, etc...

Les groupement Z peuvent aussi representer des agents actifs identiques ou differents, comme des agents therapeutiques ou de diagnostic, par exemple un anti-inflammatoire, un anti-microbien, un antibiotique,

etc..., ou encore une enzyme, un facteur de croissance, etc....

Des polymeres de 1'invention dans lesquels Z est present repondent a la formule II suivante : Aa Xx YY Zz dans laquelle, A, X, Y, a, x, y ont la meme signification que precedemment et z représente le taux de substitution de 1'ensemble des monomeres A par des groupements Z, qui est compris entre 0 et 50 %, et de preference de 1'ordre de 30%.

Les groupements X, Y et Z peuvent etre fixes directement sur le monomère A ou bien fixes les uns aux autres, l'un seulement etant fixe au monomere A.

Ainsi, les groupements Z peuvent etre fixes par covalence directement sur les monomeres A ou fixes par covalence sur les groupements X et/ou Y.

Mais, les groupements Z peuvent aussi etre conjugues aux polymeres de formule (I) par des liaisons autres que covalentes, comme des interactions ioniques ou hydrophiles, selon la nature de A, X et Y. Les polymeres de 1'invention peuvent alors constituer un systeme de vectorisation de Z. Ainsi, les polymeres de 1'invention sont utiles pour vehiculer un agent actif Z, comme un facteur de croissance ou une enzyme, au niveau de tissus leses ou souffrant definis plus loin dans le cadre des applications des polymeres de 1'invention.

Les polymeres dans lesquels les groupes R de X et Y ou les groupements Z sont susceptibles d'induire directement ou apres degradation des effets toxiques n'entrent pas dans le cadre de la presente invention. On peut citer parmi les groupements Z exclus de 1'invention, ceux qui constituent des agents mutagenes ou connus pour etre carcinogenes ou ayant d'autres toxicites. Ceci est le cas de la benzylamine qui peut etre relarguee a partir du groupement benzylamide

contenu dans le CMDBS et dont les proprietes carcinogenes sont bien connues de 1'homme de 1'art (Wiessler M, et al. , Carcinogenesis. 1983 ; 4 (7) : 867-871 ; Singer GM, et al. , J Med. Chem. 1983 ; 26 (3) : 309-312). En consequence, le CMDBS est exclu des polymeres de 1'invention.

L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques ou de diagnostic contenant au moins un polymere defini ci-dessus associe dans ladite composition avec un vehicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions sont utilisables chez 1'homme comme chez 1'animal. En effet, comme les HBGFPP decrits dans 1'art anterieur, les polymeres de 1'invention presentent les proprietes suivantes : - Ils sont depourvus d'activite anticoagulante significative, ce qui signifie qu'ils presentent une activite inferieure a 50 UI/milligramme comparee a celle de 1'heparine dont 1'activite est de 1'ordre de 150 a 170 UI/milligramme.

- Ils stabilisent et potentialisent les facteurs de croissance presentant une affinite pour 1'heparine et en particulier a titre d'exemple le FGF1 et/ou le FGF2 et le TGF P.

Ils protegent ces facteurs contre des agents proteolytiques comme la trypsine.

- Ils inhibent les activites proteasiques impliquees dans le processus inflammatoire comme par exemple elastase leucocytaire ou la plasmine.

- Ils exercent un effet cicatrisant dans au moins les modeles presentes dans les brevets suscites, sur les muscles, les nerfs ou le tractus digestif.

Les polymeres de 1'invention constituent donc une nouvelle classe d'agents favorisant la reparation des tissus musculaires, nerveux et du tractus digestif et presentant, comme cela est rapporte dans le

brevet US No. 5 693 625 a propos du CMDBS, des proprietes sur la cicatrisation cutanee et de la cornee ou sur 1'os plat tel que decrit par Blanquaert F, et al.

(Bone, 1995 ; 17 (6) : 499-506). Mais, les polymeres de 1'invention presentent aussi des proprietes inattendues par rapport au CMDBS. On peut citer a titre d'exemple, 1'effet du CMDBS sur la reparation des defauts osseux dans le crane (Blanquaert F, et al. , Bone, 1995 ; 17 (6) : 499-506) ), qui a priori, n'etait pas transposable sur 1'os long. L'os plat et 1'os long sont de nature totalement differente car : - Ils sont d'origine embryologique differente. L'os plat est un derive des cellules du tissu conjonctif alors que 1'os long derive des cellules cartilagineuses.

- L'os plat est un os spongieux et ne contient pas de canal medullaire par opposition a 1'os long.

- L'os plat ne cicatrise pas naturellement lorsqu'il y a une perte de substance comme lors d'une trepanation comme le montre 1'absence de cicatrisation sur des cranes provenant de civilisations prehistoriques comme les Incas ou les Egyptiens (voir par exemple Evidence for stone age cranial surgery, 7000 BC, Nature, 1997,367, 360). Or, de maniere surprenante, les polymeres de 1'invention presentent des effets sur la reparation de défauts osseux tres importants, de 1'ordre du tiers de la longueur de la diaphyse d'un femur de rat. Il a ete observe non seulement une réparation avec la reformation d'un fut osseux mais aussi que celui ci etait rempli de moelle osseuse, c'est a dire que le traitement par le RGTA a conduit a la reformation d'un veritable canal medullaire alors qu'en 1'absence de RGTA le défaut est simplement comble de matériel osseux desorganise. Il en est de même des incisions cutanees

car cette reparation est d'une telle qualite qu'il n'y a pratiquement plus la trace d'une cicatrice.

L'invention se rapporte donc tout particulierement aux polymeres biocompatibles de formules (I) ou (II) decrits precedemment depourvus d'activite anti-coagulante significative. Ces polymeres presentent une activite anti-coagulante inferieure a 10 UI/mg a des doses uniques ou hebdomadaires comprises : - entre 0, 001 mg et 1 mg par cm3 lorsque 1'application est locale, - entre 0,1 mg/kg et 100 mg/kg lorsque 1'administration est effectuee par voie systemique, par exemple intraveineuse, - entre 0,2 mg/kg et 500 mg/kg lorsque 1'administration est effectuee par voie intramusculaire, - entre 0,1 mg/kg a 5 g/kg pour une administration per os.

L'activite anti-coagulante des polymeres de 1'invention aux dose indiquees ci-dessus est, pour un homme de 70 kg, inferieure a : - 10 UI pour une application locale, - 100 UI pour une application intraveineuse, - 500 UI pour une application intramusculaire.

De façon remarquables, les polymeres de 1'invention sont depourvus d'activite anti-coagulante significative aux dose ci-dessus, mais presentent la capacite de preserver et/ou de restaurer l'homéostasie tissulaire. L'invention se rapporte donc tout particulierement a 1'utilisation des polymeres ci-dessus pour la preparation d'un medicament utile pour la prevention ou le traitement des dysfonctionnements de 1'homeostasie tissulaire et ne presentant pas d'activite anti-coagulante significative.

De maniere tout aussi surprenante, les Inventeurs ont mis en evidence que les polymeres de 1'invention peuvent etre administres par des voies autres que celles decrites dans 1'art anterieur pour les CMDBS qui n'envisageait qu'une administration locale, au niveau du tissu lese. Ainsi, il est possible de choisir parmi les polymeres de 1'invention ceux qui sont appropries, par exemple du fait leur solubilite, au mode d'administration choisi intra veineuse, intra arterielle, intra musculaire, intra peritoneenne, intra oculaire, dans le liquide cephalorachidien ou directement dans le système nerveux central de faucon a s'affranchir de la barriere hematoencephalique ou encore par voie orale ; toutes ces voies d'administration, eventuellement meme combinees, se sont revelees particulierement efficaces.

L'invention se rapporte donc a toute composition pharmaceutique dans laquelle le polymère de 1'invention est associe a un vehicule pharmaceutique sous une forme permettant 1'administration per os, per cutanee, sous cutanee, topique, intramusculaire, intraveineuse ou intra arterielle ou dans tous les compartiments liquidiens de 1'organisme. Les travaux menes dans le cadre de la presente invention ont permis de mettre en evidence que les RGTA agissent plus particulierement dans des fenetres de doses en dehors desquelles des effets biologiques toujours satisfaisants ne sont pas obtenus. Selon les voies d'administration et le type de lesion, les doses efficaces optimales sont celles definies ci-dessous.

Avantageusement, de maniere a recouvrir toute la surface d'une plaie ou a remplir le volume d'une lesion tissulaire, les compositions pharmaceutiques de 1'invention sont dosees de faucon a permettre une administration de 0, 001 a 1 milligramme de polymere par centimetre carre ou de 0, 005 a

1 milligramme de polymere par centimetre cube de tissu a traiter. Ainsi, les composition de 1'invention contiennent de preference entre 0, 01 et 10 milligramme de polymere par millilitre de solution physiologique de dissolution.

Pour une administration par voie systemique (veineuse, arterielle), par voie intra-peritoneale, intra oculaire, dans le liquide cephalorachidien, dans le liquide intracochleaire ou dans tous fluides peri ou intra tissulaires, les compositions de 1'invention sont dosees de faucon a permettre une administration de 0, 1 et 100 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter.

Pour une administration par voie intramusculaire, les compositions de 1'invention sont dosees de faucon a permettre une administration comprises entre 0, 2 et 500 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal a traiter, et de preference entre 1 et 50 mg par kg.

Pour une administration per os, les compositions de 1'invention sont dosees de faucon a permettre une administration comprise entre 1 et 5000 milligrammes de polymere par kilogramme de poids d'homme ou d'animal a traiter, et de preference entre 10 et 500 mg par kg.

Outre, les propriétés des HBGFPP rapportées precedemment, a savoir qu'ils presentent une activite cicatrisante et reparatrice sur les tissus musculaires, nerveux et sur ceux du tractus digestif et qu'ils peuvent etre utilises comme medicament pour le traitement des inflammations, les Inventeurs ont mis en evidence les effets remarquables des polymeres de 1'invention sur la regulation de 1'homeostasie de la masse et de la fonctionnalite des tissus et des organes, en montrant qu'ils agissent sur la regeneration, la protection, la preservation et le vieillissement

tissulaire et cellulaire in vivo et ex vivo, ainsi que des activites antifibrotiques et protectrices contre les effets deleteres des ischemies, des radiations ionisantes et des produits oxydants induits lors de pathologies ou de stress ou encore apportes dans 1'alimentation. En consequence, les RGTA doivent etre consideres comme des regulateurs de 1'homeostasie tissulaire en ce qu'ils regulent la masse des tissus regeneres et leur fonctionnalite et qu'ils agissent sur le remaniement matriciel en ce qu'ils exercent un effet antifibrotique et cicatriciel dans les tissus et organes soumis a des processus destructeurs aigus comme chroniques.

Ces proprietes des RGTA se caracterisent par des effets uniques sur la qualite et la vitesse des reparations tissulaires. Ces effets se traduisent par une reconstitution quasi complete et a 1'identique de la structure tissulaire d'origine (avant lesion) et par 1'absence presque totale de traces cicatricielles comme en particulier de signes de fibrose ou de perte de son integrite fonctionnelle. Plus particulierement, les travaux de recherche rapportes plus loin dans la partie experimentale ont mis en evidence les proprietes de protection et de regeneration tissulaire in vivo des RGTA dans les modeles suivants : - lesion de plaies cutanees, - regeneration de tissus osseux comme les os longs avec 1'exemple du femur, - protection contre la perte de tissu osseux et de regulation de son remaniement dans un modele de parodontie chronique, - protection contre les effets deleteres des rayonnements ionisants, - protection contre les effets deleteres des ischemies quelque soit leur localisation.

Ainsi, les proprietes ci-dessous des polymeres de 1'invention ont plus particulierement ete mises en évidence.

- Un effet protecteur contre les effets deleteres lies au stress oxydatif et aux agents oxydants. Les polymeres de 1'invention agissent en particulier comme des agents protecteurs et potentialisateurs d'enzymes comme la super oxyde dismutase ou SOD. Cette propriete permet d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des lésions et souffrances induites par un stress oxydatif et les agents oxydants. Mais cette propriete permet egalement d'utiliser les polymeres de l'invention seul ou en association avec un autre compose comme agent de preservation d'aliments ou de nutriments contenant naturellement des antioxydants ou auxquels ont ete ajoutes des agents antioxydants comme la SOD animale ou vegetale.

- Un effet de preservation et de protection contre les ischemies. Cette propriete permet d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des pathologies associees a une hypoxie, a une degenerescence cellulaire comme les neuropathies, les myopathies, les hepatopathies, les nephropathies, les cardiopathies, etc.. et aux peroxydations des molecules comme les lipides. Cette propriete permet egalement d'utiliser les polymeres de 1'invention dans des compositions de preservation de la fonctionnalite des tissus et organes plus particulierement en vue de leur conservation, des transports d'organes ex vivo, des transplantations d'organes, de leurs greffes comme de celles de protheses.

- Une activite inhibitrice des enzymes de la famille des calpaines. Cette propriete permet

d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des maladies cardiaques et nerveuses.

- Une activite inhibitrice des enzymes de degradation de 1'heparine ou des heparanes sulfates comme 1'heparinase ou 1'heparitinase. Cette propriete permet d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des maladies associees a une croissance anarchique des cellules et aux processus pathologiques en relation avec une angiogenese.

- Une activite de protection des cellules contre les effets des radiations ionisantes et de regulation tant quantitative que qualitative des constituants de la matrice cellulaire comme par exemple les collagenes, permettant d'augmenter la survie et le fonctionnement des cellules. Cette activite permet d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des effets deleteres des radiations ionisantes ainsi que 1'utilisation de ces polymeres dans la preparation de produit cosmetologiques.

- Une activite d'agent anti-fibrotique qui se manifeste in vitro et in vivo par des effets regulateurs sur la proliferation des cellules mesenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hepatiques et la qualite du type de collagene qu'elles secretent, ainsi qu'une activite sur la qualite phenotypique des collagenes synthetises par ces cellules et par la reduction notable des sequelles cicatricielles fibrotiques. Cette activite permet d'envisager 1'utilisation des polymeres de 1'invention pour la preparation d'un medicament destine au traitement et/ou a la prevention des pathologies pulmonaires renales, hepatiques, cardiaques, vasculaires, dermatologiques, des greffes et de leur integration fonctionnelle, des derives multiples liees aux parasistismes.

Ainsi, d'une maniere inattendue, les inventeurs ont decouvert que les RGTA presentaient la capacite de : proteger, stabiliser les activites enzymatiques de la Super Oxyde Dismutase ou SOD.

- potentialiser les activites enzymatiques de la Super Oxyde Dismutase ou SOD Cet enzyme peut done etre protegee soit in situ et in vivo soit ex vivo. Les RGTA peuvent donc être utilises seuls comme agents protecteurs de la SOD endogene et a ce titre proteger celle ci dans toutes ses fonctions ou en association avec la SOD dans les indications connues de 1'homme de 1'art dans le domaine therapeutique ou cosmetique. Ils agissent, par cette propriete, egalement comme preservateurs d'aliments ou de nutriants ou nutriments.

Les RGTA agissent donc comme des agents protecteurs et reparateurs des effets deleteres associes au stress tissulaire. Ainsi, lors d'une ischemie quelqu'en soit 1'origine, ou lors de la reponse a une agression cellulaire ou tissulaire par exemple sous 1'effet de rayonnement ionisants ou en reponse a une invasion par un agent pathogene, de quelque nature qu'il soit viral, microbien, parasitaire ou memo provoquant des pathologies de type ESST (Encephalopathies spongifonnes subaigue transmissible) comme celle provoquee par le prion, ou encore lors de rupture vasculaire provoquant des hemorragies dont les effets sont nocifs en provoquant des pertes fonctionnelles, par exemple dans le cas d'hemoragies des vaisseaux retiniens

qui pouvent conduire a la cecite ou dans le cerveau a des pertes de fonctions motrices ou autres.

En consequence, 1'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un RGTA tant dans des domaines d'applications chez 1'homme que chez 1'animal. Ces compositions sont benefiques tant dans les domaines medicales, veterinaires et cosmetologiques que dans les domaines alimentaires comme des agents de preservation d'aliments ou de nutriments contenant naturellement des antioxydants ou auxquels ont ete ajoutes des agents antioxydants comme de la SOD animale ou vegetale.

Les qualites protectices de la SOD endogene ou apporte d'une maniere exogene sont renforcees par les RGTA. Ainsi, les RGTA peuvent etre administres dans tous les cas ou 1'effet benefique de la SOD a ete decrit.

Pour le traitement de maladies dans lesquelles la SOD en apport exogene a ete montree comme efficace, 1'effet therapeutique resultant d'une action protectrice de la SOD endogene peut alors agir plus efficacement en presence de RGTA. Les RGTA limitent ou evitent des apports exogenes en agissant indirectement comme agents anti oxidants. Us resultent de ces proprietes les effets therapeutiques suivants : - Une protection contre les agressions la souffrance ou la degenerescence des tissus nerveux. Par exemple, dans le stress (Shahen et col., Effects of various stressors on the level of lipid peroxide antioxidants and Na+, K+ - ATPases activity in brain, Experentia, 1996,52, 336-339) ou encore dans la degenerescence neuronale et les maladies neurodegeneratives associes aux accidents vasculaires, traumatiques, ou a des pathologies comme le Parkinson, dans lesquelles les activites de protection de la SOD endogene permettent une lutte plus efficace (Bostantjopoulos et col. , Super oxide dismutase activity in early and advanced Parkinson's Disease, Funct.

Neurol. , 1997,12, 63-68).

- Le vieillissement par un effet anti- apotose (Fernandez Novoa et coll., Methods Find Exper Clin Pharmacol, 1997,9, 99-106).

- Une protection antioxydante dans les ischemies des membres. Dans cette application le RGTA peut etre administre seul. La protection assuree par un traitement avec la SOD seule serait bien evidemment renforce par 1'administration de RGTA. Il apparait au vue des proprietes decrites que les RGTA seraient benefiques administres seuls et/ou en association avec la SOD dans les nombreuses applications decrivant les effets de la SOD (D'Agnillo et Chang, Reduction of hydroxyl radical generation in a rat hindlimb model of ischemia - reperfusion injury using cross linked hemoglobin - superoxide dismutase - catalase, Artif.

Cells Blood Subsiti Immobil Biotechnol, 1997,25, 163- 80).

- L'administration de RGTA seuls ou en association avec de la SOD sera benefique centre les souffrances du coeur, du cerveau, du système nerveux central comme dans le cas des lesions de la moelle epiniere (Nakauchi et col. , Effects of lecithinized super oxide dismutase on rat spinal cord injury, J.

Neurotrauma, 1996,13, 573-82) ou encore de la retine.

- Dans le traitement des insuffisances respiratoires associées à la fatigue du diaphragme (Supinski et col. , Effect of free radical scavengers on diaphragmeatic fatigue, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997,155, 622). Ceci pourrait-etre notamment interessant chez les malades atteints de dystrophie musculaires.

- Tous les tissus notamment ceux pour lesquels le taux de SOD active endogene est plus eleve (cellules endotheliales vasculaires, dans le foie, le rein, le muscle cardiac et squelettique, le pancréas, les cellules epitheliales des muqueuses de 1'intestin, du colon, de la trachee, de 1'oesophage, des tissus conjonctifs, du cartilage).

- Le traitement des effets deleteres associes au diabete comme dans les retinopathies diabetiques (Szabo et col. , Direct measurement of free radicals in ischemic/reperfused diabetic rat retina, Clin. Neurosci. , 1997,4, 240-5).

- Le traitement des lepreux (Serum, zinc, copper, magnesium, proteins and super oxide dismutase in leprosy patients on multidrug therapy-a follow up study, Indian J. Lepr. 1996,68, 325-33).

- Dans le traitement du choc endotoxique (Hepatic response to the oxydative stress induced by E. Coli endotoxin, Mol. Cell. Biochem. 1996,159, 115- 121).

- Dans le traitement des lesions induites par le stress cause par la presence d'agents pathogenes de toute nature, comme notamment les Virus dont le virus du sida ou les agents induisant des pathologies ESTT tels le prion.

- Dans le traitement preventif et/ou curatif contre les irradiations. Ainsi les effets adverses de la radiotherapie peuvent etre reduits par un traitement preventif et/ou curatif de RGTA. L'utilisation des RGTA permet de reduire la dose de radiotherapie dans les conditions de traitement des cancers (Prevention of radioinduced cystisi by orgotein; a random ranomized study, Anticancer Res. , 1996,16, 2025-8) ou de prevenir les effets clastogeniques induits par 1'irradiation. Les effets d'hyperthermie associes a la radiotherapie peuvent être diminués par 1'utilisation de RGTA de la meme maniere que la SOD (Kandasamy et col., Involvement of superoxide dismutase and gluthatione peroxidase in attenuation of radiation-induced hyperthermia by interleukin 1 alpha in rats, Brain res. , 1993,606, 106- 10).

- Dans la protection contre les effets induits par les rayons ultraviolets, par exemple sur la retine. (Oguni et coll. , Chronical retinal effects by ultraviolet irradiation with special reference to superoxide dismutase, Histol. Histopathol, 1996,11, 695-702), et le traitement des Uvéites (Koch et coll., Effects of different antioxidants on lens-induced uveitis, Ger. J. Ophthalmol. , 1996 5 ; 1185-8). Le traitement par le RGTA peut être envisagé seul ou en association avec la SOD et son utilisation peut etre aussi bien medicale que cosmetologique.

- Dans le traitement de 1'hypertension. En effet, l'activité de la SOD endogene est diminuee chez les sujets hypertendus (Jun Ke yan et Catalano, Increase superoxide anion production in humans, a possible mechanism for the pathogenesis of hypertension, J. Hum.

Hypertens, 1996,10, 305-309). Un apport de RGTA aura pour effet d'augmenter cette activite et de reduire 1'hypertension.

- Dans le traitement des maladies inflammatoires comme 1'arthrite.

Les RGTA sont utiles egalement pour la conservation des organes ou tissus ainsi que dans le maintien des fluides biologiques ce qui permet d'envisager les applications suivantes : - Dans les fluides biologiques comme le sang et ses constituants cellulaires, par exemple en hemodialyse.

- Pour la preservation des organes, dans le cas de greffes ou de traitements ex vivo ou en reperfusion (Razak et col. , Crosslinked hemoglobine- superoxide dismutase-catalase scavenges free radicals in

a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury, Artif. cells Blood substiti immobil. Biotechnol. 1997, 25,181-192). L'addition de RGTA a des solutions de conservation d'organes et administres en reperfusion permet une preservation de ces organes.

L'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un polymere defini precedemment et destine au traitement et/ou a la prevention des lesions et souffrances tissulaires, telles que celles rencontrees en traumatologie, necessitant des chirurgies reparatrices ou plastiques des planchers cutanes ou plus profonds comme ceux des muscles, des os, du cerveau, du coeur, des visceres, etc..., dans les maladies degeneratives associees ou non a des fibroses, dans les pertes de masse tissulaire comme 1'osteoporose ou les myopathies, dans les domaines cardio vasculaires, neurologiques, en dermatologie, etc....

Une propriete remarquable des RGTA est leur capacite a se fixer sur les tissus leses, ce qui permet d'utiliser les RGTA comme vecteur de ciblage dans un objectif therapeutique et/ou de diagnostic. En consequence, les polymeres de 1'invention peuvent etre couples a des molecules, represenfcees precedemment par le groupement Z, douees d'activites fcherapeutiques ou a des molecules permettant de faciliter le repérage du tissu lese.

D'autres avantages et caracteristiques de 1'invention apparaitront des exemples qui suivent concernant d'une part la preparation de polymeres de 1'invention dont le squelette polymerique est de type polyester ou de nature polysaccharidique, et d'autre part, les proprietes des polymeres de 1'invention.

A) PREPARATION DES POLYMERES DE L'INVENTION.

EXEMPLE 1 : Synthese de derives de poly (acide - ß- malique) à partir d'un squelette non polvsaccharidique.

Dans cet exemple, le polymère de 1'invention est un copolymere d'acides - ß - malique de formule générale (II) dont les motifs A, substitues par X et/ou Y et/ou Z sont representes a la figure 1. Dans la figure 1 : A est - (0-CH2-CH2-CO) - X est -COOH ou -COO-Na+ Y est -CO-CH2-CHOH-CH2-SO3H ou - CO-CH2-CHOH-CH2-S03-Na+ Z est -CO-OCH3-CH (CH2-CH3) -CH3 x, y et z, correspondant aux pourcentages des groupements X, Yet Z, indiques dans le tableau I ci- dessous en fonction des differents polymeres synthetises.

Tableau I Référence Type de Groupements Groupements Groupements polymère carboxyliques Soufres hydrophobes = X = Y = Z RGTA 2010 Pcoo- 100% 0% 0% RGTA 2011 P1S 60% 10% 10% RGTA 2012 P2S 75% 11% 12% Pcoo- correspond a un polymere ne comportant exclusivement que des groupements X carboxyliques ou carboxylates.

PIS et P2S correspondent a des polymeres comportant en plus des groupements X, des groupements Y sulfonates et des groupements hydrophobes butyles Z.

La synthese de ce polymere passe par la preparation de p-lactones P-substituees et est suivie d'une polymerisation anionique par ouverture de cycle.

Les trois p-lactones synthetisees sont representees a la figure 2 en annexe.

Les monomeres sont obtenus a partir de 1'acide DL-aspartique en quatre étapes avant la polymerisation comme montre a la figure 3 en annexe.

La synthese du malolactonate d'alkyle se fait a partir de 1'acide DL-aspartique ou R représente -CH2-C6H5 (malolactonate de benzyle) ou -CH(CH3)-CH2-CH3 (malolactonate de 2-butyle) ou encore -CH2-CH=CH2 (malolactonate d'allyle).

I - Svnthese des monomeres (voies de l'acide aspartique).

1) Synthese de 1'acide (2R, S) 2- bromosuccinique.

La synthese de 1'acide (2R, S) bromosuccinique est obtenue après une reaction de diazotation de 1'acide DL-aspartique. Pour cette réaction, le carbone portant le groupement amine subit une double inversion de configuration (Guerin efc coll. , Optically active poly(ß-malic acid), 1985, Polymer Bulletin, 14 : 187).

100 g (0, 75 moles) d'acide DL-aspartique et 415 g (4,04 moles; 5,5 éq.) de bromure de sodium sont dissous dans 1620 millilitres d'acide sulfurique 2N dans un bain de glace. 62 g (0,9 moles; 1,2 éq.) de nitrite de sodium sont additionnes par petites quantites, sous agitation. 30 minutes après la fin de cette addition, le milieu reactionnel est neutralise par 8 g (0, 13 moles ; 0, 18 eq.) d'uree pendant 30 minutes a temperature ambiante. L'acide bromosuccinique est extrait par 1 litre d'acetate d'ethyle et la phase aqueuse est lavée

avec 1 litre d'acetate d'ethyle. Les phases organiques sont sechees sur sulfate de magnesium, filtrees sur buchner puis 1'acetate d'ethyle est elimine au rotavapor.

L'acide bromosuccinique est alors recristallise 4 fois dans 1'acetonitrile, filtre sur buchner puis seche 4 h a 45°C sous vide dans un dessiccateur.

Caracteristiques : PM = 197 ; m = 52, 8 g ; Rendement de 36%; Tf=168°C; Aspect : poudre blanche 2) Svnthese des monoesters.

La synthese des monoesters passe par la preparation prealable de 1'anhydride sans racemisation des centres chiraux. L'anhydride est synthetise a partir de 1'acide (2R, S) 2-bromosuccinique sous 1'action d'un agent déshydratant, l'anhydride trifluoroacétique (TFAA) en conditions anhydres et sous azote. L'etape suivante est 1'ouverture de 1'anhydride par un alcool qui conduit a 2 monoesters dont un seul sera lactonisable. Le choix de 1'alcool est fait selon la nature de la lactone souhaitee. a) Synthese du bromosuccinate de benzyle.

50 g (0, 25 moles) d'acide bromosuccinique sont degazes sous courant d'azote pendant 2 h. Dans un bain de glace, 125 millilitres de tetrahydrofurane (THF) anhydre puis 43, 4 millilitres (0,30 moles; 1,2 éq.) d'anhydride trifluoroacetique (TFAA) sont ajoutes goutte a goutte par une ampoule a brome. La solution est laissée 2 h a temperature ambiante sous agitation, puis le THF, le TFA forme et le TFAA en exces sont éliminés au rotavapor. L'anhydride bromosuccinique obtenu est mis a degazer 2 h.

27, 7 millilitres (0,25 moles; 1 éq.) d'alcool benzylique sont ensuite ajoutes. La solution

est agitee a 40°C sous atmosphere inerte pendant 12 h. Le melange de monoesters ainsi obtenus est dissout dans 150 millilitres d'ether. La phase éthérée est lavée 3 fois avec 100 millilitres d'eau, séchée sur sulfate de magnesium et filtrée sur buchner.

Caracteristiques : PM = 287; m - 71, 3 g ; Rendement de 95%; Aspect. huile jaune pale b) Svnthese du bromosuccinate d'allvle.

Le même protocole que precedemment est mis en oeuvre, mais 17, 86 millilitres (0,25 moles; 1 éq.) d'alcool allylique sont ajoutes. Le milieu reactionnel est agite 22 h à 60°C sous atmosphere inerte au lieu de 12 h a 40°C. Les monoesters sont purifies de facon identique.

Caracteristiques : PM = 237 ; m - 17, 6 g ; Rendement de 72,8%; Aspect : huile visqueuse c) Svnthese du bromosuccinate de 2-butyle.

Meme protocole que ci-dessus en 2) b) mais avec 18, 8 g (1 eq.) de (RS)-2-butanol préalablement distille. Le milieu reactionnel est agite pendant 12 heures à 60°C sous atmosphere inerte.

Caractéristiques : PM = 253; m = 45 g ; Rendement de 90% ; Aspect : huile jaune orangée 3) Svnthese des lactones.

La reaction de lactonisation a lieu sur le seul monoester lactonisable et presente une inversion de configuration. Elle est effectuée directement sur le melange de monoesters après neutralisation a pH 7, 2 par de la soude 2N. La reaction a lieu dans un milieu biphasique dichloromethane/eau. La lactone est purifiée par chromatographie sur colonne de silice. La nature de 1'eluant est différent selon la nature de la lactone.

Cette lactone est ensuite distillee sur une colonne appropriee. a) Synthese du malolactonate de benzyle.

71 g (dont 70% de monoester lactonisable soit 0, 173 moles) de melange de monoesters sont dissous dans 300 millilitres d'ether et 250 millilitres d'eau dans un ballon. Une solution d'hydroxyde de sodium 2N est ajoutée goutte a goutte jusqu'a pH 7, 2, puis 450 millilitres de dichloromethane sont additionnes. Le ballon est surmonte d'un systeme refrigerant et le systeme biphasique est fortement agite pendant 3 h a 40°C.

Apres decantation, la phase organique est lavée 2 fois avec 250 millilitres d'eau puis 2 fois avec 250 millilitres de saumure, séchée sur sulfate de magnesium et filtrée. Le solvant est elimine au rotavapor. Cette lactone est purifiee sur colonne de silice (6luant : dichlorom6thane/6ther de petrole 8/2) et distillée 3 fois sous vide.

Caractéristiques : PM=206; m=20,7 g avant purification soit un rdt =40,5% ; m=3,41 g après purification soit un rdt=6,7%; Te=116-118°C sous 3. 10-2 mbars ; IR (n, cm-l) n(COlactone)=1825cm-1; n (Coester) =1740cm-1 ; Aspect : huile incolore. b) Synthese du malolactonate d'allyle.

Selon le memo protocole que ci-dessus en 3) a) mais le pH de la phase aqueuse est de 7, 8 au lieu de 7,2 et la solution est agitée 5 h au lieu de 3 h. La lactone est purifiee sur colonne de silice (eluant : ether de petrole/ether ethylique 4/6) et est distillée 3 fois sous vide.

Caracteristiques : PM = 156 m = 15, 3 g avant purification soit un rendement de 53, 4% ; m=4 g apres purification soit un rdt=13%; Te = 62-65°C sous 3. 10-2

mbars ; IR (n, cm-1): n(CO lactone)-1825cm-1 ; n(CO ester) = 1740cm-1; Aspect : liquide incolore. c) Svnthese du malolactonate de 2-butvle.

Selon le même protocole que ci-dessus en 3) a). La lactone est purifiee sur colonne de silice (6luant : dichlorom6thane/6ther de petrole 8/2) et est distillee 3 fois sous vide.

Caracteristiques : PM = 172 ; m = 26,7 g avant purification soit un Rendement de 55% ; m = 14, 4 g apres purification soit un Rendement de 28% ; Te = 80- 82°C sous 3.10-2 mbars; IR (n, cm-1) : n(CO lactone)=1825cm-1; n(CO ester)= 1740cm-1; Aspect : huile visqueuse incolore.

II - SYnthèse des polvmeres.

Les lactones ont ete polymerisees en presence de benzoate de fcetramefchyl ammonium (10-3 eq.) à 37°C pendant 15 jours. Le suivi de la polymerisation a ete fait par analyse infrarouge en observant la disparition de la bande lactonique a 1850 cm~l.

1) Svnthese du idolv (malate de benzvle-co- malate de butyle-co-malate d'allyle).

5 g (24, 2 mmoles) de malolactonate de benzyle, 1, 4 g (9, 3 mmoles) de malolactonate d'allyle et 0, 7 g (4, 1 mmoles) de malolactonate de butyle sont dégazés pendant 2 h et transférés par canule dans un ballon contenant 471 millilitres d'une solution d'amorceur (benzoate de tétraéthylammonium:10-3 éq.; 37,72.10-6 moles) a 80. 10-3 M, prealablement degazee 2 h sous courant d'azote. La copolymerisation est conduite a 37°C pendant 15 jours sous atmosphere inerte et sous agitation. Le polymere est alors dissous dans un minimum

de chloroforme. Les chaines sont terminees par addition d'une goutte d'acide chlorhydrique concentre et le polymere est precipite a 1'ethanol puis seche sous vide à 40°C pendant 48h.

Caracteristiques : m = 4, 37 g ; Rendement de 61,5%; Tv = -5°C; IR (n, cm-1): n (C=O)=1748 cm-1; SEC (THF, standards polystyrene) : ; Mn = 6600 ; Mw = 9200 ; Ip = 1, 4 ; MSEC = 10000 ; S 134 (CH=); 168 (C=0 chaine laterale) ; 170 C=0 chaine principale) ; Aspect : polymere vitreux transparent 2) Epoxydation du poly (malate de benzyle-co- malate de butyle-co-malate d'allyle).

1, 12 g (7, 91 mmoles d'unites insaturees) de polymere sont dissous dans 3 millilitres de dichloromethane anhydre dans un ballon. Une solution contenant 466, 34 milligrammes (4, 69 mmoles ; 6 eq.) d'acide metachloroperbenzoique (MCPBA) dans 2 millilitres de dichloromethane est ajoutée par canule.

Le melange est agité 24 heures a temperature ambiante, puis est filtre. Le polymere est alors precipite a 1'ethanol et seche dans un dessicateur sous vide.

Caractéristiques: m = 4 g ; Rendement de precipitation de 92% ; Rendement de la reaction d'epoxydation = 100% ; La masse molaire ne varie pas lors de 1'epoxydation car le MCPBA n'induit pas une modification de la longueur de la chaine.

3) Hydrogenolyse du poly(malate de benzyle- co-malate de butyle-co-malate d'allyle).

4 g du polymere sont dissous dans 5 millilitres de dioxanne fraîchement distillé sur sodium dans un ballon. 800 milligrammes (20% en poids) de palladium sur charbon actif sont ajoutes et 1'hydrogenolyse est mise en route. Quand le volume

d'hydrogene consomme n'augmente plus (24 h après le debut de la reaction), 1'hydrogenolyse est arretee. La solution est filtree sur célite et le dioxanne est elimine au rotavapor.

Caracteristiques : m - 2 g ; Rendement d'hydrogenolyse de 100% ; 4) Sulfonation du poly (malate de benzyle-co- malate de butyle-co-malate d'allyle).

4 g de polymere (soit 5, 64. 10-3 moles d'epoxyde) sont dissous dans 20 millilitres d'eau. 2, 14 g de bisulfite de sodium (2 éq., 11,28.10-3 moles) sont ajoutes. Le pH de la solution est ajuste a 7, 4 (Housse- Ferrari,"Preparation et caractérisation de silices poreuses modifiees par des polymeres et des copolymeres de N,N' dimethylacrymide", Thèse de 1'universite Paris VI, 30 janvier 1990). La solution est laissée sous agitation pendant 7 h dans la glace puis est ultrafiltree 24 h A 4'C contre de 1'eau et lyophilisee.

La figure 4 en annexe récapitule les étapes de synthese des dérivés du poly (acide - P- malique).

EXEMPLE 2 : Synthese de polymeres polvsaccharidiques constifcues de motifs de alucoses substitues.

I - Synthese de Carboxymethvlesulfates de Dextran designs CMDS.

Dans cet exemple, le polymere de 1'invention est constitue de dextrane substitue dont les motifs de glucose A substitues par X et/ou Y et ou Z est rien sont representes dans la figure 5 en annexe. Les différents types de greffage sont representes a la figure 5, dans laquelle :

A est un monomere de glucose sur lequel les X, Y et Z sont greffes par 1'intermediaire des fonctions hydroxyles en position 2 et/ou position 3 et/ou position 4 et/ou par 1'intermediaire des groupements X pour Y et/ou Z, et/ou par 1'intermediaire des groupements Y pour Z, X est -CH2COOH ou -CH2COO-Na+ Y est -SO3H ou SO3-Na+ Z est un groupement variable dont quelques exemples sont rapportes plus loin.

Les polymeres de type CMDS dans lesquels Z = rien contiennent plusieurs types de monomeres. Les premiers types de monomeres substitues sont des carboxymethyl glucose de type A-X substitues en position 2 et/ou 3 et/ou 4 (motifs presentes figure 5).

L'addition du groupement Y = (motifs A-Y representes a la figure 5) correspond a une 0-sulfatation et devient, avec R = rien et R'= H+ ou Na+ Y = 0-S03- H+/Na+. Si Y est fixe sur X, R de Y devient CH2-CO et la fonctionnalite de X (COO~) perdue, n'est plus consideree comme existant. Elle devient alors partie de Y et rentre dans la mesure des pourcentages de substitution des groupements actifs Y.

Les differents monomeres consfcituants Ie polymere CMDS sont donc soit du glucose non substitue, soit du carboxymethyl glucose soit du glucose sulfate soit du carboxymefchyl glucose sulfate. Les differentes formes isomeriques sont schematisees figure 5. Les polymeres corespondent donc a toutes les combinaisons possibles de ces differentes formes monomeriques et se definissent par les taux residuels de groupements X et Y libres.

Les monomeres ainsi obtenus sont soit du glucose sulfate en position 2,3 et/ou 4 et/ou du

carboxymethyl glucose sulfate. Le sulfate est fixe soit sur le glucose soit sur le groupe carboxylique.

Ainsi, dans la figure 5, dans laquelle les liaisons des groupements schematises par un pointille representent des monomeres ou toutes les combinaisons circulaires peuvent etre envisagees.

1) Svnthese de dextrane carboxymethvl sulfate designe CMnDSm. a) Carboxvmethylation.

La première étape de carboxymethylation du dextran est realisee selon le protocole decrit dans Mauzac et collaborateurs (Mauzac et coll. , Anticoagulant activities of dextran derivatives Part I : Synthesis and characterization, 1984, Biomaterials 6/61-63). II s'agit d'une etherification des fonctions hydroxyles des résidus glucose du dextran en vue de 1'obtention d'un carboxymethyldextran. Cette réaction peut être reproduite plusieurs fois et conduit a des produits denommes CMnD ou n représente le nombre d'etapes de carboxymethylation. Les différents produits appeles CMnD se caracterisent par un % de COOH croissant. Ce procédé permet donc d'obtenir différents taux de carboxymethylation du dextrane comme indique dans le tableau de la figure 6.

Ainsi, dans un ballon refrigere de 250 millilitres, du Dextran T40 (37, 37 g, 9, 34 10-4 mol), provenant de la societe Sigma et de poids moleculaire 40 000 D, est solubilise (182 millilitres d'eau distillee) a 4°C. Une solution de soude (74 g, 1, 85 mol dans 124 millilitres d'eau distillee), egalement refroidie a 4°C, est versée lentement dans la solution de Dextran tout en maintenant la temperature de 4°C constante. De 1'acide monochloroacefcique (76, 2 g, 0, 806 mol) réduit en fine poudre, est additionne lentement en maintenant la memo temperature de reaction. Cependant la temperature du

milieu s'eleve en fin de reaction de 4'°C a 21°C en quelques minutes. Le melange est ensuite amene a 50°C dans un bain d'huile thermostate pendant 40 mn. Pendant le chauffage, le milieu reactionnel acquiert une coloration jaune. Apres refroidissement, le pH est neutralise a 7, 2 avec de 1'acide acetique glacial.

(Takakura, 1990). Le carboxymethyldextran est recueilli par precipitation dans de 1'ethanol absolu froid (5 a 6 fois le volume reactionnel). Il est, ensuite, seche dans une étuve à vide. Le polymère CM1D est purifie par ultrafiltration puis lyophilise (masse = 56 g brut).

La presence des ions carboxyliques est quantifiee par dosage acido-basique en retour avec 1'utilisation de 1'acide nitrique. La base utilisée est la soude 1 N. Le résultat s'exprime en % de groupements COOH. % COOH du CM1D = 48,98% Ce pourcentage signifie que statistiquement environ une unité glucose sur deux a efce carboxymethylee.

En pratique, cette reaction peut être réalisée plusieurs fois pour atteindre les taux de substitution souhaites. Ainsi, le même protocole a ete applique pour la synthese d'un CM2D a partir du CM1D et d'un CM3D a partir du CM2D: % COOH du CM2D = 91, 8 % et % COOH du CM3D = 118, 3 %. b) Sulfatation.

La reaction de sulfatation des fonctions hydroxyles residuelles apres les étapes de carboxymethylation est effectuée avec de 1'acide chlorosulfonique. Elle aboutit a des composes denommes CMnDSm donnes dans le tableau de la figure 6 en annexe, ou m correspond a des equivalents d'acide chlorosulfonique tels que définis dans 1'exemple ci- dessous.

Exemple de sulfatation du CM1D :

500 milligrammes (PM=7,8 mmol/g) du carboxymethylldextran (CM1D) sont disperses dans 40 millilitres de dichloromethane sec). Le nombre de residus hydroxyles restes libres et susceptibles de reagir dans une reaction de sulfatation est de nOH = 4.10-3 mole. La reaction a ete realisee en presence d'un equivalent d'acide chlorosulfonique (nClSO3H = 4. 10-3 mole) soit approximativement = 0,5g ou un volume de 0, 3 millilitres, la densite de la solution d'acide chlorosulfonique etant de 1, 75). Les 0, 3 millilitres d'acide chlorosulfonique sont dilues dans 4 millilitres de dichloromethane deshydrate. Le CMiDS1 ainsi obtenu est recupere par filtration du milieu réactionnel sous vide sur frite.

La meme reaction peut etre realisee en presence de 0, 5 ou 1, 5 ou 2 ou 3 equivalents d'acide chlorosulfonique ou d'un exces de facon a greffer des quantites croissantes de groupements 0-sulfates. Les polymeres RGTA ainsi obtenus sont appeles CMnDSm, avec n = 1, 2, etc... et m = 0. 5, 1,2, etc....

Sur le meme principe et en vue de comparer ces polymeres a d'autres molecules sulfafcees, nous avons considere comme produits de comparaison avec les CMnDSm soit des dextranes sulfates du commerce (produit Pharmacia Biotech, code 17-0270-01), soit des dextranes sulfates a partir de dextran T40 en presence de m equivalents d'acide chlorosulfonique, c'est a dire dans des conditions reactionnelles comparables a celles permettant d'obtenir les CMnDSm.

Les resultats de différents dosages des groupements X par titration et Y par analyse elementaire du taux d'atome de soufre permettent de preciser les valeurs correspondantes x et y pour chacun des composes synthetises CMnDSm. L'ensemble de ces données est rapporte dans le tableau de la figure 6 en annexe. Cette figure precise par ailleurs ce pourcentage pour du

sulfate de dextrane commercial et pour les dextranes sulfates dans les mêmes conditions que les CMnDSm 2) Svnthese des polvmeres de dextran carboxymethyle-phenyl sulfonate note CM2DPhS et d'un derive Dextran carboxymethyl sulfate phenyl sulfonate desiqne CM2DPhSS.

Ces polymeres sont constitues d'un enchainement de motifs representes a la figure 7 en annexe, et correspondent a ceux de la figure 4 ou Z n'etait rien. Ces polymeres sont constitues d'un enchainement de motifs de type A-X, A-Y et A-Z tels que representes a la figure 6.

Dans cet exemple, le groupement Z est du phenyl sulfonate note PhS. La figure 7 représente un monomere A-Z dans le cas ou Z a ete additionne sur un radical carboxyl greffe en position 2 du glucose d'origine, lui meme sulfate en position 3 et 4.

Le polymere CM2D (2 g ; 3, 90 mmol) est dissous dans 13 millilitres d'eau distillee. Le pH de la solution est a juste a 3, 5 avec de l'HCl 3 M. L'agent couplant EEDQ (1, 93 g, 2 equi.) est dissous dans 16 millilitres d'ethanol (0, 12 g d'EEDQ/millilitre) a 40°C. La solution d'EEDQ est ajoutée progressivement au polymere et le melange reactionnel est agite fortement pendant 30 min. Le sel d'acide phenylsulfanilique (NH2PhSO3Na, 3,045 g, 2qui) est ensuite ajoute par petites quantites. Le pH de la reaction est ajusté à 9 avec de la soude. Le melange est agite a temperature ambiante pendant 4 heures, puis neutralise avec HCl dilue. Le produit CM2DPhS est alors ultrafiltre, evapore sous vide puis lyophilise (1, 66 g).

Les analyses elementaires et acide-bas du CM2DPhS donnent : % C = 33,9; % H = 5, 28 ; % N = 0, 3 ; % S = 0, 67 ; % COOH = 81 %

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymère CM2DPhSS*l donnent % C = 23, 16 ; % H = 3,72; % N = 0, 27 ; % S = 9, 60 ; % COOH = 52 % 3) Svnthese d'un derive Carboxymethyl Dextran N et 0 Sulfate.

Ces polymeres sont constitues d'un enchainement de motifs de type A-X, A-Y et A-Z tels que representes a la figure 6, dans lesquels un des motifs caracteristiques A-Z est presente a la figure 8 en annexe. Dans cet exemple le groupement Z qui est de 1'ethylenediamine note DE est greffe sur le radical carboxyl du carbone 2 du monomere glucose d'origine, lui memo sulfafce en position 3 et 4.

Le memo protocole que precedemment a ete applique sur le CM2D avec dans un premier temps, 1'addition d'un groupement Z d'ethylenediamine note DE pour aboutir au produit designe CM2DE.

Les analyses elementaires et tifcrimetriques acide-base du polymere CM2DE donnent : % C = 37,67; % H = 6,25; % N =5,35; % COOH = 19 %.

Le protocole de sulfatation a ete realise sur une fraction de ce polymere en utilisant 1 équivalent d'acide chlorosulfonique. Les produits obtenus correspondent a du CM2DES1 represente a la figure 7 en annexe. Dans ce cas, selon la formule générale des RGTA, Z est du diethylamine.

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymère CM2DDES1 donnent : % C = 36,83; % H = 5,82; % N = 4, 67 ; % S = 1,82; % COOH = 10, 7 % Ces syntheses permettent de greffer des groupements N-sulfate en plus des groupements 0-sulfate des CMDS. Ces differents polymeres permettent d'apprecier les roles specifiques des groupements N- sulfate et 0-sulfate des CM2DES par rapport aux groupements phenyl sulfonate notes PhS des composes

CM2DPhS, aux composes sulfates et sulfonates des CM2DPhSS ou aux composes. Dans ce type de polymeres, il apparait que les groupements sulfates sont essentiellement lies aux proprietes des RGTA.

4) Synthese des polvmeres de dextran carboxymethvle-phenvlalanine sulfate desiqne CM3DPheS et de dextran carboxvmethyle tyrosine sulfate désigné CM3DTyrS representes a la figure 9 en annexe.

Ces polymeres sont constitues d'un enchainement de motifs de type A-X, A-Y et A-Z tels que representes a la figure 6 dans lesquels les motifs caracteristiques sont representes a la figure 9 en annexe. Dans cet exemple, les groupements Z sont -respectivement soit de la phenylalanine pour Phe soit de la tyrosine pour Tyr. Ils ont ete additionnes sur un radical carboxyl greffe en position 2 du glucose d'origine lui meme sulfate en position 3 et 4.

Dans ces polymeres, Z est un acide amine avec soit de la phenylalanine (Phe) ou de la tyrosine (Tyr) et Y est un groupe -OS03-.

Ces syntheses ont ete realisees pour apprecier 1'importance des structures aromatiques de ces deux acides amines Phe et Tyr en remplacement de la benzylamine notée B telle que connue dans le CMDBS de 1'art anterieur, mais dont le relarguage dans les applications in vivo peut etre prejudiciable en générant des risques de tumorigenicite.

Le polymere CM3D (% COOH = 136 %, 0,6 g, 3, 014 mmol) est dissous dans 6 millilitres d'eau distillée. Le pH de la solution est ajuste a 3, 5 avec HCl 3M. 1'agent couplant EEDQ (745 milligrammes, 1 equi.), est dissous dans 6, 2 millilitres d'ethanol a 40°C. La solution d'EEDQ est ajoutée au polymere goutte à goutte et le melange reactionnel est agite vigoureusement pendant 30 min. a temperature ambiante.

La phénylalanine méthylester (1,3 g, 2 equi.) est ajoute très lentement au melange et le pH est ramené de 5 à 9 avec de la soude. La reaction est maintenue a temperature ambiante pendant 4 heures. La solution est ensuite neutralisee avec HCl dilué. Le polymere CM3DPhe est alors ultrafiltre, evapore sous vide puis lyophilise (524 milligrammes).

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymere CM3DPhe donnent : % C = 36,9; % H 5, 03 ; % N = 0, 44 ; % COOH = 101, 05 %.

Le même protocole a ete realise sur le CM3D avec la tyrosine méthylester CM3DTyr.

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymere CM3DTyr donnent : % C =34,41; % H = 5,12; % N =0,28; % COOH = 101,76 %.

Le protocole de sulfatation a ete realise sur ces deux polymeres en utilisant 2 equivalents d'acide chlorosulfonique.

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymere CM3DPheS*2 donnent : % C = 18,08; % H = 2, 89 ; % N = 0, 30 ; % S = 14,71; % COOH = 28,79 %.

Les analyses elementaires et titrimetriques acide-base du polymère CM3DTyrS2 donnent : % C = 17,99; % H = 3,13; % N = 0, 3 ; % S = 14,35; % COOH = 19,85%.

5) Synthese des polvmeres lipidiques : exemple avec le dextran carboxymethyle - acide oléique Sulfaté (CM1DoléicS)et le dextran carboxvmethvle - acide palmitique Sulfate (CMlDpalmS) representes a la figure 10 en annexe.

Ces polymeres sont constitues d'un enchainement de motifs de type A-X, A-Y et A-Z tels que representes a la figure 6 dans lesquels les motifs caracteristiques sont representes a la figure 10 en annexe. Dans cet exemple, les groupements Z qui sont respectivement soit de 1'acide oleique pour oleic soit

de 1'acide palmitique pour palm ont ete additionnes sur 1'hydroxyle du carbone 3 d'un carboxymethyl glucose en position 2 sulfate en position 4.

Ces composes repondent a la formule (I) dans laquelle Y = -OS03- et Z est de 1'acide oleique ou palmitique. Ces acides gras ont ete greffes pour apprecier 1'importance de la balance hydrophobicite/ hydrophilie des polymeres en plus du rôle propre de ces acides gras.

Au polymere CM1D (1 g, 2, 43 mmol) dissous dans du DMSO (16 millilitres) est ajoute de la triethylamine (0, 8 millilitres) et goutte à goutte du chlorure oléique (1,6 millilitres). Le melange reactionnel est agite a temperature ambiante pendant 2 heures. Le polymere est precipite dans 120 millilitres d'acetate d'ethyle, centrifuge puis seche sous vide. Le precipite est dissous dans 20 millilitres d'acetate de sodium 2M et le sel forme est precipite dans 1'ethanol (160 millilitres), filtré, dissous dans 20 millilitres d'eau distillee puis enfin dialyse contre 1'eau. Apres dialyse (24 h. ), la solution evaporee sous vide fournit le dextran lipidique CMlDoleic (751 milligrammes).

Analyses elementaires du produit CM1Doléic : % C = 34, 25 et % H = 5, 91 Le même protocole a ete realise avec le chlorure palmitique polymere CMlDpalm.

Les analyses elementaires du polymere CMlDpalm donnent : % C = 35, 13, % H = 5, 96 Le protocole de sulfatation a ete realise sur ces deux polymeres en utilisant 1 equivalent d'acide chlorosulfonique.

Les analyses elementaires du polymere CM1DoléicS*1 donnent : % C = 28,28; % H = 5, 04 ; % S = 5, 26.

Analyses elementaires du produit CMlDpalmS* donnent : % C = 29,17 % ;H = 4,88; % S = 5, 14.

Les différents exemples evoques selon le greffage d'un groupement Z aboutissent à des composes dont la definition de quelques uns d'entre eux sont presentees dans le tableau II ci dessous.

Tableau II ReferenceGroupements___XYZ RGTA 1110CM2DPhSSl52,143,88,9 RGTA 1111CMaPESi_____10,742,421,2 RGTA 1112CM2DPheS2____28,956,217,9 RGTA 1113CM3DTyrS219,865,928,9 RGTA 1114 CM1DPa1mS1 39,8 47,5 3,8 RGTA 1115 CMlDOléiSl 36,0 43,9 2,2 Le tableau II ci-dessus indique les pourcentages de substitution des polymeres comportant un groupement Z.

6) Etapes de purification des différents dérivés de dextranes des exemples ci-dessus. a) Dialyse a I'eouilibre.

A la suite de chaque étape de synthese les polymeres sont recueillis sous forme solide (precipitation ou filtration suivie d'une lyophilisation). Les polymeres sont ensuite resolubilises dans le volume minimum d'eau distillée puis introduits dans un boudin de dialyse (Spectrapor) de seuil de coupure 6000 a 8000 g. mol-1. La dialyse est effectuée contre de 1'eau bidistillee (MilliQ) dans un rapport de 1 volume de produit pour 50 volumes d'eau pendant 4 a 5 jours avec deux changements d'eau par jour.

b) Chromatoaraphie.

A 1'etape precedente est associee un chromatographie HPLC sur tamis moleculaire (Colonne TSK) de façon à établir la masse molaire des polymeres purifies. c) Ultrafiltration tanaentielle.

Apres la dialyse, le contenu des boudins est ultrafiltre dans une cellule d'ultrafiltration (Pellikon, Millipore) sur une membrane de cellulose de seuil de coupure 10000 g. mol-1. La qualifie de la purification est suivie a 1'aide d'une cellule de conductimetrie. Lorqu'en sortie de cellule, la conductivité de 1'eau eliminee est revenue à la conductivité de 1'eau distillee pure ( 2RS ), la purification est arretee et la solution est concentrée avant lyophilisation.

7) Determination des pourcentaaes de substitution.

Dans les deux groupes d'exemples detailles ci-dessus, les pourcentages de substitution des groupements X, Y et éventuellement Z sont etablis de la façon suivante. a) Polvmeres poly acide - ß - malique (Exemples 1).

Pour ces polymeres, les pourcentages de substitution sont definis a priori en fonction de la proportion des differents monoesters mis a polymeriser. b) Polvmeres de dextrane (Exemples 2).

Deux cas doivent etre envisages pour ces polymeres obtenus a partir du dextrane selon la definition du groupe z.

Le premier correspond au cas des CMnDSm ou Z = rien et le second, depend de la nature chimique de Z.

Sur chaque residu glucose, 3 fonctions hydroxyles sont susceptibles de reagir. Une masse molaire relative de 54 g. mol-1 est attribuee a chaque fonction hydroxyle, soit le tiers de la masse moleculaire de 162 g. mol-1 d'un residu constitutif du dextran. Il est admis que chaque hydroxyle possede la meme reactivite et que les substitutions affectent d'abord une fois chaque unite glucose avant une éventuelle seconde substitution sur le meme residu.

Un dextran T 40 de 40 000 g. mol-1 contient donc 247 residus glucose de masse molaire 162 g. mol-1.

Les taux de substitutions atteints lors des carboxymethylations sont determines par dosage acide- base avec un titrimetre automatique (Tacussel). Ce dosage determine une valeur X1 correspondant au nombre de moles d'acide fixees par gramme de polymere.

Ainsi, lorsqu'un hydroxyle est substitue, il apparait sur le glucose un motif : -OCH2COONa. Chacune de ces sous unités substituées a une masse moleculaire relative de 240 g. mol-1.

Apres la sulfatation, il apparait plusieurs motifs.

Les taux de groupements carboxyliques libres determines par dosage acide base donnent une valeur X2 toujours inferieure a la valeur initiale X1. La difference Xi-Xa correspond à des motifs -OCH2COO-SO3Na.

Chacune de ces sous unités substituées a une masse moleculaire de 320 g. mol-1.

L'analyse par RMN permet de montrer que le S correspond a une sulfatation des hydroxyles libres des residus glucose en plus de la reaction precedente. Dans

ce cas, il apparait un motif -OS03Na. Chacune de ces sous unites de glucose sulfate a une masse moleculaire relative de 200 g. mol-1. Les microanalyses donnent le taux de S en pourcentage de la masse du polymere.

Il est ainsi possible, en fin de synthese, en connaissant les pourcentages de radicaux carboxyles libres X1 et Xa determines respectivement avant et apres 1'etape de sulfatation, de considerer que le polymère contient : - a residus glucose non substitue de masse 162 g.

- X2 residus carboxyliques libres de masse 240 g.

- Xi-Xz residus carboxyliques sulfates de masse 320 g.

- Y residus glucose sulfates de masse 200 g.

A partir de ces donnees il est possible d'établir le pourcentage de substitution des groupements X et Y.

Ainsi, le pourcentage de soufre donne par les resulats de microanalyse (S%) permet de connaitre le nombre d'atomes de soufre (Es) greffes sur le polymère.

Ce nombre d'atomes est de ES =(S% x MM)/32 x 100, ou 32 est la masse atomique de S et MM la masse molaire du polymere synthetise.

I1 est posible d'en tirer le pourcentage Y de radicaux SO3- comme étant égal à : (100 x S% x MM) /247 x 3200 Dans le deuxième cas, ou ive groupement Z greffe est par exemple de la tyrosine, le même raisonnement s'applique avec la valeur de 1'azote donnee par les resultats de 1'analyse elementaire.

B) PROPRIETES DES POLYMERES DE L'INVENTION.

Les proprietes communes aux RGTA et aux HBGFPP.

1) Ils sont depourvus d'activite anticoagulante significative c'est a dire presenter une activite inferieure a 50 UI/milligrammes comparee a celle de 1'heparine dont 1'activite est de 1'ordre de 150 a 170 UI/milligrammes.

2) Ils stabilisent et potentialisent les facteurs de croissance presentant une affinite pour 1'heparine et en particulier a tire d'exemple le FGF1 et/ou le FGF2 et/ou le TGF P.

3) Us protegent ces facteurs contre des agents proteolytiques comme la trypsine.

4) Ils inhibent les activites proteasiques impliquees dans le processus inflammatoire comme par exemple elastase leucocytaire et/ou la plasmine.

5) Ils exercent un effet cicatrisant dans au moins 1'un des modeles presentes dans les brevets suscites, a savoir, les muscles, les nerfs, ou le tractus digestif.

Les nouvelles proprietes des RGTA.

6) Us protegent et potentialisent les activites enzymatiques impliquees dans la lutte contre le stress oxydatif comme par exemple la super oxyde dismutase ou SOD. De par cette propriete ils agissent comme agents anti oxydants et peuvent etre utilises seuls ou associes a la SOD dans des indications thérapeutiques et/ou cosmétologiques de la SOD ou comme agent protecteur antioxydant notamment dans la protection des aliments ou comme nutrient.

7) Ils inhibent 1'activite des enzymes comme la Calpaine 8) Ils inhibent 1'activite des enzymes comme 1'heparitinase ou 1'heparinase.

9) Ils augmentent la survie de cellules soumises a des radiations ionisantes et regulent la secretion, sur le plan quantitatif comme qualitatif, des constituants de leur matrice comme les collagenes par exemple.

10) Ils agissent comme des agents antifibrotiques en modulant la croissance des cellules mesenchymateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hépatiques et la qualite du type de collagène qu'elles sécrètent.

11) Us presentent une degradabilite lente critere permettant de les differencier des heparanes sulfates qui sont des produits naturellement degrades par 1'heparinase ou 1'heparitinase.

12) Ils ne contiennent pas et ne liberent pas apres degradation de produits connus pour leur toxicite comme par exemple peut le faire le CMDBS avec les groupements greffes Z = benzylamine, ce qui exclut donc le CMDBS.

13) Us presentent in vivo des capacites de protection et de regeneration tissulaire dans les differents modeles suivants : a) lesion de plaies cutanees, b) regeneration de tissus osseux comme les os longs avec 1'exemple du femur, c) protection contre la perte de tissu osseux et de regulation de son remaniement comme dans le cas de 1'osteoporose ou des parodonties. De fait ce sont des agents regulateurs de 1'homeostasie tissulaire et des masses tissulaires comme la masse osseuse ou musculaire. d) regeneration hepatique ou de protection contre la degenerescence du systeme nerveux central et peripherique, e) protection contre les effets deleteres des ischemies quelque soit leur localisation.

EXEMPLE 3 : Mesure des activites anti- coaqulantes des polymères des exemples 1 et 2.

Les tests de coagulation sont realises selon la technique du Temps de Cephaline Activee ou T. C. A.

(Biggs, 1972, in Human blood coagulation, Oxford Blackwell Scientific Publications). Cent microlitres d'une solution de polymere a differentes concentrations en tampon d'Owen Koller sont incubes 5 minutes a 37°C avec 100 microlitres de plasma pauvre en plaquettes et 100 microlitres d'une solution de cephaline de cerveau de lapin. 100 microlitres de chlorure de calcium 0, 25 M sont ajoutes et le temps d'apparition du caillot est repere par chronometrage.

Comme le montre la figure 11, les polymeres des exemples 1 et 2 ne presentent pas d'activité anticoagulante superieure a 50 UI/milligrammes, en particulier par rapport a 1'heparine, pris comme controle positif. Il convient de remarquer que les valeurs des activites anticoagulantes des produits donnes ici en exemple sont toutes inferieures a 10 UI/milligrammes de produits.

EXEMPLE 4 Stabilisation et potentia- lisation des polvmeres des exemples 1 et 2 sur des facteurs de croissance presentant une affinité pour l'héparine et en particulier a tire d'exemple le FGF1 et/ou le FGF2 et/ou le TGF D.

Cet exemple considere 1'effet des polymeres sur la stabilisation du FGF1 et 1'effet sur la potentialisation du FGF1 et du FGF2. Ces effets sont evalues sur la croissance des cellules 3T3 BALB/c ou CCL39. Les conditions utilisees pour ces experimentations sont celles decrites dans 1'art

anterieur dans les brevets relatifs aux HBGFPPs incorporees a la presenteinvention par reference.

1) Effets des polymeres de 1'invention sur la stabilisation des FGF1 ou FGF2.

La figure 12 en annexe represente les effets des RGTA contre des degradations thenniques a 20° C et a 37° C en fonction du temps d'incubation de FGF2 conserve seul ou en presence des produits testes. L'ED50 represente la concentration en mcrogramme/millilitre de FGF1, ici de 6 nanogrammes/millilitre, qu'il faut inoculer a une culture de cellules fibroblastiques, les cellules CCL 39, pour obtenir 50 % du taux maximal d'incorporation de thymidine tritiee.

Les resultats obtenus montrent que 1'ensemble des polymeres testes exercent a 20° C comme a 37° C, de effets protecteurs comparables a ceux de 1'heparine, et parfois avec une efficacite plus importante.

2) Effets des polymeres de 1'invention sur la potentialisation des FGF2 ou FGF2.

Le protocole est le meme que celui precedemment decrit avec une quantite variable de FGF associee ou non a une quantite constante de polymere.

La concentration de polymere retenue correspond a celle qui potentialise au maximum 1'effet mitogene du FGF. Ces tests sont faits sur les cellules 3T3 pour le FGF1 et le FGF2. Les contrôles sont les memes que ceux <BR> <BR> <BR> cites precedemment a 1'exception d'une etude systematique pour chaque test de la valeur de l'ED50.

Les molecules de ces deux familles de polymères testés potentialisent les actions du FGF1 et du FGF2 puisque les valeurs de l'ED50 sont obtenues pour

des valeurs de FGF inferieures ou comparables a celle obtenue en presence d'heparine (figure 13).

EXEMPLE 5 : Protection des facteurs contre des agents proteolytioues comme la trypsine.

La trypsine est une enzyme proteolytique a large spectre d'action qui est utilisee dans les tests in vitro et qui est une des enzymes fonctionnelle primordiale dans les processus digestifs.

Le test de protection contre la trypsine se déroule ainsi. Un nanogramme/millilitre final de FGF2 iode ou 5 microgrammes/millilitre final de trypsine sont incubes dans un premier temps 15 minutes à 37°C avec differentes concentrations de polymeres (0, 5 a 500 microgrammes/millilitre) dans un tampon Tris HC1 100 mM, 0, 18 M NaCl, brij 0, 03% pH 7, 6. 5 microgrammes/millilitre final de trypsine ou 1 nanogramme/millilitre final de FGF2 iode sont alors ajoutes respectivement. Le volume reactionnel total est de 30 F1. La réaction enzymatique est arretee après 2 h d'incubation a 37°C, par addition de tampon Laemmli et un chauffage de 5 minutes à 90°C (Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4, Nature, 1970, 227 : 680-685).

Chaque echantillon est déposé sur un gel de polyacrylamide de 15%. La migration s'effectue pendant 1 h a 200 V dans la glace. Les gels sont seches 2 h à 80°C sous vide et exposes a -80°C en presence d'un film autoradiographique. L'intensite des bandes est mesurée par analyse d'image et le pourcentage de FGF2 protege par rapport au FGF2 degrade calcule

Protection du FGF1 et du TGF p La figure 14 en annexe presente les effets protecteurs exprimes en % de protection des polymeres poly acide ß malique sur le FGF1, le FGF2 et le TGFß, vis à vis d'une attaque par la trypsine. La figure 15 presente les effets protecteurs exprimes en % de protection des polymeres derives de dextrane sur le FGF2 et le TGFß, vis a vis d'une attaque par la trypsine.

Ces polymeres exercent pour la plupart d'entre eux un effet protecteur comparable a celui de 1'heparine pris comme reference positive.

EXEMPLE 6 : Inhibition des activites proteasigues impliquees dans le processus inflammatoire comme par exemDle l'élastase leucocvtaire ou la plasmine.

L'elastase leucocytaire et la plasmine sont des proteases cles dans 1'installation et le deroulement de la phase inflammatoire. Ces tests visent a etablir si les polymères protègent les facteurs de croissance des degradations par 1'elastase leucocytaire humaine.

Les tests de protection contre lçélastase leucocytaire se déroulent ainsi. Le protocole utilise est le même que celui utilise avec la trypsine avec 30 nanogrammes/millilitre final d'elastase et 0,5 à 500 microgrammes/millilitre de polymeres. Le tampon est du Tris HC1 100 mM, NaCl 0, 18 M, 0, 03% brij pH8.

L'intensite des bandes est évaluée par analyse d'image et le pourcentage de FGF2 non dégradé est calcule. Le controle positif pour ces tests est 1'heparine. Le dextran T40 et le dextran sulfate ont ete pris comme références internes.

La figure 16 rapporte les effets inhibiteurs des differents polymeres exprimes par les valeurs des IC50.

EXEMPLE 7 Exemple des effets des RGTA sur la regeneration, la protection et la restauration fonctionnelle des tissus : cas de la regeneration du muscle saueletticrue.

Le modele retenu pour apprécier le plus efficacement les proprietes cicatrisantes des RGTA a ete celui de 1'ecrasement musculaire tel que defini et presente dans le brevet Francais n° 2 718 026.

Apres ecrasement du muscle EDL (Extensor Digitorum Longus) de la patte arriere du rat et injection dans le muscle ecrase d'une solution de serum physiologique contenant ou non les substances a tester, les muscles ainsi traites sont recuperes 8 jours apres 1'operation. L'analyse du poids associee a une etude histologique permettent de quantifier les effets des polymeres sur la regeneration musculaire. Les resultats sont exprimes en % par rapport aux caracteristiques d'un muscle n'ayant recu qu'une injection de serum physiologique sans polymere dans les memes conditions experimentales. La figure 17 presente les resultats obtenus qui demontrent qu'aussi bien les nouveaux polymeres derives du squelette de dextrane que les copolymères d'acide ß malique excercent les effets revendiques.

Il est important de noter que ces effets sur la regeneration musculaire sont obtenus aussi bien par injection in situ des polymeres que par injection intra veineuse, intra arterielle ou intra musculaire a partir du moment ou les doses injectees en fonction des voies d'administration sont adaptees.

EXEMPLE 8 : Effets des RGTA sur la regeneration de 1'os plat.

Le modele retenu pour évaluer les proprietes cicatrisantes des RGTA est celui deja connu de 1'art anterieur et décrit par Blanquaert F, et al. Bone. 1995 ; 17 (6) : 499-506).

Ce modele consiste a pratiquer une trepanation circulaire de 5 millimetres de diametre dans la calvaria d'un rat adulte. Le defaut est comble par un tampon de collagene predecooupe aux mêmes dimensions et imbibe ou non dans une solution contenant des RGTA. Dans 1'exemple presente ici, les polymeres etudies sont les polymeres de type CMS (RGTA 1005 et 1012) et les copolymeres d'acide (3-malique (RGTA 2011). Le tableau III ci-dessous presente les pourcentages de comblement osseux établis par analyse d'image des radiographies prises 35 jours après le traitement.

Tableau III Type de traitement % de comblement osseux controle 18 +/- 4, 8 RGTA 2011 56 +/- 7,0 RGTA 1005 54 +/- 6,9 RGTA 1012 72 +/- 8,9 Les deux types de polymeres stimulent donc la regeneration osseuse d'autant que dans ces conditions de cicatrisation la suture sagittale se reforme ad integrum.

Exemple 9 : Protection et potentialisation des activites enzvmatiaues impliauees dans la lutte contre le stress oxydatif comme par exemple la super oxvde dismutase ou SOD.

La production d'ions 02- et celle de peroxyde dhydrogène (H202) représentent des radicaux qui exercent des effets cytotoxiques particulierement destructeurs. Les SOD ou super oxydismutase sont des enzymes engagees dans la detoxification de ces radicaux.

Ce sont des agents qui preservent 1'organisme du stress oxydatif.

Les RGTA presentent plusieurs types d'activité vis a vis de la SOD : - Ils exercent un effet potentialisateur sur 1'activite catalytique de la SOD a pH neutre et un effet protecteur et potentialisateur a des pH acide et basique.

- Us presentent la propriete de proteger les SOD vis a vis des degradations enzymatiques comme par exemple la trypsine et d'autre part vis à vis de traitements thermiques.

- Sur des modeles de cultures de monocytes actives, ils stimulent les activites catalytique des SOD endogenes et permettent de diminuer la production des ions superoxydes.

Dans tous les cas, les dosages de 1'activite SOD sont realises selon la technique de Pick, (Freund M et Pick E, The mechanism of action of lymphokines. IX.

The enzymatic basis of hydrogen peroxide production by lymphokine-activated macrophages. J Immunol 1986 15 ; 137 (4) : 1312-1318). Cette technique repose sur le dosage des ions O2- par reduction du cytochrome c. De la MnSOD (Sigma ref. S 8151) a 30 U/millilitre est mise en solution en presence de differents RGTA a la concentration de 10 microgrammes/millilitre. Ces melanges subissent differents traitements.

L'activite SOD est évaluée en presence de differentes concentrations de polymeres dans des conditions reactionnelles normales.

Soit, les melanges de SOD et de polymeres sont soumis a temperature ambiante a 1'action de la trypsine (meme conditions que pour les tests de protection de 1'exemple 5) soit ils sont soumis a un traitement thermique a 60° C pendant 30 minutes.

L'activite catalytique residuelle de la SOD de ces melanges est alors evaluee par les techniques enzymatiques classiques ou sur systeme cellulaire.

Les echantillons ainsi traites sont incubes dans une suspension de monocytes (2,5 106 cellules/millilitre) stimules par 200 nM de PMA. Cette condition induit la production d'anion superoxyde par ces monocytes actives en macrophages. La stimulation par le PMA induit une augmentation de la production d'ions superoxyde normalement produits a un niveau basal en 1'absence d'activation. L'adjonction de MnSOD active utilisée comme controle positif, diminue la quantite d'ions superoxydes produits.

Dans ces conditions, plus la production d'ions superoxydes sera faible, plus 1'activite catalytique residuelle de la SOD contenue dans les melanges sera elevee. Ces tests permettent donc d'apprecier les effets protecteurs et potentialisateurs des polymeres sur 1'activite SOD exogene comme endogene.

La figure 18 illustre les effets protecteurs et potentialisateurs des RGTA sur 1'activite catalytique de la SOD in vitro a diferents pH, la figure 19 les effets protecteurs des RGTA sur la SOD soumise a une attaque par la trypsine ou apres un choc thermique et la figure 20 les effets potentialisateurs de l'activité SOD sur la production d'ions superoxydes par des macrophages actives.

Conclusion :. Les polymeres exercent donc des effets potentialisateurs et protecteurs aussi bien dans des systemes acellulaires que cellulaires. L'adjonction des differents polymeres module donc l'activité

catalytique de SOD ajoutée de facon exogene comme de SOD produite de façon endogène par les cellules.

EXEMPLE 10 : Inhibition de 1'activite des enzvmes comme la Calpaine par les RGTA.

1) Introduction.

La calpaine 1 (Sigma P 4533) est utilises dans cet exemple. Ainsi, 0.78 unité d'enzyme (57, 2 nM) sont incubées dans 1 millitre de tampon 50 mM Tris-HCl pH 7. 4, 0. 05% Brij, 2mM CaC12, 2 mMDT et 0. 15M NaCl. Les solutions de RGTA a tester sont ajoutées pendant 5 minutes a 27°C. Le substrat (250 micromolaire de N- succinyl-leu-tyr-amido-7methyl coumarin, de chez Sigma (S 1153) est ensuite ajoute dans une cuve en quartz dans laquelle le melange decrit ci-dessus est ajoute. Les mesures sont ensuite realisees toutes les 3 à 5 minutes par excitation a 380 nm et détection en fluorescence a 460 nm de la transformation du substrat en 7 amino- 4methyl coumarin (selon le protocole décrit par Sasaki, Kikuchi, Yumoto N, Yoshimura et Murachi T, 1984. dans J.

Biol. Chem 259, (20) p 12489-12494.

Les resultats obtenus sont résumés dans la figure 21.

2) Conclusion.

Des resultats obtenus dans 1'inhibition de 1'activite de la calpaine par les RGTA, nous pouvons predire que les RGTA ont une activite de protection contre les lesions induites par les ischemies cerebrales comme le laissent prevoir les publications de Markgraf C G et col. (Stroke, 1998,29, 152-158) ou encore Saido et al, (Neuroscience. Letters, 1997 16 ; 227 : 75-78) qui decrivent 1'effet d'inhibiteurs des calpaines comme le MDL28170 ou encore la proteine Calpastatine dans le traitement des lesions post ischemique du cortex ou de

1'hippocampe. L'adminsitration par voie locale ou intraveineuse de RGTA aura 1'effet inhibiteur des calpaines et favorisera la reparation du tissus nerveux lese notamment par manque d'apport en oxygene comme c'est le cas des ischemies.

EXEMPLE 11 : Inhibition de 1'activite des enzymes comme 1'heparitinase par les RGTA.

1) activité inhibitrice des heparinase et heparitinases.

La mesure de 1'inhibition par les RGTA des activites heparinase ou heparitinase est realisee en utilisant comme substrat les heparanes sulfates radiomarque au soufre 35 et presents dans une matrice extracellulaire synthetises par des cellule endotheliales cultives en presence de Na2 35SO4 pendant 7 jours. Le protocole utilise est celui decrit par Ishai-Michaeli R et coll. (Importance of size and sulfation of heparin in release of basic fibroblast growth factor from the vascular endothelium and extracellular matrix. Biochemistry 1992 ; 31 (7) : 2080- 2088). La matrice extracellulaire obtenue apres elimination des cellules endotheliales est ensuite incubee 24h a 37°C en presence ou en absence d'heparanase et 0. 5 microgramme/ml de RGTA.. Afin de mesurer la degradation des heparanes sulfates radio marques le milieu d'incubation est collecte et depose sur une colonne de Sepharose 6B selon le protocole decrit dans Ishai-Michaeli (Biochemistry 1992 ; 31 (7) : 2080-2088). La figure 22 illustre les resultats obtenus. Les heparanes sulfates de haut poids moleculaire correspondant au materiel non degrade par 1'enzyme heparanase sont elues en premier (fractions 3 a 20). Le traitement a 1'heparanase induit la disparition de ce pic et 1'apparition d'un pic correspondant a des

fractions de petit poids moleculaire d'heparanes sulfate degrade. (fractions 20 a 40). Dans 1'exemple donne 1'effet du RGTA 1005 a 50 microgramme/ml induit 50% d'inhibition et 100 microgrammes/ml 100% d'inhibition de 1'activite heparanase.

EXEMPLE 12 Effets des RGTA sur la protection des cellules musculaires lisses intestinales humaines soumises a des radiations ionisantes ; effets sur leur survie et sur leurs effets antifibrotiques evalues a travers la quantite et la qualite des collagenes secretes.

La formation d'un tissu fibreux ou fibrotique est une etape physiologique essentielle, associee aux processus de reparation et de remodelage tissulaire. Le tissu fibrotique est un tissu de comblement, normalement transitoire, visant a conserver l'intégrité structurale et fonctionnelle des tissus et organes. Il se caracterise par la richesse en collagenes de la matrice extra-cellulaire.

Lorsque cette situation persiste ou se developpe, elle correspond a une pathologie illustrant un dereglement de 1'homeostasie structurale et fonctionnelle des tissus et se traduit par une accumulation anormalement elevee de matrice extra- cellulaire qui engendre une fibrose. Une fibrose, quelle que soit son origine se caracterise par : la presence d'un infiltrat inflammatoire permanent, 1'existence d'un desequilibre dans la balance entre un etat proliferatif et quiescent des cellules conjonctives ou mesenchymateuses comme les fibroblastes ou les cellules musculaires lisses, la destruction progressive du tissu envahi qui se renouvelle peu ou de façon défectueuse, l'existence d'un desequilibre de la

balance entre la synthese et la degradation de la matrice extra-cellulaire.

Une fibrose peut etre induite soit a la suite d'un traumatisme d'origines variees (infectieux, mecanique, toxique, etc...) soit a la suite de radiations ionisantes (notamment par des rayons 7). Il s'agit dans ce cas des fibroses radioinduites comme c'est frequemment le cas chez les patients ayant subi une radiotherapie.

Les collagenes sont les composants majeurs de la matrice extra-cellulaire des tissus normaux comme des tissus fibrotiques. Ils sont essentiellement synthetises par les cellules mesenchymateuses comme les fibroblastes et les cellules musculaires lisses. Dans un tissu fibreux, le collagène total est quantitativement augmente, en raison de modifications affectant aussi bien, sur le plan quantitatif que qualitatif, la synthese et/ou la degradation des collagenes, c'est a dire la dynamique du remodelage. Les fibroses se caracterisent par une augmentation du collagene de type III, et ceci preferentiellement lors de fibroses radio- induites. Cette augmentation de collagene de type III est associee a une augmentation mais dans une moindre importance du rapport entre le collagène de type III et le collagène de type I. Un autre collagène, le collagène de type V, est associe a la qualite de 1'organisation des fibres de collagenes dans la matrice c'est a dire la fibrillogenese. Dans les tissus fibrotiques, 1'effondrement du taux de collagene de type V est une des origines de la destructuration des fibres de collagene de la matrice extracelulaire.

Le modele cellulaire considere dans cet exemple est celui des cellules HISM, Human Intestinal Smooth Muscle cells, (American Type Culture Condition, Rockville, Maryland ATCC CRL 192), issues de la muscularis propria de jejunum humain (Graham

M., Diegelmann R. , Elson C. , Bitar K. and Ehrlich H.

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 176 (1984) 503. ). Cette lignee de cellules musculaires lisses intestinales humaines a ete utilisee pour apprecier les effets des radiations sur la survie cellulaire et 1'induction de phenomenes fibrotiques analyses a travers la quantite et la qualite des types de collagene secretees par des cellules normales ou en situation d'inflammation ou de processus de reparation par une fibrose.

Les cellules sont cultivees en milieu DMEM contenant 1 gel de glucose, 1% de L-glutamine, 1% penicilline-streptomycine et 10% de serum de veau foetal et conservees dans un incubateur à 37°C sous une atmosphere saturee a 5% de C02 et 95 % d'humidite relative, dans des flasques 75 cm². Les cellules HISM sont ensemencees sur plaques 24 puits a fond plat a raison de 20 000 cellules par puits. Le volume de chaque puits est complete a 2 milliL de milieu. Plusieurs cinetiques de croissance sont realisees en presence ou non de RGTA a differentes concentrations allant de 0, 4 a 400 microgrammes/milliL.

L'irradiation est effectuee a partir d'une source d'irradiation de 60 Cobalt dans un incubateur ou les plaques de culture sont disposees. Deux boites sont soumises simultanement a cette irradiation dont la source est verticale et dont les doses sont evaluees en fonction de la surface irradiee. Le debit de 1'irradiateur est de 1 Gy/mn. Les doses absorbees sont de 10 Gy pour un temps d'irradiation par boite de 10 minutes.

Differents protocoles sont utilises pour apprecier le role des RGTA selon qu'ils sont ajoutes au milieu de culture avant, pendant ou apres 1'irradiation c'est a dire sur un plan preventif, curatif ou les deux a la fois. Le tableau IV ci-dessous precise les differents protocoles.

Tableau IV Sequence_______RGTAirradiation RGTA Temoin______________-______________________ Irradiation_________-______+___________-____ Curatif - + - Préventif + + - Preventifefc+++ curatif

L'effet preventif est evalue par adjonction de RGTA (+) a la dose de 400 microgrammes/mL dans le milieu de culture, 48 heures avant 1'irradiation.

L'effet curatif est apprecie par adjonction de RGTA 2 heures apres 1'irradiation aux memes doses que pour 1'effet preventif. Pour les effets cumulés préventifs et curatifs, les cellules sont continuellement cultivees en presence des memes doses de RGTA.

72 heures apres 1'irradiation, les cellules sont incubées dans un milieu depourvu de serum en presence de proline tritiee (10 microCi/mL) et d'acide ascorbique (50 microgrammes/mL) pendant 24 heures. Le surnageant est alors preleve et la couche cellulaire recuperee a 1'aide d'un robber-policeman dans un volume final de 18 mL. Les milieux de culture et les couches cellulaires recuperees sont extensivement dialysees (seuil de coupure de 6 a 8 kDa)contre de 1'eau courante (24 heures à 4°C) pour éliminer les petites molecules des macromolecules. Apres dialyse, des fractions aliquotes sont prelevees et hydrolysees (HCl 6M, 105°C, 24 h) pour déterminer la radioactivite de 1'hydroxy (3H) proline, marqueur specifique des collagenes A ce stade, une fraction aliquote est utilisée pour quantifier par comptage de la radioactivite, la synthese totale de collagenes.

Le volume restant est a nouveau dialyse en presence de pepsine et de collagene I contre de 1'acide acetique 0, 5 M pendant 24 h a 4°C. La pepsine va digerer

les contaminants non collageniques qui seront elimines dans le dialysat sous forme de peptides. Du collagene de type I est ajoute afin d'augmenter la proportion de collagene qui est faible dans chaque echantillon et de tendre vers un rapport enzyme/substrat de 1/5. Les conditions de reaction sont les suivantes : 1 mL de solution de pepsine (0, 5 M) + 1 mL de solution de collagene I (0, 5 M) + 0, 514 mL d'acide acetique pour avoir une concentration finale en acide acetique de 0, 5M, dans un echantillon de 18 mL. Chaque dialysat ainsi obtenu est lyophilise a froid (-50°C) et conserve a -20°C jusqu'a utilisation.

Les differentes chaines a de collagene sont separees par electrophorese sur gel de polyacrylamide en presence de SDS (Sodium Dodecyi Sulfate) selon la methode de Leammli, apres reduction avec dup mercaptoethanol. La radioactivite incorporee dans chaque collagene est determinee par hydrolyse des chaines a issues du decoupage des bandes de gel correspondant a chaque chaine de collagene d'un type precis. Celles-ci sont ensuite dissoutes dans de 1'eau oxygenee a 60°C et la radioactivité contenue dans les differentes bandes dissoutes est comptee au compteur p a scintillation liquide ou par autoradiographie directe des gels.

La separation electrophoretique est realisee avec 5 microlitres de collagene V et 50 microlitres de chaque echantillon reduit.

Ces gels permettent plusieurs types d'exploitation : - La determination des differents types de collagene par analyse de la radioactivite incorporee.

- La quantification de ces differents types de collagene par analyse densitometrique apres autoradiographie.

Les fractions aliquotes prelevees apres la dialyse contre de 1'eau courante sont hydrolysees (HC1 6M, 105°C, 24 h) en ampoules scellees. L'acide acetique est ensuite evapore, puis le contenu de 1'ampoule est resuspendu dans 1 ml d'eau distillee. La proline et 1'hydroxyproline sont separes par la methode de Rojkind et Gonzales (Rojkind M et Gonzalez E, An improved method for determining specific radioactivities of proline-14C and hydroxyproline-14C in collagen and in noncollagenous proteins. Analytical Biochemistry 1974 ; 57 (1) : 1-7). Le principe consiste a oxyder la proline et 1'hydroxyproline par la chloramine T. La proline est transformee en pyrroline carboxylate soluble dans le toluene alors que 1'hydroxyproline est transformee en carboxylate soluble dans 1'eau. Apres traitement, les deux fractions proline et hydroxyproline sont recuperees pour chaque echantillon et quantifiees par mesure de la radioactivite.

En conditions normales, les cellules HISM se caracterisent par la quantite de collagene synthetise (figure 23) et surtout, sur le plan qualitatif, par le phenotype des collagenes secretes (figure 24).

Dans des conditions normales, le collagene majoritaire est le collagene de type I. Les collagenes de type III et de type V sont minoritaires. La quantite de collagene de type V est associee a la qualite de 1'organisation de la fibrillogenese.

Le collagene de type III est un"collagene <BR> <BR> <BR> d'alerte ", synthetise en theorie de facon transitoire dans le cas d'une reaction a un stress mais de façon permanente dans le cas d'une fibrose. La quantite proportionnelle de collagene de type III par rapport au collagene de type I augmente de facon importante dans les situations de reponse a une lesion tissulaire, un stress ou une agression comme par exemple des radiations ionisantes. Le collagene de type III devient

preponderant dans les matrices des tissus presentant une reaction fibrotique aigue comme chronique. Ce collagene peut etre considere comme un composant signaletique de la reaction fibrotique.

Lorsque les cellules HISM sont cultivees dans des conditions temoins c'est a dire sans RGTA, elle synthetisent ces trois types de collagenes (figure 24).

L'irradiation modifie la quantite (figure 23) et la qualifie (figure 24) des collagenes elabores. La synthese globale de collagene augmente de pres de 50 % (figure 23). La secretion ce collagene de type I et surtout de type II augmente considerablement (respectivement de 50 % et de pres de 500 %). A 1'inverse, la synthese de collagene de type V diminue de plus de 50 %.

La presence de differents RGTA (RGTA 1005 et RGTA 1025) restaure presque à l'identique le comportement temoin des cellules malgre leur exposition a 1'irradiation. La figure 23 montre que la synthese globale de collagene revient a des valeurs normales en particulier pour les conditions de traitements preventifs ou cumules (Prev + Cur). La figure 24 confirme ce retour a une homeostasie de reference en particulier dans le cas des traitements cumules. Les traitements curatifs comme preventifs exercent les memes types d'effets, surtout en ce qui concerne les valeurs des rapports de secretion des collagenes de type I et de type III qui retrouvent des valeurs comparables a celles des cellules temoins. Ces RGTA restaurent le fonctionnement des cellules HISM vis a vis des collagenes.

Ils agissent également sur la survie des cellules (figure 25). L'irradiation provoque en effet une mortalite cellulaire importante de plus de 50 % de la population irradiée. En presence des polymeres, un effet protecteur net est enregistre puisque la mortalite

est reduite a environ 25 %, effet le plus marque etant obtenu pour les traitements cumules preventif + curatif.

EXEMPLE 13___Action comme agents antifibrotiques en modulant la croissance des cellules mesenchvmateuses comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes ou les cellules hépatiques et la qualite du type de collaqene qu'elles secretent.

Comme expose dans 1'exemple 12 precedent, la fibrose traduit une alteration de la croissance des cellules mesenchymateuses associee a une modification de la quantite et de la qualite des collagenes synthetises.

Ce exemple utilise un autre modele cellulaire que sont les cellules musculaires lisses d'aorte de porc. Ces cellules sont obtenues selon la methode des explants a partir d'aortes. L'aorte est composee de 3 couches cellulaires : 1'adventice (couche externe) qui contient les cellules fibroblatiques, la media (couche centrale) qui contient les cellules musculaires lisses (CML) et 1'intima (couche interne) qui contient les cellules endotheliales.

La media, apres prelevement est dilaceree en petits morceaux. Les explants sont mis en culture en flasque 25 cm2 contenant du DMEM 1 g/L de glucose, avec rouge de phenol, additionne de 20% de serum de veau foetal (SVF), 1% de L-glutamine et 1% de penicilline- streptomycine. Les cellules se detache de ces explants et vont coloniser le milieu (stade PO). Au bout de 2 semaines de mise en culture, les cellules sont congelees a une densite cellulaire de 2 millions de cellules dans du DMSO 10 % et DMEM 20% SVF.

Les cinetiques de croissance sont effectuees en évaluant le nombre de cellules par puits a 1'aide du compteur automatique de particules (Coulter Counter ZM, Coultronics) etalonne prealablement par une evaluation

du diametre des cellules a 1'aide d'urie cellule de Malassez. Chaque comptage est realise sur une moyenne de 4 puits a partir desquels les cellules sont detachees a 1'aide de 500 microL/puits d'une solution de trypsine- EDTA (lOmM).

Les CML sont ensemencees dans les memes conditions d'experimentation que les cellules HISM. Les cinetiques de croissance sont realisees en presence ou non de polymeres des series RGTA 1000 a 1025 pour les polymeres ou Z est rien, et quand Z existe, pour les series des RGTA 1110 a 1115 ou d'heparine a titre de controle, aux differentes concentrations allant de 0, 4 a 400 mg/mL.

Le pourcentage d'inhibition de la proliferation est calcule selon la formule suivante : I% = 100 x (1 - croissance nette avec polymeres)/croissance nette temoin) ou la croissance nette représente la différence entre la quantite de cellules denombrees lorsqu'elles sont a confluence avec le nombre de cellules ensemencees en debut de mise en culture.

Le temoin correspond aux cultures de CML en absence de polymères. L'héparine et les RGTA representent les différents effecteurs testes, susceptibles de modifier 1'activite biologique de la cellule.

Dans les mêmes conditions que les cellules HISM, la synthese et le typage des collagene par les CML a ete realise.

La figure 26 presente les resultats obtenus.

Les RGTA exercent un effet inhibiteur sur la proliferation des cellules musculaires lisses comparable a celui de 1'heparine utilisee comme molecule de reference controle comme 1'illustrent les valeurs des deux premieres colonnes. Cependant et a la différence de

1'heparine, ces polymeres retablissent Ie phenotype de secretion des collagenes. En effet le taux de synthèse global des collagenes est significativement diminue en presence des RGTA 1005,1012 et 1013. Sur le plan qualitatif, ces memes polymeres a 1'inverse de 1'heparine diminue le taux de synthese de collagenes de type I et de type III alors qu'ils augmentent la secretion de collagene de type V.

Ces effets confirment les proprietes antifibrotiques des polymeres de 1'invention.

EXEMPLE 14 : Effets des RGTA sur la regeneration de la peau de rat.

Cet exemple illustre 1'effet des RGTA sur la cicatrisation cutanee profonde apres suture chez le rat.

Des rats males Hairless de 250 grammes sont anesthesies par une injection IM de Ketamine et de Largactil. Deux excisions de 3 cm sont pratiquees lateralement par rapport a 1'axe de symetrie dorsal des animaux de chaque cote de la colonne vertébrale (figure 27). Par rapport aux animaux temoins non traites par le RGTA 1012, les animaux traites recoivent en intra musculaire une injection d'une solution de RGTA 1012 a 1 milligrammes par kilogramme 30 minutes avant 1'excision et 100 microlitres d'une solution a 100 microgrammes par millilitre en application topique sur la plaie juste avant la suture. La suture est effectuee en un seul plan par un surjet intradermique au prolene 2-0. Les rats traites et controles sont macrophotographies aux jours 7,21 et 60 apres 1'operation. A chacun de ces delais, trois rats de chaque serie experimentale sont euthanasies en vue d'une etude histologique des prelevements cutane cicatriciels.

La figure 27 montre les effets des RGTA sur la cicatrisation cutanee :

- Figure 27-A : Incision cutanee profonde realisee jusqu'au plancher musculaire sousjacent de 3 cm de long de part et d'autre de la colonne vertébrale.

- Figure 27-B : Vue dorsale de 1'animal apres suture des berges de la plaie par surjet - Figures 27-C : Aspect des cicatrices apres dix jours après le traitement. C1 et C2 correspondent a un animal controle, traite par du serum physiologique sans RGTA 1012. En C1 les fils n'ont pas ete enleve au contraire de la photographie C2. La cicatrice est visible et presente encore des croutes de sang coagule en particulier au iveau des traces des aiguilles utilisees pour la suture. C3 et C4 correspondent a un animal traite par du serum physiologique contenant du RGTA 1012. Dans le même temps les cicatrices ne sont plus visibles. Les fils de la suture sont visibles sur la figure C3 alors qu'ils ont ete enleves sur la figure C4. Sur cette photographie seul un fin lisere marque 1'incision d'origine.

- Figures 27-D : Analyse histologique. D1 et D2 presentent les coupes histologiques de la peau ayant ete incisee 60 jours au prealable. Dl correspond a un animal controle, traite par du serum physiologique sans RGTA 1012, la figure D2 a a un animal traite par du serum physiologique contenant le RGTA 1012. En D1, le derme sous jacent a un epithelium encore imparfaitement mature n'a pas retrouve une structure identique a celle d'une peau normale. Le remodelage est tres partiel. A 1'inverse, en D2 la peau a retrouve une structure et une organisation identique a celle d'une peau qui n'aurait jamais ete lesee. La seule trace d'une cicatrice est visible dans la profondeur du derme qui laise encore detectee une zone incompletement remodelee. Dans ce dernier cas, il y a absence totale de cicatrice externe.

Les photographies de la figure 27 montrent au bout de 7 jours la disparition de cicatrice superficielle que les fils aient (C4) ou non (C3) ete enleves alors que les animaux controle laissent apparaitre une cicatrice dans les deux conditions precitees (Cl et C2).

Une analyse histologique pratiquee a 60 jours montre que les peaux des animaux non traites (D1) presentent un derme absolument pas mature alors que les animaux traites par les RGTA ne laissent apparaitre qu'une legere trace dermique en profondeur. L'histologie de la peau des animaux traites (D2) est d'un aspect comparable a une peau d'un animal temoin non soumis a un quelconque processus cicatriciel. Dans ce modele, les RGTA non seulement accelerent la vitesse de cicatrisation du plancher cutane mais aussi et surtout permettent un remaniement du tissu cicaticiel qui aboutit a un tissu regenere dans lequel aucune trace de fibrose n'est détectable. Ils apparaissent avec cet exemple comme des regulateurs particulierement puissants de 1'homeostasie tissulaire.

Exemple 15 : Effets de protection contre l'ischémie par les RGTA.

Cet exemple illustre avec le polymère RGTA 1005 demontre les effets de protection des RGTA contre la souffrance tissulaire qui permettent de conserver 80 % de la masse d'un organe en comparaison des organes non traites (figure 28). Ces effets de protection des RGTA contre les effets deleteres provoques par le stress induit par un manque d'apport d'oxygene resultant d'une ischémie des muscles sont presentes dans 1'experimentation decrite ci-dessous.

Le modele utilise est inspire du modele decrit par Hansen-Smith, F. M., Carlson, B. M., & Irwin,

K. L. (1980, Revascularization of the freely grafted Extensor digitorum Longus muscle in the rat. Am. J. Anat. 158,65-82). La procedure experimentale consiste a sectionner le tronc neurovasculaire des muscles EDL (Extensor Digitorum Longus) sur les deux pattes arrieres de rats adultes Wistar (350g) au niveau de son entree dans le muscle et a completer 1'ischemie par une ligature des deux tendons. Une injection de 100 microlitres d'une solution de RGTA 1005 a 50 microgrammes par millilitre dans du serum physiologique est alors effectuee directement dans un muscle EDL. Dans 1'autre muscle controlatéral, le même volume de serum physiologique sans RGTA est injecte.

7 jours apres 1'injection, les muscles sont retires et examines apres preparation histologique au microscope. Dans chaque groupe de muscle, traite et non traite, un ensemble de parametres tels le diamètre moyen du muscle, 1'epaisseur de 1'epimysium, de la zone peripherique, Ie diametre moyen de la zone ischemiee a ete mesure a 1'aide d'un objectif x10 et d'une echelle micrometrique. Le nombre de couches de fibres musculaires ayant survecu a 1'ischemie dans la zone peripherique a ete compte sur trente champs differents pris au hasard et observes a 1'aide d'un objectif x20.

La figure 28 montre les effets protecteurs des RGTA (RGTA 1005) contre la souffrance tissulaire dans un modele d'ischemie musculaire chez le rat. La figure 27-A et la figure 27-B montrent respectivement deux coupes histologiques de muscles de rats controle (27-A) et traite (27-B) par une solution de RGTA 1005.

Chez le controle, 1'ischemie a provoque la degenerescence des fibres musculaires a 1'exception d'une couronne de fibres peripheriques au contact de 1'epimysium. L'administration de RGTA 1005 limite de facon considerable la degenerescence des fibres

musculaires situees en profondeur tout comme elle diminue de facon tres significative la reaction inflammatoire et les degradations qu'elle provoque. Le RGTA 10015 preserve donc les cellules des effets deleteres provoques par 1'ischemie.

On observe sur la figure 28 qu'apres une semaine, le diametre moyen n'est pas modifie apres traitement au RGTA (5, 2 +/-0. 3mm) par rapport au diametre (5, 1+/-0, 2mm) d'un muscle temoin non lese. La reaction inflammatoire dans 1'epimysium est diminuee dans les muscles traites au RGTA d'une maniere tres significative puisque les epaisseurs des epimysiums sont de 10 +/- 5 micrometres avec traitement par le RGTA en comparaison de 85 +/- 10 micrometres sans traitement avec du RGTA (p<0.01). La zone centrale ischemiee des muscles EDL non traites au RGTA presente un diametre moyen de 4, 4000 +/- 100 micrometres dans laquelle les fibres musculaires ont completement disparu. Cette zone est entouree d'une zone peripherique de 270 +/- 50 micrometres contenant une moyenne de 3. 2 +/- 0. 5 couches de fibres musculaires. Le traitement au RGTA est caracterise par une nette diminution de 1'importance de la zone centrale degeneree dont le diametre moyen est de 3600 micrometres +/-200 (p<0.05) et d'une augmentation de la zone peripherique dont 1'epaisseur est de 700+/- 40 (p<0.05) micromètres et qui contient 8. 3 +/-1. 8 p<0. 01) couches de fibre.

EXEMPLE 16 Effets des RGTA sur la regeneration des os longs.

Cet exemple illustre la reconstruction d'un defaut osseux, pratique dans le tube diaphysaire d'un femur de rat, a 1'identique avec au bout de 8 semaines et mieux a 12 semaines une reconstitution d'un canal

medullaire identique a celui d'origine et de corticales matures comme dans 1'os non fracture d'origine (figure 29).

Des rats males Wistar (Ico : WI (IOPS AF/Han), Iffa Credo) de 275 a 325 grammes sont utilises. L'etude est realisee en accord avec les recommandations de la CEE sur le travail sur animal (decret 87-848 - 04/19/1987). Sous anesthesie, par injection de pentobarbital de sodium, lue fémur est aborde lateralement. Les tissus musculaires et periostiques sont desolidarises du tube diaphysaire. Une plaque en polyethylene de haute densifie est fixee a la surface du femur par des broches de Kirschner. Un defaut segmentaire de 5 millimetres esfc pratique au milieu de la diaphyse femorale. Un implant et insere a la place du defaut osseux avant suture des tissus. Cet implant correspond a une matrice osseuse allogenique demineralisee preparee avec des diaphyses femorales d'autres rats selon la procedure decrite par F. Blanquaert et coll. (1995, Bone 17 : 499-506), impregnee ou non de RGTA 1012 par incubation dans une solution saline comprenant 100 microgrammes par millilitre de ce produit. Les animaux sont ensuite maintenus en cage sans contrainte deambulatoire. Les femurs des animaux sont radiographies toutes les deux semaines pendant 12 semaines avant d'etre euthanasies.

Les femurs sont alors preleves et soumis aux traitements necessaires a une etude histologique. Les radiographies sont etudiees en particulier au niveau de leur densitome trie par analyse d'images.

La figure 29 montre les effets des RGTA sur la regeneration des os longs et rapporte plus particulierement les etudes histologiques et radiographiques de femurs de rat traites ou non par du RGTA 1015.

La figure 28-A présente le modèle de defaut pratique dans la diaphyse femorale.

Les figures 28-B, 28-D, 28-F et 28-H representent des radiographies de femur de differents groupes experimentaux. Les figures 28-C, 28-E et 28-G representent des coupes histologiques des pieces operatoires correspondant respectivement aux spécimens presentes en 28-D, 28-F et 28-H.

Sur les figures 28-C et 28-D, on observe que le défaut fémoral nta reçu aucun traitement particulier.

Il n'y a pas eu en 12 semaines de phenomene cicatriciel et le fut osseux n'est pas reconstitue.

Sur les figures 28-E et 28-F, on observe que le défaut osseux a ete comble par de la matrice osseuse demineralisee. Dans ce cas, le comblement est effectue mais aucun remaniement n'est observable. La structure de comblement ne presente pas 1'organisation d'un os long traditionnel.

Sur les figures 28-G et 28-H, on observe que le défaut osseux a ete comble par de la matrice osseuse demineralisee impregnee dans une solution de RGTA 1015.

Dans ce cas, la structure des tissus de comblement correspond a celle d'un os normal. L'os compact cortical est en relation avec la zone non lesee dans laquelle on peut voir 1'empreinte des vis de fixation. Cette partie délimite une cavite remplie de moelle osseuse en continuite avec la cavite medullaire d'origine.

Les figures 28-Il, 28-12, 28-il et 28-J2 montrent 1'effet du RGTA 1015 sur la vitesse de reformation de 1'os long. Les radiographies I1 et 12 sont prises a 8 semaines, les radiographies J1 et J2 a 12 semaines. I1 et J1 correspondent au traitement presente en 28-E et 28-F où le défaut osseux a ete seulement comble par de la matrice osseuse demineralisee san. RGTA. I2 et J2 correspondent au traitement presente en 28-G et 28-H où le défaut osseux a ete comble par de

la matrice osseuse demineralisee impregnee dans une solution de RGTA 1015. Ces radiographies montrent une acceleration de la cicatrisation et surtoute de la maturation des os reformes surtout en ce qui concerne une corticalisation nette (I2 et J2) non detectable en I1 et J1. Le RGTA 1015 agit comme un agent de regeneration qui permet de reconstituer, dans un delai accelere, une structure osseuse d'os long identique a la structure de 1'os d'origine.

Ainsi donc et de facon etonnante, le RGTA 1012, impregne dans la matrice osseuse demineralisee en comparaison d'une matrice impregnee dans du serum physiologique sans le polymere induit une acceleration tout a fait significative sur les processus de remodelage et de maturation osseuse. Cet effet se manifeste par llapparition de nouvelles corticales apres seulement 8 semaines alors que dans les conditions controles ce phenomene ne se deroule pas. Apres 12 semaines, six des sept animaux traites par 1'association avec du RGTA 1012 presentent a 1'etude radiologique les evidences d'une union complete du defaut avec la reformation de corticales épaisses et delimitees tandis que sans le CM1DS2 seule 1'union est observee avec des images radiologiques d'os immature sans corticalisation.

Une etude quantitative en analyse d'image des radiographies confirme ces observations. Cette etude precise par ailleurs que le profil des os traites par le RGTA 1012 est comparable a celui d'un os normal, a la seule difference que le materiel osseux est d'une densite relativement plus faible dans les delais experimentaux consideres de 12 semaines. La projection de la densite de l'os néoformé dans le defaut d'origine revele que le traitement par le polymere RGTA 1012 induit un remodelage tissulaire a travers la reformation de corticale et d'un canal medullaire.

Les etudes histologiques correlent et confirment les resultats etablis par analyse d'image des donnees radiologiques. Ces etudes histologiques démontrent la presence de nouvelles corticales constituée d'os compact avec encore quelques regions de moelle et la presence d'un canal medullaire en continuite avec le fut diaphysaire d'origine, rempli de nouvelle moelle osseuse. Les femurs traites sans RGTA 1012 ne montrent aucune figure de maturation. L'os reconstitue ne presente pas d'organisation particuliere.

Il est constitue d'un melange hefcerogene d'os compact et de tissu medullaire sans delimitation particuliere du territoire.

Ces resultats illustre les effets osteoindueteurs des polymeres de 1'invention sur leur capacite a induire non seulement la réparation des os longs mais aussi et surtout leur potentiel a reguler 1'homeostasie des fcissus regeneres au niveau de leur masse comme de leur remodelage.

Les propriétés des RGTA comme agent regulateur de 1'homeostasie des tissus osseux, c'est a dire sur la masse tissulaire, sa fonctionnalite et son remodelage sont confirmees par 1'exemple 17 ci-apres.

EXEMPLE 17 : Effets des RGTA, sur le remaniement et la protection de la masse osseuse dans un modele de parodontie aigue chez le hamster.

Le modele utilise dans cet exemple concerne le remaniement osseux de la mandibule de Hamster.

Une parodontie est induite chez des Hamsters dores de Syrie (centre d'elevage Depre, references HSM 41/50) après deux mois d'une alimentation hyperglucidique. Le regime administre se compose de saccharose (56 %), lait en poudre ecreme (28 %), farine

complete de ble (6 %), levure de biere (4 %, luzerne en poudre (3 %), poudre de foie (1 %) et chlorure de sodium (2 %).

Les animaux sont repartis en groupes experimentaux. 14 animaux constituent les groupes temoins qui reçoivent une alimentation normale a base de biscuit et de croquette. 24 animaux constituent les groupes experimentaux soumis au regime hyperglucidique.

Ils développent une parodontie chronique etablie au bout de deux mois. Les groupes expérimentaux reçoivent après ce delai, chaque semaine pendant 3 semaines, une injection intramusculaire de RGTA 1005 a differentes doses comprises entre 0, 1 et 15 milligrammes par kilogramme sous un volume de 0, 5 millilitres de serum physiologique tamponne. Les groupes contrôles reçoivent une injection de serum physiologique sans RGTA 1005 (SHAM). Le poids des animaux est releve chaque semaine.

Un mois apres chaque type de traitement, les animaux sont sacrifies, les mandibules prelevees et preparees pour une etude histologiques. Les inclusions des pieces operatoires sont realisees dans du methyl metacrylate stabilise.

Dans ce modele de parodontite, seuls 200 micrometres sont exploitables en hauteur pour chaque hemimandibule. Le système est standardisé de façon etudier toujours la même séquence de coupes a une profondeur definie et reperee par le tissu osseux compris entre les racines des deux premières molaires du cote lingual.

La maladie parodontale, au niveau de ces molaires se manifeste par 1'apparition d'une poche parodontale qui delimite un volume rempli de plaque bacterienne. Cette maladie entraine une destruction importante de 1'os parodontal qui se caracterise par une importante resorption osteoclastique et une reduction

des surfaces osseuse en apposition c'est a dire a une phase d'osteosynthese.

La résorption osseuse est quantifiee en mesurant les zones de contact entre 1'os et les osteoclastes (Oc). Ce sont des cellules geantes colorees en bleu par le bleu de toluidine. L'apposition quant a elle se caracterise par une bande de tissu osteoide, identifiee par une coloration bleu attenuee recouverte d'osteoblastes. A 1'inverse des OC, les osteoblastes sont des cellules de petite taille, de forme cubique et mononuclees. Les quantifications de ces phenomenes se font a 1'aide d'une station d'imagerie assistee d'un logiciel de traitement d'images.

La figure 30 presente les quantifications obtenues dans les differentes conditions experimentales.

Chez les animaux temoins qui n'ont pas developpe la maladie, 1'activite de la resorption est quasiment nulle alors que celle de 1'apposition est importante. Chez les animaux non traites (SHAM), la maladie est fortement developpee et se caracterise par une forte resorption et un faible taux d'apposition. Chez les animaux traites par du CM1DS2, et en particulier a la dose de 1, 5 milligrammes par kilogramme, le taux de resorption est fortement diminue et est associe a une augmentation tres importante du taux d'apposition qui atteint pres de 80 % du taux etabli chez les témoins.

Ces effets sont obtenus par injection intramusculaire. Ils montrent que les RGTA regulent la masse du tissu osseux en reequilibrant la balance du remodelage entre la resorption et 1'apposition.

EXEMPLE 18 : Données pharmacocinétiques montrant les proprietes des RGTA pour vectoriser des molecules vers des tissus leses.

Cet exemple illustre la capacite que presentent les polymeres de 1'invention a se fixer de façon spécifique et a se concentrer au niveau des sites de souffrance tissulaire.

Dans le modèle de la regeneration du muscle soumis a un ecrasement, decrit dans 1'exemple 7, une lesion est pratiquee sur 1'EDL de la patte gauche des animaux. Chaque animal recoit une injection intraveineuse de 2 10 6 cpm de RGTA 1012 radiomarque au tritium par les soins de la societe SibTech, Inc. (NY, USA). L'activite specifique de ce traceur est de 20 milliCurie par milligramme.

A differents temps post-operatoires, les muscles EDL lésés des pattes gauches et ceux non leses des pattes droites sont preleves et congeles dans 1'azote liquide. La realisation de coupes histologiques en congelation permet grace a un beta imager (Societe Biospace) de mesurer la quantite de produit radiomarque fixe au niveau des coupes des tissus etudies. Les resultats rapportes dans le tableau V ci-dessous montre que les muscles leses concentrent des 24 heures une quantite de produit radioactif environ 5 fois plus elevee que les muscles non leses dont le niveau de marquage ne differe pas du bruit de fond de 1'appareil.

Tableau V cpm de RGTA 1012 fixe au niveau des tissus Temps post- 24 heures 48 heures 96 heures opératoires Tissu musculaire 11800+/-890 10150+/-1020 9000+/-790 lese Tissu musculaire 2060+/-530 1980+/-390 1870+/-640 temoin controlateral Bruit de fond de 1800+/-160 1780+/-210 1950+/-180 l'enregistrement

Ces resultats demontrent les capacites d'autociblage des polymeres de 1'invention qui se concentrent specifiquement au niveau des tissus presentant une souffrance ou une lesion. Une propriete particulierement interessante de ces polymeres reside donc également dans leur capacite de vectorisation d'un principe medicamenteux ou de diagnostic.

Exemple 19 : Effets du RGTA en parodontie et sur la masse osseuse.

Dans le domaine de la parodontie, une etude macroscopique de la perte d'os alveolaire a ete menee sur la parodontite du hamster.

Apres une periode d'induction de la maladie de 2 mois, des animaux (n=20) ont ete traites par voie IM pendant 2 autres mois, sans agir sur la cause initiale de la maladie, c'est a dire la composante bacterienne. D'autres animaux sont restes non traites (n=20). Ces 2 groupes ont ete compares a des hamsters sains (pas de parodontite) (n=12).

A la fin de la periode experimentale, les maxillaires superieurs ont ete decharnes pour mettre en evidence la perte osseuse. La zone de la lere molaire a ete photographiee de façon standardisée. Sur chaque photo, une ligne de reference a ete tracee, elle correspond à la jonction email-cement. Puis a ete tracee une seconde ligne qui epouse les contours de la crete osseuse. Ces deux lignes ont ete reunies en avant et en arriere de la lere molaire. Cette surface a ete mesuree.

Il faut remarquer que chez les témoins, il y a une zone de denudation de la racine qui correspond : a une zone d'insertion fibreuse, physiologique, qui ancre la gencive sur la racine, - a une perte de hauteur d'os qui se produit en rapport avec le vieillissement des animaux.

Cette denudation represente chez nos animaux 0, 96 mm2.

Chez les animaux atteints, la perte d'os est de 1,34 mm², ce qui inclut la zone physiologique initiale (qui se détruit au cours de la parodontite) et une partie de la perte due au vieillissement. Neanmoins, nous pouvons considerer que la maladie a provoque une perte d'os de 1'ordre de 0,38 mm2 (différence : p<0, 0001).

Chez les traites, il y a toujours une zone incompressible (idem temoins). La denudation de la racine représente 1,02 mm² chez ces animaux. Il y a donc un déficit net par rapport aux temoins de 0,06 mm² (difference non significative), et une amelioration de 0,32 mu2 par rapport aux non traites (p = 0, 0005).