Petersen, Holger (Neuhäuser Weg 1/3 Weil am Rhein, 79576, DE)
Kissel, Thomas (Im Steiner 9 Marburg, 79219, DE)
Petersen, Holger (Neuhäuser Weg 1/3 Weil am Rhein, 79576, DE)
| 1. | Kopolymer bestehend aus einer Komponente A und einer Komponente B, wobei Komponente A ein nicht oder nur gering biologisch abbaubares Polymer ist, dessen Molekulargewicht bevorzugt so klein ist, dass es über die Nieren eines Menschen oder tierischen Säugers ausgeschieden werden kann, und Komponente B ein Poly mer ist, dessen Molekulargewicht so klein ist, dass es über die Nieren eines Menschen oder tierischen Säugers ausgeschieden werden kann und/oder welches biologisch abbaubar ist und/oder welches biologisch wirksam ist, wobei A und B chemisch so miteinander verbunden sind, dass die Bindung enzymatisch oder hydrolytisch gespalten werden kann und wobei A und B gleich oder verschieden sein können. |
| 2. | Kopolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass A und B gleich oder verschieden sind und ein kationisches, anionisches oder neutrales Polymer sind. |
| 3. | Kopolymer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass Komponente A ein kationisches Polymer, bevorzugt ein Polyethylenimin ist. |
| 4. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente A ein Molekulargewicht von 100 Da bis 20 kDa, bevorzugt 0,5 bis 5 kDa, insbesondere 0,8 bis 1,2 kDa, hat. |
| 5. | Kopolymer nach einem mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Komponente B ein anionisches Polymer, bevorzugt ein Polymer einer Hy droxycarbonsäure ist. |
| 6. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Komponente B ein pharmazeutischer Wirkstoff, geeignet zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung ist. |
| 7. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente B ein Molekulargewicht von 100 Da bis 20 kDa, bevorzugt 800 Da bis 2 kDa, aufweist. |
| 8. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen den Komponenten A und B durch Enzyme eines Menschen oder tierischen Säugers gespalten werden kann. |
| 9. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen den Komponenten A und B durch Esterasen, Peptidasen, AminoacylpeptidHydrolasen, Glycosi dasen, Phosphatasen oder Lipasen gespalten werden kann. |
| 10. | Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen den Komponenten A und B eine Ester, Glyco sid, Säureamid, Thioesteroder eine Disulfid bindung ist. |
| 11. | Verfahren zur Herstellung eines Kopolymers nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10 durch chemische Bindung der Komponenten A und B über eine oder me hrere chemisch reaktive Gruppen. |
| 12. | KopolymerWirkstoffKomplex gebildet aus einem Kopolymer nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10 und einem Wirkstoff. |
| 13. | KopolymerWirkstoffKomplex nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Wirkstoff um eine oder mehrere Substanzen handelt, die zur Diag nose, Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung, des Menschen oder tierischen Säugers verwendet werden können. |
| 14. | KopolymerWirkstoffKomplex nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine Nuk leinsäuresequenz ist. |
| 15. | Verfahren zur Herstellung eines KopolymerWirkstoff Komplexes nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14 durch Vermischung von Kopolymer und Wirkstoff unter Erhalt einer kolloidalen Lösung, bzw. Suspension. |
| 16. | Verwendung eines KopolymerWirkstoffKomplexes nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14 zur Her stellung eines pharmazeutischen Mittels. |
| 17. | Verwendung eines KopolymerWirkstoffKomplexes nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14 zur Verabreichung eines Wirkstoffes in eine Zelle oder einen Organismus. |
| 18. | Verwendung eines KopolymerWirkstoffKomplexes nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14 zur Her stellung eines pharmazeutischen Mittels zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung eines Men schen oder tierischen Säugers. |
| 19. | Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krank heit, wobei zumindest ein Wirkstoff nach Maßgabe der Krankheit selektiert wird, wobei dieser Wirkstoff mit einem Kopolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kom plexiert wird, wobei ein dabei erhaltener Wirkstoff KopolymerKomplex optional mit nach Maßgabe einer se lektierten Darreichungsform mit Hilfsund/oder Trägerstoffen galenisch hergerichtet wird und wobei das so erhaltene galenisch hergerichtete Produkt einem Patienten in einer physiologisch wirksamen Dosierung dargereicht wird. |
| 20. | Bioabbaubares Kopolymer, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch erhältlich, daß A) 1 bis 99 Gew.%, insbesondere 10 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 30 bis 70 Gew.%, eines ersten synthe tischen Polymers und B) 1 bis 99 Gew.%, insbesondere 10 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 30 bis 70 Gew.%, eines zweiten synthe tischen oder natürlichen Polymers, C) 0 bis 99 Gew. %, insbesondere 0 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 0 bis 70 Gew.%, eines oder mehrerer voneinander verschiedener weiterer synthetischen oder natürlichen Polymere, welche verschieden von A) und B) sind, miteinander umgesetzt werden, wobei die Summe der Gewichtsanteile der Komponenten A) bis C) stets 100% ergibt, wobei die Komponenten A) und B) gleich oder ver schieden sein können, wobei das Polymer A und das Polymer B sowie ggf. das Polymer C oder die Polymere C jeweils zumindest eine reaktive Gruppe aufweisen, welche mit einer reaktiven Gruppe eines anderen Polymers ein Reaktionsgruppenpaar bildend miteinander zu einer hydrolytisch oder enzyma tisch spaltbaren Bindung reagieren. |
| 21. | Bioabbaubares Polymer nach Anspruch 20, wobei ein Reaktionsgruppenpaar ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus"COOH/OH,COOH/NH2,COOH/NH, COSH/OH,SH/SH,COH/OH,CO/OH,CO/NH, und CO/NH2", wobei""für eine Bindung zu einem CAtom steht und wobei ein Element eines Reaktionsgruppen paares oder beide Elemente optional aktiviert ist. |
| 22. | Bioabbaubares Polymer nach Anspruch 21, wobei die Kom ponenten A und/oder B 1 bis 50 oder 200, vorzugsweise 1 bis 10, höchstvorzugsweise 2 bis 5, reaktive Gruppen tragen. |
| 23. | Bioabbaubares Polymer nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Molekulargewicht zumindest das 1fache der Summe der Molekulargewichte der Komponenten A und B, vorzugsweise zumindest das 3fache, bis zu das 100fache, beträgt. |
| 24. | Verfahren zur Herstellung eines bioabbaubaren Kopoly mers, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei A) 1 bis 99 Gew.%, insbesondere 10 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 30 bis 70 Gew.%, eines ersten synthe tischen Polymers und B) 1 bis 99 Gew.%, insbesondere 10 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 30 bis 70 Gew.%, eines zweiten synthe tischen oder natürlichen Polymers, C) 0 bis 99 Gew. %, insbesondere 0 bis 90 Gew.%, vorzugsweise 0 bis 70 Gew.%, eines oder mehrerer voneinander verschiedener weiterer synthetischen oder natürlichen Polymere, welche verschieden von A) und B) sind, miteinander umgesetzt werden, wobei die Summe der Gewichtsanteile der Komponenten A) bis C) stets 100% ergibt, wobei die Komponenten A) und B) gleich oder ver schieden sein können, wobei das Polymer A und das Polymer B sowie ggf. das Polymer C oder die Polymere C jeweils zumindest eine reaktive Gruppe aufweisen, welche mit einer reaktiven Gruppe eines anderen Polymers ein Reaktionsgruppenpaar bildend miteinander zu einer hydrolytisch oder enzyma tisch spaltbaren Bindung reagieren. |
Die vorliegende Erfindung betrifft bioabbaubare Po- lymere bzw. Kopolymere, Polymer-bzw. Kopolymer-Wirkstoff- Komplexe mit denen Wirkstoffe in einen Organismus bzw. in Gewebe, Organe und Zellen übertragen werden können, weitere Verwendungen der Polymere/Kopolymere und der ent- sprechenden Wirkstoffkomplexe, sowie Verfahren zur Her- stellung der Polymere/Kopolymere bzw. der Polymer-/Kopolymer-Wirkstoff-Komplexe.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik Kationische Polymere wie beispielsweise Poly-L-Lysin (Biotherapy 3 : 87-95, 1991), DEAE-Dextran (Mol. Cell. Biol.
5 : 1183-1193,1985), Dendrimere (Bioconjugate Chem.
4 : 372-379,1993), kationische Methacrylsäure-Derivate (Hum. Gene Ther. 7 : 2123-2133,1996) oder Polyethylenimine (PEI) sind z. B. in der Lage, Komplexe mit Nukleinsäurese- quenzen zu bilden und diese zu kondensieren. Über derar- tige Komplexe können Nukleinsäuresequenzen dann in Zellen eingeschleust werden (Acc. Chem. Res. 26 : 274-278,1993 ; Bioconjugate Chem. 5 : 382-389,1994). Das Ausmaß dieser Einschleusung wird gemessen an der Transfektionsrate, d. h. dem Anteil von Zellen, in welchen die jeweiligen Nuklein- säuresequenzen eingeführt und wirksam werden konnten.
Als besonders wirksam hat sich in dieser Hinsicht <BR> PEI erwiesen (Gene Therapy 3 : 1074-1080 (1996) ). Jedoch ist die Transfektionsrate bei PEI stark abhängig von dessen Molekulargewicht. Hochmolekulare PEI-Polymere mit Moleku- largewichten gleich oder größer 25 kDa bewirken eine hohe Transfektionsrate (W096/02655). Ein gravierender Nachteil ist allerdings, dass derartige PEI Moleküle für die Zelle
toxisch sind (Godbey et al. J. Biomed. Mater. Res.
45 : 268-275,1999 ; Hum. Gene Ther. 7 : 1947-1954,1996 ; Pharm. Res. 16 : 1273-1279,1999).
Im Gegensatz hierzu bewirken niedrigmolekulare PEI mit Molekulargewichten gleich oder kleiner 2 kDa fast keine Transfektion, schädigen aber auch die Zellen nicht (Pharm. Res. 16 : 268-275, 1999).
Da eine Reihe von kationischen Polymeren, wie beispielsweise PEI, weder enzymatisch noch hydrolytisch gespalten werden können, ist nach Verabreichung, von hochmolekularen Polymeren dieser Art in einen Organismus mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen, da diese Polymere weder biologisch abgebaut, noch über die Nieren oder den Darm ausgeschieden werden können.
Da sich jedoch hochmolekulare kationische Polymere, wie z. B. PEI, hervorragend für die Übertragung von Nuk- leinsäuresequenzen eignen, wird im Stand der Technik ver- sucht, kationische Polymere zu finden, welche gleichzeitig hoch wirksam aber nicht toxisch sind.
Dieses Ziel konnte zumindest teilweise erreicht wer- den durch die Herstellung, von PEI-Molekülen mit einem Molekulargewicht zwischen 2 kDa und 10 kDa (Pharm. Res.
16 : 1273-1279,1999). Diese PEI-Moleküle bewirken eine gute Transfektionsrate, sind gering zytotoxisch und so klein, dass sie durch die Nieren ausgeschieden werden kön- nen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser niedrigmolekularen PEI-Moleküle sind jedoch auf bestimmte Zellen beschränkt und damit nur äußerst begrenzt für z. B. pharmazeutische Zwecke einsetzbar (Pharm. Res. 16 : 1273-1279,1999).
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, verbesserte Materialien oder Träger zur Verfügung
zu stellen, mit denen Wirkstoffe im breitest möglichen Sinn, wie z. B. auch Nukleinsäuren/Nukleinsäuresequenzen oder Plasmide, in einen Organismus (Zellen, Gewebe, Or- gane) für diagnostische, prophylaktische und/oder thera- peutische Zwecke eingebracht bzw. übertragen werden können. Dabei sollte gleichzeitig eine möglichst ef- fiziente Wirkstoffübertragung und eine möglichst geringe Toxizität der verwendeten Materialien gewährleistet sein.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung Kopolymere mit folgenden Komponenten : A) einem nicht oder nur gering biologisch abbaubaren physiologisch verträglichen Polymer, dessen Molekulargewicht bevorzugt so klein ist, dass es über die Nieren eines Menschen oder tierischen Säugers ausgeschieden werden kann, und B) einem weiteren Polymer, dessen Molekulargewicht so klein ist, dass es über die Nieren eines Menschen oder tierischen Säugers ausgeschieden werden kann und/oder welches biolo- gisch abbaubar ist und/oder welches biologisch aktiv ist, wobei die Komponente A mit der Komponente B chemisch so verbunden ist, dass diese Bindung enzymatisch oder hydro- lytisch gespalten werden kann.
Biologisch abbaubar bedeutet für die Zwecke der vor- liegenden Erfindung biologisch abbaubar im menschlichen oder tierischen Körper. Ein Polymer ist insbesondere dann biologisch abbaubar, wenn innerhalb einer definierten Zeitspanne, bis maximal 24 Monate, nach Gabe einer definierten Menge an Polymer an einen Organismus nur noch zu weniger als 90% (bezogen auf das Gewicht) der einge- setzten Menge an Polymer, vorzugsweise weniger als 50%, höchstvorzugsweise weniger als 10%, in dem Organismus nachweisbar ist. Ein Polymer ist insbesondere dann
biologisch nicht oder nur wenig abbaubar, wenn es im gleichen Organismus nach 24 Monaten zu mehr als 90%, bis zu 100%, nachweisbar ist.
Unter enzymatischer Spaltung wird bevorzugt die Spaltung durch Enzyme eines Menschen oder tierischen Säugers verstanden.
Bei den Polymeren der Komponenten A und B, die selbst wiederum Kopolymerprodukte sein können, handelt es sich um anionische, neutrale oder kationische Polymere.
Unter kationischen bzw. anionischen Polymeren versteht man Polymere, die bei physiologischem pH die entsprechend geladene Funktionalität aufweisen. Ein typische anionische Funktionalität ist-COO-. Eine typische kathionische Funk- tionalität ist-NH3 Die Komponenten A und B können gleich oder ver- schieden sein. Beispielsweise kann bei Wahl einer ka- tionischen Komponente A, z. B. niedermolekulares PEI, als Komponente B ein anionisches Polymer bevorzugt werden.
Für die Komponente A kommen grundsätzlich alle Polyamine, i. e. mit 2 bis zu beispielsweise 200 primären, sekundären und/oder tertiären Aminogruppen, in Frage, lin- ear, cyclisch oder auch verzweigt, wie beispielsweise im Falle der Polyimine, welche primäre, sekundäre sowie ter- tiäre Amingruppen enthalten. Die Polyamine können Alkyl- Aryl-oder Aralkylamine sein, es ist aber auch möglich, daß diese H-substituiert sind, wozu auf in anderen Zusam- menhängen dargelegte in Frage kommende Substituenten ver- wiesen wird. Die Repetitionseinheiten eines Polyamins können insgesamt oder teilweise an Stelle einer Bindung über eine Amingruppe verbunden sein über in der Po- lymertechnologie übliche andere Bindungen, wie beispiel- sweise über Ester-, Ether, Glykosid-, Amid-, und/oder Urethanbindungen, wobei dann die Amingruppen innerhalb der
Repetitionseinheiten angebracht sind. Beispiele für Polyamine sind Chitosane, Polyamidoamine, beispielsweise PAMAM Dendrimere und Polyaminosäuren, beispielsweise Polylysin.
Die Amingruppen können teilweise oder vollständig verkappt sein, beispielsweise als Ketimingruppe. Dann emp- fiehlt es sich, die verkappten Amingruppen im fertigen Copolymer wieder in der fachüblichen Weise zu freien Amin- gruppen umzusetzen.
Ein bevorzugtes Beispiel für derartige Polymere der Komponente A sind Polyethylenimine (PEI). Dieses PEI kann eine lineare oder eine gering, oder stark verzweigte Struktur haben und ein beliebiges Molekulargewicht auf- weisen. Bevorzugt im Sinne der Erfindung wird jedoch ein PEI mit einer Molekülgröße, welches von den Nieren aus- geschieden wird und damit zugleich nicht zytotoxisch ist.
Demzufolge werden im Sinne der Erfindung Polyamin bzw.
PEI-Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 100 Da und 20 kDa (kdalton) bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Polyamin bzw. PEI-Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 0,5 und 5 kDa, insbesondere bevorzugt sind Polyamin bzw. PEI-Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 0,8 und 1,2 kDa. Im Sinne der Erfindung kann die Komponente A jedoch auch jedes andere biologisch nicht oder nur gering abbaubare Polymer sein, welches bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 100 Da und 20 kDa aufweist.
Bevorzugt wird jedoch ein Molekulargewicht dieses Polymers zwischen 0,5 und 5 kDa.
Beispiele für weitere Verbindungen, welche als Kom- ponente A einsetzbar sind, sind Polypropylendi-bzw. tria- mine (Jeffamine@), Mannich-Basen, Addukte von Aminen an Polymere, wie Polyepoxide, Melaminderivate, Piperazine, Polyoxyalkylenamine und Polyvinylamine.
Als Komponente B können beispielsweise Polymere von aliphatischen oder aromatischen Hydroxycarbonsäuren gewählt werden. Beispiele für aliphatische Hydroxycarbon- säuren sind Hydroxyessigsäure, 1-oder 2-Hydroxypropan- säure, 1-, 2-oder 3-Hydroxybutansäure, 1-, 2-, 3-, oder 4-Hydroxypentansäure, 1-, 2-, 3-, 4-oder 5-Hydroxyhexan- säure. Die vorstehenden Hydroxycarbonsäuren können einfach oder mehrfach H-substituiert sein. In Frage kommende Sub- stitutenten sind beispielsweise C1-C20 Alkyl, linear oder verzweigt, Aryl, C1-C20 Aralkyl, Hydroxy, Carboxy, Thiol und/oder Cyano. Beispiel für eine Arylsubstition ist Hy- droxyphenylessigsäure. Beispiel für eine einfache Carbox- ylsubstitution ist Hydroxybernsteinsäure. Beispiel für eine mehrfache Carboxysubstitution ist 2-Hydroxy-1, 2,3- propantricarbonsäure. Beispiel für eine Hydroxy-und Car- boxysubstitution ist Dihydroxybernsteinsäure. Beispiele für eine aromatische Hydroxycarbonsäure ist 2-Hydroxy- benzoesäure. Beispiel für eine mehrfache Hydroxysubstitu- tion ist 3,4, 5-Trihydroxybenzoesäure. Bezüglich möglicher Substituenten gilt das Vorstehende analog. Des weiteren sind Polymere einsetzbar, welche aus einer ringöffnenden Polymerisation cyclischer Monomere erhältlich sind. Als cyclische Monomere kommen insbesondere in Frage Lactone, Lactame oder Lactide. Lactone sind innere Ester aus Hy- droxycarbonsäuren, beispielsweise vorstehenden Hydroxycar- bonsäuren, insbesondere beta-, gamma-, delta-, gamma-, ep- silon-Hydroxycarbonsäuren. Beispiele für einsetzbare Lac- tone sind Propiolacton, Butyrolacton, delta-oder gamma- Valerolacton und epsilon-Caprolacton. In Frage kommen auch makrocyclische Polylactone, wie beispielsweise PCL (makro- cyclisches Poly-epsilon-caprolacton). Lactame sind cy- clische Amide, welche sich in der Struktur von Lactonen dadurch unterscheiden, daß der Ringsauerstoff durch NH
oder NR ersetzt ist, wobei R beispielsweise C1-C20 Alkyl, Aralkyl oder Aryl, substituiert (s. o. ) oder unsubsti- tuiert, sein kann. Lactide sind cyclische Doppelester aus vorstehend genannten alpha Hydroxycarbonsäuren. Beispiel eine Lactids ist 3, 6-Dimethyl-1, 4-dioxan-2,5-dion. Ein- setzbare Lactone, Lactame oder Lactide können einfach oder mehrfach substituiert sein, wozu auf in Frage kommende Substituenten für Hydroxycarbonsäure-Monomere verwiesen wird. Sofern anwendbar, lassen sich D-oder L-Formen der Monomere einsetzen oder Mischungen dieser Formen.
Bezüglich der Polymerisationsbedingungen sowie ein- setzbarer Katalysatoren wird auf die dem Fachmann geläufige Fachliteratur verweisen.
Allgemein sind für B anionische Polymere bevorzugt, beispielsweise mit einer freien Carboxylgruppe oder mehre- ren freien Carboxylgruppen. Diese Polymere können, insbe- sondere wenn sie biologisch abbaubar sind, ein beliebiges Molekulargewicht aufweisen, bevorzugt werden jedoch Po- lymere mit einem Molekulargewicht zwischen 100 Da und 20 kDa, besonders bevorzugt Polymere mit einem Molekularge- wicht zwischen 800 Da und 2 kDa.
In einer besonderen Ausformung dieser Erfindung, kann die Komponente B des weiteren einen pharmazeutischen einschließlich veterinärmedizinischen Wirkstoff darstel- len, bevorzugterweise ein Peptid oder ein Protein, wie beispielsweise einen Antikörper, oder ein Antigen- bindendes Spaltprodukt eines Antikörpers wie beispiel- sweise ein Fv-Fragment, ein Fab-Fragment oder ein F (ab) 2-Fragment, ein Cytokin, wie Erythropoietin, ein In- terleukin, ein Interferon oder einen Wachstumsfaktor wie vascular endothelial cell growth factor (VEGF) oder fibro- blast growth factor (FGF).
Bei der chemischen Verbindung bzw. Bindung zwischen den Komponenten A und B handelt es sich bevorzugt um sol- che Verbindungen bzw. Bindungen, welche durch Enzyme, die in Zellen oder in Körperflüssigkeiten eines Menschen oder tierischen Säugers anzutreffen sind, gespalten werden kön- nen. Zu solchen Enzymen gehören bevorzugt Esterasen wie beispielsweise Carboxylester-Hydrolasen, Peptidasen, Aminoacyl-peptid-Hydrolasen, Glycosidasen, Phosphor- monoesterasen wie Phosphatasen, des weiteren Lipasen. Zu solchen Enzymen gehören aber auch Enzyme der biologischen Oxidation und Reduktion wie beispielsweise Oxydoreduktasen und Oxygenasen. Eine derartige Verbindung bzw. Bindung zwischen A und B kann beispielsweise sein eine Ester- bindung, eine Glykosidbindung eine Säureamidbindung, eine Thioesterbindung oder eine Disulfidbindung.
Die Komponenten A und B weisen die jeweils für eine der vorstehenden Bindungen komplementären Reaktionsgruppen auf, welche dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, ebenso wie die Reaktionsbedingungen für eine Reaktion der Reaktionsgruppen miteinander, so daß hierzu auf die Fach- literatur verwiesen werden darf. Die jeweiligen Elemente der Reaktionspaare können beliebig an den Komponenten A und B verteilt sein, insbesondere beliebig zwischen A und B vertauscht sein und können entweder durch Substituenten der den Polymeren A und B zu Grunde liegenden Monomere gebildet sein, und/oder endständige Funktionalitäten der Polymere darstellen.
Die als Komponenten A und B zu verwendenden Polymere sowie deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben bzw. im Handel erhältlich.
Des weiteren sind die chemischen Methoden zur Bindung von Komponente A an Komponente B über deren Ami- nogruppen, Hydroxygruppen, SH-Gruppen oder Carboxylgruppen
dem Fachmann geläufig und beispielsweise übersichtlich in Contributions to Oncology Nr 32, Seite 81-84, Karger Ver- lag, 1988 beschrieben. Insofern ist diese Veröffentlichung "incorporated by reference".
Im Rahmen der Erfindung kann das Kopolymer auch aus Mischungen verschiedener Komponenten A und/oder B herg- estellt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Kopolymer-Wirkstoff-Komplexes in Form einer Lösung, einer kolloidalen Lösung oder einer Suspension durch Vermischung eines erfindungsgemäßen Kopolymers mit einem oder mehreren pharmazeutischen oder biologischen Wirkstoffen, wobei die Ladung des Wirkstoffes und seine Hydrophilie, Lipophilie und Amphiphilie von Be- deutung sein können für die Auswahl der Komponenten A und B des erfindungsgemäßen Kopolymers. Ist der pharmazeu- tische Wirkstoff beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz, so ist das Kopolymer bevorzugt insgesamt hydrophil und weist eine kationische Ladung auf, das heißt, es stellt ein kationisches Kopolymer dar.
Beispielsweise wird ein erfindungsgemäßer Komplex aus einem erfindungsgemäßen Kopolymer und einer Nuklein- säuresequenz hergestellt aus einem Kopolymer bestehend aus kleinmolekularen PEI Molekülen (Komponente A), welche über Polyesterbindungen mit dicarboxyliertem Poly (L-lactid) (Komponente B) verbunden sind. Poly (L-lactid) ist biolo- gisch abbaubar und daher ist sein Molekulargewicht im vor- liegenden Fall unkritisch.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kopolymer- Wirkstoff-Komplexe werden pharmazeutische oder biologische Wirkstoffe mit dem Kopolymer bevorzugt im molaren Verhältnis von 100 : 1 bis 1 : 100 (Wirkstoff : Kopolymer, Gewichtsanteile) vermischt. Vorzugsweise wird eine
Mischung von 100 : 1 bis 1 : 10 eingestellt. Nach einem Zei- traum von ca. 10 min. bis 96 Stunden ist der Komplex aus dem Kopolymer und dem Wirkstoff fertiggestellt. Der so entstandene Kopolymer-Wirkstoff-Komplex sollte vorzug- sweise eine leicht positive Gesamtladung, aufweisen.
Die Erfindung umfasst somit auch die beschriebenen Kopolymer-Wirkstoff-Komplexe.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Ver- wendung eines erfindungsgemäßen Kopolymer-Wirkstoff- Komplexes für die Übertragung von Wirkstoffen innerhalb einer Zellkultur auf Zellen oder in Zellen hinein (in- vitro) oder zur Verabreichung des Wirkstoffes in einen Organismus, zur Übertragung des Wirkstoffes in Zellen, Gewebe oder Organe dieses Organismusses bevorzugt zum Zwecke der Diagnose, Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
Die Verabreichung des Kopolymer-Wirkstoffgemisches oder Kopolymer-Wirkstoff-Komplexes kann lokal oder sys- temisch erfolgen. Die lokale Verabreichung kann äußerlich erfolgen, wie beispielsweise auf die Haut oder auf die Schleimhaut. Die Verabreichung, kann jedoch auch oral, nasal, vaginal, durch Inhalation, durch Inspiration, rek- tal oder durch Injektion erfolgen. Die Injektion des Kopolymer-Wirkstoff-Gemisches kann erfolgen in den Blutkreislauf, d. h. beispielsweise intravenös oder in- traarteriell, in ein Organ, in ein Gewebe oder in eine Körperhöhle.
Bei der Verwendung des Kopolymer-Wirkstoff-Komplexes zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung wird je nach Art der zu diagnostizierenden oder zu behan- delnden Erkrankung der Wirkstoff im Kopolymer-Wirkstoff- Gemisch ausgewählt. Ebenso ist die zu verwendende Dosierung bzw. zu verabreichende Wirkstoffmenge vom
Wirkstoff und Verwendungszweck abhängig und grundsätzlich dem Fachmann bekannt oder durch Standardverfahren zu ermitteln.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Er- läuterung der Erfindung. Alle"Anteile"sind Gewichtsan- teile, soweit nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1 : Herstellung einer Komponente B Dicarboxyliertes bifunktionelles Poly (L-lactid) (PLLA) wurde hergestellt durch Polykondensation von L (+) Milchsäure (Fa. Fluka, 90% in Wasser, 20 Anteile) in Anwesenheit von Succin (Bernstein) säure (Fluka, größer/gleich 99, 5%, 1 Anteil). Die Reaktion wurde im Vakuum bei 160°C für 4 Std. durchgeführt und ergab ein klares, hochviskoses Material.
Die Menge des kondensierten Wassers (19 Anteile) ließ auf eine Konversion von 90% der Milchsäure zu Dekameren zurückschließen. Demzufolge sollte das Moleku- largewicht des dicarboxylierten PLLA etwa 1000 Da be- tragen. Das dicarboxylierte PLLA war löslich in Ethanol und Chloroform, jedoch unlöslich in Wasser.
Beispiel 2 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Kopolymers aus dem Produkt des Beipiels 1 und einer käu- flichen Komponente A.
1 Anteil des dicarboxylierten PLLA aus Beispiel 1 wurde mit 1, 2 Anteilen von PEI (Molekulargewicht 1200 Da, 99%, Fa. Polyscience) vermischt und die Mischung bei 160°C für 2 Stunden im Vakuum inkubiert. Das entstandene Kopoly- mer wurde in Ethanol gelöst und in Diethylether präzipit- iert. Lösungsmittelrückstände wurden im Vakuum evaporiert.
Die Ausbeute an Kopolymer betrug, etwa 81%.
Das entstandene orange-rote Kopolymer war löslich in organischen Lösungsmitteln wie auch in Wasser. Unter- suchungen mit dem Kapillar-Viskosimeter (Ubbelohde, Fa.
Schott, TYP No. 50101/Oa) bei 25°C im gefilterten Wasser ergaben für das Kopolymer eine deutliche Zunahme der Viskosität verglichen beispielsweise mit dem Homopolymer PEI (Molekulargewicht 1200).
Beispiel 3 : Hydrolysierbarkeit des Produktes aus Beisp. 2.
Nach Inkubation des in Wasser gelösten Kopolymers aus Beispiel 2 bei 37°C über 20 Tage konnte dessen hydro- lytische Aufspaltung durch die zeitabhängige exponentielle Abnahme der Viskosität belegt werden. Nach etwa fünf Tagen war das Kopolymer weitgehend gespalten. Dieser relativ schnelle Zerfall des Kopolymers kann durch die Aminogrup- pen der PEI-Komponente erklärt werden, durch welche wahr- scheinlich die hydrolytische Spaltung der Esterbindungen des Kopolymers beschleunigt werden. Ein autokatalytischer Abbau der Esterbindungen durch die entstehenden Säuregrup- pen und pH-Wert-Erniedrigung ist unwahrscheinlich, da durch die hohe Pufferkapazität des PEI der pH Wert während des Abbauprozesses weitgehend konstant bleibt (hydroly- tische Spaltung, als Beleg, für biologische Abbaubarkeit).
Beispiel 4 : Prüfung der Toxizität des Produktes aus Beispiel 2.
Die Toxizität des Kopolymers aus Beispiel 2 auf Zel- len wurde, wie von Fischer et al. (Pharma Res. 16 : 1273-1279,1999) bereits für die Zytotoxizitätsprüfung von PEI beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurden L929 Mausfi- broblasten unter den dem Fachmann geläufigen Standard- bedingungen kultiviert. Diese Zellen wurden in einer Dichte von 8000 Zellen/Kulturvertiefung in einer Zellkul- turschale mit 96 Kulturvertiefungen ausgesät und 24 Stun- den lang kultiviert, bevor sie für Toxizitätsexperimente verwendet wurden. Die Toxizität der Polymere und Kopolymere wurde mit einem MTT-Assay nach der Methode von Mosmann et al. (J. Immunol. Methods 65 : 55-63,1963)
bestimmt. Hierzu wurden Verdünnungsreihen der Polymere in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) und 2mM Glutamin hergestellt und steril- filtriert (0,2 um Fa. Schleicher&Schuell, Dassel).
Falls erforderlich, wurden pH-Wert und Osmolarität der Lösungen korrigiert. Die Zellen wurden mit der Po- lymerlösung versetzt und für eine Dauer von 3,12, oder 24 Stunden, 2,3, oder 4 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Lebensfähigkeit der Zellen durch UV photometrische Messung, der Formazankonzentration quantifiziert.
Es zeigte sich, dass das Kopolymer außerordentlich gut verträglich ist. Die Anzahl der lebenden Zellen, inku- biert mit Konzentrationen des Kopolymers bis zu 1 mg/ml betrug nach 3 Stunden Expositionszeit noch ca 80%. Längere Expositionszeiten (12 und 24 Stunden) führten oberhalb einer Konzentration des Kopolymers von 0,1 mg/ml zeit-und konzentrationsabhängig, zu einer deutlichen Verminderung des Anteils lebender Zellen.
Expositionen mit Konzentrationen des Kopolymers bis zu 0,05 mg/ml und über einen Zeitraum von 24-48 Stunden überlebten ca 50-80% der Zellen.
Beispiel 5 : Herstellung eines PEI-Wirkstoffkomplexes als Vergleichsbeispiel.
Als Wirkstoff zur Herstellung eines PEI-Wirkstoff- komplexes diente Plasmid-DNA (pGL3-control Vector enthal- tend das Gen für Luciferase unter Kontrolle eines SV40-Promoters und Enhancers ; Fa. Promega). Die Herstel- lung des PEI-Wirkstoffkomplexes erfolgte in Anlehnung an Boussif et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 92 : 7297-7301, 1995). Zu einer konstanten Menge (l0ug) Plasmid wurde in Wasser gelöstes PEI [9 mg PEI (ca 791 Da, Fa. Fluka, Neu Ulm), gelöst bzw. als kolloidale Lösung in bidestilliertem Wasser, mit 1N HCl auf pH 7,4 eingestellt, mit Wasser auf
ein Endvolumen von 10,0 ml aufgefüllt] tropfenweise hin- zugegeben, gemischt und für mindestens 10 min. bei Raum- temperatur inkubiert.
In dieser Art wurden kolloidale Lösungen von Polye- lektrolytkomplexen, bestehend aus PEI-Plasmid-Komplexen hergestellt, welche ein Stickstoff/Phosphor Verhältnis von jeweils 3 und 6 aufwiesen. In Zellkulturschalen, deren Kulturnäpfchen mit L929 Fibroblasten bewachsen waren, wur- den pro Kulturnäpfchen PEI-Wirkstoffkomplex (3,33 ug Plas- mid pro Kulturnapf) als kolloidale Lösung hinzugefügt.
Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde wurden die Zellen gewaschen und für weitere 60 Stunden nachinkubiert.
Anschließend erfolgte die Bestimmung, der Luciferase nach Angabe des Herstellers (Fa. Promega).
Beispiel 6 : Herstellung eines Kopolymer-Wirkstoff-Kom- plexes.
Es wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben vorgegangen, nur dass anstelle des PEI das Produkt aus Beispiel 2 eingesetzt wurde (9 mg). Eingesetzte Materialien und Men- gen waren ansonsten gleich.
Ein Vergleich der Ergebnisse aus Beispiel 5 mit den Ergebnissen des vorliegenden Beispiels ergab, dass er- findungsgemäße Kopolymer-Plasmid Komplexe deutlich mehr Zellen transfizieren können als die entsprechenden PEI- Plasmidkomplexe des Beispiels 5. So waren die Lu- ciferaseaktivitäten nach Transfektion mit Kopolymer- Plasmid-Komplexen bei einem N/P Verhältnis von 3 etwa 200% stärker und bei einem N/P Verhältnis von 6 etwa 50% stärker als nach Transfektion mit PEI-Plasmid-Komplexen.
Beispiel 7 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Kopolymers mit einem PEI und einem Peptid.
1 Anteil Polylysin (Sigma, MW ca. 10 kDa) wurde mit 4, 2 Anteilen PEI (Polyscience, MW ca. 1,2 kDa) zu einem
erfindungsgemäßen Kopolymer umgesetzt. Die Umsetzung er- folgte dabei analog der chemischen Peptidsynthese. Die freie alpha-Aminogruppe des Polylysins wird (in DMF Lösung) zunächst mittels Fmoc (9-Fluorenmethoxycarbonyl) blockiert. Die freie Carboxylgruppe des Polylysins wird dann mittels HOBt/HBTU (Hydroxybenzotriazol/[2-(lH-benzo- trialzol-1-yl)-1, 1, 3,3-tetramethyluroniumhexa-flourophosph at] ) sowie DIPEA (Diisopropylethylamin), in äquimolaren Mengen, aktiviert. Zu der so erhaltenen carboxyaktivierten und aminogeschützten Polylysinlösung wird das PEI zugege- ben. Nach 2-stündiger Umsetzung bei 25 °C wird Piperidin zugegeben, und zwar in einer Menge, die 20% des DMF- Lösungsvolumens beträgt. Hierdurch wird Fmoc abgespalten.
Der erhaltenen Lösung wird ein in der Festphasenpeptidsyn- these übliches Harz zur Bindung des freigesetzten Fmoc zugegeben, sodann werden die Harzpartikel abfiltriert. Die erhaltende Kopolymerlösung kann unmittelbar zur Komplex- ierung mit Wirkstoffen eingesetzt werden. Das Kopolymer kann aber auch durch Entfernung des DMF isoliert werden.
Beispiel 8 : Herstellung eines erfindungsgemäßen Kopolymers mit einem PEI und einem Cytokin.
1 Anteil reifes IL-1-alpha (159 Aminosäuren, MW 17,5 kDa) werden mit 7,1 Anteilen PEI (Polyscience, MW ca. 1,2 kDa) umgesetzt. Die Umsetzung erfolgt dabei analog dem Beispiel 7.