[발명의 명칭]

생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물 [기술 분야】

본 발명은 포밀기를 갖는 산화 글리코사미노글리칸과 폴리아민을 포함하는 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물에 관한 것이다.

【배경 기술】

생체 접착제 (bioadhesive) 및 실란트는 수술시 조직올 봉합 또는 도포하거나， 출혈 방지제 (지혈) , 체액과 혈액 차단제 등으로 사용되는 것으로， 피부에 접촉하므로 생체 적합성이 요구되며, 생체 내에서 독성과 위해성이 없어야 하고， 생분해성이야 하며, 생체의 치유를 방해하지 않아야 한다.

현재 실용화되고 있는 의료용 접착 소재로는 시아노아크릴레이트계, 피브린 글루계, 젤라틴 글루계, 폴리우레탄계 등이 있으며， 미국의 Closure Medi cal사는 Dermabond라는 옥틸시아노아크릴레이트의 의료용 조직접착제를 상품화하여 1997년 8월 유럽공동체의 판매승인을 얻은 데 이어 1998년 미국 FDA로부터 승인을 받은바 있다. 그러나， 시아노아크릴레이트계 접착제는 고화물이 유연성이 부족하고 단단하므로 창상 치유를 방해하는 경우가 있고 또한 생체 내에서 분해되기 어려우므로 피포화 (被包化)되어 이물질이 되기 쉬운 등의 문제가 있었다. 또한, 피브린 글루는 접착력이 상당히 낮으므로， 생성된 피브린 명어리가 조직으로부터 떨어지는 경우가 있으며, 혈액 제제이므로 바이러스 감염이 우려되는 등의 문제가 있었다.

상기 의료용 접착제 외에， 한국공개특허 게 10-2009-0083484호에는 동결건조 후 기계적으로 분쇄하여 제조된 알데히드화 텍스트란 분말과 ε - 폴리— L-리신 분말을 포함하는 의료용 2 성분형 접착제 (상품명: LYDEX , 라이덱스)가 개시되어 있다. 상기 2 성분형 접착제는 분말상의 의료용 접착제라는 점에 특징이 있으나， 겔 분해 시간이 비교적 오래 소요되고， 수분 흡수력에서 만족할만한 효과를 얻지 못하는 문제가 있다. 따라서， 분해 시간， 접착력 및 수분 흡수력 등에 있어 개선된 특징을 갖는 새로운 의료용 접착제에 대한 요구가 높아지고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 는문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】

본 발명자들은 체액 및 혈액이 존재하는 체내 부위에서도 충분한 접착， 피복 및 지혈을 수행할 수 있고, 특히 다른 생분해성 고분자에 비해 많은 양의 수분을 흡수할 수 있으며, 체내에서 스스로 분해 가능한 생분해성 의료용 접착제 및 실란트를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 포밀기가 도입되어 산화된 글리코사미노글리칸과 폴리아민을 함께 사용함으로써 생체 조직의 접착， 층전, 도포， 유착 방지， 창상 피복 및 지혈 등을 효과적으로 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서， 본 발명의 목적은 의료용 접착제 또는 실란트 (또는 의료용 접착제 또는 실란트 조성물)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체 조직의 접착， 층전, 도포， 유착 방지, 창상 피복 또는지혈방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【과제의 해결 수단】

본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 (또는 의료용 접착제 또는 실란트 조성물)를 제공한다:

(a) 포밀기가 도입되어 산화된 산화 글리코사미노글리칸을 포함하는 제 1 성분; 및 (b) 2 이상의 아미노기를 갖는 폴리아민을 포함하는 제 2 성분， 상기 제 2 성분의 수용액 상태에서의 pH는 8.5 내지 11.0임.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 (또는 의료용 접착제 또는 실란트 조성물)를 제공한다:

(a) 포밀기가 도입되어 산화된 산화 글리코사미노글리칸을 포함하는 제 1 성분; 및

(b) 2 이상의 아미노기를 갖는 폴리아민을 포함하는 제 2 성분， 상기 제 2 성분의 수용액 상태에서의 pH는 8.5 내지 11.0이고,

상기 제 1 및 제 2 성분을 흔합한 경우 포밀기 /아미노기의 몰비는

0. 1 내지 500임 .

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 (또는 의료용 접착제 또는 실란트 조성물)를 접착， 층전, 도포， 유착 방지, 창상 피복 또는 지혈이 필요한 생체 조직에 적용하는 단계를 포함하는 생체 조직의 접착, 층전， 도포， 유착 방지， 창상 피복 또는 지혈방법을 제공한다. 본 발명자들은 체액 및 혈액이 존재하는 체내 부위에서도 충분한 접착， 피복및 지혈을 수행할 수 있고， 특히 다른 생분해성 고분자에 비해 많은 양의 수분올 흡수할 수 있으며， 체내에서 스스로 분해 가능한 생분해성 의료용 접착제 및 실란트를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 포밀기가 도압되어 산화된 글리코사미노글리칸과 폴리아민을 함께 사용함으로써 생체 조직의 접착， 층전， 도포， 유착 방지, 창상 피복 및 지혈 둥을 효과적으로 할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 의료용 접착제 또는 실란트와 이의 조성물은 상호 교환적으로 사용된다.

하기 실시예에서 확인한 바와 같이 , 본 발명의 조성물은 기존의 의료용 2 성분형 접착제 (LYDEX) 보다 겔 형성 시간， 점착력 및 수분 흡수력에서 개선된 효과를 나타내었으며 (표 5 내지 7 참조)， 지혈 효과에 있어서도 기존의 지혈제 (Ar i sta ^TM AH) 보다 더 우수한 효과를 나타내었다 (도 12 참조) . 이러한 결과들은 제 1 성분과 제 2 성분의 조합인 본 발명의 조성물이 생체 조직의 접착， 충전， 도포, 유착 방지， 창상 피복 및 지혈 등의 의료 용도에 있어 우수한 물성을 나타내어， 본 발명의 조성물을 이들 의약 용도로 사용할 수 있음올 보여준다 .

본 발명의 조성물은 산화 글리코사미노글리칸을 제 1 성분으로 포함한다. 상기 용어, "산화 글리코사미노글리칸 "은 글리코사미노글리칸에 포밀기 (-CH0)가 도입되어 산화되었음을 의미한다. 상기 글리코사미노 글리칸은 핵소사민을 포함한 2당의 반복구조를 갖는 다당이라는 점에서 단당의 0-글리코시드 결합인 글루칸과는 구별된다.

이러한 포밀기의 도입은 과요오드산 산화법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 글리코사미노글리칸올 과요오드산 또는 과요오드산염으로 산화하여 무수 포도당 단위 (당 잔기 ) 당 적정 개수 (예를 들어， 0.01 내지 0.95개)의 포밀기가 도입된 산화 글리코사미노글리칸을 얻을 수 있다.

본 글리코사미노글리칸의 산화도는 에 따라 계산되며, 10 내지 99.5%의 값을 갖는다. 이와 같은 산화도를 갖는 산화 글리코사미노글리칸은 제 2 성분과 조합사용 시, 체내의 혈액과 체액을 신속하게 흡수하여 빠른 시간 안에 겔화할 수 있다.

하나의 특정예에 따르면， 상기 산화 글리코사미노글리칸의 산화도는

10 내지 60%이고, 다른 특정예에서는 10 내지 55%이며， 또 다른 특정예에서는 10 내지 50<¾이고， 또 다른 특정예에서는 10 내지 45%이며, 또 다른 특정예에서는 10 내지 40%이다. 일예로, 상기 게 1 성분에 1 종류 이상의 산화 글리코사미노글리칸이 포함되며， 이 산화 글리코사미노글리칸이 산화 히알루론산인 경우, 상기 산화 히알루론산의 산화도는 10-20%일 수 있다.

상기 글리코사미노글리칸의 산화도 측정은 NaOH 점정법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 17.5 g의 하이드록실아민 하이드로클로라이드와 0.05% 메틸 오렌지 6 을 994 의 증류수에 흔합하여 0 .25 ιηοΐ/ ί의 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액을 만들고 ρΗ를 4로 적정한 다음， 산화 글리코사미노글리칸 0. 1 g을 25 ^의 상기 용액에 녹이고， 0. 1 \/ i 수산화나트륨을 이용하여 다시 pH 4로 적정한 후， ， ， 一 ， ， ，

도 (%)를 계산한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 산화 글리코사미노글리칸은 무수 포도당 단위 (당 잔기) 당 0.01 내지 0.95개의 포밀기를 갖는다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 산화 글리코사미노글리칸은 산화 히알루론산, 산화 콘드로이틴 설페이트， 산화 콘드로이린, 산화 더마탄 설페이트， 산화 헤파란 설페이트， 산화 헤파린 및 산화 케라탄 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따르면， 특정 분자량의 글리코사미노글리칸을 사용함으로써 접착제 /실란트 조성물의 겔화 형성능, 겔화 상태 유지시간, 겔의 탄성 등을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 산화 글리코사미노글리칸을 얻는데 사용되는 글리코사미노글리칸은 1 , 000 내지 500만의 분자량올 갖는다. 일예로， 상기 산화 글리코사미노글리칸을 얻는데 사용되는 글리코사미노글리칸은 1만 내지 400만, 5만 내지 350， 10만 내지 350， 10만 내지 300만， 10만 내지 250만, 10만 내지 200만， 또는 10만 내지 160만의 분자량을 가질 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 제 1 성분에는 10만 내지

200만의 분자량을 갖는 산화 히알루론산이 포함된다. 하나의 특정예에 따르면， 상기 산화 히알루론산의 분자량은 10만 내지 160만이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 제 1 성분에는 2 종류 이상의 산화 글리코사미노글리칸이 포함된다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 이들 산화 글리코사미노글리칸의 중량비는 1 : 0. 5-5이다. 하나의 특정예에 따르면， 상기 산화 글리코사미노글리칸의 중량비는 1 : 0.5-4이고， 다른 특정예에서는 1 : 0. 5-

3.5이며， 또 다른 특정예에서는 1 : 0. 5-3이고， 또 다른 특정예에서는 1 : 0.5-

2.5이고, 또 다른 특정예에서는 1 : 0. 5-2이며, 또 다른 특정예에서는 1 : 0.5-

1 .5이다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 2 종류 이상의 산화 글리코사미노글리칸은 산화 히알루론산 및 산화 콘드로이틴 설페이트이다. 상기 산화 히알루론산과 산화 콘드로이틴 설페이트의 중량비는 1:0.5-5， 1:0.5-4， 1:0.5-3.5， 1:0.5-3， 1:0.5-2.5， 1:0.5-2， 1:0.5-1.5 또는 1:0.8-

I.2일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 산화 히알루론산의 산화도는 10- 이다. 하나의 특정예에 따르면， 상기 산화 히알루론산의 산화도는 12- 40%이고， 다른 특정예에서는 12-38¾>이며， 또 다른 특정예에서는 13-3 이다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 산화 콘드로이틴 설페이트의 산화도는 10-55%이다. 하나의 특정예에 따르면， 상기 산화 콘드로이린 설페이트의 산화도는 10-50%이고， 다른 특정예에서는 10-45%이며， 또 다른 특정예에서는 10-40%이고, 또 다른 특정예에서는 10-35%이다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 1 성분은 분말상， 액상 또는 고체상 (예컨대， 펠렛 형태)이다. 일예로， 분말상의 제 1 성분은 산화 글리코사미노글리칸 -함유 용액을 건조 (예컨대， 분무건조, 동결건조 등)한 후 분쇄 (예컨대， 기계적 분쇄)하여 수득할 수 있다.

본 발명의 조성물은 활성성분으로서 제 1 성분 외에 2 이상의 아미노기를 갖는 폴리아민을 포함하는 제 2 성분을 더 포함한다. 상기 제 2 성분은 수용액 상태에서 8.5-11.0의 pH를 나타낸다. 하기 실시예에서 확인한 바와 같이， 상기 제 2 성분의 수용액 상태에서의 pH가 8.5-11.0인 경우에 수초 내로 겔화가 이루어질 수 있다 (도 7 참조).

하나의 특정예에 따르면， 상기 제 2 성분은 수용액 상태에서 9.0-

II.0의 pH를 나타낸다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 플리아민은 2차 및 /또는 3차 아미노기를 더 가질 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 폴리아민을 포함하는 제 2 성분은 분말상, 액상 또는 고체상 (예컨대, 펠렛)이다. 일예로, 분말상의 제 2 성분은 폴리아민 -포함 용액을 건조한 후 분쇄하여 수득할 수 있다. 이때， 상기 폴리아민 -포함 용액은 제 2 성분의 수용액 상태에서의 pH 범위가 8.5- 11.0이 되도록 pH 조절제를 더 포함할 수 있다. 상기 pH 조절제로의 예로는， 아세트산， 시트르산, 숙신산， 글루타르산， 말산, 푸마르산 및 말레산과 같은 1가 또는 다가의 카본산 화합물 또는 그 무수물 등을 들 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 폴리아민은 폴리리신， 키토산， 알부민 , 푸트레신 (putrescine) , 카다베린 (cadaver ine)， 스페르미딘 (spermidine) , 스페르민 (spermine) , .프로타민 및 PEI (Polyethylenimine)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 폴리아민은 100 이상의 분자량을 갖는다. 일예로， 상기 폴리아민의 분자량은 1 ,000 내지 20만일 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 폴리아민은 폴리 -L-리신이다. 상기 폴리 -L-리신은 미생물 (예컨대， 스트랩토마이세스 아불러스) 또는 효소를 사용하여 생산된 ε -폴리 -L-리신일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 2 성분은 폴리아민 외에 ρΗ 조절제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 약물을 더 포함할 수 있다. 일예로 상기 약물은 제 2 성분에 포함될 수 있다. 상기 약물은

1개 이상의 아민기를 가질 수 있으며, 이러한 약물의 예로는， 안트 라사이클린계열 약물, 젬시타빈， 반코마이신， 폴리미신， 메토트렉세이트， 단백질 약물 및 펩타이드 약물 등을 들 수 있다. 이 경우， 제 1 성분과 제

2 성분의 겔화 시 상기 약물의 아민기 역시 제 1 성분의 포밀기와 작용하여 세 성분이 함께 겔을 형성할 수 있고ᅳ 형성된 겔의 붕괴에 따라 약물이 서서히 방출되어 약리활성 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 여러 형태로 제형화 될 수 있고, 예를 들어， 분말상, 액상 또는 고체상 (예컨대， 펠렛 형태)인 제 1 성분과, 분말상， 액상 또는 고체상인 제 2 성분의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 제 1 성분과 제 2 성분을 0.5-10 : 1의 중량비로 포함한다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 제 1 성분과 계 2 성분은 0.5-8 : 1의 중량비로 포함되며, 다른 특정예에서는 0.5-6 : 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.5-4 : 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.5-3 : 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.5-2: 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.5- 1.5: 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.8-1.5: 1의 중량비， 또 다른 특정예에서는 0.8-1.2 : 1의 중량비로 포함된다. 본 발명에 따르면， 상기 제 1 성분의 포밀기와 제 2 성분의 아미노기의 비율을 조절함으로써 겔 형성시간， 생성 겔의 분해시간 등을 조절할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 제 1 및 제 2 성분을 흔합한 경우 포밀기 /아미노기의 몰비는 0. 1-500이다.

하나의 특정예에 따르면， 상기 제 1 및 제 2 성분을 흔합한 경우 포밀기 /아미노기의 몰비는 1-400이고， 다른 특정예에서는 1_350이며， 또 다른 특정예에서는 1-300이고， 또 다른 특정예에서는 10— 300이다.

상기 제 1 성분과 제 2 성분은 의료 효과 (의료 용도)를 위하여, 동시에 혹은 순차적으로 피착체 (생체 내외의 피부면)에 도포될 수 있다. 이때ᅳ 경우에 따라 상기 제 1 및 제 2 성분의 겔화를 위하여 식염수 혹은 증류수를 분사할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 의료 용도는 생체 조직의 접착, 층전， 도포, 유착 방지, 창상 피복 및 지혈로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물은 제 1 성분과 제 2 성분을 동일한 용기에 담겨진 형태로 제공하거나， 또는 별도의 용기에 분리되어 담겨진 형태로 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명의 특징 ^ᅵ 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

( i ) 본 발명은 산화 글리코사미노글리칸과 폴리아민을 포함하는 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물을 제공한다.

( i i ) 본 발명의 조성물은 생분해성 도포성， 겔화 시간， 지혈능， 접착력 및 수분 흡수력 등에서 개선된 효과를 나타낸다.

( iii ) 본 발명의 조성물은 생체 조직의 접착, 층전， 도포, 유착 방지， 창상 피복， 누출방지 및 지혈 등 의료용 접착제 또는 실란트가 사용 가능한 다양한 의료 용도로 활용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 FT-IR 분광계를 이용하여 산화 히알루론산을 분석한 결과를 보여준다.

도 2는 아미노기 갖는 제 2 성분을 이용한 흔합물의 겔화 모습과 겔화 시간을 보여주는 사진이다.

도 3은 서로 다른 중량비로 흔합한 제 1 성분과 제 2 성분 흔합물의 겔화 평가 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 본 발명의 접착제 및 실란트 조성물과 기존의 접착제 조성물 (라이덱스)의 겔화 시간을 비교하여 보여주는 사진이다.

도 5는 본 발명의 접착제 및 실란트 조성물과 기존의 접착제 조성물 (라이텍스)의 점착력을 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 6은 위점막 절제 후 출혈 부위에 본 발명의 접착제 및 실란트 조성물， 또는 기존의 접착제 조성물 (라이덱스)을 도포한 후의 결과 (점막 부착능력과 지혈능력)를 보여주는 사진이다.

도 7은 산화 글리코스아미노글리칸과 폴리아민 흔합물의 겔화 모습과 겔화 시간， 그리고 pH에 따른 겔화 여부를 보여주는 사진이다.

도 8 내지 11은 간엽 절제술 모델, 신장 절제술 모델， 위점막 절제술 모델 및 혈관 출원 모델을 대상으로 실시한 본 발명의 접착제 및 실란트 조성물과 기존의 지혈제 (Ar i sta ^TM AH) 사이의 비교실험 결과를 보여준다. 도 12는 도 8 내지 11의 결과를 정량적으로 보여주는 그래프이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서 , 본 발명의 요지에 따리- 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

실시예 1. 의료용 접착제의 제조 ①

(1) 산화 히알루론산 (CH0—HA; 제 1 성분)의 제조

분자량 7 kDa , 150 kDa , 1400 kDa 흑은 3000 kDa 의 히알루론산 (HA) 1 g 또는 3 g 을 소듐 페리오데이트 (NaI0 ₄ )가 녹아있는 150 m£의 물에 녹였다. 이때 소듐 페리오데이트의 농도와 반응조건을 하기 표 1 내지 4 와 같이 다르게 함으로써 산화도 (치환도 (DS) , 를 다르게 하였다. 반웅 플라스크를 15-70 ^° C에서 3-48 시간 동안 반웅시켰다. 반옹물을 증류수로 분획분자량 1-100 kDa 의 투석막을 이용하여 24 시간 동안 투석하였다. 여기에서 수득한 산화 히알루론산을 4 일 이상 동결건조 한 후， 분쇄하여 500 μια 크기의 메쉬를 통과시킴으로써 직경 약 500 im 이하의 산화 히알루론산을 수득하였다.

산화히알루론산

^' 職

산화 히알루론산을 FT-IR 분광계 (Cary 640, Agilent Technologies, USA)를 이용하여 분석한 결과， 4000-400 cm ^' Hresolution 4 cm— ¹ )에서 치환기를 확인하였다 (도 1).

히알루론산의 산화도를 확인하기 위해 17.5 g 의 하이드톡실아민 하이드로클로라이드와 0.05% 메틸 오렌지 6 ι 을 994 m의 증류수에 흔합하여 0.25 M 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액을 만들고 pH 를 4 로 적정하였다. 산화 히알루론산 0.1 g 을 25 의 상기 에 녹이고ᅳ 0.1 mM 수산화나트륨을 이용하여 다시 pH 4 로 적정하였다. 산화도 (%)는 다음의 식을 이용하여 계산하였으며， 결과는 하기 표 1 내지 4와 같았다. 수학식 1

¾ -화 i (%) =

수^화나 λίίί의농 : 수산하나?쉐의 V ] Χ10~ ³ _{1 Λη}

산화히 , ^' 산의^게 ᅳ 腳

'.' ';· VH ( repeating unit)의양 【표 1】 M.?. M증량 산화채농도 반믐몬도 반 시간

(kDa) (6) (ιΜ) (°0 W간)

67,4 3.1 15, δ 40 24

7 75,9 3,1 15,7 40 24

.79,3 1,0 15,8 40 24

【표 2】

【표 3】

3.3 1,1 2,8 40 3

3,9 1,0 2.6 RT, 24

7,6 1,1 2.6 RT, 6

9.2 1,0 3.8 RT, 6

9.7 1.0 2.7 40 6

9,9 1,0 5,3 RT, 6

11,3 1,0 3.8 RT. 6

!4,0 1,0 5.2 RT, 6

14.3 1,0 2.6 40 24

14.8 3.1 8.0 40 6

15,4 1,0 7,8 RL ^■ 6 ^' ύ

16.5 1.0 3.8 RT, 6

17.4 3.1 7.9 40 24 ¾

1 00 17.7 1.0 5.3 RT. 6

18,0 1,0 9.6 RT, 6 ^'"'

19,5 1,0 ^' 11,1 RT. 6

21.0 1,0 11,0 RT. 6

21,6 1,0 12.7 RT, 6

21,9 1,0 9,4 RT, 6 '-^

22.8 1.0 7.8 RT. 6 ^' ： S

23.2 1.1 7.9 RT. 6 ^' ：:

23.6 1.0 12.5 RT, 6 :

24.7 1,0 11.1 RT, 6 ^.

27.0 1.0 9.5 RT, 6 -

30.9 1,0 12,7 RT, 6

40.8 8,1 15.8 40 24

47.7 3.1 23.5 40 24

82.6 l.l 15.7 40 24

【표 4】

4.6 1.1 2.6 RT. 6

4,7 1,1 2.5 40 6

3000 19.8 3,0 7.9 40 24

23.3 1.1 2,6 40 2

43.4 3,0 15.9 40 24

,82.2 1.1 15,7 40 24 (2) 2 이상의 아미노기를 갖는 제 2성분

다양한 아미노기 함유 폴리아민 중에서 대표적으로 키토산， 프로타민， PEI, 폴리리신, 스퍼민， 스퍼미딘 및 알부민 등올 제 2 성분으로 이용하였고, 5 중량 % 이상의 폴리아민 수용액으로부터 pH 조절제 (산， 산염， 염기， 염기염 등)를 이용하여 pH 를 8.5， 9.0, 9.5 및 10 으로 조절한 후 상기 산화 히알루론산 /산화 콘드로이친 설페이트의 경우와 동일하게， 동결 건조 후에 수득된 분말을 사용했다.

상기 나열된 아미노기 함유 폴리아민의 겔화도와 겔화 시간을 평가하였다. 그 결과， 알부민， 염기성 폴리리신 (BPL), PEI 가 겔화 속도와 젤의 안정성 면에서 우수하였다 (도 2). 이 중에서 BPL 로 하기 실험을 진행하였다. 실시예 2. 물성 평가

(1) 겔화 평가

실시예 1 에서 얻은 제 1 및 제 2 성분을 서로 다른 중량비 (1:1, 2:1,

4:1， 8:1)로 흔합하였다. 흔합한 성분에 물을 뿌려 겔화되는 정도를 확인하였다.

그 결과， 제 1 성분과 제 2 성분을 8:1 로 혼합한 경우에는 10 분 후에 일부 액체로 변하였고， 2:1 과 4:1 로 흔합한 경우는 겔의 탄성이 1:1 에 비하여 비교적 떨어졌다 (도 3). 또한， 3,000 kDa 분자량의 히알루론산을 이용한 흔합제제는 겔화가 되었지만 탄성이 떨어졌다. 분자량 150 kDa 과 1,400 kDa 의 히알루론산의 경우에는 치환도에 상관없이 겔화가 되었으나， 치환도 1 。대 (10-19%)일 때의 흔합제제가 짧은 겔화 시간을 나타냈으며 , 탄성 또한 우수하였다.

이상의 결과를 바탕으로， 게 1 성분 (분자량 150 kDa 또는 1,400 kDa의 히알루론산에 알데히드기가 도입된 치환도 의 산화 히알루론산)과 제 2 성분을 1:1의 중량비로 흔합하여 하기의 실험을 실시하였다.

(2) 겔화 시간 평가

2 ml 류브에 흔합한 성분을 30 mg 씩 소분하여 튜브 뚜정에 모았다. 여기에 120 의 물을 1 초 이내에 뿌린 뒤 겔화되는 시간을 측정하였다. LYDEX 의 경우에는 히알루론산 혼합제제에 비해 적은 양 (80 의 물을 적용했음에도 불구하고 굳어진 젤을 얻는 데에 10 초 이상이 소요되었다. 반면, 산화 히알루론산의 혼합제제의 경우에는 2-3 초 이내의 짧은 겔화 시간을 나타내었다 (도 4 및 표 5 ) .

【표 5】

(3) 점착력 평가

100 nig 의 혼합한 성분에 800 ^의 물을 뿌린 후에 Texture Ana lyzer 를 이용하여 점착력을 측정하였다. 그 결과 , LYDEX 는 산화 히알루론산 흔합제제에 비해 적은 양 ( 500 의 물을 적용했음에도 불구하고 평균 점착력이 약 53 .6 gf 로 나타났다. 반면, 산화 히알루론산의 흔합제제의 경우에는 평균 점착력이 각각 약 65.9 및 67.5 gf 로 측정되었다 (도 5 및 표 6) .

【표 6】

(4) 흡수력 평가

LYDEX 와， 제 2 성분과 흔합한 각각의 CHO-HA 150 kDa(DS 10%) , CH0- HA 1 , 400 kDa(DS 10%)의 흡수력을 평가하였다. 각 샘플 30 nig 을 페트리 디쉬 (패 60)에 올려놓고 무게를 측정하였다. 37 ^° C로 미리 데워놓은 증류수를 제품의 흡수력을 고려하여 샘플 무게의 30 배 (30 g)를 첨가하였다. 37 ^° C의 항온기에서 30 분 동안 방치한 후 페트리 디쉬를 30 초 동안 뒤집어 놓고 그 무게를 측정하였다. 다음의 계산식을 이용하여 흡수력을 계산하였다. 수학식 2

30붇후 -¾¾ (mg) ~초기투계 (mg)

* 력 (%) = X 100

초기부게 (nig)

그 결과， 기존 LYDEX 제형에 비하여 산화 히알루론산의 흔합제제 (CH0-HA ,,400 kDa)의 흡수력이 약 5 배 정도 우수함을 확인하였다 (표 7)·

【표 7】

실시예 3. 생체 내 평가

(1) 실험동물

체중 2 내지 3 kg 의 3 마리의 수컷 토끼 (New Zealand White; 오리엔트 바이오 (Orient Bio), 성남， 대한민국)를 실험에 사용하였다. 모든 동물 사육 및 시험 과정은 인하대학교의 실험동물연구위원회 (Experimental Animal Research Co瞧 ittee)의 지침에 따라 수행하였다.

(2) 위 출혈 유발 동물 모델

토끼의 점막절제 (mucosectomy)-유도 위출혈 모델을 다음과 같이 제작하였다. 수술 전 24 시간 동안 토끼를 절식시키고， 케타민 (4.2 mg/kg) 및 실라진 (11.7 mg/kg)의 흔합물을 근육 주사하여 마취시켰다. 토끼의 상복부를 절개하여 위를 노출시키고， 위의 대만곡 (greater curvature)을 따라 약 5-7 cm 정도 절개하였다. 등장 생리식염수 200 를 위의 점막하 층 (submucosal layer)에 주사하고， 팽윤된 위 점막을 수술가위를 사용하여 절제하였다. 절제된 부위의 직경은 약 7-10瞧 이었다. (3) 점막 부착능력 및 지혈능력 평가

출혈이 되고 있는 절제된 토끼의 위점막에 약 0.5 g 의 흔합제제 (1:1 중량비의 제 1 성분와 제 2성분의 흔합물)를 도포하였다. 그 결과， 도 6 에 나타난 바와 같이， 흔합제제를 도포한 즉시 흔합제제와 혈액이 반응하여 흔합제제의 겔화가 이루어졌고 비처치군에 비해 출혈시간이 단축되었다. 또한， 본 발명의 조성물의 점막 부착능력을 확인하였다 (도 6) . 실시예 4. 의료용 접착제의 제조 ②

(1) 산화 히알루론산과산화콘드로이친 설페이트 (제 1 성분)의 제조 분자량 1 , 400 kDa 의 히알루론산 (SHANDONG BL00MAGE FREDA BIOPHARM CO . , Ltd) 3 g 을 150 의 증류수에 용해시켰다. 다음에 표 1 과 같이 과요오드산 나트륨 (분자량 213.89)을 첨가하고， 반응 플라스크를 40 ^° C에서 24 시간 교반하면서 반웅시켰다. 그리고， 반웅 후의 용액을 증류수로 48 시간 투석 (분획분자량 12000-14000 의 투석막 사용)한 후 동결 건조하였다.

분자량 5， 000-50， 000 사이의 콘드로이친 설페이트 (YANTAI D0NGCHENG BIOCHEMICAL CO. , Ltd) 3 g을 15 mi의 증류수에 용해시켰다. 다음에 표 2 과 같이 과요오드산 나트륨 (분자량 213.89)을 첨가하고, 상온에서 18 시간 교반하면서 반응시켰다. 그리고， 반응 후의 용액을 증류수로 48 시간 투석 (분획분자량 12000-14000의 투석막사용)한 후 동결 건조하였다.

이하의 실험에서는 산화 히알루론산과 산화 콘드로이친 설페이트를 제 1 성분으로서 사용했다.

NaOH 적정법으로 히알루론산과 콘드로이친 설페이트의 치환도 (산화도)를 확인하였다. 구체적으로는， 17.5 g 의 하이드록실아민 하이드로클로라이드와 0.05% 메틸 오렌지 6 11 을 994 ^의 증류수에 혼합하여 0.25 1∞1/ £의 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액을 만들고 pH를 4로 적정하였다. 산화 히알루론산 흑은 콘드로이친 설페이트 0. 1 g을 25 m의 상기 용액에 녹이고, 0. 1 \/ ί 수산화나트륨을 이용하여 다시 pH 4 로 적정하였다. 치환도 (%)는 다음의 식을 이용하여 계산하였으며， 결과는 하기 표 8 및 9와 같았다. 수학식 3

수산화니 의농도 X수 ¾화나트 f의年피 > (r ³

ᅳ 산하 미노: ¾리^의무? ό ᅳ

굴리. . re ting (init).s|

【표 8】

【표 9]

(2) 2 이상의 아미노기를 갖는 제 2성분의 제조

다양한 아미노기 함유 폴리아민 중에서 대표적으로 키토산, 프로타민 PEI , 폴리리신， 스퍼민， 스퍼미딘 및 알부민 등을 제 2 성분으로 선택하였고, 제 2 성분으로서는 pH 에 따른 겔화 여부를 알아보기 위하여 수용액 상태에서 pH 를 여러 범위 (5.5-6.4， 6.5-7.4, 7.5-8.4, 8.5-9.4， 9.5-10.4, 10.5-11)로 조절한 후, 상기 산화 히알루론산 /산화 콘드로이친 설페이트의 경우와 동일하게， 동결 건조 후에 수득된 분말을 사용하였다. 상기 제 1 성분의 산화 히알루론산 /산화 콘드로이친 설페이트와 폴리아민을 흔합하였다. 그 결과, 폴리아민의 종류에 관계없이 pH 8.5-11 일 경우에만 겔화됨을 확인하였다. 일예로 폴리 -L-리신의 pH 가 8.5 인 경우에는 젤이 형성되었지만， pH 가 5.6 에서는 젤이 형성되지 않았다. 본 실험에서 젤의 형성 유무는 젤의 투명도에 의해서 결정하였다 (투명: 젤화， 불투명: 젤화되지 않음) (도 7) . 실시예 5. 최적의 비율 확인

(1) 분자량， 비율별 최적 조건 확립

수득된 분말상의 산화 콘드로이틴 설페이트와 분자량 150-3 , 000 kDa 인 산화 히알루론산 (1 : 1)을 산화도에 따라 비율별로 폴리아민 (PA; pH 8.5-9.5 폴리리신 선정하여 사용)과 섞어 물성을 확인하였다. 산화도에 따라 비율별로 섞은 분말 50 mg 에 멸균된 증류수 200 ^를 넣어 멸균된 증류수를 홉수하는지 육안으로 그 정도를 확인하였다. 분말이 멸균된 증류수를 10 초 이내 흡수하기 시작 할 때를 좋음 (+++) , 30 초 이내를 보통 (++) , 60 초 이상올 나쁨 (+)으로 평가하여 용해도 (solubi l i ty)를 확인하였다. 또한, 멸균된 증류수를 넣었을 때 겔화가 되는지 확인하고 그 시간을 측정하였다. 이렇게 만들어진 겔이 다시 액화 되는지 확인하여 그 시간을 측정하였다. 이렇게 확인한 결과를 하기 표에 정리하여 나타내었다 (표 10 및 11) .

표 11 에 나타난 바와 같이， 거의 모든 제 1 성분과 제 2 성분의 조합에서 수분흡수력과 겔화 시간에 있어 만족할만한 결과가 도출되었으며， 이중에서 최상의 성능 (수분흡수력이 +++， 겔화 시간이 30 초 이내)을 보인 것은 10-50% 산화 콘드로이틴 설페이트와 10-40% 산화 히알루론산 (150， 1 ,400 또는 3 ,000 kDa)을 폴리아민과 1 : 1 의 비율로 섞은 흔합제제였으며 (샘플번호: 3, 4, 12， 14, 17, 26, 29)， 이 결과를 바탕으로 하기 실시예에서는 #14(UI-SAH 명명)를 사용하여 실험을 진행하였다. 【표 10]

(1) 간엽 절제술 모델

체중 200-300 g 의 수컷 SD 래트의 복강에 케타민과 럼푼 흔합물을 주사하여 마취한 후 중앙 상복부를 세로 또는 가로로 약 3-4 cm 정도 절개하였다. 절개된 복부의 틈으로 젖은 거즈를 이용하여 간엽을 노출시키고, 간문맥 및 간동맥를 혈관용 클립으로 결찰하였다. 간엽의 가장자리에서 약 1 cm 정도 떨어진 곳을 수술용 가위를 이용하여 절제하고， UI-SAH 50-100 mg 를 도포하였다. 대조군으로는 Ar i sta™ AH(Medafor Inc . , USA)를 도포하였다. 도포 후 결찰 하였던 클립을 제거한 후 출혈이 발생하는지 확인하고， 멸균된 거즈를 이용하여 출혈량을 측정하였다.

(2) 신장 절제술 모델

체중 200-300 g 의 수컷 SD 래트의 복강에 케타민과 럼푼 흔합물을 주사하여 마취한 후 우측 복부를 세로로 약 3-4 cm 정도 절개하였다. 절개된 복부의 틈으로 젖은 거즈를 이용하여 신장을 노출시키고， 신정맥 (renal vein) , 신동맥 (renal arter i es)올 혈관용 클립으로 결찰하였다. 신장의 가장자리에서 약 1 cm 정도 떨어진 곳을 수술용 가위를 이용하여 절제하고， UI— SAH 50-100 mg 을 도포하였다. ¹ 대조군으로는 Ar i sta™ AH(Medafor Inc . , USA)를 도포하였다. 도포 후 결찰 하였던 클립을 제거 한 후 출혈이 발생하는지 확인하고, 멸균된 거즈를 이용하여 출혈량을 측정하였다.

(3) 위점막 절제술 모델

체중 200-300 g 의 수컷 SD 래트를 24 시간 절식시킨 후 복강에 케타민과 럼푼 흔합물을 주사하여 마취한 후 중앙 상복부를 세로 또는 가로로 약 3-4 cm 정도 절개하였다. 절개된 복부의 름으로 젖은 거즈를 이용하여 위를 노출시키고 혈관이 적은 위의 만곡된 부위를 수평으로 약 3 cm 정도 절개하여 위 내벽이 보이게 하였다. 위 내벽에 주사용 생리식염수 100 를 주입한 후 위점막을 수술용 가위로 약 5 mm 직경의 원이 되도록 절제하고 UI-SAH 50-100 mg 을 도포하였다. 대조군으로는 Ar i sta™ AH(Medafor Inc . , USA)를 도포하였다. 도포 부위에 출혈이 발생하는지 확인하고 멸균된 거즈를 이용하여 출혈량을 측정하였다. (4) 혈관 (Portal vein) 출혈 모델

체중 200-300 g 의 수컷 SD 래트의 복강에 케타민과 럼푼 흔합물을 주사하여 마취한 후 중앙 상복부를 세로 또는 가로로 약 5-6 cm 정도 절개하였다. 절개된 복부의 틈으로 다른 장기들을 좌축으로 이동시킨 후 문맥 (Portal vein)을 노출시켰다. 문맥의 위와 아래 두 곳을 혈관용 클립으로 결찰하였다. 18 게이지 바늘을 이용하여 문맥에 구멍을 낸 후 UI- SAH 50-100 mg 을 도포하였다. 대조군으로는 Ar i sta™ AH(Medafor Inc . , USA)를 도포하였다. 도포 후 결찰하였던 클립을 제거 한 후 출혈이 발생하는지 확인하고, 멸균된 거즈를 이용하여 출혈량올 측정하였다.

(5) 실험결과

실험결과는 도 8 내지 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이 , 본 발명의 조성물의 지혈효과는 대조군 (Ar i sta™ AH) 보다 더 우수하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그와 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.