Dr. Moritz Beck-Broichsitter

Neue Kasseler Straße 3 3/4

35039 Marburg

Dr. Thomas Schmehl

Liebigstr. 23

35390 Gießen

Dr. Tobias Gessler

Eschenweg 15

35435 Wetten berg

Bioabbaubare Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel zur Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung in der Lunge und zum Schutz des pulmonalen Surfactants

Die vorliegende Erfindung stellt Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel bereit, die eine positive Oberflächenladung und ein positives ζ-Potential besitzen. Diese Partikel sind in der Lage, pathogene Proteine zu binden, welche bei bestimmten Er- krankungen in den Lining Layer der Lunge eindringen und dadurch die biophysikalischen Eigenschaften des pulmonalen Surfactants beeinflussen. Auf diese Weise schützen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel das pulmonale Surfactant- System. Beschreibung des altgemeinen Gebietes der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Innere Medizin, Pharmakologie, Nanotechnologie und Medizintechnik.

Stand der Technik

Der Alveolarraum von Säugerlungen ist von einem komplexen Surfactantsystem bedeckt, das die Oberflächenspannung reduziert, um ein Kollabieren der Alveolen während des Atmens zu verhindern. Pulmonaler Surfactant wird von Typ II- Pneumozyten sezerniert und enthält ungefähr 90 % Lipide und 10 % Proteine. Die Lipide, die die Alveolaroberflächen bedecken, bestehen vor allem aus Phospholipiden (-80-90 %) und einem kleineren Anteil neutraler Lipide (-10-20 %). Unter den Phospholipiden überwiegen Phosphatidylcholine (-70-80 %) und Phosphati- dylgycerole, wobei kleinere Mengen an Phosphatidylinositolen, Phosphatidylseri- nen und Phosphatidylethanolaminen vorkommen. Etwa die Hälfte der Proteinmasse des alveolären Surfactants besteht aus den Surfactant-assoziierten Proteinen SP-A und SP-D, bei denen es sich um hochmolekulare hydrophile Proteine handelt, sowie SP-B und SP-C, die niedermolekulare hydrophobe Proteine sind. Zahlreiche in fro-Studien beschäftigten sich mit der komplexen Wechselwirkung zwischen Phospholipiden (Phosphatidylcholinen und Phosphatidylglycerolen) und Surfactantproteinen (SP-B und SP-C), die die Abnahme der Oberflächenspannung in der Alveolarregion auf Werte nahe 0 mN/m während der Kompressions- Expansions-Zyklen ermöglichen. Derart extrem niedrige Oberflächenspannungen können nur durch Oberflächenfilme erzielt werden, die reich an Phospholipiden sind. Darüber hinaus weisen diese Monoschichten eine hinreichende Stabilität und Fluidität auf, um den Ersatz individueller Surfactantbestandteile während einer Oberflächenänderung der Luft-Wasser-Grenzfläche zu ermöglichen. Während der Kompression des Oberflächenfilms (Exspiration) fördern SP-B und SP-C die Reinigung der Monoschicht, und vor allem Nichtphospholipidverbindungen werden in die Bulkphase zurück befördert („squeeze out"), wo ein „Oberflächenassoziiertes Reservoir" gebildet wird. Bei Expansion der Alveolaroberfläche (Inspiration) erleichtern SP-B und SP-C den schnellen Wiedereintritt und die Wiederausbreitung der Surfactantlipide, die sich im„Oberflächen-assoziierten Surfactant- Reservoir" ("surface-associated Surfactant reservoir") befinden, was für die Limitierung des Anstiegs der Oberflächenspannung essentiell ist.

Das Eindringen von Plasmaproteinen (Albumin) in den Lining Layer der Lunge führt zu einer Beeinflussung der pulmonalen Surfactant-Funktion, wie dies bei- spielsweise für das Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) beschrieben wurde (W. Seeger, C. Grube, A. Günther, R. Schmidt: „Surfactant Inhibition by plasma proteins: differential sensitivity of various Surfactant preparations", Eur Respir J 1993, 6:971-977). Eine gestörte Surfactant-Funktion wird auch bei weiteren pulmonalen und kardialen Erkrankungen beobachtet (A. Günther, C. Siebert, R. Schmidt, S. Ziegler, F. Grimminger, M. Yabut, B. Temmesfeld, D. Walmrath, H. Morr, W. Seeger:„Surfactant alterations in severe pneumonia, acute respiratory distress Syndrome, and cardiogenic lung edema", Am J Respir Crit Care Med 1996, 153:176-184; A. Günther, R. Schmidt, F. Nix, M. Yabut-Perez, C. Guth, S. Rosseau, C. Siebert, F. Grimminger, H. Morr, H.G. Velcovsky, W. Seeger: „Surfactant abnormalities in idiopathic pulmonary fibrosis, hypersensitivity Pneumonitis and sarcoidosis", Eur Respir J 1999, 14:565-573). Als mögliche Therapiestrategie bei derartigen Erkrankungen wird seit Jahren die Surfactant- Replacement-Therapie evaluiert, bei der synthetischer oder natürlicher Surfactant in die Lunge eingebracht wird. Allerdings löst dieses therapeutische Vorgehen nicht das eigentliche Problem, nämlich das Vorhandensein schädlicher Proteine im Lining Layer der Lunge. Entsprechend kann es zur Beeinträchtigung bzw. zur Inaktivierung auch des therapeutisch in die Lunge eingebrachten Surfactants kommen. In den letzten Jahren wurden biokompatible Polymerpartikel als mögliche Arzneistoffträger, auch für die pulmonale Applikation, untersucht. Mit Hilfe der direkten Applikation verkapselter Wirkstoffe in die Lunge kann eine lang anhaltende und kontrollierte Wirkstofffreigabe am gewünschten Wirkort erreicht werden, was zu einer verlängerten pharmakologischen Wirkung führt. Des Weiteren gestatten Po- lymerpartikelformulierungen den Schutz des verkapselten Wirkstoffs vor Abbau sowie das zielgerichtete Ansprechen spezifischer Wirkorte oder Zellpopulationen innerhalb des respiratorischen Systems. Inzwischen wurde in zahlreichen in vitro- und in v/Vo-Studien für verschiedene biodegradierbare Polymerpartikel eine gute pulmonale Verträglichkeit gezeigt. Überraschenderweise können in die Lunge eingebrachte Nano-, Meso- und Mik- ropolymerpartikel durch Adsorption von in den Lining Layer der Lunge eingedrungenen Plasmaproteinen auf ihre Oberfläche die pulmonale Surfactant-Funktion positiv beeinflussen. Adsorbierte Plasmaproteine sind nicht mehr in der Lage, die Struktur des Surfactants an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu stören.

Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, dass erfindungsgemäße Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel zur Wiederherstellung und Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung in der Lunge und zum Schutz des pulmona- len Surfactants geeignet sind.

Aufgabe

Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel zur Wiederherstellung und Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung in der Lunge und zum Schutz des pulmonalen Surfactants bereitzustellen.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe der Bereitstellung von Mitteln zur Wiederherstellung und Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung in der Lunge und zum Schutz des pulmonalen Surfactants wird erfindungsgemäß gelöst durch biokompatible Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel zur Bindung pathogener Proteine, die in den Li- ning Layer der Lunge eindringen, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel

- einen Durchmesser zwischen 20 nm und 10 μηι aufweisen,

- wasserunlöslich sind,

- eine positive Oberflächenladung aufweisen,

- eine geringe Oberflächenhydrophobizität aufweisen, gleichbedeutend mit einem Kontaktwinkel kleiner 120°, gemessen nach der Sessile-drop-

Methode,

- einen isoelektrischen Punkt aufweisen, der größer als 5 ist, damit die Partikel unter physiologischen Bedingungen in der Lunge als positiv ge- ladene Partikel vorliegen und der zugleich größer ist als der isoelektrische Punkt des zu bindenden pathogenen Proteins, und

- ein positives ζ-Potential größer als +20 mV aufweisen.

Überraschend wurde gefunden, dass biokompatible Nano-, Meso- und Mikropo- lymerpartikel mit diesen Eigenschaften in der Lage sind, eine niedrige Oberflächenspannung in der Lunge aufrecht zu erhalten und den pulmonalen Surfactant zu schützen, indem sie pathogene Proteine binden, die in den Lining Layer der Lunge eindringen. Der Lining Layer der Lunge wird auch als Lungenflüssigkeitsfilm bezeichnet.

Nachfolgend werden die erfindungsgemäßen und biokompatiblen Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel kurz als„Polymerpartikel" bezeichnet.

Die natürlichen Surfactantproteine SP-B und SP-C sind vergleichsweise kleine Proteine mit einem Molekulargewicht -ί 10 kDa. Sie sind sehr hydrophob und besitzen einen isoelektrischen Punkt (IEP) von etwa 10 - 12, liegen also unter physiologischen Bedingungen positiv geladen vor.

Dagegen sind bekannte pathogene Proteine, z.B. pathogene Plasmaproteine, signifikant größer, besitzen also ein deutlich höheres Molekulargewicht (MW). Im Gegensatz zu den Surfactantproteinen SP-B und SP-C weisen sie einen IEP kleiner als 8 auf und sind daher unter physiologischen Bedingungen negativ geladen. Des Weiteren sind diese pathogenen Proteine deutlich weniger hydrophob als die natürlichen Surfactantproteine. Beispiele für physiologisch relevante pathogene Proteine sind Albumin (IEP: ca. 4,6; MW ca. 66 kDa), Fibrinogen (IEP: ca. 5,8; MW: ca. 340 kDa) und Hämoglobin (IEP: ca. 7,1 ; MW: ca. 64 kDa). Die isoelektrischen Punkte und Molekulargewichte pathogener Proteine, die in der Lunge auf- treten, sind dem Fachmann bekannt.

Die pathogenen Proteine dringen in den Lining Layer der Lunge ein, stören die physiologische Wechselwirkung der natürlichen Surfactantproteine mit Phospholi- piden und führen auf diese Weise zu einer erhöhten Oberflächenspannung in der Lunge.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel weisen einen isoelektrischen Punkt (IEP) auf, der größer als 5 ist, damit sie unter physiologischen Bedingungen in der Lunge als positiv geladene Partikel vorliegen. In einer bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel einen isoelektrischen Punkt auf, der größer als 7 ist. In einer besonders bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Partikel einen isoelektrischen Punkt auf, der größer als 9 ist. Des Weiteren ist der isoelektrische Punkt der erfindungsgemäßen Polymerpartikel so zu wählen, dass er größer ist als der IEP des zu bindenden pathogenen Proteins. Dem Fachmann ist bekannt, wie er den isoelektrischen Punkt von Polymeren bestimmen kann, beispielsweise mittels Polyelektrolyt-Titration. Er kann diese Kenntnisse verwenden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlas- sen.

Optional können die erfindungsgemäßen Polymerpartikel permanent positiv geladen sein. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn sie Polymere mit quartären Stickstoffatomen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel haben einen Durchmesser zwischen 20 nm und 10 pm. Partikel mit einem Durchmesser von mindestens 200 nm werden von den Makrophagen der Lunge aktiv erkannt, aufgenommen und abgebaut. Die pulmonalen Makrophagen stellen einen effizienten Clearance-Mechanismus der tiefen Lunge (respirable Bronchien, Alveolarraum) dar. Nanopartikel, die kleiner als 200 nm sind, werden durch unspezifische Mechanismen (passiver Transport, Diffusion, Endozytose, Transzytose etc.) aus dem Lining Layer der tiefen Lunge in Epithelzellen, Makrophagen, Zellen der Immunabwehr, dendritische Zellen, Endo- thelzellen oder in das Interstitium entfernt. Die erfindungsgemäßen Polymerparti- kel dürfen jedoch nicht größer als 10 μηι sein, da größere Partikel nicht mehr effektiv von den Makrophagen der Lunge aufgenommen und abgebaut werden können. In einer bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel einen Durchmesser zwischen 200 nm und 10 m auf. In einer besonders bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel einen Durchmesser zwischen 200 nm und 6 pm auf.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel sind wasserunlöslich. Unter wasserunlös- liehen Polymeren werden dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung solche Polymere verstanden, deren Lösiichkeit in Wasser weniger als 0,1 Gewichtsprozent beträgt.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel weisen eine positive Oberflächenladung und ein positives ζ-Potential größer als +20 mV auf, damit sie aufgrund elektrostatischer Wechselwirkung pathogene Proteine adsorbieren können, während natürliche Surf acta ntproteine nicht adsorbiert werden. In einer bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel eine positive Oberflächenladung und ein positives ζ-Potential größer als +40 mV auf. In einer besonders bevorzug- ten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel eine positive Oberflächenladung und ein positives ζ-Potential größer als +60 mV auf. Bei Partikeln mit einer positiven Oberflächenladung handelt es sich um kationische Partikel. Die Adsorption der eher hydrophilen pathogenen Proteine wird zudem durch die geringe Oberflächenhydrophobizität der erfindungsgemäßen Polymerpartikel begünstigt. Dagegen werden die hydrophoben Surfactantproteine nicht adsorbiert. Erfindungsgemäß wird unter„geringer Oberflächenhydrophobizität" verstanden, dass der Kontaktwinkel, gemessen nach der Sessile-drop-Methode, kleiner als 120° Grad ist. In einer bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel eine Oberflächenhydrophobizität auf, dass der Kontaktwinkel, gemessen nach der Sessile-drop-Methode, kleiner als 90° Grad ist. In einer besonders bevorzugten Ausführung weisen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel eine Oberflächenhydrophobizität auf, dass der Kontaktwinkel, gemessen nach der Sessile-drop-Methode, kleiner als 60° Grad ist.

Man erkennt, dass die durch die erfindungsgemäßen Polymerpartikel bewirkte Adsorption pathogener Proteine auf rein physikalischen Wechselwirkungsprozessen zwischen Partikel und Protein beruht. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass alle Partikel, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweisen, zur Adsorption pathogener Proteine im Lining Layer der Lunge geeignet sind.

Geeignete Monomere, aus denen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel herge- stellt werden können, sind beispielsweise, aber nicht erschöpfend, Acrylate, Me- thacrylate, Butylmethacrylate, (2-Dimethylaminoethyl)-methacrylat, Amine, Amide, Acetale, Polyester, Ketale, Anhydride und Saccharide. Dabei kann es sich um ein Homopolymer, Copolymer, Blockpolymer, Pfropfcopolymer, Sternpolymer, Kammpolymer, hochverzweigtes Polymer, statistisches Polymer oder Dendrimer handeln.

Erfindungsgemäße Polymerpartikel weisen eine positive Oberflächenladung auf. Dies bedeutet, dass das Polymer entweder selbst positive Ladungen trägt {z.B. kationische Acrylate, kationische Kammpolymere) und über eine bekannte Her- Stellungsmethode (z.B. Nanopräzipitation, Emulsionsmethode) zu Partikeln verarbeitet wird. Des Weiteren können Polymere verwendet werden, die ungeladen vorliegen oder negative Ladungen tragen und über eine bekannte Herstellungsmethode {z.B. Nanopräzipitation, Emulsionsmethode) zu Partikeln verarbeitet werden können. Die positive Ladung der Partikel wird durch Anwesenheit kationi- scher Emulgatoren (z.B. Cetylpyridiniumchlorid) während der Herstellung erzeugt. Außerdem lassen sich Partikel nach der Herstellung durch zusätzliche Schritte (Coating mit positiv geladenen Coatingsubstanzen wie Chitosan, DEAE-Dextran, DEA-PA, DEAPA-PVA, PEI) mit einer positiven Oberflächenladung versehen. Dabei steht DEAE für eine Diethylaminoethylgruppe, DEA-PA für Diethylamino- Polyamid, DEAPA-PVA für Diethylaminopropylamin-modifizierter Polyvinylalkohol und PEI für Polyethylenimin.

In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel aus Poly-(butylmethacrylat)-co-(2-dimethylaminoethyl)-methacryla t-co- methylmethacrylat. Dieses Terpolymer ist dem Fachmann bekannt und kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerpartikel verwendet werden. Das Verhältnis der drei Monomersorten Butyl- methacrylat, 2-{Dimethylaminoethyl)-methacrylat und Methylmethacrylat kann dabei erfindungsgemäß variieren, solange die resultierenden Partikel die Merkmale des Anspruchs 1 aufweisen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er feststellen kann, welche Terpolymerzusammensetzungen diese Bedingung erfüllen. Er kann also ohne großen Aufwand und ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen geeignete Terpolymere ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen Butylmethacrylat, 2- (Dimethylaminoethyt)-methacrylat und ethylmethacrylat im Verhältnis 1 :2:1 (w/w/w) vor. Ein solches Terpolymer ist unter dem Namen Eudragit ^® E100 bekannt. Die erfindungsgemäßen Partikel, die aus einem solchen Polymer herge- stellt werden, können sich dann dadurch auszeichnen, dass ihr Isoelektrischer Punkt zwischen 8 und 9 liegt. Ihr Kontaktwinkel beträgt zwischen 80 und 90°, beispielsweise 86°. Außerdem ist ihr ζ-Potential positiv und dabei größer als + 20 mV, nämlich beispielsweise zwischen +40 und +60 mV. Der Durchmesser solcher Partikel beträgt günstigerweise mehr als 200 nm, beispielsweise zwischen 400 und 500 nm. Die Partikel können so aktiv von Alveolarmakrophagen phagozytiert und aus dem Lining Layer des unteren Respirationstrakts entfernt werden. Auch ist es möglich, sie inhalativ in die Lunge zu applizieren.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel können beispielsweise mittels Nanoprä- zipitation oder mit Hilfe der Emulsionsmethode hergestellt werden. Des Weiteren können Nanopartikel auch mittels Aussalzen oder Polymerisation und Mikroparti- kel mittels Sprühtrocknung hergestellt werden.

Werden die Partikel mittels Nanopräzipitation hergestellt, so wird eine 0,1 bis 10 %-ige Lösung (w/v) des Polymers in einem ersten, polar aprotischen Lösungsmittel hergestellt und anschließend in einem zweiten Lösungsmittel gefällt. Das erste Lösungsmittel muss dabei das Polymer lösen und mit dem zweiten Lösungsmittel vollständig oder teilweise mischbar sein, wobei das zweite Lösungsmittel das Polymer nicht löst. Geeignete polar aprotische Lösungsmittel sind bei- spielsweise Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid, Trichlormethan und Ethylenamin. Vorteilhaft wird als zweites Lösungsmittel Wasser eingesetzt. Die Fällung kann erfolgen, indem die Polymerlösung in das zweite Lösungsmittel gegeben oder gegen dieses Lösungsmittel dialysiert wird. Anschließend wird das organische Lösungsmittel entfernt und die Partikel in Suspension erhalten. Die Auswahl des ersten Lösungsmittels richtet sich dabei nach der Herstellungsmethode. Es sind prinzipiell solche Lösungsmittel als erste Lösungsmittel geeignet, die das Polymer lösen und mit dem zweiten Lösungsmittel vollständig oder teilweise mischbar sind. Definierte Durchmesser der erfindungsgemäßen Polymerpartikel sowie enge Größenverteilungen lassen sich über die gewählte Herstellungsmethode, die Polymerkonzentration in der organischen Phase, die Rührgeschwindigkeit, die Mischungsgeschwindigkeit und die Volumenverhältnisse einstellen. Des Weiteren kann der Polymerlösung optional ein Tensid zugesetzt wer- den, beispielsweise ein anionisches oder nichtionisches Tensid. Auch mit Hilfe einer Tensidzugabe lassen sich der Durchmesser der erfindungsgemäßen Polymerpartikel sowie die Größenverteilung definiert einstellen. Die genannten Methoden zur Einstellung des Durchmessers und der Größenverteilung sind dem Fachmann bekannt und können, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu ver- lassen, angewendet werden.

Man erkennt, dass ein Vorteil der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Polymerpartikeln liegt, das die Schritte

a) Lösen des Polymers in einem ersten, organischen, bevorzugt polar aprotischen, Lösungsmittel,

b) Ausfällen von Partikeln, indem die Polymerlösung in ein zweites Lösungsmittel gegeben oder gegen dieses dialysiert wird, wobei erstes und zweites Lösungsmittel vollständig oder teilweise miteinander mischbar sind, aber das zweite Lösungsmittel das Polymer nicht löst, c) Entfernen des ersten Lösungsmittels und Erhalten der Partikel in Suspension

aufweist.

Dabei ist es günstig, wenn in Schritt a) 1 bis 40 mg, bevorzugt 0 bis 30 mg Poly- mer pro ml Lösungsmittel gelöst werden. Weiter ist es vorteilhaft, wenn das Polymer in Schritt a) ein Homopolymer, Copolymer, Blockpolymer, Pfropfcopolymer, Sternpolymer, Kammpolymer, hochverzweigtes Polymer, statistisches Polymer oder Dendrimer ist dessen Monomereinheiten ausgewählt sind aus Acrylaten, Me- thacrylaten, Butylmethacrylaten, (2-Dimethylaminoethyl)-methacrylaten, Aminen, Amiden, Acetalen, Polyestern, Ketalen, Anhydriden und Sacchariden, wenn das erste Lösungsmittel ausgewählt ist aus Aceton, Acetonitril, Tetra hydrofu ran, Di- methylsulfoxid, Trichlormethan und Ethylenamin und wenn das zweite Lösungsmittel mit dem ersten Lösungsmittel vollständig oder teilweise mischbar ist und das Polymer nicht löst.

Besonders günstig ist es wenn in Schritt a) 20 mg Polymer pro ml Lösungsmittel gelöst werden. Dabei kann das Polymer Poly-(butylmethacrylat)-co-(2- dimethylaminoethyl)-methacrylat-co-methylmethacrylat mit einem Verhältnis von Butylmethacrylat, 2-(Dimethylaminoethyl)-methacrylat und Methylmethacrylat von 1 :2:1 (w/w/w) sein, das erste Lösungsmittel Aceton und das zweite Lösungsmittel Wasser.

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel sind vorteilhaft mit piezoeleketrischen, Düsen-, Ultraschall-Aerosolgeneratoren, Soft-Mist-In haiern, Metered Dose Inha- lern oder Dry Powder Inhalern vernebelbar, d.h. die Applikation in die Lunge erfolgt durch Inhalation eines Aerosols (Suspension, Pulver) mit Hilfe eines Vernebiers. Für diese Applikation ist es vorteilhaft, wenn die erfindungsgemäßen Polymerpartikel einen Durchmesser kleiner 6 μιη aufweisen, um in die tiefe Lunge gelangen zu können.

Eine weitere Möglichkeit der Applikation in die Lunge besteht in der Instillation, beispielsweise über einen Katheter, ein Bronchoskop oder einen Beatmungszugang (z.B. Tubus oder Trachealkanüle).

Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel können zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Prävention und/oder Behandlung von Lungenerkrankungen verwendet werden, die mit einem Anstieg der Oberflächenspannung in der Lunge und einer Schädigung des pulmonalen Surfactants einhergehen. Die erfindungs- gemäßen Polymerpartikel dienen dabei der Wiederherstellung und Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung in der Lunge und dem Schutz des pulmonalen Surfactants. So können die erfindungsgemäßen Polymerpartikel zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung oder Diagnose folgender Erkrankungen eingesetzt werden: Neonatal Respiratory Distress Syndrome, Acute/Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Acute Lung Injury (ALI), Lungeninfektionen, Pneumonie, pulmonale Hy- pertonie, kardiogenes Lungenödem, Asthma, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) / Emphysem, interstitielle Lungenerkrankungen, Lungentumoren, toxische Alveolitis, alveoläres Hämorrhagie-Syndrom, Mukoviszidose, idiopathische pulmonale Hämosiderose, Kollagenkrankheiten, Vaskulitiden, Pneumokoniosen, eosinophile Lungeninfiltrate, Strahlenschäden, hereditäre oder kongenitale Lungenerkrankungen.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Polymerpartikel ist dabei rein physikalischer Natur, indem wie oben beschrieben pathogene Proteine adsorbiert werden. Anschließend werden die mit pathogenen Proteinen beladenen Polymerpartikel von Makrophagen der Lunge eliminiert oder durch unspezifische Clearance- Mechanismen aus dem pulmonalen Lining Layer entfernt.

Ausführungsbeispiele

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungs- beispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen:

Fig. 1 Rasterelektronenmikroskopisches Bild von Eudragit® E100-

Nanopartikel mit einer mittleren Partikelgröße von etwa 500 nm Fig. 2 Kurven zur Partikelgrößenverteilung aus der dynamischen Licht- Streuung (DLS) für frisch hergestelltes Eudragit® E100-Nanopartikel mit einer mittleren Partikelgröße von etwa 500 nm. Die durchgezogene Linie stellt die Dichteverteilung der Partikelgröße, die gestrichelte Linie die Summenverteilung der Partikelgröße dar. Fig. 3a, b Adsorptionsfähigkeit (Γ) von Eudragit® E100-Nanopartikel mit einer mittleren Partikelgröße von etwa 500 nm für BSA und Cytochrom C nach Inkubation der Partikel mit den jeweiligen Proteinen bei verschiedenen Konzentrationen (a) und an das Langmuir-Modell ange- passte BSA- und Cytochrom C-Adsorptionsdaten (b). Bei den durchgezogenen Linien in (b) handelt es sich um die Ausgieichsgeraden der Messdaten. Die Werte in (a) sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n =3).

Materialien Das im nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispiel verwendete kationische Polymer, nämlich Poly(butylmethacrylat)-co-(2-dimethylaminoethyl)-methacrylat - co-methylmethacrylat) 1 :2:1 (Eudragit® E100) wurde von Roehm (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Cytochrom C (aus Rinderherz, 95 %) und bovines Serumalbumin (BSA) wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) bezogen. Alle anderen in diesen Experimenten verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel wiesen den höchsten kommerziell erhältlichen Reinheitsgrad auf. Methoden

1. Herstellung der Nanopartikel

Die Nanopartikel wurden in Anlehnung an die in Hyun-Jeong Jeon, Young-Il Jeong, Mi-Kyeong Jang, Young-Hoon Park, Jae-Woon Nah:„Effect of solvent on the preparation of surfactant-free poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles and norfloxacin release characteristics", Int J Pharm 2000, 207:99-108, beschriebene Methode hergestellt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden 200 mg Polymer (Eudragit® E100) in 10 ml Aceton gelöst. Dann wurden 10 ml Polymerlösung in einen Dialyseschlauch (Porengröße 10 kDa) gegeben und für 24 h gegen Aqua dest. dialysiert. Die Partikel wurden unmittelbar nach ihrer Herstellung charakterisiert und verwendet.

Charakterisierung der Nanopartikel

Die gemäß Methoden, Punkt 1 hergestellten Nanopartikel wurden mit Hilfe der nachfolgend unter Punkt 2 bis 4 beschriebenen Methoden charakterisiert.

2. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Ein Tropfen der verdünnten Nanopartikel-Suspension wurde auf einen Silizium- Wafer aufgebracht. Nachfolgend wurden alle Proben im Vakuum getrocknet und mittels eines Gatan Alto 2500 Sputter Coaters {Gatan GmbH, Muenchen, Deutschland) mit Platin beschichtet. Die Morphologie der Nanopartikel wurde bei 2 - 5 kV mittels eines Rasterelektronenmikroskops (JSM-7500F, JEOL, Eching, Deutschland) untersucht. 3. Messung von Größe und ζ-Potential

Hydrodyamischer Durchmesser und Größenverteilung der erhaltenen Nanopartikel wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (dynamic light scattering, DLS) gemessen. Das ζ-Potential wurde durch Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) unter Verwendung eines Zetasizers NanoZS/ZEN3600 (Malvern Instruments, Herrenberg, Deutschland) bestimmt. Alle Versuche wurden bei einer Temperatur von 25 °C und mit Proben in geeigneter Verdünnung durchgeführt. Für die DLS wurden die Proben mit filtriertem und zweifach destilliertem Wasser verdünnt; zur Verdünnung der Proben für die LDA wurde 1 ,56 mM NaCI verwendet. Alle Messungen wurden in Dreifachbestimmung und unmittelbar nach der Herstellung der Nanopartikel mit mindestens 10 Durchgängen durchgeführt.

4. Adsorption von Proteinen an Nanopartikeln

Zur Messung der Adsorption von Cytochrom C und BSA an Nanopartikeln wurden Nanopartikelsuspensionen mit definierten Konzentrationen mit definierten Mengen des Modellproteins Cytochrom C (IEP = 10, MW = 12.3 kDa) und des pathogenen Modellproteins BSA (IEP = ca. 4,6, MW = ca. 66 kDa) für 3 h bei 25 °C inkubiert. Die Menge des auf den Nanopartikeln adsorbierten Proteins wurde als Differenz zwischen der Menge des zu der Nanopartikelsuspension zugegebenen Proteins und der Menge des nicht absorbierten Proteins bestimmt, das in der wässrigen Phase verblieben war. Nach der Inkubation wurden die Proben für 2 h bei 16.000 x g zentrifugiert (Centrifuge 5418, Eppendorf, Hamburg, Deutschland), und das nicht gebundene Protein im Überstand wurde über den Extinktionskoeffizienten von Cytochrom C bzw. BSA bestimmt. Für jede Protein konzentration wurde eine Kontrollprobe ohne Nanopartikel hergestellt, um den Proteinverlust während der Inkubationszeit zu ermitteln. Der Proteinbeladungsgrad wurde wie folgt berechnet:

„ . , , , . Gesamtmenge Protein - freies Protein , _ΛΛ Γ _η „ι

Pr otetnbeladungsgrad = - 100 [%\ .

Gesamtm enge Pr otein

5. Oberflächenhydrophobizität Die Oberflächenhydrophobizität ist mittels der Sessile-drop-Methode bestimmbar. Dabei handelt es sich um eine dem Fachmann bekannte Methode zur optischen Kontaktwinkelmessung. 6. Isoelektrischer Punkt

Der Isoelektrische Punkt der Polymerpartikel ist mit Hilfe einer Polyelektrolyt- Titration bestimmbar.

Ergebnisse

1 . Eigenschaften der Nanopartikel

Die physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel, die gemäß„Methoden, Punkt 3" bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Tab. 1 : Eigenschaften der Nanopartikelformulierungen, die gemäß„Methoden, Punkt 1" hergestellt wurden

Nanopartikelformulie- Größe [nm] ¹ PDI ¹ ζ-Potential [mV] rung

Eudragit® E100 486 0,070 +53,7

: Die Werte wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt.

PDI: Polydispersitätsindex

Zur Bestimmung von Struktur, Größe und Größenverteilung der verwendeten Na- nopartikeiformulierung wurden Rasterelektronenmikroskopie-Messungen (SEM) durchgeführt. Man erkennt in Fig. 1 , dass die Nanopartikel eine mittlere Partikelgröße von etwa 500 nm aufweisen. Dabei beträgt die Länge des weißen Maßsta- bes wie angezeigt 1 μίη. Die weitaus meisten dargestellten Partikel haben einen Durchmesser, der etwa der Hälfte dieses Maßstabes entspricht. Das Bild wurde bei 8000facher Vergrößerung und einer Spannung von 2,0 kV aufgenommen. Die Nanopartikel wiesen nahezu Kugelgestalt auf. Größe und Größenverteilung der Nanopartikelformulierungen wurden des Weiteren mittels dynamischer Lichtstreu- ung (DLS) ermittelt. Typische Kurven der Dichte und Summenpartikelgrößenver- teilung gemäß DLS sind in Fig. 2 dargestellt. Die durchgezogene Linie stellt dabei die Dichteverteilung dar, deren Skala an der linken y-Achse ablesbar ist, die gestrichelte Linie die Summenpartikelgrößenverteilung, deren Skala an der rechten y-Achse ablesbar ist. Man erkennt, dass das Maximum der Dichteverteilung bei einer Größe von etwa 500 nm liegt. Die in Fig. 2 dargestellten Kurven belegen somit für alle Formulierungen eine mittlere Größe von etwa 500 nm mit engen Größenverteilungen. Die Daten aus den Rasterelektronenmikroskopie-Messungen (SEM) stimmen gut mit denjenigen aus der dynamischen Lichtstreuung (DLS) überein.

Die Oberflächenladung (ζ-Potential) der Eudragit ^® E100-Nanopartikel wurde mittels Laser-Doppler-Anemometrie bestimmt, das ζ-Potential betrug +53,7 mV und ist somit positiv.

Der isoelektrische Punkt der Partikel beträgt 8,5 ± 0,5, der Kontaktwinkel 86°. 2. Adsorption von Cytochrom C und BSA auf Nanopartikein Um die Adsorption von Surfactant-assoziierten Proteinen auf der Oberfläche verschiedener Nanopartikelformulierungen zu simulieren, wurde das positiv geladene Modellprotein Cytochrom C verwendet {Fig. 3). BSA wurde als Modellprotein für ein pathogenes Protein im Lining Layer gewählt. Wie in den Adsorptionsisothermen in Fig. 3 a gezeigt, wo die absorbierte Menge von Cytochrom C beziehungs- weise BSA ( ) als Funktion der Cytochrom C- bzw. BSA-Konzentration (Co) aufgetragen ist, betrugen die Werte für die Menge des auf der Oberfläche der Nanopar- tikel adsorbierten Cytochrom C bis zu -15 pg/mg Polymer {n = 3) bzw. bis zu -100 pg/mg Polymer (n = 3) im Falle von BSA Die Adsorptionsdaten wurden anschließend über den untersuchten Konzentrationsbereich an das Langmuir- Adsorptionsmodell angepasst, das beschrieben wird durch wobei Γ die Menge des adsorbierten Proteins darstellt, c _e die Gleichgewichtsproteinkonzentration im Inkubationsmedium ist, b einen Koeffizienten darstellt, der sich auf die Affinität zwischen Nanopartikeln und Protein bezieht, und f _m die maximale Adsorptionskapazität darstellt. Die Ausgleichsgeraden sind in Fig. 3 b abgebildet, die berechneten Parameter für die Langmuir-Gleichung sind in Tab. 2 dargestellt. Die Daten zeigten die Bildung einer monomolekularen Schicht der Proteine auf der Oberfläche der Nanopartikel (R ² >0.99). Die Affinität (b) und damit die Gibbs'sche freie Adsorptionsenergie (AG ⁰ ) der Modellproteine zu den Nanoparti- keloberflächen hingen von der Art des eingesetzten Proteins ab. Während für das positiv geladene Cytochrom C nur eine geringfügige Affinität beobachtet wurde {£> = 0,031 ± 0,012 ml/mg (Mittelwert ± S.D., n - 3) und AG ⁰ = +1 ,7 ± 1 ,5 kj/mol (Mittelwert ± S.D., n = 3)), war die Affinität für BSA deutlich höher (b - 0,070 + 0,026 ml/mg (Mittelwert ± S.D., n = 3) und AG ⁰ = -4,8 ± 0,7 kJ/mol (Mittelwert ± S.D., n = 3))·

Tabelle 2: Langmuir-Parameter und freie Energie für die Adsorption von BSA und Cytochrom C auf Nanopartikeln, die gemäß„Methoden, Punkt 1" hergestellt wurden

Maximale

Adsorptions- Affinitäts¬

Protein

kapazität r _m konstante ΔΟ° R ²

(pg/mg) (ml/mg) (kJ/mol)

BSA 105,9 ± 14,7 0,070 ± 0,02 7,2 ± 1 ,9 -4,8 ± 0,7 0,9989 ± 0,0010

Cytochrom

17,2 ± 3,7 0,031 ± 0,01 0,6 ± 0,3 +1 ,7 ± 1 ,5 0,9948 ± 0,0014 C

Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (S.D.) angegeben (n

r _m : maximale Adsorptionskapazität

b: Affinitäts konstante von Cytochrom C zu den Nanopartikeln

K _a : Gleichgewichtsassoziationskonstante (K _a = f _m b)

AG ⁰ : Gibbs'sche freie Energie (AG ⁰ = - RTInK _a )

Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentiich sein. Man stellt insgesamt fest, dass Erkenntnisse über die Wechselwirkungsmechanismen der Polymerpartikel mit Surfactantbestandteilen und Plasmaproteinen für die gezielte Herstellung und Optimierung kolloidaler Carrier für die Therapie pulmonaler Krankheiten verwendet werden können. Die Adsorption Surfactant-assoziierter Proteine auf der Oberfläche von Polymer- nanopartikeln führt zu einer Verschlechterung der pulmonalen Surfactant- Funktion. Adsorbierte Surfactantproteine sind nicht mehr in der Lage, die Struktur des Surfactants an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu organisieren und können daher auch nicht die Oberflächenspannung in ähnlicher Weise verringern (Ausmaß und zeitlicher Verlauf) wie das native Surfactantmaterial.

Das Eindringen von Plasmaproteinen (z. B. Albumin) in den Lining Layer der Lun- ge führt zu einer Beeinträchtigung der pulmonalen Surfactant-Funktion, wie dies beispielsweise für das Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) beschrieben wurde (W. Seeger, C. Grube, A. Günther, R. Schmidt:„Surfactant Inhibition by plasma proteins: differential sensitivity of various Surfactant preparations", Eur Respir J 1993, 6:971-977). Die Adsorption von in den Lining Layer der Lunge ein- gedrungenen Plasmaproteine auf der Oberfläche von Polymernanopartikeln ermöglicht es letzteren, die pulmonale Surfactant-Funktion positiv zu beeinflussen. Adsorbierte Plasmaproteine sind nicht mehr in der Lage, die Struktur des Surfactants an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu stören. Die erfindungsgemäßen biokompatiblen Nano-, Meso- und Mikropolymerpartikel sind in der Lage, schädliche Proteine zu eliminieren, ohne die physiologisch relevanten Surfactant-assoziierten Proteine aus dem Lining Layer der Lunge zu entfernen. Auf diese Weise schützen die erfindungsgemäßen Polymerpartikel das pulmonale Surfactant-System.