Bei den bei der DSMZ in Braunschweig nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegten Mikroorganismen handelt es sich um die Stämme Paenibacillus pabuli DSMZ 10049, sowie 34.7 (DSMZ 14317), 34.8 (DSMZ 14318), 34.16 (DSMZ 14319), 35.3 (DSMZ 14320) und 35.7 (DSMZ 14321).

Von der DSMZ in Braunschweig sind ferner frei erhältlich die folgenden für die Ausführung der Erfindung besonders geeigneten Stämme Staphylococcus carnosus DSMZ 20501, Staphylococcus carnosus DSMZ 4604 und Bacillus amyloliquefaciens DSMZ 7.

Das erfindungsgemäße Rohrreinigungsmittel ist für Entsorgungssysteme in privaten und gewerblichen Bereichen bestimmt. Es ist insbesondere geeignet, Fettablagerung in Rohrsystemen zu entfernen, die dessen Funktionsfähigkeit vor allem durch eine Verengung des Querschnittes beeinträchtigen. Bei den

Ablagerungen handelt es sich vor allem um solche organische Stoffe, die ihren Ursprung in Essensresten haben, insbesondere um Fette, in die andere organische Materialien eingelagert sind. Weiterhin ist das erfindungsgemäße Mittel geeignet, Rohrsysteme von Stärkeablagerungen zu befreien. Derartige Verstopfungen in Rohrsystemen treten vor allem in Betrieben der Lebensmittelindustrie, in Restaurants und Kantinen auf. Stärkeablagerungen kommen insbesondere in Abwassersystemen von Betrieben im Backwarensektor vor.

Es ist bekannt, verstopfte Entsorgungssysteme mit chemischen Reinigungsmittel gängig zu machen. Solche chemischen Reinigungsmittel enthalten zumeist Ätznatron und Natriumhypochlorit. Sie sind stark alkalisch und wirken in einer Weise, daß die Ablagerung nach chemischer Reaktion entweder in eine lösliche Form überführt werden oder ihre Haftung an die Systemwandungen verlieren. Eine mechanische Abtrennung von Fetten aus dem Abwasser mit Hilfe von Fettabscheideanlagen ist allerdings bei Einsatz solcher chemischer Methoden nicht mehr möglich. In jedem Fall enthalten die herkömmlichen chemischen Reinigungsmittel Schadstoffe, die geeignet sind, die Funktionsfähigkeit von Kläranlagen zu beeinträchtigen.

Aus der DE 33 22 950 C ist ein Reinigungsmittel bekannt, das als aktive Komponente das Enzym Cellulase aus der Gattung Cellulomonas enthält und insbesondere für den Abbau von Celluloseablagerungen geeignet ist. Gemäß US 3 418 251 A wird ein Reinigungsmittelgemisch aus abrasiv wirkenden Stoffen, z. B. Siliziumdioxid, Tensiden und vermehrungsfähigen Mikroorganismen beschrieben, das für den Abbau von Ablagerungen in Rohrsystemen geeignet ist. Nachteil beider Reinigungsmittel ist, daß sowohl die Mikroorganismen als auch die Enzyme durch das regelmäßig fließende Wasser von den abzubauenden Ablagerungen weggespült werden. Aus diesem Grund müssen derartige Reinigungsmittel permanent nachdosiert werden.

Ein weiter entwickeltes Rohrreinigungsmittel ist in der DE 44 28 834 C beschrieben. Dieser Rohrreiniger besteht aus zwei Komponenten, einer ersten Komponente mit einem Fettsäureestergemisch mit gelösten fettsauren Salzen und Fettsäureamiden sowie nativen Ölen und einer zweiten Komponenten aus

einem organischem Trägermaterial, vermehrungsfähigen Mikroorganismen und Enzymen.

Der Rohrreiniger gemäß DE 44 28 834 C hat trotz guter Funktion zwei grundsätzliche Nachteile. Zum einen ist dies die beschränkte Lagerfähigkeit, da die zweite Komponente aufgrund ihres Gehaltes an lebenden Mikroorganismen und funktionsfähigen Enzymen in ihrer Haltbarkeit stark begrenzt ist. Nach Ablauf der zulässigen Lagerzeit verliert dieser Rohrreiniger seine Aktivität weitestgehend. Zum anderen hängt die Wirkung und das Haftungsverhalten der Mikroorganismen und der Enzyme entscheidend von der ersten Komponente ab. Die erste Komponente erlaubt die Einlagerung der Mikroorganismen und Enzyme in den Fettablagerungen. Durch Hydrolasen werden die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle aus der Komponente 1 für die Mikroorganismen verfügbar gemacht. Das bedeutet, daß für das Wachstum der Mikroorganismen das Vorhandensein von Hydrolasen in der Komponente 2 notwendig ist. Sind Fettabscheider vorhanden, gelangen aber gerade diese Hydrolasen durch den täglichen Abwasserfluß in den Fettabscheider und führen zu einer Spaltung der Fette und einer unerwünschten Verschlechterung der Abwasserqualität.

Eine Weiterentwicklung dieses Rohrreinigers ist in der DE 198 50 012 A beschrieben. Der dort beschriebene zweikomponentige Rohrreiniger macht Gebrauch von Sporen eines aeroben, sporenbildenden und membrangebundene Lipase exprimierenden Mikroorganismus, zusammen mit einer Wasser-in-ÖI-Emulsion eines Triglyzerids, einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und eines Emulgators zur Beseitigung von Fettablagerungen eingesetzt wird.

Dieser Rohrreiniger hat sich als effektiv erwiesen. Nachteilig ist jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, die zwei Komponenten voneinander abgestimmt einzusetzen. Da nach der Dosierung der ersten Komponente eine Einwirkzeit von wenigstens 6 h, meist 24 h, notwendig ist, ist eine Fehlanwendung nicht auszuschließen. Aus diesem Grunde wird gemäß DE 199 40 110 A die zweite sporenhaltige Komponente in mikroverkapselter Form in die erste Komponente integriert, die zur Vermeidung einer vorzeitigen Auflösung der Verkapselung

wasserfrei gehalten ist. Bei hochgradig zugesetzten Rohrleitungen ist die Fettabbauleistung noch nicht zufriedenstellend.

Insgesamt wäre es aber wünschenswert, über einen Rohrreiniger zu verfügen, der eine weitere Verkürzung der Anwendungsdauer mit sich bringt-entsprechend einer Beschleunigung des Fettabbaus-und darüber hinaus, soweit gewünscht oder notwendig, auch in der Lage ist, Stärkeablagerungen wirksam abzubauen.

Diese Aufgabe wird mit einem Reinigungsmittel der eingangs beschriebenen Art gelöst, bei dem das Bakterium eine gegenüber Paenibacillus pabuli DSMZ 10049 um wenigstens 50 % gesteigerte Lipaseaktivität, gemessen anhand der Aktivität gegenüber a-Naphthylcaprylat bei 37°C, aufweist.

Paenibacillus pabuli DSMZ 10049, auch als Bacillus pabuli bezeichnet, ist der den vorgenannten Reinigungsmitteln der DE 198 50 012 A und 199 40 110 A zugrundeliegende Mikroorganismus. Es handelt sich dabei um ein Isolat aus einem Abwassersystem, das sich als erstaunlich aktiv beim Fettabbau erwiesen hat und zugleich einfach und zuverlässig zur Sporulation gebracht werden kann.

P. pabuli weist eine membrangebundene Lipase auf und setzt, insbesondere bei älteren Zellen, auch Lipase frei.

Es wurde jetzt überraschend gefunden, daß die Aktivität des bereits zuvor isolierten P. pabuli DSMZ 10049 durch mutagenisierende Maßnahmen noch erheblich gesteigert werden kann. Die Steigerung beträgt bei in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln zum Einsatz kommenden Bakterien wenigstens 50 % gegenüber dem Ausgangsbakterium, wobei die Lipaseaktivität anhand der Aktivität gegenüber a-Naphthylcaprylat bei 37°C bestimmt wird. Das Verhalten gegenüber a-Naphthylcaprylat ist ein zuverlässiger Indikator für die Eignung eines daran getesteten Mikroorganismus zum Abbau von Fettablagerungen. Vorzugsweise ist die Aktivität um wenigstens 100 % gesteigert und insbesondere um wenigstens 200 %.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Bakterien durch Mutagenisierung eines Ausgangsstammes mit UV-Strahlen über wenigsten 2 min. in

physiologischer Kochsalziösung und anschließendes Screening auf Tributyrin-Agar erhalten und vorselektiert. Besonders gute Ergebnisse werden durch zusätzliche Inkubation mit Nitrosoguanidin (wenigstens 250 mg/ml über wenigstens 30 min.), insbesondere 500 mg/ml in physiologischer Kochsalzlösung über 40 bis 60 min., erhalten. Die Mutagenisierung mit UV-Strahlen erfolgt insbesondere bei einer Wellenlänge von 254 nm über 4 bis 5 min.

Erfindungsgemäß besonders geeignet sind Bakterien der Gattungen Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas oder Staphylococcus, wobei Stämme der Spezies Paenibacillus pabuli besonders bevorzugt sind. Es versteht sich, daß erfindungsgemäß geeignete Mikroorganismen die im Vergleich zum Referenzmikroorganismus erhöhte Lipaseaktivität aufweisen. Es versteht sich ferner, daß die Mikroorganismen einer niedrigen Risikostufe angehören, was ihre Freisetzung in Abwassersystemen ermöglicht.

Besonders bevorzugt sind ferner Stämme der Spezies B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, P. pabuli, P. fluoreszenz, S. xylosus und davon die eingangs beschriebenen und bei der DSMZ hinterlegten Stämme.

Die erfindungsgemäßen Reinigungsmittel weisen insbesondere auch eine zusätzliche Amylaseaktivität auf, d. h. sie enthalten Sporen eines Bakteriums mit Amylaseaktivität. Dabei kann es sich um Bakterien handelt, die sowohl Lipase-als auch Amylaseaktivität aufweisen, wie P. pabuli, oder um zusätzlich vorhandene Sporen eines Bakteriums, das besonders gute Amylaseaktivität hat, wie beispielsweise B. amyloliquefaciens. Zahlreiche Stämme aus den Gattungen Staphylococcus und Bacillus weisen parallel zur Lipase-auch eine Amylaseaktivität auf ; dem Fachmann ist es ein leichtes, solche Stämme mit Standardmethoden zu identifizieren. Bakterien mit Amylaseaktivität sind zahlreich und grundsätzlich bekannt. Bislang wurden aber solche Mikroorganismen nicht zur Reinigung von Entsorgungssystemen eingesetzt. Ferner war auch nicht bekannt, welche der Mikroorganismen mit der Fähigkeit zum Stärkeabbau sich für den Einsatz in Abwassersystemen eignen, d. h. unter den dort herrschenden Bedingungen überlebens-und arbeitsfähig sind. Es hat

sich überraschend gezeigt, daß dies insbesondere Mikroorganismen der Gattungen Paenibacillus, Bacillus und Staphylococcus sind.

Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel für Entsorgungssysteme auf biologischer Basis beruht auf einer Mischung aus Fettsäurekomponenten, die geeignet sind, in Fettablagerungen einzudringen, diese aufzuweichen und anzulösen und dadurch Raum für die Ansiedlung und Entwicklung von Mikroorganismen zu schaffen. Bei Stärkeablagerungen heftet sich die Mischung aus Fettsäurekomponenten an diese Ablagerungen an, zieht in diese ein und bereitet auf diese Weise ebenfalls eine Grundlage, auf der sich die stärkeabbauenden Mikroorganismen gut entwickeln können. Die Sporen der zweiten Komponente gelangen, gegebenenfalls nach Auflösung der Mikroverkapselung, an ihren Einsatzort und dringen dort mit der Fettsäurekomponente in die Ablagerungen ein, um dort zu keinem.

Die Reinigungsmittel gemäß der Erfindung, die die Sporen der Mikroorganismen auf einem separaten Trägermaterial in einer getrennten zweiten Komponente enthalten, weisen zweckmäßigerweise eine Wasser-in-ÖI-Emulsion jeweils wenigstens eines Triglyzerids und/oder einer Fettsäure sowie eine weitere Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und einen Emulgator auf. Die Sporen des aeroben und membrangebundenen lipaseexpimierenden Mikroorganismus befinden sich auf einem Trägermaterial.

Die Wasser-in-ÖI-Emulsion enthält eine Ölkomponente, die geeignet ist, in Fettablagerungen einzudringen und diese anzulösen. Diese Komponente besteht aus Triglyzeriden und/oder Fettsäuren. Es handelt sich dabei um eine im wesentlichen lösende Wirkung, die dazu dient, die Ablagerungen für Mikroorganismen zugängig zu machen. Naturgemäß sind diese Komponenten als Kohlenstoffquelle für Mikroorganismen geeignet. Als weitere Bestandteile sind aber eine weitere Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Emulgator zur Stabilisierung der Emulsion vorhanden. Die erste Komponente hat zweckmäßigerweise einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5.

Die zweite Komponente enthält die Sporen, deren Vorteil darin liegt, daß auch bei längerer Lagerzeit kein Aktivitätsverlust eintritt. Als Trägermaterial dient

insbesondere ein resorptiv wirksames, biologisch abbaubares organisches Material, wie beispielsweise ein Cellulosematerial, Grieß, Brot oder ein geeignetes Harz.

Zweckmäßigerweise kann ferner eine die Sporenkeimung fördernde Substanz zugegeben werden, etwa Trypsin oder Alanin entweder separat oder zur ersten Komponente.

Besonders geeignete Triglyzeride sind solche von Carbonsäuren mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere das Triglyzerid der Capryl-oder Caprinsäure. Als Pflanzenöl kommt insbesondere Rizinusöl in Frage, als Fettsäure Ölsäure. Als Stickstoffquelle sind anorganische oder organische Ammoniumverbindungen, Harnstoff, Aminosäuren oder Hefeextrakte geeignet.

Bei Mikroverkapselung der Sporen, d. h. Integration der zweiten Komponente in die erste, enthält die erste Komponente keine wäßrigen Bestandteile, um eine vorzeitige Auflösung der Mikroverkapselung zu vermeiden. In diesem Fall enthält die erste Komponente eine Mischung aus Glyzeriden von Fettsäure mit bis zu 18 C-Atomen, Fettsäure mit bis zu 18 C-Atomen und Salzen und Amiden von Fettsäuren mit bis zu 18 C-Atomen. Als geeignetes Trägermaterial für die Sporen in den Mikrokapseln kommt insbesondere Sorbit in Frage. Im übrigen komme für das Reinigungsmittel mit mikroverkapselten Sporen im wesentlichen die gleichen Bestandteile in Frage, wie zuvor beschrieben, was die Komponente 1 anbetrifft.

Für die Mikrokapseln kommen wasserlösliche Materialien in Frage, wie sie für Arzneimittel entwickelt werden, insbesondere auf Basis von Gelatine und wasserlöslichen Polymeren, etwa Polyacrylaten.

Bezüglich der Einzelheiten der Zusammensetzung der Komponenten 1 und 2 wird bezüglich nicht-verkapselter Sporen ausdrücklich auf die DE 198 50 012 A hingewiesen, bezüglich mikroverkapselter Sporen auf die DE 199 40 110 A, deren Offenbarungsgehalt hier ergänzend herangezogen wird.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Zusammensetzung eines zweikomponentiaen Reiniounosmittets Die Komponente 1 eines Rohrreinigers mit Lipaseaktivität bestand aus 77 Gew.-% Glyzerintricaprilat, 1,5 Gew.-% Ölsäure, 4,5 Gew.-% Emulgatoren, 13 Gew.-% Rizinusöl, 1,0 Gew.-% 50 % ige Harnstofflösung, 1,0 Gew.-% 70 % ige Zuckerderivattösung sowie Wasser auf 100 %.

Für die zweite Komponente wurden Sporen des Mikroorganismus P. pabuli DSMZ 14317 in einer Menge von 1 x 108 KBE/g Reinigungsmittel auf gemahlenes trockenes Brot als Trägermaterial aufgebracht. Komponente 1 und 2 standen in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1 : 1.

Die beiden Komponenten wurden in getrennte Flaschen abgefüllt und zeigten nach sechs Monaten Lagerzeit unveränderte Aktivität.

Eine Feldstudie wurde in einer Kantine eines mittelgroßen Betriebes durchgeführt. Das Abwasserrohr zeigte Fettablagerungen von bis zu 4 cm Dicke, bei einer Länge von insgesamt etwa 25 m und 10 cm Durchmesser.

Die Rohrleitung wurde mit 2 kg der Komponente 1 und 400 ml Leitungswasser beaufschlagt, gefolgt von 2 kg der Komponente 2 und 2,5 1 lauwarmen Leitungswassers nach 6 h.

Eine erneute Inspektion des Abwasserrohres nach 14 Tagen zeigte einen fast vollständigen Abbau der Fettablagerungen.

Beispiel 2 Reinigungsmittel mit mikroverkapselten Sporen Die Komponente 1 bestand aus 50 Gew.-% Caprylsäuretriglyzerid, 40 Gew.-% Ölsäure und Ölsäureamid, 5,0 Gew.-% eines üblichen nicht-ionischen Emulgators und 5 Gew.-% mikroverkapselter Sporen der Komponente 2.

Die Komponente 2 bestand aus 70 Gew.-% Fettsäuretriglyzerid und 30 Gew.-% einer Mischung aus Sporen und Sorbit, eingeschlossen in Kapseln aus einem handelsüblichen wasserlöslichen Polyakrylat. Es handelte sich dabei um Sporen von P. pabuli DSMZ 14321 und B. amyloliquefaciens DSMZ 7 im Verhältnis von etwa 1 : 1. Eingesetzt wurden zusammen 109 KBE/g der Komponente 1.

In einem Feldversuch wurde die Abwasserleitung eines Restaurants, die bei 10cm Durchmesser mit bis zu 2 cm dicken Fett-und Stärkeablagerungen zugesetzt war, mit insgesamt 2,5 kg der vorstehend beschriebenen Mischung in 1 IWasser versetzt. Die Länge der Rohrleitung betrug 20 m bis zum Fettabscheider.

Eine Inspektion der Leitung nach 4 Wochen ergab eine praktisch vollständige Befreiung von Rückständen. Die Fettrückstände im Fettabscheider waren nicht angegriffen ; sie hatten jedoch erheblich zugenommen, so daß angenommen wird, daß sie aus der Rohrleitung angespült wurden. Stärkeablagerungen im Fettabscheider wurden nicht gefunden.

Daraus wird geschlossen, daß es in der Rohrleitung zu einem im wesentlichen vollständigen Abbau der Stärkeablagerungen kommt, während sich die Fettablagerungen überwiegend nur lösen und abgeschwemmt werden. Letztere können im Fettabscheider auf bekanntem Weg entsorgt werden.

Im Fettabscheider wurden ferner auch keine nennenswerten Mengen der einge- setzten Mikroorganismen mehr nachgewiesen.

Beispiel 3 Mutagenisierung von Paenibacillus pabuli DSMZ 10049 Das hier verwandte Mutagenisierungsverfahren beruht auf einem Verfahren, das üblicherweise angewandt wird, um Mangelmutanten zu erzeugen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit diesem Verfahren auch die Möglichkeit besteht, gewünschte Eigenschaften zu verstärken.

Für die Mutagenisierungsarbeit wurde UV-Licht einer Wellenlänge von 254 nm (Lampe der Marke UV-Universal, Camag TL-900) benutzt. Das Ausgangsbakterium wurde in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 4 min. einer Strahlungsmenge von 500 erg/mm2 ausgesetzt. Die Keimzahl betrug 1,2 x 108 KBE/mI. Die Überlebensrate betrug 0,4 %.

Im Anschluß daran wurde die Kochsalzsuspension mit 500 mg/ml Nitrosoguanidin versetzt und 55 min inkubiert. Es ergab sich eine weitere Reduktion der Keimzahl um 90 %.

Die den Mutagenisierungsverfahren ausgesetzten Zellen des Ausgangsstammes wurden anschließend verdünnt und auf Tributyrin-Agar-Platten inkubiert. Nach 4-tägiger Inkubation bei 28°C zeigten sich Kolonien mit unterschiedlich großen klaren Höfen, wobei die Größe der Höfe als Indikator für das Ausmaß der Lipase-Aktivität gewertet wurde. Wenige Kolonien mit besonders großen Höfen wurden ausgewählt und einem weiteren Screening-Test unterworfen.

Beispiel 4 Bestimmung der Lipase-Aktivität Alle Kolonien, die sich durch die Ausbildung größerer klarer Höfe auf Tributyrin-Agar-Platten (Fa. Merck) ausgezeichnet hatten, wurden über einen Zeitraum von 6 Tagen auf 2 PHP40-Medium ohne Glukose (10,0 g Pepton, 1,0 g KH2P04, 2,0 g Hefeextrakt, 475 ml H20 ; 0,5 Gew.-% Tween 40) bei 28 °C auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation über 40 min. bei 5000 rpm entfernt. Nach dem Abtrennen des so gewonnenen Extraktes von der Biomasse wurde diesem ein Protease-Inhibitor-Cocktail (Fa. Sigma) zugeführt. Der Rohextrakt war bei dieser Temperatur von 4 °C über einen Zeitraum von 14 Tagen haltbar. Der Rohextrakt wurde in Gegenwart von a-Naphthylcaprylat (VolNol 1 : 2) als einzigem Enzymsubstrat bei 37 °C im Wasserbadschüttfer inkubiert. Nach einer Stunde erfolgte der Nachweis von freigesetztem 1-Naphthol durch die Zugabe der Reagentien Zym A und B (Fa. Biomerieux). Es wurden folgende Aktivitäten anhand der optischen Dichten des Mediums bei 580 nm erhalten : P. pabuli DSMZ 10049 0,55 (Referenzwert) P. pabuli 34.7, DSMZ 14317 2,30 P. pabuli 34,8, DSMZ 14318 2,30 P. pabuli 34.16, DSMZ 14319 2,10 P. pabuli 35.3, DSMZ 14320 2,20 P. pabuli 35.7, DSMZ 14321 2,03 S. carnosus DSMZ 20501 2,00.

Die Lipasen aller hier untersuchten Mikroorganismen zeigen in ihrem katalytischen Zentrum die folgende übereinstimmende Abfolge von 6 Aminosäuren. Die Sequenz ist Ala-His-Ser-Met-Gly-Gly. In einige Bacillus spezies kann Met durch Glu ersetzt sein. Es wird angenommen, daß diese Abfolge von Aminosäuren im katalytischen Zentrum für die Lipaseaktivität auch der hier beschriebenen Mikroorganismen verantwortlich ist und damit maßgeblich ihre Eignung für Rohrreinigungszwecke bedingt und daß das hierfür kodierende Gen in mehreren Kopien im Mikroorganismus vorhanden ist.

Alle untersuchten Stämme von P. pabuli zeigten neben der Lipase auch eine Amylaseaktivität. Gleiches gilt für Stämme der Gattungen Staphylococcus und Bacillus. Dies macht die Eignung dieser Stämme für den Stärkeabbau in Abwasserrohren aus. Eine besonders ausgeprägte Amylaseaktivität hat allerdings B. amyloliquefaciens DSMZ 7, dessen Sporen aus diesem Grunde für den zusätzlichen Stärkeabbau in Rohrsystemen besonders bevorzugt sind.

Alle hier beschriebenen Mikroorganismen zeigen ausgezeichnete Aktivität in den Eingangsabschnitten von Rohrleitungen, d. h. unter aeroben Bedingungen.

Bereits im Fettabscheider zeigen sie sich aber unter den dort herrschenden Bedingungen gegenüber der nativen Flora als nicht mehr konkurrenzfähig ; auch eine Enzymaktivität konnte im Fettabscheider nicht nachgewiesen werden.

- Ansprüche-