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Patent Searching and Data


Title:
BIOLOGICAL SOLID STATE FERMENTATION PROCESS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2020/174101
Kind Code:
A1
Abstract:
Biological solid state fermentation process The invention provides a biological solid state fermentation process wherein an animal residual raw material having a proteic nitrogen content of high value for different industrial processes, such as in the fertiliser, composting and similar industries, is transformed into a final product. The process essentially comprises selecting the microorganisms present in the animal residual raw material capable of transforming organic nitrogen into proteic nitrogen, i.e. into amino acids and peptides, culturing said microorganisms in an adequate medium, and adding said microorganisms in their optimum culture medium to the previously sterilised or inactivated raw material.

Inventors:
ATARES REAL SERGIO (ES)
ROMERO LOPEZ JOAQUÍN (ES)
SALAET MADORRAN IGNASI (ES)
FERRER GINES MARÍA (ES)
CABALLERO MOLADA MARCOS (ES)
YANCE CHAVEZ TULA DEL CARMEN (ES)
FUERTES DOÑATE CARLOS (ES)
Application Number:
PCT/ES2019/070116
Publication Date:
September 03, 2020
Filing Date:
February 27, 2019
Export Citation:
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Assignee:
FERTINAGRO BIOTECH SL (ES)
International Classes:
C12P13/00; C12P1/00; C12R1/125
Domestic Patent References:
WO2006082264A12006-08-10
Foreign References:
ES2259542A12006-10-01
CN1974782A2007-06-06
Other References:
GARCIA CRISTINA ET AL.: "Liquid-phase food fermentations with microbial consortia involving lactic acid bacteria: A review", FOOD RESEARCH INTERNATIONAL ELSEVIER, vol. 119, AMSTERDAM, NL, pages 207 - 220, XP085636291, ISSN: 0963-9969, DOI: 10.1016/j.foodres.2019.01.043
CARDONA ET AL.: "Fuel ethanol production: Process design trends and integration opportunities", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 98, no. 12, 19 March 2007 (2007-03-19), AMSTERDAM, NL, pages 2415 - 2457, XP005932845, ISSN: 0960-8524, DOI: 10.1016/j.biortech.2007.01.002
BERMUDEZ SAVONROSA CATALINA ET AL.: "Conversion de residuales agroindustriales en productos de valor agregado por fermentacion en estado solido", RTQ [ONLINE, vol. 34, 2014, pages 263 - 274
See also references of EP 3885441A4
Attorney, Agent or Firm:
GONZALEZ LOPEZ-MENCHERO, Alvaro Luis (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Proceso de fermentación biológica en estado sólido caracterizado por comprender las siguientes etapas:

i) Proporcionar una materia prima animal residual;

¡i) Realizar un análisis metagenómico de la microbiota de dicha materia prima para seleccionar aquellos microorganismos de alta capacidad para producir enzimas específicas capaces de hidrolizar proteínas, en particular proteasas, subtilinas, tripsinas y pepsinas;

iii) Cultivar los microorganismos seleccionados en un medio de cultivo adecuado;

iv) Esterilizar-inactivar la materia prima inicial mediante tratamiento térmico; v) Adicionar el cultivo de los microorganismos seleccionados a la materia prima inicial inactivada;

vi) Facilitar la fermentación biológica del cultivo en la materia prima inactivada controlando las condiciones de pH, humedad y temperatura.

vii) Analizar el rendimiento de fermentación y, en su caso, repetir las etapas v) Y vi).

2. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la materia prima animal residual se selecciona del grupo consistente en harinas de sangre, harinas de carne, plumas y sus mezclas.

3. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 2, caracterizado porque la materia prima animal residual es harina de carne.

4. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa ¡i) se utiliza un medio agar-calcio-caseinato para facilitar el aislamiento de microorganismos, al observarse halos alrededor de las colonias que tienen la función de hidrolizar proteínas.

5. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque el cultivo de los microorganismos seleccionados de la etapa i¡¡) se lleva a cabo a una temperatura constante entre 25°C y 35°C pH de 5,5 a 8,5.

6. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque, como resultado de las etapas ¡i) y i¡¡) se seleccionan y cultivan los microorganismos Bacillus subtilis, en particular Bacillus subtilis CECT n° 9187 y Bacillus subtilis CECT n° 9265.

7. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa iv) se lleva a cabo una temperatura de 65°C a 95°C durante al menos 4 horas. 8. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque, en la etapa v), se adiciona el cultivo seleccionado a la materia prima inactivada en una proporción de un 0,5 a un 3,0% en peso, conteniendo este cultivo entre 109 y 101° UFC. 9. Proceso de fermentación biológica en estado sólido según la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa vi) el pH está en un rango de 6, 5-8, 5, la humedad es del 40% y la temperatura es de 35°C-55°C.

Description:
PROCESO DE FERMENTACIÓN BIOLÓGICA EN ESTADO SÓLIDO

La presente invención se refiere a un proceso de fermentación biológica en estado sólido, proporcionando el proceso la transformación de una materia prima residual animal con alto contenido en nitrógeno proteico en un producto final de alto valor para diversos procesos industriales, tales como la industria de fertilizantes, de compostaje y similares.

La presente invención se enmarcaría en el campo de la Biotecnología Industrial, entendida como el campo relacionado con las tecnologías para producir bienes y servicios usando organismos y materiales biológicos encontrados en la naturaleza, modificados o no.

Así, la invención proporciona un proceso de fermentación biológica en estado sólido donde una materia prima residual animal que contiene nitrógeno proteico se transforma, mediante este proceso, en un producto rico en péptidos y aminoácidos, de alto valor en las citadas industrias.

La mayoría de los procesos biotecnológicos están basados en microorganismos. Los organismos más frecuentemente utilizados son bacterias y levaduras, pero también se pueden utilizar otros cultivos celulares, incluyendo tejidos u órganos. Por sus diferentes implicaciones desde el punto de vista del bioproceso se distinguen los procesos en fase líquida y en fase sólida.

En particular, en los procesos en fase sólida gran importancia, y pueden llegar a ser controlantes, los procesos difusionales tanto de materia como de calor. Los diseños de estos biorreactores son absolutamente diferentes de los biorreactores en fase líquida, donde los procesos de transporte son más intensos. Son muy comunes en el sector alimentario, pero también en el medioambiental/energético y de la salud (Rendueles, M.; Díaz, M. (2014). "Biotecnología industrial". Arbor, 190 (768): a155. doi: http://dx.doi.org/10.3989/arbor.2014.768n4009). Existen muchos procesos que tratan los residuos sólidos desde un punto de vista biotecnológico, concretamente los procesos de fermentación en fase sólida se presentan en los aprovechamientos como el compostaje, la obtención de biogás o la obtención de fertilizantes o piensos.

En este contexto, por ejemplo la solicitud de patente internacional W02006082264 describe un procedimiento donde se revalorizan productos residuales vegetales con un alto contenido en nitrógeno proteico y procedentes de diversas industrias mediante su transformación, en un proceso en dos fases, fermentación e hidrólisis, en un producto bioestimulante líquido para las plantas, empleándose Bacillus licheniformis como microorganismo productor de enzimas hidrolíticas.

La fermentación en estado sólido (denominada a veces en la literatura abreviadamente como SSF), se define como el crecimiento de microorganismos en medios sólidos, o semi-sólidos, en ausencia de agua libre, siendo su principal ventaja el hecho de permitir el uso de sustratos de muy bajo coste, tales como residuos agroindustriales.

Así, son conocidos numerosos procesos de fermentación sólida donde se utilizan como materiales de partida residuos vegetales. A este respecto véase, por ejemplo, el documento CN1974782 donde se obtiene un producto alimenticio animal o el artículo“Conversión de residuales agroindustriales en productos de valor agregado por fermentación en estado sólido” (Bermúdez Savon, Rosa Catalina et al. Conversión de residuales agroindustriales en productos de valor agregado por fermentación en estado sólido. RTQ [online] 2014, vol.34, n.3 [citado 2019-02-26], pp.263-274), donde se describe la aplicación de la fermentación en estado sólido en la biotransformación de subproductos agrícolas lignocelulósicos, empleando hongos basidiomicetos de pudrición blanca. Como ejemplo de esta tecnología se muestra el cultivo de las setas comestibles Pleurotus spp sobre pulpa de café.

La presente invención proporciona un proceso de fermentación biológica en estado sólido donde se emplea como materia prima un residuo industrial animal con un alto contenido en nitrógeno proteico, el cual se transforma, mediante este proceso, en un producto rico en péptidos y aminoácidos.

A este respecto, los residuos industriales animales tienen un alto contenido proteico y también un elevado coste para su destrucción, por lo que los procesos para su aprovechamiento tienen interés particular. La sangre residual de mataderos es un subproducto de difícil revalorización, aunque contiene elevadas cantidades de proteínas aprovechables. Tradicionalmente se ha utilizado el plasma como aditivo alimentario, sobre todo en productos cárnicos (conservas, precocinados, etc.). También se han desarrollado métodos para obtener y utilizar la globina, proteína mayoritaria de la fracción celular de la sangre, mediante su decoloración para su uso en alimentación. También se pueden aprovechar las fracciones del plasma (Rendueles, M.; Díaz, M. (2014). "Biotecnología industrial". Arbor, 190 (768): a155. doi: http://dx.doi.Org/10.3989/arbor.2014.768n4009).

Por tanto, la presente invención, además de proporcionar un producto final de alto valor añadido, permite aprovechar este tipo de residuos animales que, de otra forma, son difíciles de procesar para su reaprovechamiento.

El proceso de la invención comprende esencialmente seleccionar aquellos microorganismos presentes en la materia prima residual animal que tienen capacidad de transformar el nitrógeno orgánico en nitrógeno proteico, esto es en aminoácidos y péptidos, cultivar dichos microorganismos en un medio adecuado y adicionar dichos microorganismos en su medio de cultivo óptimo a la materia prima previamente esterilizada o inactivada.

A continuación se describe más en detalle la invención en base a una forma de realización de la misma y en referencia a las figuras adjuntas, en las cuales:

Fig. 1 : Representación esquemática del procedimiento de la invención; Fig. 2: Gráfica mostrando los resultados como % de hidrólisis en una fermentación biológica en un solo ciclo del proceso de la invención;

Fig. 3: Gráfica mostrando los resultados como % de hidrólisis en una fermentación biológica en vahos ciclos del proceso de la invención;

Fig. 4: Gráfica mostrando los resultados como % de hidrólisis en una fermentación biológica comparativa con microorganismos tipo.

El proceso de fermentación biológica en estado sólido de la presente invención se caracteriza entonces por comprender las siguientes etapas: i) Proporcionar una materia prima animal residual, tal como harinas de sangre, harinas de carne y huesos, plumas y similares, así como combinaciones de estas materias primas animales;

¡i) Realizar un análisis metagenómico de la microbiota de dicha materia prima para seleccionar aquellos microorganismos de alta capacidad para producir enzimas específicas capaces de hidrolizar proteínas, en particular proteasas, subtilinas, tripsinas y pepsinas;

iii) Cultivar los microorganismos seleccionados en un medio de cultivo adecuado; iv) Esterilizar-inactivar la materia prima inicial mediante tratamiento térmico;

v) Adicionar el cultivo de los microorganismos seleccionados a la materia prima inicial inactivada;

vi) Facilitar la fermentación biológica del cultivo en la materia prima inactivada controlando las condiciones de pH, humedad y temperatura.

vii) Analizar el rendimiento de fermentación y, en su caso, repetir las etapas v) y vi).

En la figura 1 se muestra una representación esquemática del proceso indicado.

Como se ha mencionado, se proporciona en primer lugar una materia prima animal residual, tal como harinas de sangre, harinas de carne, plumas y similares, y combinaciones de los mismos. A este respecto y en el contexto del presente proceso, como harinas de sangre o harinas de carne se entiende el producto que, una vez secado, acompaña al sebo en los procesos de fusión de desechos. Este es un producto muy rico en nitrógeno, fósforo y calcio y en la actualidad se utiliza como integrante de piensos para animales. Puede contener altos contenidos de proteínas (hasta el 60 %). Si contienen más de un 4,4% de fósforo se denominan“harina con huesos”. Dependiendo del tipo de proceso que se utilice en la fusión, la harina puede tener un valor proteínico superior (vía de fusión seca), la harina de huesos se prepara a partir de huesos limpios de grasa y carne.

En una realización preferente, como materia prima residual animal se utiliza harina de carne.

La de etapa de análisis metagenómico de la microbiota presente en la materia prima se lleva a cabo mediante un secuenciador metagenómico con el fin de estudiar el interés microbiológico de la materia prima seleccionada y aislar de la misma aquellos microorganismos con las funciones específicas citadas, empleando medios de cultivo selectivos donde se siembran dichos microorganismos.

Así, de los posibles medios de cultivo conocidos, se selecciona un medio donde se pueda apreciar rápidamente, con el crecimiento de los microorganismos, la capacidad de éstos para hidrolizar proteínas, transformando el nitrógeno orgánico en nitrógeno proteico, es decir para obtener aminoácidos.

En una realización preferente, este medio de cultivo consiste en un medio agar-calcio- caseinato, que facilita el aislamiento de estos microorganismos al observarse halos alrededor de las colonias que tienen dicha función.

A continuación, se lleva a cabo el cultivo de los microorganismos seleccionados, siendo necesario el diseño selectivo de cultivos con medios de pre-enriquecimiento. Tal como es conocido, el medio de pre-enrequecimiento es una disolución de sales ricas en nutrientes, sobre todo con alto aporte de carbono y nitrógeno.

En la presente invención el medio de pre-enriquecimiento es una mezcla con una concentración de nutrientes específica para el crecimiento y reproducción de los microorganismos seleccionados para sintetizar proteasas.

Preferentemente, las condiciones óptimas de crecimiento del microorganismo concreto en este medio de cultivo son una temperatura constante entre 25°C y 35°C, un pH de 5,5 a 8,5 y unas condiciones adecuadas de oxígeno disuelto.

En una realización preferente del proceso de la invención, los microorganismos seleccionados son Bacillus subtilis, en particular Bacillus subtilis con número de cepa 9187 y Bacillus subtilis con número de cepa 9265, ambos depositados en la colección Española de Cultivos Tipo (CECT).

En esta realización preferente, ambos microorganismos se cultivaron en condiciones óptimas para su crecimiento mediante un medio de pre-enriquecimiento consistente en una composición de sales incluyendo macro y microelementos, extracto de levadura como fuente de nitrógeno, glucosa, sacarosa, dextrosa, maltosa como fuente de carbono y como aporte extra caseína, por ejemplo medio LB (Luna Bertani), y se estabilizaron con un medio selectivo de Bacillus para su adición posterior a la materia prima en la etapa v).

La etapa iv) del proceso antes descrito preferentemente se lleva a cabo una temperatura de 65°C a 95°C durante al menos 4 horas con el fin de inactivar cualesquiera microorganismos presentes en la materia prima.

Preferentemente, en la etapa v), se adiciona el cultivo seleccionado a la materia prima inactivada en una proporción de un 0,5 a un 3,0% en peso, conteniendo este cultivo entre 10 9 y 10 10 UFC. La incorporación de este cultivo a la materia prima permite también ajustar el pH en un rango de 6, 5-8, 5 y una humedad óptima del 40% en la etapa vi) del proceso, que preferentemente se lleva a cabo a una temperatura de 35°C-55°C durante un tiempo de entre 4 y 8 horas.

Una vez finalizada la fermentación, que puede conllevar un tiempo de al menos 96 horas aproximadamente, en la etapa vii) se analiza el rendimiento de fermentación y, en caso de no ser el deseado para el producto final, se repiten las etapas v) y vi).

Ejemplos

En un ensayo a escala de laboratorio, se llevó a cabo el proceso de la invención con harinas de carne como material de partida y se estudió el rendimiento del proceso en función del grado de hidrólisis, aplicándose un único ciclo de las etapas v) y vi). Los resultados se muestran en la figura 2, observándose un porcentaje de hidrólisis de un 25% en 5 días de fermentación biológica.

Se realizó el mismo ensayo aplicando un ciclo de vahas adiciones según las etapas v) y vi), con los resultados mostrados en la figura 3.

De la observación de ambas figuras se concluye que el nivelo máximo de hidrólisis para este proceso está en torno al 25-30%, nivel que, en comparación con los procesos de fermentación en fase sólida descritos en la literatura con estos microorganismos, de un máximo del 20%, es claramente superior.

De la misma forma, se llevó cabo un ensayo comparativo de fermentación convencional con un microorganismo Bacillus sp con el fin de comparar los resultados obtenidos con las cepas preferentes de la invención, en particular con Bacillus subtilis CECT 9265 y Bacillus subtilis 9187. Brevemente, en el ensayo comparativo se cultivó Bacillus sp para obtener una concentración de microorganismo similar a la empleada en el ensayo y se inoculó en materia prima no inactivada. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4, comprobándose que la fermentación empleando estos microorganismos en el proceso de la invención tiene un rendimiento muy superior al obtenido empleando Bacillus sp. Asimismo se realizó un ensayo a escala industrial partiendo de 100 toneladas de harinas de carne, 5 toneladas de medio de cultivo con un 20% en peso de los microorganismos Bacillus subtilis CECT 9265 y Bacillus subtilis CECT 9187 a una concentración de 10 9 UFC y agua para conseguir una humedad del 40%. La inactivación de la materia prima se llevó a cabo durante 6 horas a una temperatura de 85°C y la fermentación se desarrolló durante 5 días, obteniéndose, tal como se muestra en la figura 4, un grado de hidrólisis del 23, 1 %.