Compositions biologiquement actives, procédé pour leur obtention, et applications biologiques

L'invention a pour objet de nouvelles compositions biologiquement actives, susceptibles d'être obtenues à partir de plantes. Elle concerne également un procédé d'obtention de ces compositions par extraction à partir de plantes sélectionnées au regard d'une activité donnée. L'invention vise en outre les applications biologiques de ces compositions pour le traitement chez l'homme ou l'animal de maladies qui découlent d'une perturbation du métabolisme et/ou de la balance énergétique, dites maladies métaboliques, en particulier le traitement du diabète de type 2. Depuis une trentaine d'années, la sédentarité et la surnutrition ont provoqué une explosion de l'incidence de l'obésité dans les pays industrialisés. Les obèses présentent un risque accru de développer d'autres syndromes ou maladies métaboliques, comme le syndrome X, la résistance à l'insuline, et le diabète de type 2. On dénombre près de 200 millions de personnes diabétiques dans le monde, dont environ 90% souffrent de diabète de type 2. On estime que ce chiffre doublera d'ici à 25 ans, affectant ainsi un peu plus de 5% de la population mondiale.

Les personnes atteintes de diabète ont d'autre part 2 à 4 fois plus de risques de développer des complications cérébro- et cardio-vasculaires. En plus de ces problèmes macro-vasculaires, les patients développent également un certain nombre de complications micro-vasculaires : rétinopathies, neuropathies et néphropathies. Après 10 ans d'évolution de la maladie, un tiers des patients diabétiques sont atteints de ces complications qui pourraient être considérablement réduites par une prise en charge à la fois comportementale — en particulier avec un régime adapté et accompagné de compléments alimentaires - et médicamenteuse. II existe différentes classes de médicaments disponibles pour le traitement des maladies métaboliques, lesquels ont en commun d'agir sur une des composantes du métabolisme. Néanmoins, le caractère multi-symptomatique des maladies métaboliques implique une multi-médicamentation, laquelle, outre son coût élevé pour les organismes de santé, augmente les risques d'effets secondaires par interaction médicamenteuse. C'est pourquoi, malgré l'existence d'un grand nombre d'outils thérapeutiques, il existe un très grand besoin médical pour ces maladies métaboliques.

Les patients souffrant de maladies métaboliques voient leur maladie évoluer sur des périodes de 30, voire 40 ans. Pendant ces années, il n'y a pas de réel ressenti d'état malade et la plupart des personnes souffrant de maladies métaboliques ont beaucoup de mal à adhérer à des traitements composés de plusieurs médicaments lesquels sont souvent sources d'effets secondaires.

De plus, les produits utilisés à ce jour pour traiter le diabète n'ont pas de profil véritablement satisfaisant, leurs effets secondaires soutenus et nombreux restreignant leur emploi. La plupart des nouveaux médicaments en développement avancé ou récemment mis sur le marché présentent également des effets secondaires et il devient donc urgent de développer des produits efficaces plus satisfaisants.

Les recherches se poursuivent donc dans ce domaine, avec un intérêt particulier pour des solutions alternatives, basées en particulier sur des produits d'origine végétale, considérés comme naturels, par opposition aux composés de synthèse. Ces recherches aboutissent à la découverte de médicaments à base de plantes et/ou d'origine végétale, mais également à l'identification de compléments alimentaires à base de plantes. Il est en effet clairement établi que l'association d'un régime adapté intégrant l'utilisation de compléments alimentaires à base de certaines plantes et d'une activité physique adéquate, permet de prévenir le développement des maladies métaboliques, et en particulier celui de l'obésité et du diabète.

Au niveau mondial, on a attribué à près de 1200 plantes des effets sur les maladies métaboliques et en particulier le diabète de type 2. Cependant, dans la plupart des cas, la non toxicité des plantes n'a pas été démontrée, les principes actifs qu'elles contiennent n'ont pas été identifiés, leur pharmacologie afin de déterminer à quelle classe thérapeutique la plante appartient et éventuellement identifier une nouvelle classe thérapeutique n'a pas été effectuée ou encore aucune méthode d'extraction permettant d'obtenir de manière optimisée techniquement et économiquement leurs principes actifs n'a été décrite.

Il s'ensuit que ce manque de connaissances scientifiques précises sur leurs effets empêche leur utilisation thérapeutique. Sans ces informations scientifiques, l'utilisation en nutraceutique est elle aussi difficile, puisque le cadre réglementaire régissant ce domaine s'est récemment renforcé depuis la mise en application du nouveau décret 2006-352 relatif

aux compléments alimentaires lequel est la transposition en droit français de la directive européenne 2002/46/CE.

Dans un souci d'obtention de données scientifiques précises et de développement d'actifs originaux, les inventeurs ont développé des moyens pour évaluer l'effet de compositions d'origine végétale sur l'activité métabolique au niveau mitochondrial. En effet, des études récentes ont montré que la diminution de l'activité métabolique elle-même, et en particulier au niveau de la mitochondrie, était l'une des perturbations majeure et précoce observée dans le développement des maladies métaboliques, notamment dans la pathogenèse du diabète de type 2 [Petersen et al].

Selon une première approche, les inventeurs ont constaté que le test du MTT

(bromure 2 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium), couramment utilisé pour évaluer la cytotoxicité d'un produit chimique donné, d'origine synthétique ou naturelle (Mosmann), pouvait constituer un outil de grand intérêt pour sélectionner des compositions actives à partir des plantes et l'ont donc détourné de son utilisations habituelle.

Ce test est basé sur la capacité qu'ont les enzymes déshydrogénase contenues dans les mitochondries à convertir le MTT, molécule de couleur jaune en solution, en cristaux de formazan, de couleur bleue en solution. Il permet d'obtenir une mesure de l'activité déshydrogénase continue dans les mitochondries après traitement avec un produit donné et donc de mesurer la quantité d'ATP produite par la mitochondrie, laquelle est la signature de l'activité métabolique au niveau de la mitochondrie d'une cellule.

Les inventeurs ont ainsi développé une méthode de criblage de molécules originales pour leur potentiel à agir sur l'activité métabolique, en utilisant le test du MTT, non seulement pour mesurer la cytoxicité d'extraits, fractions et composés de plantes sélectionnées mais, de manière originale, pour mesurer la capacité de ces extraits, fractions et composés à augmenter l'activité métabolique.

La poursuite de leurs travaux a ensuite porté sur la recherche de produits d'origine végétale reconnaissant spécifiquement une cible biologique interférant avec la fonction mitochondriale, le TGR5. Le récepteur TGR5 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG en abrégé). Il s'agit du premier récepteur membranaire activé par

les acides biliaires. TGR5 est décrit comme étant un médiateur de certaines fonctions endocrines des acides biliaires.

Ainsi, en utilisant une lignée de cellules de CHO transfectée de manière stable avec un vecteur d'expression du TGR5 et un plasmide rapporteur (à titre d'exemple le gène codant pour la luciférase), les inventeurs ont constaté que l'activité de TGR5 était augmentée, par rapport à un contrôle, lorsque les cellules CHO étaient traitées par des extraits et/ou fractions susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, ou par des molécules susceptibles d'être obtenues à partir de ces extraits ou fractions. Ces extraits, fractions et molécules sont désignés globalement par les termes compositions ou « produits » dans la description et les revendications.

L'utilisation du TGR5 comme cible biologique conformément à l'invention permet de disposer de produits présentant une grande spécificité au niveau de leurs effets sur le métabolisme .

L'invention a donc pour but de fournir un procédé de grande fiabilité et facile à mettre en œuvre pour obtenir de nouvelles compositions utiles pour prévenir, accompagner un régime et traiter des maladies métaboliques.

Elle a également pour but de fournir de telles compositions en tant que produits nouveaux et de mettre à profit leurs propriétés pour la fabrication de médicaments ou encore de compléments alimentaires à base de plantes ou d'actifs végétaux pour le traitement et la prévention des maladies métaboliques.

L'invention a notamment pour but de fournir des produits agonistes de TGR5, et vise les applications de ces produits, chez l'homme et l'animal, notamment dans les domaines thérapeutiques, alimentaires, nutraceutiques et, de manière générale, pour prévenir et traiter les affections, troubles et syndromes liés à des désordres métaboliques.

Selon un premier aspect, l'invention vise un procédé d'obtention de compositions biologiquement actives, par extraction à partir d'une ou plusieurs plantes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes

a) de traitement, séparément, des plantes sélectionnées par rapport à une activité donnée, ou de parties de ces plantes, avec un ou plusieurs solvants pour obtenir des extraits totaux ou des fractions enrichies en principes actifs, plus spécialement des fractions apolaires et des fractions polaires

b) de sélection d'extraits ou fractions présentant une activité métabolique dans le test MTT et une activité biologique dans au moins un test spécifique de cette activité métabolique.

Ce procédé comporte avantageusement, outre les étapes a) et b) définies ci-dessus, une étape c), mise en œuvre après l'étape a), et/ou après l'étape b), cette étape c) comprenant l'analyse desdits extraits ou desdites fractions sélectionnés pour déterminer les composants qu'elles renferment et isoler et purifier, si souhaité, le ou les principes actifs portant l'essentiel de l'activité biologique. Cette analyse est réalisée plus particulièrement par profils HPLC.

Cette disposition sur l'identification et l'isolement de composés actifs ouvre la perspective d'obtention de tels composés par voie de synthèse dans l'optique d'un développement pharmaceutique ou en nutraceutique.

Dans l'étape a), les plantes ou les parties de plantes sont utilisées, de préférence, sous forme de fine poudre, obtenue après broyage et séchage.

Il s'agit plus particulièrement des feuilles, des écorces, des racines, des parties aériennes, des fruits, graines ...

L'étape a) comprend généralement une ou plusieurs extractions, ces extractions étant réalisées à l'aide de CO ₂ supercritique ou avec des solvants organiques, notamment un solvant alcoolique (en particulier avec de l'éthanol ou du méthanol) ou du cyclohexane ou tout autre solvant apolaire (éther de pétrole, heptane...), du dichlorométhane ou du chloroforme, et, plusieurs de ces solvants ou tous ces solvants, pouvant être utilisés successivement pour l'isolement de fractions spécifiques

On notera que l'utilisation du test du MTT selon l'étape b), appliquée à des plantes auxquelles des effets biologiques étaient reconnus, mais ne pouvaient être utilisés efficacement faute de moyens pour leur caractérisation, permet de révéler des extraits et fractions qui n'avaient jamais été identifiés jusqu'à l'invention.

Les compositions et produits, extraits, fractions composés et molécules susceptibles d'être obtenus par le procédé défini ci-dessus sont nouveaux et à ce titre entrent également dans le champ de l'invention.

L'invention est illustrée ci-après par son application à l'obtention de compositions possédant une activité antidiabétique et utiles en particulier pour la prévention et le traitement du diabète de type 2.

Dans ce but, les tests biologiques réalisés selon l'étape b) du procédé défini ci-dessus sont des tests pour déterminer une activité antidiabétique, notamment sur la sécrétion d'insuline.

Des compositions et produits préférés à cet égard sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les genres et espèces : Strychnos myrtoldes, Obetia radula, Tréma orientalis, Sclerocarya birrea, Voacanga thouarsii Moringa oleifera (= Moringa moringa, Moringa pterygosperma, Guilandina moringa), Agrimonia eupatoria, Arctium majus= Lappa major, Alchemilla vulgaris, Phaseolus vulgaris . Vaccinium myrtillus, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Géranium robertianum, Juglans regia, Kalanchoe crenata, Leptodenia madagascariensis, Morus nigra, Olea europaea, Rubus fructicosus, Spathodea campanulata.

Avantageusement, il s'agit de compositions et produits caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les genres : Strychnos, betia, Tréma, Sclerocarya, Voacanga, Moringa, Agrimonia, Arctium, Alchemilla, Phaseolus,

Vaccinium, Cichorium, Cynara, Géranium, Juglans, Kalanchoe, Leptodenia, Morus, Olea,

Rubus, Spathodea.

Des compositions et produits particulièrement préférés sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les familles : Loganiaceae, Urticaceae, Ulmaceae, Anacardiaceae, Apocynaceae, Moringaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Ericaceae, Geraniacaea, Juglandacaea, Crassulaceae, Oleaceae, Bignoniacea.

D'autres compositions particulièrement préférées sont des fractions de Tréma orientalis

Ulmaceae, Strychnos myrtoides Loganiaceae, Obetia radula Urticaceae, Vaccinium myrtillus Ericaceae, Sclerocarya birrea Anacardiaceae, Agrimonia eupatoria Rosaceae, Alchemilla vulgaris Rosaceae et Olea europaea Oleaceae, présentant respectivement, les

profils HPLC des figures 1-8, ainsi que les composés biologiquement actifs issus de ces fractions.

Selon un autre aspect, l'invention vise particulièrement l'utilisation de produits susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, tels qu'extraits, fractions, composés et/ou molécules comme agonistes spécifiques de TGR5.

On mesurera l'originalité de cet aspect de l'invention basée sur la mise en évidence du mécanisme d'action desdits produits qui permet le développement d'applications spécifiques.

Les produits mis en œuvre dans l'utilisation selon l'invention sont des produits biologiquement actifs, caractérisés en ce qu'ils présentent une structure chimique différente de celle des acides biliaires, agonistes connus de TGR5 ; possèdent une CE ₅₀ supérieure ou égale à celle d'un ligand naturel de TGR5, tel que l'acide lithocholique (LCA); et en outre n'activent pas le récepteur nucléaire FXR. De plus, ces produits entraînent une réduction de la prise de poids induite par une nourriture grasse dans un modèle murin de syndrome métabolique et entraînent également une réduction de la masse des coussinets graisseux de l'épididyme dans ce même modèle. Ils entraînent également une amélioration de la tolérance au glucose.

Grâce à ces effets spécifiques, ils s'avèrent ainsi particulièrement appropriés pour prévenir ou traiter des patients souffrant de pathologies telles que l'obésité, le syndrome métabolique (ou syndrome X) ou le diabète de type 2.

Les produits utilisés comme agonistes de TGR5 selon l'invention sont plus spécialement susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies dans le groupe comprenant Olea europaea, Alchemilla vulgaris, Juglans regia, Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus et Obetia radula.

Des molécules particulièrement préférées compte tenu de leur effet activateur de TGR5 comprennent les triterpènes pentacycliques .

II s'agit plus spécialement de triterpènes pentacycliques de type oléanane, tel l'acide oléanolique, de type ursane, tel l'acide corosolique, ou de type lupane.

La mise en évidence des effets antihyperglycémique, antihyperinsulinémique et sur l'obésité de l'acide oléanolique présente un caractère particulièrement surprenant étant donné qu'à ce jour les propriétés antihypertensive et hypoglycémique des feuilles d'olivier avaient été seulement attribuées à l'oleuropéine.

De manière avantageuse, lesdits agonistes de TGR5 selon l'invention présentent une grande innocuité et ne donnent pas lieu à des effets secondaires nocifs.

L'invention vise donc de manière générale la mise à profit des compositions et produits définis ci-dessus, à savoir extraits, fractions et composés de l'invention.

Selon un premier aspect, l'invention concerne ainsi de nouvelles compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins une composition ou un produit tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention vise également l'utilisation desdits compositions et produits biologiquement actifs pour la fabrication de médicaments destinés à la prévention et/ou traitement de troubles/syndromes métaboliques, plus spécialement de l'obésité et/ou de maladies associées comme le syndrome X (syndrome métabolique), le diabète de type 2.

Dans un mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de triterpènes pentacycliques de type ursane, de triterpènes pentacycliques de type oléanane, ou de triterpènes pentacycliques de type lupane.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise en particulier l'utilisation desdits extraits, ou fractions, ou de l'acide corosolique pour la prévention et/ou le traitement du diabète de type 2 ₅ de l'obésité et/ou le syndrome métabolique .

Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation desdits extraits ou fractions, ou de l'acide oléanolique pour la prévention et/ou le traitement de l'obésité ou du diabète, notamment du diabète de type 2, et/ou le syndrome métabolique.

Les médicaments de l'invention se présentent avantageusement sous des formes galéniques pour une administration par voie orale, topique, ou par injection.

Pour une administration par voie orale, les compositions pharmaceutiques se présentent plus particulièrement sous forme de comprimés, tablettes, gélules, granulés, gouttes, sirop, sirop alcoolique.

Pour une administration par voie topique, elles se présentent avantageusement sous forme de crèmes, laits, lotions, huiles ou patchs.

Des formulations galéniques appropriées comprennent les aérosols.

Pour une administration par voie injectable, elles se présentent sous forme de solutions dans des ampoules injectables par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables, ou encore de suspensions ou d'émulsions.

La posologie dans les différentes formes et pour l'application quotidienne, sera établie, de manière classique, selon le type d'effets à traiter.

A titre d'exemple, on administrera lesdits médicaments à base desdits agonistes à raison de 0.1mg à 5g/jour.

Les effets antihyperglycémiques, antihyperinsulinérniques et sur la prise de poids desdits produits sont également avantageusement mis à profit en diététique.

Selon un deuxième aspect, l'invention se rapporte donc à des compléments alimentaires, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins une composition ou un produit tels que définis ci-dessus pour une application en nutraceutique, en association avec un excipient inerte.

L'invention vise ainsi particulièrement l'utilisation des agonistes de TGR5 définis ci- dessus comme compléments alimentaires destinés à l'homme (adulte ou enfant) ou à l'animal.

Les compléments de l'invention sont incorporés dans l'alimentation durant l'élaboration des aliments ou lors de leur conditionnement, ou en utilisant des préparations déjà formulées avec lesdits produits, permettant d'effectuer la supplémentation désirée.

Ils peuvent également se présenter sous une forme ingérable telle que gélules, capsules, sous forme liquide d'infusions, de gomme, de poudre, de comprimés, de gélules, décoctions, cette énumération n'étant pas limitative.

De manière générale, l'invention propose donc une alternative pour la prévention de ces maladies métaboliques car ces produits d'origine naturelle sont associés à une meilleure qualité de vie et d'autre part leur utilisation souvent séculaire dans la pharmacopée traditionnelle assure une connaissance exhaustive des effets secondaires.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés avec les exemples qui suivent de modes détaillés de réalisation de l'invention. Ces exemples servent à illustrer l'invention sans en limiter la portée. Il est fait référence dans ces exemples :

- A : aux figures 1 à 9 qui représentent les profils HPLC d'extraits de plantes selon l'invention (figures 1 à 8) et donnent un résultat de test MTT (figure 9), et

- B : aux figures 10 à 24 qui illustrent les résultats obtenus avec des fractions de 6 extraits de plantes (Olea europaea, Alchemilla vulgaήs, Juglans regia, d'Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus, Obetia radula), à savoir, respectivement :

- la figure 10 : l'effet de fractions d'Olea europaea sur l'activité du récepteur TGR5, - la figure 11 : le profil HPLC de la fraction d'Olea europaea active sur le TGR5,

- la figure 12 : le spectre RMN de l'acide oléanolique, principe actif sur le TGR5, extrait d'Olea europaea,

- la figure 13 : l'effet de fractions à? Alchemilla vulgaris sur l'activité du récepteur TGR5,

- la figure 14 : le profil HPLC de la fraction d ^: 'Alchemilla vulgaris active sur le TGR5, - la figure 15: le spectre RMN de l'acide corosolique, principe actif sur le TGR5, extrait d' Alchemilla vulgaris,

- la figure 16 : l'effet de fractions de Juglans regia sur l'activité du récepteur TGR5,

- la figure 17 : le profil HPLC du pool de fractions de Juglans regia actives sur le TGR5,

^ ^

- la figure 18 : l'effet de fractions d'Agrimonia eupatoria sur l'activité du récepteur TGR5,

- la figure 19 : le profil HPLC de la fraction active d'Agrimonia eupatoria sur le TGR5, la figure 20 : l'effet de fractions de Vaccinium myrtillus sur l'activité du récepteur TGR5,

- la figure 21 : le profil HPLC de la fraction de Vaccinium myrtillus active sur TGR5,

- la figure 22 : l'effet de fractions d'Obetia r adula sur l'activité du récepteur TGR5, la figure 23 : le profil HPLC de la fraction d'Obetia r adula active sur TGR5, et

- la figure 24 : l'effet de l'acide oléanolique (OA), de l'acide corosolique (AVA) et de la fraction active TGR5 de Juglans regia (JRL) sur le test de tolérance au glucose

(IPGTT) chez la souris soumise à un régime gras.

Exemples A

Matériel et méthode

Plantes

Les parties de plantes séchées (feuilles, racines....) sont broyées afin d'obtenir une poudre fine destinée à l'extraction.

Extraction-purification

La poudre est épuisée par percolation ou par macération, ou par sonication par des solvants polaires ou apolaires. Ces solvants peuvent être du cyclohexane, de dichorométhane, du chloroforme, de l'acétone, de l'acétate d'éthyle, du butanol, de Péthanol, du méthanol, de l'eau ou un mélange de ces différents solvants. Les extraits sont obtenus avec des rendements compris entre 2 et 10%. Ils sont évaporés à sec sous pression réduite. Puis fractionnés soit par extraction liquide-liquide, soit par extractions successives par des solvants de polarité croissante. Les composés purs peuvent être obtenus notamment par fractionnement par chromato graphie d'adsorption, chromato graphie d'exclusion, chromatographie d'affinité, chromatographie d'échanges d'ions, ou par cristallisation fractionnée

Profils chromatographiques

Les extraits, les fractions enrichies, les fractions plus ou moins purifiées ou les composés purs sont analysés par chromatographie à haute pression en utilisant une colonne de phase inverse (RP-CLHP). La phase stationnaire utilisée correspond notamment à une silice greffée C8 ou Cl 8, de 5 à 10 de granulométrie. Les mélanges d'élution correspondent notamment à de l'eau acidifiée (pH 3) additionnée de méthanol ou d'acétonitrile. Le gradient utilisé varie de 98% à 0% d'eau acidifiée sur au moins 60 min.

Test MTT

La lignée transformée pancréatique INSl utilisée pour ce test est un don du Centre Européen du Diabète (Hautepierre, France). Les cellules sont ensemencées à une densité de 3 10 ³ /puit dans des plaques 96 puits et cultivées dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau fœtal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 μg/ml) pendant 24 heures et le test MTT ensuite réalisé: le MTT (bromure 2 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium) est un sel de tétrazolium donnant une solution de couleur jaune quand il est dilué dans un milieu. Il est converti en formazan violet insoluble dans le milieu de culture après clivage du cycle tétrazolium par les déshydrogénases mitochondriales actives des cellules vivantes seules. Les cellules mortes ne peuvent être le siège de ce changement. La solution de MTT (concentration finale de 0,5 mg/ml) est ajoutée aux cellules pour 4h d'incubation. Le milieu est ensuite aspiré avec précaution afin de ne pas aspirer les cristaux de formazan formés, lesquels seront solubilisés dans 100 μl de DMSO. Le matériel dissous est mesuré par spectrophotométrie donnant une absorbance proportionnelle à la concentration de colorant converti. L'absorbance de chaque puits est mesurée à 540-630 après soustraction du bruit de fond sur le spectrophotomètre. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul).

Test de sécrétion d'insuline

Les ilôts de Langerhans de pancréas de porc sont obtenus auprès du Centre Européen du Diabète (Hautepierre, France). 100 ilôts/puit sont ensemencés dans des plaques 24 puits et cultivés dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau fœtal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 μg/ml) pendant 60 minutes et la

sécrétion d'insuline mesurée à l'aide d'un kit Elisa (Mercodia) selon les recommandations du fournisseur. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul).

Exemple 1 A: Etude de l'effet de plantes sélectionnées sur l'activité métabolique de cellules

Des cellules INSl ont été traitées pendant 24 heures avec 200 μg/ml d'extrait de plante obtenus par extraction à l'aide d'éthanol, de méthanol ou de dichorométhane. Le taux de conversion du MTT a été calculé et l'effet des extraits exprimé en pourcentage du contrôle.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 : extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires). Dans ce tableau, EtOH = fraction éthanol ; MeOH = fraction méthanol ; DCM = fraction dichlorométhane.

Tableau 1

L'examen de ces résultats montre que l'ensemble des plantes sélectionnées a un effet sur l'activité métabolique des cellules.

Exemple 2 A : Profils HPLC

Les fractions actives sont soumises à une RP-HPLC analytique afin d'avoir l'empreinte chromatographique des extraits par rapport à leur activité biologique. Les figures 1-8 donnent, respectivement, les profils RP-HPLC des fractions éthanoliques de Tréma orientalis, Strychnos myrtoides, Obetia radula, Vaccinium myrtillus, Sclerocarya birrea, Agrimonia eupatoria, Alchemilla vulgaris et Olea europaea.

Les fractions sont ensuite purifiées par RP-HPLC semi-préparative puis soumises au test de MTT afin de confirmer et d'identifier le principe actif. Pour ce test, les cellules INS 1 ont été traitées avec 100, 200, 400 ou 800 μg/ml d'extrait de plante pendant 24h. Un exemple de résultat obtenu avec Tréma orientalis est présenté dans la Figure 9. Les abréviations données sur cette figure ont les significations suivantes: TC: témoin cellule seule; DMSO: témoin cellule seule + solvant (DMSO); A-J: fractions obtenues après RP-HPLC semi- préparative (détail des fractions présenté figure 1). Le taux de conversion est présenté après mesure de la densité optique à 560 nm.

Exemple 3 A: Effet des extraits de plantes sélectionnées sur la sécrétion d'insuline

II existe quatre classes thérapeutiques d' antidiabétiques distinctes pour traiter le diabète de type 2. Parmi elles, les sulfonylurées, médicament phare aux Etats-Unis pour le traitement du diabète de type 2. Les sulfonylurées favorisent la sécrétion d'insuline par le pancréas et préviennent donc par ce biais l'hyperglycémie. Puisque les plantes sont actives sur le métabolisme cellulaire, afin de déterminer si les actifs appartenaient à une des 4 classes thérapeutiques connues, en particulier les sulfonylurées, l'activité de ces extraits a été vérifiée sur un test de sécrétion d'insuline sur ilôts de Langherans porcins.

Les ilôts de Langherans de porc ont été traités pendant 60 minutes avec 200 μg/ml d'extrait de plante. La sécrétion d'insuline est mesurée par test ELISA et l'effet des extraits exprimé en pourcentage du contrôle.

Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant. Dans ce tableau, EtOH, MeOH et DCM correspondent, respectivement, aux extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires).

Tableau 2

Exemples B

Produits et procédés Produits

L'acide oléanolique est un produit commercialisé par Extrasynthèse (Genay, France) et l'oleuropéine et l'acide lithocholique sont des produits commercialisés par Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).

Extraction à partir de plante

L'extraction à l'éthanol est effectuée, exhaustivement, sur 10 g de feuilles d'olivier séchées à l'air et pulvérisées (Olea europaea L. Oleaceae, PhytoEst, France) avec une solution aqueuse d'éthanol à 80%, par macération à température ambiante pendant 3 heures.

On filtre ensuite le mélange à l'aide d'une pompe aspirante et on concentre le filtrat par évaporation sous pression réduite.

Pour l'extraction au dichlorométhane et au méthanol, on extrait successivement la matière végétale en poudre (10 à 20 g) avec du cyclohexane (100 mL), du dichlorométhane (100 mL) et du méthanol (100 mL), en utilisant un extracteur Soxhlet automatique (2055 Aventi Soxtex, Foss Tecator). Ce protocole permet d'obtenir trois types d'extrait dans lesquels sont respectivement concentrés les constituants très lipophiles, non polaires et polaires du végétal.

On élimine le solvant par évaporation sous pression réduite puis on pèse les résidus correspondants et on les conserve au congélateur jusqu'à utilisation.

Analyse par HPLC

Pour les profils analytiques de chaque extrait, on soumet une solution méthanolique du résidu (5 mg/mL) à une HPLC analytique (Varian Pro Star) couplée à un détecteur DAD (Varian) en utilisant une colonne en phase inverse (Nucleodur 100- 10-Cl 8, 250/4,6, Mâcher ey-Nagel) . Pour l'élution, on utilise un mélange d'acétonitrile et d'eau acidifiée (0,1% d'acide trifluoroacétique) .

En conditions analytiques, le débit est de 1 mL/min avec le gradient suivant : H ₂ O/CH ₃ CN (20:80) pendant 30 min, CH3CN (100%) pendant 5 min, et H ₂ O/CH ₃ CN

(20:80) pendant 5 min. Pour l'analyse par LC/MS (Agilent 1200SL), on enregistre le PDA

dans la gamine de 200 à 500 nm, en utilisant 254 nm en tant que longueur d'onde de détection. On procède aux analyses avec une APCI (Application Layer Protocol Control Information) couplée à une interface d'ionisation par électronébulisation (ESI) en mode négatif.

Analyse par RMN

On utilise un spectromètre de RMN DPX300 fonctionnant à 300 MHz pour ¹ H. Les déplacements chimiques sont exprimés en δ (parties par million) en référence au pic de solvant de 7,58 pour la pyridine-d5 C5D5N.

Dosage de l'activité TGR5 par un test luciférase

Des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) ont été obtenues auprès de l'ATCC (Manassas, Virginie) et maintenues dans du Milieu Essentiel Minimum alpha (α-MEM) auquel est ajouté 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF), 100 μM d'acides aminés non essentiels (AANE), 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de sulfate de streptomycine.

Pour le dosage de l'activité TGR5, on utilise une lignée cellulaire stable obtenue en transfectant des cellules CHO avec 3,8 μg d'un plasmide, vecteur d'expression du TGR5 (pCMVSPORT6/TGR5), 3,8 μg d'un plasmide rapporteur luciférase dont l'expression est contrôlée par le cAMP Response Elément (CRE,pCRE-Luc) et 0,4 μg d'un plasmide d'expression du gène de résistance à la néomycine (pcDNA3.1(+)) en utilisant de la

Lipofectamine 2000. Les cellules transfectées sont sélectionnées avec 400 μg/mL de sulfate

G418 et les clones individuels sont cultivés indépendamment sur une plaque à 96 puits. Les cellules CHO exprimant TGR5 sont traitées avec 10 μM d'acide lithocholique (LCA) ou d'extraits végétaux, puis soumises à des dosages de la luciférase [Picard ét al.]. La luminescence est déterminée sur un appareil Centro XS3 LB960 (Berthold Technologies,

Bad Wildbad, Allemagne).

Dosage de FXR par la luciférase

Pour évaluer l'activité FXR des extraits végétaux, on transfecte grâce à la Lipofectamine 2000 des cellules COSl (ATCC) avec 25 ng de plasmide vecteur d'expression du hFXR

(pCMX-hFXR), 25 ng de plasmide vecteur d'expression du récepteur des rexinoïdes α (RXRα) de souris (m) (pCMX-mRXRα), rapporteur luciférase (pEcREx7 -Luc ) et 50 ng de pCMVβ utilisé en tant qu'étalon interne dans chaque puits.

Environ 18 heures après les transfections, les cellules sont incubées pendant 5 heures avec différentes concentrations de chaque extrait dans du MEM (ou du DMEM) frais. Après ce traitement, les cellules sont lysées et on détermine l'activité luciférase normalisée en opérant selon Picard et al ci-dessus.

Animaux et régime alimentaire

Des souris C57BL/6 mâles de six semaines, obtenues auprès de Charles River, sont utilisées.

La nourriture normale et équilibrée riche en glucides (SAFE, D04) et la nourriture riche en lipides (60% Kcal Fat, D12492 ) sont obtenues auprès de Research Diets (New Brunswick, New Jersey) .

Les souris sont par cages de 4 ou 5 animaux sous température stable, avec un cycle jour/nuit de 12 heures, et avec 1 accès libre à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont maintenus pendant 10 semaines soit sous une alimentation normale et équilibrée (n = 5), soit sous une alimentation riche en lipides (n = 32). Après 10 semaines sous une alimentation riche en lipides, les animaux sont divisés en quatre groupes de 8 animaux : un groupe est maintenu sous une alimentation riche en lipides uniquement, un autre groupe reçoit la même alimentation additionnée d'acide oléanolique à une dose de 100 mg/kg/jour (l'absorption de nourriture est mesurée tout au long de l'étude et la quantité de composé ajustée de façon à maintenir le dosage stable), un autre groupe reçoit la même alimentation additionnée d'acide corosolique à une dose de 100 mg/kg/jour, enfin un dernier groupe reçoit la même alimentation additionnée de fraction active de Jugions regia à une dose de 100 mg/kg/jour. Le poids corporel et l'absorption de nourriture sont déterminés un jour sur deux. Cette expérience est réalisée en respectant les principes éthiques.

Test de tolérance au glucose

Le test est réalisé sur des animaux que l'on a laissé jeûner pendant 10 heures. La glycémie est surveillée à l'aide d'un glucomètre portatif (Maxi Kit Glucometer 4, Bayer Diagnostic). Pour ce test, on injecte par voie intrapéritonéale une solution stérile contenant

2 g de glucose/kg de poids corporel. La glycémie est évaluée en prélevant du sang dans la veine caudale à 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 et 180 minutes.

Exemple IB : identification d'agonistes de TGR5 à partir à'Olea europaea

• Extraction à partir de feuilles d'Olea europaea

Extraits éthanoliques totaux, extraits au DCM fdichlorométhane) et extraits au MeOH fméthanol) Les extraits totaux présentant une activation de TGR5 similaire à celle observée avec le

LCA (utilisé en tant que témoin positif) sur le test luciférase dans les cellules CHO-TGR5 ont d'abord été sélectionnés.

L'isolement du principe actif se poursuit en testant des extraits enrichis soit en molécules hydrophobes (extraction au DCM) , soit en molécules hydrophiles (MeOH). Pour Olea europaea, la majeure partie de l'activité est présente dans l'extrait DCM.

Fractionnement de l'extrait hvdrophobe

Le fractionnement de la fraction hydrophobe de l'extrait d'Olea europaea se poursuit par

HPLC en phase inverse préparative ou par chromatographie sur couche mince. Dix fractions numérotées de 1 à 10 sont obtenues et l'activité luciférase dans les CHO-TGR5 est mesurée avec à titre de contrôle, celle de LCA et celle de l'oleuropéine à des doses de 1,5,

5, 15 et 50 μg/mL.

Comme le montre la figure 10, l'activité n'est présente que dans les fractions 6 à 9. Avec l'oleuropéine à des doses allant de 1,5 à 50 μg/mL, on n'observe aucun effet agoniste sur TGR5. Ces données démontrent que la molécule active contenue dans l'extrait DCM d'Olea europaea est différente de l'oleuropéine.

• Molécule active de la fraction 7

De manière surprenante, la fraction active 7 présente une grande pureté. La détection

UV ne révèle qu'un pic principal avec un temps de rétention de 21,9 minutes (figure 11). L'analyse LC/MS de la fraction 7 permet d'identifier la masse moléculaire de la molécule à 455,3 g/mol. On réalise cette analyse en mode négatif, ce qui signifie qu'il manque un proton hydrogène sur la molécule. On estime donc la masse moléculaire réelle du pic

principal détecté aux alentours de 456 à 457 g/mol. L'identification est terminée en analysant la fraction 7 par RMN (figure 12). Le spectre obtenu est caractéristique d'une molécule de type triterpénoïde. Les données analytiques de HPLC, de LC/MS et de RMN combinées avec celles disponibles pour les triterpènes de feuilles d'olivier déjà décrits, amènent à conclure que la molécule de la fraction 7 est l'acide oléanolique. Cette identification est confirmée en réalisant une co-injection en HPLC avec un étalon commercial (Extrasynthèse, Genay, France) et par comparaison du spectre de RMN obtenu avec celui déjà rapporté de l'acide oléanolique [Seebacher et al.]. La valeur de la CE50 obtenue pour l'acide oléanolique dans le test d'activité luciférase TGR5 humain qui est de 1,42 μM, est comparable à la CE50 de 0,89 μM obtenue pour le LCA, ligand naturel de

TGR5.

• Etude de la sélectivité de l'acide oléanolique vis-à-vis de TGR5

Pour exclure toute éventuelle implication du récepteur nucléaire des acides biliaires dans l'explication de l'activité biologique de l'acide oléanolique, on détermine ensuite si l'acide oléanolique active le FXR dans un dosage de gène rapporteur (luciférase) dépendant de FXR. Les résultats obtenus confirment que l'acide oléanolique n'active pas le FXR, ce qui démontre que ce triterpène est un agoniste sélectif de TGR5, le différenciant nettement des acides biliaires, qui activent à la fois TGR5 et FXR.

Exemple 2 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir d'Alchemilla vulgar±s

On prépare des extraits et fractions en opérant comme ci-dessus avec Oleα europαeα.

Les résultats obtenus avec les fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 13.

On constate la très forte réactivité de la fraction 9 dans le test TGR5.

Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 14.

La figure 15 rapporte le spectre RMN de l'acide corosolique, qui est la molécule active contenue dans la fraction 9.

Exemple 3 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir de Juglans regia

On opère comme indiqué dans l'exemple 1 en rapport avec Olea europaea. Les résultats obtenus avec les fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 16 qui montre la forte activité des fractions 7, 8 et 9. Le profil HPLC du pool de ces fractions est donné sur la figure 17.

Exemple 4 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir tfAgrimonia eupatoria

On opère comme indiqué dans l'exemple 1 en rapport avec Olea europaea. Les résultats obtenus avec 8 fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 18 qui montre la forte activité de la fraction 4. Le profil HPLC de ces fractions est donné sur la figure 19.

Exemple 5 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir de Vaccinium myrtillus

On opère comme indiqué dans l'exemple 1.

Les résultats obtenus sur 9 fractions DCM sont donnés sur la figure 20. L'examen de cette figure montre que les fractions 3, 5, 6, 7, et 8 présentent une activité supérieure à celle de LCA, tout spécialement en ce qui concerne la fraction 6. Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 21.

Exemple 6 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir d'Obetia radula

On opère comme indiqué dans l'exemple 1.

Les résultats obtenus sur 8 fractions DCM sont donnés sur la figure 22. L'examen de cette figure montre que les fractions 3, 4 et 6, tout spécialement la fraction 6 présentent une activité supérieure à celle du LCA. Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 23.

Exemple 7 B : étude de l'effet de fractions actives d'extraits de plantes sur la tolérance au glucose chez les souris soumis à un régime gras

L'effet de fractions actives d'extraits de plantes selon l'invention a été évalué dans un modèle murin de syndrome métabolique, à savoir la souris soumise à un régime gras. Des souris C57BL/6 sont nourries soit avec de la nourriture normale et équilibrée, soit avec de la nourriture riche en lipides pendant 10 semaines avant de commencer le traitement par les extraits de plantes. Pendant cette période, les souris sous régime gras présentent une augmentation de 50% de leur poids corporel, accompagnée d'une augmentation similaire de l'apport calorique.

A la fin de la période de traitement (14 jours) avec les fractions de : Olea (OA), Alchemilla (AVA) et Juglans (JRL), les paramètres cliniques donnés dans le tableau 1 ci- dessous sont obtenus.

Tableau 1

Alimentation normale régime gras

Véhicule OA AVA JRL 100 mg/kg 100 mg/kg 100 mg/kg

JO 24,3 ± 0,5 36,1 ± 1 34,5 ± 0,7 34,1 ± 1 ,5 35 ± 1,3

Poids corporel (g) J14 26,3 ± 0,4 38,3 ± 1 ,1 30,4 ± 1 ,4 35 ± 1 ,4 35,9 ± 1 ,3

Prise moyenne d'aliments 7,20 ± 0,29 14,79 ± 0,88 11 ,43 ± 0,98 X X (Kcal/animal/jour)

WAT Epididymal (% Poids corporel) 1 ,73 ± 0,09 5,77 ± 0,27 3,7 ± 0,7* 4,8 ± 0,4 ^* 5,1 ± 0,3

Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, alimentation normales n=5, Véhicule, OA, AVA, JRL n=8. (* p<0,001) - WAT = tissu adipeux blanc

Une tendance à produire un effet inhibiteur sur la prise de poids corporel est observée, ainsi qu'une nette réduction de la masse des coussinets graisseux de l'épididyme, ce qui indique que les fractions actives affectent le métabolisme énergétique.

On mesurera que, dans ces expériences, une alimentation riche en gras est maintenue pendant 10 semaines avant de commencer le traitement. L'étude porte donc sur la capacité à corriger, plutôt qu'à prévenir, l'apparition d'une surcharge pondérale et d'une résistance à l'insuline.

Les résultats de la figure 24 indiquent que ces fractions sont capables d'améliorer l'homéostasie métabolique chez les souris soumises à un régime gras. En particulier, la résistance à l'insuline induite dans ce modèle d'alimentation riche en gras et provoquant un effet pré-diabétique est corrigé: en effet après 14 jours de traitement avec les fractions actives de l'invention, une épreuve d'hyperglycémie provoquée par voie intrapéritonéale (IPGTT) est effectuée. La glycémie moyenne avant l'IPGTT est respectivement de 103 ± 7, 154 ± 5, 144 ± 18, 141 ± 2 et 159 ± 3 mg/dL pour les groupe à alimentation normale, à alimentation riche en lipides, à alimentation riche en lipides + acide oléanolique, à alimentation riche en lipides + acide corosolique, et à alimentation riche en lipides + JRL. Les courbes d'IPGTT montrent clairement que l'administration d'une nourriture riche en gras induit une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline (figure 24). Cette tolérance au glucose est partiellement corrigée lorsque les souris sont traitées avec les fractions actives de plantes.

L'invention fournit ainsi des agonistes de TGR5 hautement spécifiques et puissants et les résultats obtenus montrent la forte activité de ces molécules, correspondant à des fractions pures et/ou enrichies.

Références

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KF Petersen, D Befroy, S Dufour, J Dziura, C Ariyan, DL Rothman, L DiPietro, GW Cline and GI Shulman. Science, 300 : 1140-1142 (2003).

T Mosmann, J Immunol Methods, 65(l-2):55-63 (1983).

F. Picard, M. Gehin, M.C. Annicotte, S. Rocchi, M.F. Champy, B.W. O'Malley, P. Chambon, et J. Auwerx. SRC-I and TIF2 control energy balance between white and brown adipose tissues. CeIl 111 (2002) 931-941.

W. Seebacher, N. Simic, R. Weiss, R. Sat, et O. Kunert. Magn. Reson. Chem. 41 (2003) 636-638.