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Title:
BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDE DELQ AND PREPARATION AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/090172
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided is a milk-derived biologically active polypeptide having an amino acid sequence of DELQ, which has in-vitro antioxidation activity and promotes immune activity of human body. In-vitro antioxidation and in-vitro immunity promotion experiments prove that the peptide has good biological antioxidation activity, and has the function of enhancing cellular immunity.

Inventors:
ZHANG SHAOHUI (CN)
LU SHANSHAN (CN)
SUN GUANHUA (CN)
MA LIULIU (CN)
ZHOU JIEHUI (CN)
LI DAVID XI AN (AU)
ZHAN DONGSHENG (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/089196
Publication Date:
June 19, 2014
Filing Date:
December 12, 2013
Export Citation:
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Assignee:
UNIV SHANGHAI JIAOTONG (CN)
ZHEJIANG PANDA DAIRY GROUP COMPANY LTD (CN)
International Classes:
A23L1/305; C07K5/113; A61K38/07; A61P37/04; A61P39/06; C07K1/20; C07K1/34; C07K1/36; C12N15/12; C12P21/06; C12R1/225
Foreign References:
JP2004081178A2004-03-18
CN103232528A2013-08-07
Other References:
SINGH, T.K. ET AL.: "Isolation and Identification of Further Peptides in the Diafiltration Retentate of the Water-soluble Fraction of Cheddar Cheese", JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, vol. 64, no. 3, August 1997 (1997-08-01), pages 433 - 443
MA, LIULIU ET AL.: "Effect of Simulated Gastrointestinal Digestion on Lymphocyte Proliferation of Milk-derived Peptides", CHINA DAIRY INDUSTRY, vol. 41, no. 5, May 2013 (2013-05-01), pages 4 - 7
SUN, GUANHUA ET AL.: "Study on Immune Activity of Bioactive Oligopeptides Derived from Lactobacillus Helveticus Fermented Milk.", CHINA DAIRY INDUSTRY, vol. 41, no. 9, September 2013 (2013-09-01), pages 4 - 7
Attorney, Agent or Firm:
J.Z.M.C. PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (CN)
上海光华专利事务所 (CN)
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Claims:
1. 一种生物活性多肽, 其氨基酸序列为 Asp-Glu-Leu-Gln。

2. 权利要求 1所述的生物活性多肽, 其特征在于, 所述生物活性多肽为乳源性。

3. 编码权利要求 1所述生物活性多肽的核苷酸片段。

4. 权利要求 3所述的核苷酸片段, 其特征在于, 所述核苷酸片段的序列如 SEQ ID NO: 2 所示。

5. 权利要求 1-2任一权利要求所述生物活性多肽的制备方法, 步骤如下:

1 ) 发酵: 将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵, 获得瑞士乳杆菌发酵乳;

2) 多肽的粗提: 对步骤 1 ) 的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离, 取上清液;

3) 多肽的纯化:

a. 对步骤 2) 的上清液进行超滤处理, 收集滤液;

b. 收集的滤液采用反向层析柱 S0URSE 5 RPC ST进行反相高效液相色谱分离, 收集 生物活性多肽 DELQ。

6. 如权利要求 5所述的制备方法, 其特征在于, 步骤 1 ) 所述厌氧发酵的条件为: 发酵温 度 36〜38°C, 发酵时间 15〜20h。

7. 如权利要求 5所述的制备方法, 其特征在于, 步骤 3) a所述超滤法所采用的滤膜的截 留分子量分别为 lOkDa和 3kDa; 所述超滤过程中, 压力范围为 0. 1〜0. 3MPa, 滤液流速 为 0· 8〜L 2mL/min o

8. 权利要求 1-2任一权利要求所述生物活性多肽在制备抗氧化和 /或增强机体免疫力的食 品、 保健品及药物中的应用。

9. 一种抗氧化药物, 包含前述生物活性多肽 DELQ或前述生物活性多肽 DELQ的衍生物。

10. 一种增强机体免疫力药物,包含前述生物活性多肽 DELQ或前述生物活性多肽 DELQ的衍 生物。

Description:
一种生物活性多肽 DELQ及其制备和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域, 具体涉及一种生物活性多肽 DELQ及其制备和应用。

背景技术

在牛乳经乳酸菌发酵的过程中, 牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用, 并发生了 一系列生理生化反应, 使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸, 被人体消化吸收或通过小肠 上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环 。 在这些多肽中, 有一部分具有特殊的生理 功能, 被称为 "生物活性肽"。

氧化反应和氧化代谢对于食物和人体来说都是 至关重要的, 自由基和活性氧引起了一 系列的氧化反应。 当过量的自由基形成, 它们会超过保护性酶如超氧化物歧化酶、 过氧化 氢酶的保护作用, 从而导致脂质氧化、 细胞凋亡等一系列的副作用产生。 这一类的氧化反 应, 不仅影响含脂食物的保质期, 也对人体的健康造成了一定的危害, 如风湿性关节炎、 糖尿病、 动脉硬化等。 此外, Collins等人 2005年研究发现癌症的发生也与 DNA的氧化损 伤有关。

早期一些人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香 醚 (BHA)、 2,6-二叔丁基 -4-甲基苯酚 (BHT) 被运用到食品中, 作为脂质的抗氧化剂, 但这些人工合成的添加剂对于人体都有 潜在的风险。 因此, 在天然食物来源中寻找安全的抗氧化剂尤为重 要。 近些年来, 人们发 现一些食物来源的多肽类物质具有良好的抗氧 化作用, 如玉米短肽、 大豆肽、 牛乳多肽等。 这些多肽可以通过微生物发酵、 消化酶解等多种途径得到, 并且大多具有抗氧化活性的多 肽是由 2〜20个氨基酸残基组成, 分子量小于 6000Da, 含有一定量的疏水氨基酸、 芳香族 氨基酸。

免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得 并证明其生理活性的一类生物活性多 肽。 1981年 Jolles等人首次发现, 利用胰蛋白酶水解人乳蛋白, 可以得到一个氨基酸序列 为 Val-Glu-Pro-Ile-Pra-Tyr的六肽, 体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞 对绵羊血 红细胞的吞噬作用。 Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp 能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的 吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵 抗。 李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽 (PGPIPN) 伺喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞 噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的 增强。

研究表明, 免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力, 刺激机体淋巴细胞的增殖, 增强巨 噬细胞的吞噬功能, 促进细胞因子的释放、 提高机体抵御外界病原体感染的能力, 降低机 体发病率, 而且不会引起机体的免疫排斥反应。

发明内容 本发明的目的在于提供一种生物活性多肽, 其氨基酸序列为 Asp-Glu-Leu-Gln ( SEQ ID NO: D o 较优的, 所述生物活性多肽的来源为乳源性。

本发明的生物活性多肽 DELQ为乳源性, 具体来源于 β-酪蛋白, 并且为 β-酪蛋白 (SEQ ID ΝΟ:3)第 58〜61位的氨基酸残基。

较优的, 所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强 机体免疫力的功能。 本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方 法和化学方法人工合成, 也可以从乳制 品中通过分离纯化的方法直接获得。

本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷 酸片段。

β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有 技术, 编码 β-酪蛋白第 58〜61位氨基酸残 基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽 DELQ。

进一步的,编码前述生物活性多肽的核苷酸片 段,其序列为: 5'-gatgaactccag-3' ( SEQ ID NO: 2)。

本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制 备方法, 步骤如下:

1 ) 发酵: 将瑞士乳杆菌 iLactobacillus helveticus 添加到脱脂乳中进行厌氧发酵, 获得瑞 士乳杆菌发酵乳;

2 ) 多肽的粗提: 对步骤 1 ) 的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离, 取上清液;

3 ) 多肽的纯化: a. 对步骤 2) 的上清液进行超滤处理, 收集滤液; b. 收集的滤液采用反向层析柱 SOURSE 5 RPC ST (4.6 X 150mm) 进行反相高效液相 色谱分离, 收集生物活性多肽 DELQ。 本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳, 通常脱脂乳中脂肪含量小于 0. 1%。 较优的, 所述厌氧发酵的条件为: 发酵温度 36〜38 °C, 发酵培养 15〜20h; 优选发酵 培养 19h。 较优的, 步骤 2 ) 所述低温离心的条件为: 4°C, 8000〜10000rpm, 离心 15〜30min。 较优的, 步骤 3 ) a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别 lOkDa和 3kDa。 本 发明采用截留分子量分别为 10kDa、 3kDa的滤膜, 使样品依次通过两张滤膜进行超滤 更优的, 步骤 3 ) a 所述超滤过程中, 压力范围为 0.1〜0.3MPa, 滤液流速为 0.8〜 1. 2mL/min。 较优的, 步骤 3 ) b反相高效液相色谱分离法中, 流动相 A为含有 2%乙腈和 0.05%TFA 的 dd¾0; 流动相 B为 100%乙腈。 较优的, 步骤 3 ) b反相高效液相色谱分离法中, 收集分子量为 504.23Da的多肽的洗脱 峰, 即为生物活性多肽 DELQ。 在本发明反相高效液相色谱法分离过程中, 已知 DELQ 的分子量, 收集分子大小为 504.23Da 的洗脱峰, 即为本发明的生物活性多肽 DELQ。 具体的, 本发明分子大小为 504.23Da的洗脱峰其保留时间为 24min。 本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制 备抗氧化和 /或增强机体免疫力的食品、 保健品及药物中的应用。 本发明的生物活性多肽 DELQ 可以用于酸奶等乳制品、 减少自由基对皮肤伤害的化妆 品、 并且由于本发明的生物活性多肽 DELQ能够通过胃肠道直接吸收不被降解, 因此可以用 于制备提高免疫力的保健品, 或者用于制备具有抗氧化和 /或增强机体免疫力的药物。 本发明第四方面公开了一种抗氧化药物,包含 前述生物活性多肽 DELQ或前述生物活性 多肽 DELQ的衍生物。 本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药 物,包含前述生物活性多肽 DELQ或前述 生物活性多肽 DELQ的衍生物。 所述多肽的衍生物, 是指在多肽的氨基酸侧链基团上、 氨基端或羧基端进行羟基化、 羧基化、 羰基化、 甲基化、 乙酰化、 磷酸化、 酯化或糖基化等修饰, 得到的多肽衍生物。

本发明生物活性多肽 DELQ的有益效果为: 本发明的乳源性生物活性多肽 DELQ具有很 好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性; 一方面能够清除机体内的自由基, 减少自由基对 人体的伤害; 另一方面, 本发明的生物活性多肽 DELQ还能够增强机体免疫力, 增强巨噬细 胞的吞噬功能, 提高机体抵御外界病原体感染的能力, 降低机体发病率, 而且能够通过胃 肠道直接吸收不被降解, 进入体内不会引起机体的免疫排斥反应。 对开发具有抗氧化功能 及增强免疫功能的乳制品、 保健品和药品具有十分重要的意义。

附图说明

图 1 : 瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超 滤后粗提物的质谱对比图 (A: 3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图, B : 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物质谱图) 图 2 : 3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与 3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物分子量 差异及丰度比较 图 3 : 反相高效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆 菌发酵乳中生物活性多肽比较图 ( a 曲线: 对照发酵乳反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱; b 曲线: 瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱) 图 4: 质量色谱提取图 (m/z=504. 23 ) 图 5 : 质荷比为 504. 23的片段的一级质谱图 图 6 : 质荷比为 504. 23的片段的二级质谱图 图 7 : 质荷比为 504. 23的多肽 az、 by断裂情况及计算得到的序列 图 8 : [DPPH · ]甲醇标准曲线 图 9: 瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽对 [DPPH · ]自由基清除率 图 10: FeS0 4 标准曲线 图 11 : EDLQ的总离子流图 图 12 : EDLQ的一级质谱图 具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前, 应理解, 本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案; 还应当理解, 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的 具体实施 方案, 而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时, 应理解, 除非本发明另有说明, 每个数值范围的两个端点 以及两个端点之间任何一个数值均可选用。 除非另外定义, 本发明中使用的所有技术和科 学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义 相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 材料外, 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握 及本发明的记载, 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来 实现本发明。

除非另外说明, 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组 DNA技术 及相关领域的常规技术。 这些技术在现有文献中已有完善说明, 具体可参见 Sambrook等 MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001 ; Ausubel等, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates ; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999 ; 和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.1 19, Chromatin Protocols(P. B.Becker, ed.)Humana Press, Totowa, 1999等。 实施例 1 活性肽的制备 一、 发酵乳的制备 1 ) 瑞士乳杆菌发酵乳 采用脱脂奶粉 (新西兰 NZMP牌脱脂奶粉) 与水配置 12wt%的脱脂乳 (12g脱脂奶粉 加入到 88g 水中, 下同)。 在无菌条件下, 挑取瑞士乳杆菌 ( Lactobacillus helveticus , CICC6024)菌落三环, 将其加入已灭菌的 12 wt %的脱脂乳中, 在无菌条件下搅拌均匀。接 种完成后, 用铝箔封口, 以防止污染。 置于培养箱中 37°C培养 19h。 培养结束后, 在无菌 条件下将凝乳搅拌均匀, 即完成瑞士乳杆菌的活化, 制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发 酵剂。

取 10mL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到 500mL已灭菌的 12^%脱脂乳中 (接种率 为 2 v/v %), 37°C发酵 19h后, 在无菌条件下搅开凝乳, 在 4°C条件下保存, 得到瑞士乳杆 菌发酵乳。

2 ) 对照发酵乳 采用同样方法, 使用保加利亚乳杆菌 Lactobadllus Bulgaricus, LB340)和嗜热链球茵 (Streptococcus The画 philus, TA40 M乍为发酵菌种制作对照发酵乳。 具体方法为: 在无菌条件下, 分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三 环, 将其 分别加入已灭菌的 12 wt%的脱脂乳中, 在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后, 用铝箔封口, 以防止污染。 置于培养箱中 37°C培养 19h。 培养结束后, 在无菌条件下将凝乳搅拌均匀, 即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化, 制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。

取 5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和 5mL嗜热链球菌发酵剂,共同接种到 500mL 已灭菌的 12 ^ %脱脂乳中(接种率为 2 v/v %), 37°C发酵 19h后, 在无菌条件下搅开凝乳, 在 4°C条件下保存, 得到对照发酵乳。 二、 生物活性多肽的确认

1.实验方法

1 ) 样品处理

分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对 照发酵乳, 以及 12 wt%的脱脂乳装入离 心管中进行低温离心, 离心条件为 9000rpm/min, 4°C, 20min。 离心后弃沉淀, 取上清液。

将上清液分别倒入超滤杯中, 为了防止生物活性多肽被氧化, 打开氮气罐压力阀充氮, 同时打开磁力搅拌装置, 以防止溶液出现浓差极化现象。 使样品分别通过截留分子量为 lOkDa, 3kDa的滤膜, 待有滤液流出时进行收集。

超滤过程中, 应保持流速稳定, 滤液清澈。 流速控制在 lmL/min 左右, 压力为 0.1〜0.3MPa, 分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、 对照发酵乳, 以及未发酵的 12 wt%脱脂乳的滤 液作为实验样、 对照样以及空白对照, 于 -4°C冷冻保存。 2) 质谱分析

将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的 滤液 (实验样) 和脱脂乳超滤后的滤液 (空白对照) 进行质谱分析, 质谱条件如下:

离子方式: ES+

质量范围 (m/z): 100-1500

毛细管电压 (Capillary) (kV): 3.0

采样锥 (V): 35.0

离子源温度 (°C ) ) : 100

去溶剂温度 (°C ): 350

去溶剂气流 (L/hr): 600.0

碰撞能量 ( eV): 6.0

扫描时间 (sec): 0.3

内扫描时间 (sec): 0.02

2. 实验结果

瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和 脱脂乳超滤后的滤液(空白对照) 的质谱 对比结果见图 1〜2。图 1中的 A曲线为 3000Da未经发酵的脱脂乳(空白对照)粗提物样 品, 图 1中的 B曲线为 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品 (实验样)。 经过比较可以看出, 经过瑞士乳杆菌发酵后, 3000Da未经发酵乳粗提物和 3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物 的组分上发生很大变化, 且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差 异。 此质谱质量范 围为 100D a -1500Da, 因此可知脱脂乳在 1500Da以下、 210nm处有吸收的小分子物质相对较 少; 而经过瑞士乳杆菌发酵后, 在这一分子量范围内的物质明显增多, 说明了这些多肽并 不存在于未经发酵处理的脱脂乳中, 而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。 而且我们发现随 着发酵时间的延长, 多肽的丰度明显增多, 进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵, 脱脂乳 中原有的大分子蛋白被分解, 从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子 多肽。 图 2是 3000Da未经发酵脱脂乳(空白对照)粗提物与 3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳(实 验样) 粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。 纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物 质对应的分子量, 横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分 子量。 通过比较, 可以得 到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中, 因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量, 从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进 行进一步的分析。 如图 1所示, 分子量 397. 07Da, 保留时间 6. 72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高 (图 1-A图谱中的峰), 而发酵乳中几乎没有。 而分子量为 232. 15Da, 保留时间为 3. 61min 的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。 因此, 我们选择了在发酵乳中含量较高而在 未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差 异比较, 比较结果见表 1。 表 1 : 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物与 3000Da脱脂乳粗提物差异比较

分子量 3000Da脱脂乳粗提物 3000Da发酵乳粗提物

显著性

(Da) (unit) (unit)

504.2302 0.0779 0 37.23±2.78

444.2442 0.1498 0 71.58±4.27

585.3251 0.0886 0 41.72±4.02

748.3877 0.0753 0 35.25±2.46

439.291 0.3968 0 186.95±10.67

1025.5662 0.2441 0 115.86±7.17 根据 MarkerLynx软件分析, 得到具有显著性差异的(p〉0. 05 )分子量片段如表 1所示, 根据丰度和质荷比情况, 选择 504. 2302Da, 保留时间为 16. 20 min的多肽进行二级质谱的 测序分析。 三、 生物活性多肽的分离提纯和产量的比较

1.实验仪器和试剂 仪器: AKTA蛋白纯化仪 purifier 10

色谱柱规格: SOURSE 5 RPC ST4.6/150

流速: lmL/min

温度: 25 °C

紫外检测波长: 215nm

流动相 A: 含有 2%乙腈和 0.05%TFA的 ddH20

流动相 B: 100%乙腈

进样量: lmL

梯度条件: 0min-7.5min保持 100%A液; 7.5min-42.5minB液从 0%变为 50%; 42.5min-45minB 液从 50%变为 100%; 45min-50min保持 100%B液; 50min-72minA液从 0%变为 100%。

2. 实验方法 样品前处理: 将实验样和对照样与流动相 A液对半稀释 (体积比 1 : 1进行稀释), 作为 上样样品。 上样样品进行反相高效液相色谱分析, 实验结果见图 3。

3. 实验结果 由图 3可见, a曲线是对照样的反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱,洗脱时间为 26min 处有一明显的吸收峰, 其余峰高相对较低, 根据吸收值和肽键浓度的正比关系, 可认为在 12%对照发酵乳 3000Da上清液 (对照样) 中, 其多肽类物质较少, 且种类单一。 b曲线是 瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液(实验样)反相高效液相色谱 215nm的洗脱图谱, 与对照 发酵乳相比, 瑞士乳杆菌发酵乳 3000Da上清液的反相图谱中吸收峰明显增多, 且在洗脱时 间为 21min、 24min和 33min处有三处最为明显的吸收峰, 实验中对这三个峰进行了收集, 分别记录为发酵乳分离物 B峰、 发酵乳分离物 C峰和发酵乳分离物 D峰。

根据对各分子量对应的多肽与原发酵乳分离物 B峰、 C峰和 D峰对应分子量物质的保留 时间对比, 发现分子量 504. 23Da的物质来源于发酵乳分离物的 C峰。

通过对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳的比较, 可发现经过瑞士乳杆菌发酵得到的发酵 乳, 其含有比对照发酵乳更为丰富的、 分子量小于 3000Da的多肽物质。 这些多肽类物质是 由于原脱脂乳中的大蛋白被瑞士乳杆菌所分泌 的胞内酶和胞外酶分解, 释放出一些多肽片 段和游离的氨基酸所形成的。乳酸菌所分泌的 胞外酶对乳品中 β -酪蛋白片段具有非特异性 或特异性的切割。 通常这些由微生物发酵得到的多肽类物质, 极有可能具有一定的生物活 性。 如果使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合生 产普通酸奶, 由于多肽的产量少, 品种 单一, 生物活性相对较低。

根据反相高效液相色谱原理, 疏水性较差的物质由于与分离柱固相结合力较 弱, 先从 分离柱中洗脱下来, 而疏水性较好的物质与分离柱固相键合作用较 大, 后从分离柱中被洗 脱下来。 由此可得, 三个分离物其疏水性按如下顺序排列: 瑞士乳杆菌发酵乳分离物 Β峰> 〔峰> 0峰。 经过收集操作, 得到 C峰值的样品, 采用真空冷冻干燥技术进行冷冻干燥, -4 °C冷冻保藏, 作为后续质谱分析、 体外功能性检测的实验材料。 四、 生物活性多肽的质量和氨基酸序列测定

1.实验方法

( 1 ) 色谱条件:

仪器: Waters ACQUITY UPLC超高效液相 -电喷雾-四级杆-飞行时间质仪

色谱柱规格: BEH C18 色谱柱

流速: 0.4mL/min 温度: 45 °C

紫外检测波长: 210nm

进样量: 7 L

梯度条件: 0min-3min保持 99%A液, 1%B液; 3min-9minB液从 1%变为 5%, A液从 99% 变为 95%; 9min-15minB液从 5%变为 10%, A液从 95%变为 90%; 15min-21min%B液从 10%变为 25%, A液从 90%变为 75%; 21min-24min, B液从 25%变为 40%, A也从 75%变 为 60%; 24min-27min, B液从 40%变为 80%, A液从 60%变为 20%; 27min-27.5min保持 80%B 液, 20%A 液; 27.5min-28min, B 液从 80%变为 5%, A 液从 20%变为 95% ; 28min-28.5min, B液从 5%变为 1%, A液从 95%变为 99%; 28.5min-30min, 保持 99%A液, 1%B液。 A液: 含有 2%乙腈和 0.05%TFA的 ddH20; B液: 100%乙腈

(2) 质谱条件:

离子方式: ES+

质量范围 (m/z): 100-1500

毛细管电压 (Capillary) (kV): 3.0

采样锥 (V): 35.0

离子源温度 (°C ) ) : 100

去溶剂温度 (°C ): 350

去溶剂气流 (L/hr): 600.0

碰撞能量 ( eV): 6.0

扫描时间 (sec): 0.3

内扫描时间 (sec): 0.02

二级质谱母离子质量 (m/z): 439.3

根据上述实验条件, 利用超高效液相-电喷雾 -四级杆-飞行时间质谱, 得到瑞士乳杆菌 发酵乳分离物 C峰中分子量为 504.23Da的多肽质量色谱提取图、 一级质谱图、 二级质谱图 和通过 Masslynx软件计算氨基酸序列, 结果图见图 4-7。

2. 实验结果 由图 7可知,根据 az、by断裂的情况,经过 Masslynx软件分析计算,得到质荷比 504.23Da 的片段序列为 Asp-Glu-Leu-Gln (DELQ), 记为 SEQ ID NO: 1。 该片段来源于瑞士乳杆菌 发酵乳分离物 C峰, 与 β-酪蛋白的 58〜61位的残基序列相对应, β-酪蛋白氨基酸序列的 GenBank编号为 AAA30431.1, 序列见 SEQIDNO: 3。

实施例 2 生物活性肽的抗氧化活性实验 采用清除自由基法(DPPH*法)和总抗氧化能力 (Ferric Reducing Ability Power FRAP 法), 对实施例 1得到的生物活性多肽 DELQ的抗氧化活性进行了测试。

1、 [DPPH-]法测定生物活性肽 DELQ的体外抗氧化活性

1) 实验试剂及仪器

试剂: 1, 1-二苯基 -2-三硝基苯肼 (1, l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl [DPPH · ] ) , 日本 Wako公司生产; 甲醇, 上海国药公司提供; 实施例 1获得的瑞士乳杆菌发酵得到 的乳源性生物活性多肽 DELQ (收集到的 C峰值样品) 。

主要仪器: Sunrise 酶标仪,奥地利 Tecan公司产品;96孔细胞培养板,美国 Millipore 公司制造; 分析天平, Meitelei-tolido公司产品。

2) 实验方法

(1) lmmol/L [DPPH · ]甲醇溶液

用分析天平称取 0· 349mg[DPPH · ]溶于 ImL甲醇溶液中, 配制得到的 lmmol/L [DPPH · ] 甲醇溶液, 锡纸避光保存, 即配即用。

(2) [DPPH · ]甲醇标准曲线的测定

在 96孔板中按表 2分别加入 100μ L[DPra · ]甲醇标准曲线样品, 室温静置 90min, 用酶标仪在 517nm处检测吸光值。 表 2 [DPPH · ]甲醇标准曲线溶液配制

1 2 3 4 5 6

[DPPH ·]甲醇(μ 100 80 60 40 20 0

甲醇 (μί) 0 20 40 60 80 100

[DPPH · ]甲醇标准 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

溶液 (mmol/1) 根据实验结果,使用 Excel拟合曲线并计算回归方程,结果见图 8(回归方程: y=-0.192x 十 0.2271, R 2 =0.9991 )o [DPi¾ · ]甲醇标准曲线的线性关系良好, 相关系数为 0.999, 表明 [DPPH * ]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要 。 从结果看, 吸光度值与 [DPPH · ] 含量呈反比关系, [DPPH · ]含量越少, 吸光值越高, 即样品清除自由基的能力越强。

(3) [DPPH · ]法测定生物活性肽 DELQ的抗氧化活性 1 ) 样品组: 在 96孔板中加入 80 μ L浓度为 lmmol/L [DPPH · ]甲醇溶液、 按表 3分别加入 20 L 不同浓度的待测样品 (DELQ )、 阳性对照 1 ( 2. 5mg/mL 的 Trol OX )、 阳性对照 2

( 0. 025mg/mL的 Trolox), 和阴性对照 (植酸);

2 ) 空白组: 在同一 96孔板上, 以加入 80 μ L浓度为 lmmol/L [DPPH · ]甲醇溶液和 20 μ L 去离子水的样品做空白对照。

待检测样品加样完毕后, 室温静置 90min, 用酶标仪在 517nm处检测吸光值。 按照下 式计算自由基清除率, 实验结果见表 3。 公式: [DPPH · ]自由基清除率 = 0D 空白— ^样品 X 100%

OD空白 表 3 [DPPH • ]法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽的 氧化活性结果 (%)

样品浓度 (mg/mL)

样品名称 10.00 5.00 2.50 1.25 0.625 待测样品 24.98±0.05 22.76±0.01 19.04±0.01 16.64±0.01 2.28±0.12

(多肽 DEQL)

阳性对照 1 99.96±0.0016

(2.5mg/mL Trolox)

阳性对照 2 71.08±0.03

(0.025g/mL Trolox)

阴性对照 (植酸) 58.49±0.08 从图 9可以看出, 作为阳性对照的 2. 5mg/mL的 Trolox在相同条件下具有最强的清除 自由基的能力, 几乎能清除溶液中所有的自由基, 其次为 0. 025m g /mL的 Trolox、 植酸、 发 酵乳分离物 C峰分离肽。 从发酵乳分离物 C峰中分离的多肽 DELQ清除 [DPPH · ]自由基率为 24. 98%, 并且随着 DELQ浓度的降低, 清除自由基能力减弱。

2、 FARP法测定发酵乳中多肽体外抗氧化能力

1 ) 实验试剂和仪器

总抗氧化能力检测试剂盒(Ferric Reducing Ability of Plasma FRAP法), 购自上海碧云 天生物科技公司; FeS0 4 溶液 (10mmol/L), 水溶性维生素 E ( Trolox溶液) (10mmol/L), 实施例 1获得的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活 多肽 DELQ。

主要仪器: Sunri se 酶标仪, 奥地利 Tecan 公司产品; 96 孔细胞培养板, 美国 Mi l l ipore公司制造; 分析天平, Me i te l ei-tol ido公司产品; HWS26型 电热恒温水 浴锅, 上海一恒科技有限公司制造。 2 ) 实验方法

( 1 ) FRAP工作液的配制

根据总抗氧化能力检测试剂盒使用说明, 将 TPTZ 7. 5mL稀释液、 TPTZ 750 L溶液、 检 测缓冲液 750 混合均匀, 并在 37°C水浴中孵育, 2小时内用完。

( 2 ) FeS0 4 标准曲线曲线的制作测定

在 96孔板中先加入 180 μ LFRAP工作液, 按表 4加入 5 μ L FeSO^ 准曲线溶液, 轻轻 混匀, 37°C孵育 3_5min后, 用酶标仪在 593nm处测定吸光值。 表 4 FeS0 4 标准曲线测定的溶液配制

1 2 3 4 5 6

FeS0 4 溶液(μυ 10 5 2 1 0.5 0

dd¾0 0 5 8 9 9.5 10

FeS0 4 标准溶液 1 0.5 0.2 0.1 0.05 0

(mmol/L)

FeS0 4 浓度与吸光值呈良好的正比关系, FeS0 4 浓度越高, 吸光值越高。 本发明 FeSO^ 准曲线结果见图 10, 标准曲线的线性关系良好, 相关系数为 0. 998, FeSO^ 准曲线的精密 度和准确度均符合检测要求, 可用于后续计算。

( 3 ) FRAP法测定生物活性多肽 DELQ的抗氧化能力

在 96孔板中先加入 180 μ L FRAP工作液, 空白对照孔中加入 5 μ L dd¾0, 样品检测孔 内加入 5 L待测样品、 阳性对照内加入 5 L植酸, 轻轻混匀, 37°C孵育 3-5min后, 用酶 标仪在 593nm处测定吸光值。 总抗氧化能力表示方式以 FeS0 4 标准溶液的浓度来表示。 按照 下式计算总抗氧化能力, 实验结果见表 5。

与样品 OD值相同的 FeS04标准溶液浓度 ( mmol/L) 总抗氧化能力 (mmol/g)

样品浓度 (mg/mL) 表 5 FARP法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽 总抗氧化能力结果

对应的 FeS0 4 浓 总抗氧化能力 样品名称

度 (mmol/L) (mmol/g) 样品组 多肽 DELQ 4.00 0.0835±0.0351 0.0208 阳性对照 植酸 4.00 0.0356±0.0055 0.0089

组 通过总抗氧化能力法 (Ferric Reducing Ability Power FRAP法) 对瑞士乳杆菌发酵乳中 分离的多肽体外总抗氧化活性进行了测定, 发现瑞士乳杆菌发酵乳中分离物中的生物活性 多肽 DELQ具有较好的还原氧化物质的能力, 其总抗氧化能力为 0.0208mmol/g, 高于同等 浓度下的具有弱抗氧化活性的植酸, 具有显著性(p>0.05 )差异。 因此, 可认定发明的生物 活性多肽 DELQ具有显著的抗氧化能力。

实施例 3 生物活性肽的促进机体免疫力活性实验

MTT法测定生物活性多肽 DELQ的体外淋巴细胞增殖能力实验

1)实验材料与仪器:

试剂与材料: 实验动物 balb/c小鼠 (雄性 6-8周龄, 上海交通大学农业与生物学院动 物实验中心); 瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽 DELQ; 小鼠淋巴细胞提取液 (购自索来宝公司); RPMI1640培养基 (购自 GIBCO公司); 3-(4, 5-二甲基噻唑 -2)-2, 5- 二苯基四氮唑溴盐 (MTT, 购自 Amresco公司); 伴刀豆蛋白 (ConA, 购自 Sigma公司); 牛血清白蛋白 ( BSA, 购自 Genebase公司); 胃蛋白酶(购自 Sigma公司); 胰酶( Corolase PP, 购自 AB公司)。

仪器: LRH-250F生化培养箱, 上海一恒科技有限公司; GL-22M高速冷冻离心机, 上 海卢湘仪离心机仪器有限公司; Hera cell 150 C0 2 培养箱, Heraeus公司; Dragon Wellscan MK3酶标仪, Labsystems公司; ALPHA 1-2-LD 真空冷冻干燥机, Christ公司; 超高效液 相色谱 -四极杆飞行时间质谱仪, waters公司。

2 ) 实验方法:

无菌条件下取小鼠脾脏, 用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞, 进行元代培养。 用完 全 RPMI1640培养液将细胞密度调整为 2.5 X 10 6 个 /mL。 在 96孔细胞培养板中依次加入: 100 小鼠淋巴细胞悬液, 100 L RPMI1640完全培养液, 20 伴刀豆蛋白, lOO L样 品。另外,设置空白对照组(pH7.2〜7.4, 3mol/L的 PBS )和阴性对照组 ( 500 μ g/mL BSA) , 研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。 每组 3个平行实验样。 在 5%C0 2 37°C培养箱 中培养 68h后, 无菌条件下每孔加入 20 L MTT, 继续培养 4h, 小心弃去上清液, 每孔加 入 100 二甲基亚砜, 37°C生化培养箱孵化 10min, 摇匀, 用酶标仪在 570nm处测定吸光 值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示, 计算方法如下: 刺激指数= ^:^ χ ΐθθο/ο

A 2 - A t 式中: Al为空白对照在 570nm处下的吸光值; A2为阴性对照组在 570nm处下的吸光 值, A 3为实验组在 570nm处下的吸光值。

3 ) 实验结果及分析 表 6生物活性多肽 DELQ对体外淋巴细胞增殖的影响 实验结果见表 6, 由表 6可知, 在生物活性肽的质量浓度为 100 g/mL的条件下, 乳源 性生物活性肽 DELQ的刺激指数大于 BSA,说明 DELQ—定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的 增殖。 并且 DELQ的刺激指数达到了 1. 154, 和阴性对照组具有显著差异 (P〈0. 05)。 因此, 本发明的瑞士乳杆菌发酵乳分离的到的活性多 肽 DELQ具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能 力, 可以作为一种保健品或者添加剂食用, 能够提高动物和人体的免疫力。

实施例 4 生物活性多肽 DELQ模拟胃肠道消化实验

( 1 ) 体外模拟胃肠道消化

模拟胃肠道消化实验主要分为两步进行。 首先, 配制浓度为 500 g/mL生物活性多肽 DELQ溶液, 在浓度为 500 μ g/mL DELQ溶液中加入胃蛋白酶, 比例是每克 DELQ加入胃 蛋白酶 20mg, 调节反应液的 pH值至 2.0, 在 37°C恒温水浴中保温 90min; 然后将反应液的 pH值调整至 7.5, 加入胰酶, 比例是每克 DELQ加入胰酶 40mg, 在 37°C恒温水浴中保温 150min;最后置于 95°C水浴中加热 5min使消化酶失活,将反应液冷冻浓縮干燥, 成干粉, 储存于 -20°C条件下, 备用。

(2) DELQ模拟肠胃道消化前后的质量和氨基酸序列 定

取体外模拟肠胃道消化后的样品粉末 0.2mg, 加入 50 水和 450 无水乙醇, 充分 震荡后放入 -20 °C冰箱 20min, 在 15000rpm转速条件下离心 30min, 取上清液 400 μ L进行

UPLC-Q-TOF-MS分析。

UPLC条件: Hypersil GOLD C18色谱柱 ( 100mmX 2.1mm, 1.9 m, 19θΑ) (Thermo

Scientific Co.); 流动相 A: 0.1%甲酸水溶液, 流动相 B: 含 0.1%甲酸乙腈; 采用从 99%的

A相到 50%A相的梯度洗脱程序; 流速 0.4mL/min; 柱温: 45 °C ; 进样量: 5 L。 Q-TOF-MS条件: 飞行时间质谱仪, 质谱采用电喷雾电离源 (ESI), 正离子模式。 并以 200ng/mL的亮氨酸脑啡肽进行实时精确质量校正 质量扫描范围为 m/z 80-1000, 扫描时 间为 0.3s。 毛细管电压 3kV; 锥孔电压 35V; —级质谱碰撞能量分别为 4; 离子源温度 100 °C ; 脱溶剂气温度和流量分别为 300°C, 500L/h。

根据上述实验条件,生物活性多肽 DELQ经过消化酶处理前后产物经 UPLC-Q-TOF-MS 分析, 获得的总离子流图, 见图 11。 并对图中峰进行了提取, 采用 Q-TOF-MS分析获得了 相应的质谱图。

利用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱对消化 冷冻干燥浓縮物进行氨基酸序列测定, 酶解处理后 DELQ的一级质谱图见图 12, 得到的分子量和氨基酸序列与消化前的 DELQ完 全相同, 证明生物活性多肽 DELQ在上述模拟胃肠道消化条件下稳定, 没有被进一步降解, 可以被动物机体直接吸收利用, 发挥其具有的生物活性。