BIOMATERIAU PERMETTANT LA DELIVRANCE CONTROLEE

D'ACTIFS

DESCRIPTION

Domaine technique de l'invention

La présente invention se rapporte à un biomatériau comprenant une phase aqueuse, un réseau de polymère, un second polymère indu dans le réseau et au moins une enzyme de dégradation du second polymère.

La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation dudit biomatériau.

La présente invention se rapporte à des utilisations du biomatériau, notamment pour la libération de substances actives et à un dispositif de libération contrôlée de substances actives comprenant le biomatériau.

Le biomatériau de l'invention trouve notamment des applications dans les domaines cosmétique et pharmaceutique.

Etat de la technique antérieure

Les gels sont utilisés du fait de leurs propriétés particulières dans de nombreux domaines, notamment alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Un gel est composé d'au moins deux composants dont l'un, très fortement majoritaire, correspond à un solvant liquide et l'autre est un composant que l'on peut qualifier de solide. Les deux composants sont continus à travers tout le milieu. La phase dite solide, constitue un réseau qui emprisonne la phase dite liquide correspondant au solvant, et l'empêche de s'écouler. L'ensemble du milieu se comporte comme un solide mou et élastique facile à déformer.

Les gels sont classifiables selon le type de liens qui forment le réseau. Ainsi deux grands mécanismes de gélification se distinguent qui conduisent à des gels "physiques" ou à des gels "chimiques".

à partir d'une solution ou d'une dispersion à l'état liquide, la formation du gel est le résultat de la formation d'un réseau solide continu. On appelle cette transformation la transition solution/gel.

Un gel physique est un assemblage supramoléculaire constitué par des molécules liées entre elles par des liaisons de faible énergie (Van der Waals, liaisons hydrogènes, polaires, etc.). La stabilité de cet assemblage est associée à une plage précise de conditions physico-chimiques (pH, concentration en molécules, température, qualité du solvant, force ionique, etc.). En dehors de cette plage, le mélange est liquide. La transition sol/gel est donc réversible pour les gels physiques. Ainsi, une modification des paramètres du milieu peut entraîner la destruction de l'édifice et induire une transition gel-sol. Il est bien connu de l'art antérieur des compositions pour obtenir des gels "physiques". Les biogels sont obtenus essentiellement à partir de macromolécules ou polymères d'origine naturelle: protéines ou polysaccharides.

On connaît également dans l'état de l'art des gels qualifiés de "chimiques". Un gel chimique correspond à un assemblage supramoléculaire dont les molécules sont associées par des liaisons de forte énergie (covalentes). La stabilité de cet assemblage est donc très grande. Ces gels chimiques présentent une stabilité améliorée, le seul moyen d'effectuer une transition gel/solution consistant à détruire les liaisons covalentes du réseau. C'est pourquoi, la transition sol/gel des gels chimiques est dite irréversible.

Une famille de gels chimiques correspond aux gels catalysés enzymatiquement. Ce mode de gélification est surtout observé dans les grands processus biologiques. La coagulation sanguine, la cicatrisation, la formation de peau, l'assemblage des matrices extracellulaires sont des processus biologiques où le passage des protéines solubles à l'état de gel

est indispensable. In vivo, un nombre limité d'enzymes par exemple les lysyloxydases, les transglutaminases, catalysent ces réactions. In vitro, la plus utilisée est la transglutaminase qui crée des ponts covalents entre les chaînes latérales des résidus lysine et glutamine des protéines.

Les Tgases catalysent ainsi la polymérisation des protéines responsables de la formation des réseaux gélifiés biologiques, Cette famille de protéines est ubiquitaire et on la retrouve aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Les Tgases permettent d'obtenir des gels à partir de nombreuses protéines dans l'industrie alimentaire, et notamment pour la fabrication du surimi ou le durcissement de nombreux dérivés carnés (Jambon, nourriture reconstituée, etc.). On peut citer, à titre d'exemples de protéines polymérisables, la gélatine, la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, les protéines du petit lait, notamment les caséines et la lactaglobuline, les protéines du soja, du blé et notamment la gluténine, du jaune et du blanc d'œuf, et notamment l'ovalbumine.

Un des gels protéiques les plus utilisés est le gel de gélatine. La gélatine est obtenue à partir du collagène qui est une protéine de structure. Le collagène est une molécule organisée en triple hélice. Ces triples hélices peuvent s'associer en fibrilles qui peuvent s'associer en fibres. La triple hélice de collagène est instable à la température du corps. La gélatine est obtenue par dénaturation du collagène. Les tissus contenant du collagène subissent ainsi un traitement acide ou alcalin, qui aboutit à la dénaturation de la triple hélice du collagène. La possibilité de faire des fibres est alors totalement perdue. Un traitement acide aboutit à la formation de gélatine de type A et un traitement alcalin à une gélatine de type B. La solution de gélatine est donc composée de chaînes isolées de collagène. Les utilisations de la gélatine étant multiples, il est parfois nécessaire de créer des gels de gélatine dans des conditions où les gels physiques n'existent pas (hautes températures, pH extrême ou force ionique particulière). Pour former le réseau nécessaire au gel, les chaînes

de gélatine sont alors pontées par des liens covalents, et notamment par l'action des Tgases. Les gels ainsi obtenus sont des gels chimiques.

Une plus grande maîtrise des propriétés mécaniques des différents gels chimiques constitue donc un enjeu essentiel pour étendre leur potentialité.

L'analyse du vivant a révélé l'existence de systèmes extrêmement dynamiques. Dans les tissus vivants, les cellules sont en interaction avec une structure appelée la matrice extracellulaire (MEC) ₁ riche en protéines et assimilable à un gel au niveau macroscopique. Cette structure est principalement localisée sous les cellules épithéliales et autour des tissus conjonctifs. Les cellules peuvent synthétiser différents composants de la matrice extracellulaire tels que le collagène qui confère sa rigidité à la MEC ou la fibronectine qui intervient dans les mécanismes de l'adhérence cellulaire. Parallèlement, la cellule produit également des protéases qui engendrent la dégradation de la matrice extracellulaire. La cellule intervient donc simultanément dans la construction et la dégradation de la matrice extracellulaire. La structure de la matrice extracellulaire n'est donc pas une structure irréversible et statique mais correspond à un équilibre dynamique résultant de la balance entre les activités de construction et de dégradation des protéines synthétisées par la cellule.

De la même manière, les caillots formés suivant le mécanisme de coagulation sanguine constituent également des systèmes dynamiques. Ainsi, par une cascade de réactions enzymatiques, un caillot est formé à partir de protéines solubles s'organisant en réseau insoluble. Ce caillot sera ensuite éliminé au cours d'une autre réaction enzymatique..

Dans ces équilibres dynamiques, les réseaux de protéines s'associent pour devenir insolubles et former des gels, ce qui peut être assimilé à des transitions solution/gel. Dans le même temps, les réseaux protéiques sont également détruits par l'action de protéases, ce type de transition pouvant cette fois être assimilé à des transitions gel/solution. On

assiste ainsi parfois à des transitions successives comme dans la coagulation où le caillot est formé en premier lieu, puis dégradé.

La transition solution/gel dans ces processus biologiques est le plus souvent associée à la famille des transglutaminases mentionnée précédemment. La transition opposée, à savoir gel/solution est associée à l'activité antagoniste d'enzymes de type protéolytique.

Une des familles les plus étudiées est celle des métalloprotéinases de la matrice (MMP). Elles forment une famille d'endopeptidases dépendantes du zinc qui dégradent la plupart des protéines de la matrice extracellulaire. Il existe toutefois un grand nombre de protéases différentes. On peut citer, à titre d'exemple de familles de protéases, les serines protéases, telles que la trypsine, la matriptase, les Cystéines et Aspartate protéases, telles que les cathepsines B et L et les cathepsines D et G, les métalloprotéases et la famille ADAM.

Un grand nombre des enzymes orchestrant ce type de réaction, comme les transglutaminases ou encore les métalloprotéases sont caractérisées par les biochimistes et les enzymologistes.

Des gels présentant la capacité de transition solution/gel et gel/solution sont décrits dans le document WO 2006/056700 Ces gels comportent une phase aqueuse, un polymère et des enzymes capables de dégrader le polymère et de polymériser des monomères afin de former ledit polymère. Dans le document WO 2006/056700, les "monomères" peuvent être des macromolécules biologiques ou polymères. De plus dans ce document le terme "polymère" s'applique à un "réseau de polymères".

Les gels de l'état de la technique présentent des cinétiques de gélification et de resolubilisation programmées. Par ailleurs, les gels de l'état de la technique présentent des caractéristiques physiques maîtrisées, par exemple leur viscoélasticité. De plus, les caractéristiques physiques du réseau solide et de la phase aqueuse formant les gels de l'état de la technique sont modifiées de façon indissociable et simultanée. Ces inconvénients limitent le champ d'application de ces gels du fait de leurs

caractéristiques physiques. Il est par exemple impossible selon l'état de la technique de modifier le réseau solide sans modifier la phase aqueuse ou de modifier la phase aqueuse sans modifier le réseau solide de gel.

Il existe donc un réel besoin de nouveaux biomatériaux, notamment sous forme de gels, dont on puisse modifier de façon contrôlée les propriétés physiques d'une seule des deux phases constituant le gel.

Il existe également un besoin de nouveaux biomatériaux gélifiés capables d'incorporer des molécules, notamment des molécules actives (par exemple cosmétique et/ou pharmaceutique), et de libérer de façon programmée ces molécules en modifiant de façon contrôlée les propriétés physiques d'une seule des deux phases constituant le biomatériau gélifié

Exposé de l'invention

L'invention permet précisément de répondre à ces besoins de l'art antérieur et de surmonter ces inconvénients en fournissant un biomatériau dans lequel les propriétés viscoélastiques du gel peuvent être modifiées et dans lequel la modification de ces propriétés est programmée.

La présente invention a notamment pour objet un biomatériau comprenant une phase aqueuse et un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques et/ou saccharidiques, dans lequel le premier réseau de polymères et la phase aqueuse forment un premier gel (A), le biomatériau comprenant :

(i) un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, le second polymère étant différent du premier polymère, et étant inclus dans le gai (A) soit en solution dans la phase aqueuse du gel (A), soit sous la forme d'un second réseau de polymères constituant un gel (B),

(ii) une première enzyme de dégradation dudit second polymère.

Selon l'invention, par « réseau » il est entendu une association de molécules. Cette association entre les molécules peut être assurée par des interactions fortes ou faibles (liaisons covalentes, liaisons hydrogène, Van der Waals etc). Dans le cas de liaisons covalentes, l'association est une réticulation et le réseau est dit « réticulé ». Par polymère on entend une macromolécule, par exemple un polymère protéique ou saccharidique. Un réseau de polymères est une association de polymères protéiques ou une association de polymères saccharidiques. Le réseau de polymères peut constituer un gel.

Selon l'invention, par « phase aqueuse », il est entendu une solution aqueuse, par exemple de l'eau, par exemple encore une solution aqueuse tamponnée, par exemple à un pH souhaité, par exemple au moyen d'un tampon phosphate ou Tris ou tout tampon approprié connu de l'homme du métier comme tampon. Il peut s'agir, par exemple, d'un milieu permettant l'activité de la ou des enzymes présente(s) dans le biomatériau.

Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être constitué d'un premier polymère protéique. Ce premier polymère protéique peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, le collagène et ses dérivés, les protéines du lait, les protéines du soja, les protéines du blé, et les protéines du jaune et du blanc d'œuf, les protéines du pois, les protéines de féverole, les protéines du lin, les protéines de soie, la fibronectine, la laminine, l'élastine, la vitronectine, ou un mélange de ces polymères. Ce premier réseau de polymères peut donc être constitué d'un seul premier polymère protéique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques.

Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être constitué d'un premier polymère saccharidique. Ce premier polymère saccharidique peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant les carraghénanes, les alginates, le xanthane, le chitosan, la chitine, l'acide hyaluronique, les glycosaminoglycanes sulfatés, le glycogène, la cellulose^

et ses dérivés, les pectines, l'amidon et ses dérivés, les dextrans et les xylanes, ou un mélange de ceux-ci. Ce premier réseau de polymères peut donc être constitué d'un seul premier polymère saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères saccharidiques.

Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut également être constitué d'un mélange de premiers polymères protéiques et saccharidiques, choisi par exemple dans les groupes précités de polymères protéiques et saccharidiques.

Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les gels de gélatine, de fibrine et d'alginate, étant entendu que ce premier réseau de polymères est constitué de polymères différents des seconds polymères.

Selon l'invention, la quantité du premier réseau de polymères ou mélange de premiers polymères peut-être comprise par exemple entre 0,1 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau, de préférence de 0,5 à 10% en poids.

Selon l'invention, le second polymère est différent du polymère constituant le premier réseau de polymères. Ce second polymère peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, le collagène et ses dérivés, les protéines du lait, les protéines du soja, les protéines du blé, et les protéines du jaune et du blanc d'œuf, les protéines du pois, les protéines de féverole, les protéines du Nn, les protéines de soie, la fibronectine, la laminine, l'élastine, la vitronectine, ou un mélange de ces polymères. Ce second polymère peut donc être constitué d'un seul polymère protéique ou d'un mélange de polymères protéiques.

Selon l'invention, le second polymère peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant, par exemple, les carraghénanes, les alginates, le xanthane, le chitosan, la chitine, l'acide hyaluronique, les glycosaminoglycanes sulfatés, le glycogène, la cellulose et ses dérivés, les pectines, l'amidon et ses dérivés, les dextrans et les xylanes, ou un

mélange de ceux-ci. Ce second polymère peut donc être constitué d'un seul polymère saccharidique ou d'un mélange de polymères saccharidiques.

Selon l'invention, le second polymère peut également être constitué d'un mélange de second polymères protéiques et second polymères saccharidiques, par exemple choisis dans les groupes précités de polymères protéiques et saccharidiques.

Selon l'invention, le second polymère peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant la gélatine, la fibrine, l'acide hyaluronique et l'alginate, étant entendu que ce second polymère est différent du premier.

Selon l'invention, la quantité du second polymère ou mélange de seconds polymères peut être comprise entre 0,01 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau, de préférence de 0,1 à 10 % en poids .

Selon l'invention, la première enzyme peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM, les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, l'alginate lyase.

Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la première enzyme peut-être comprise entre 2x10 ⁷ et 50 U/ml, de préférence de 2x 10 ^~6 à 20 U/ml.

Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une seconde enzyme différente de la première enzyme et capable de dégrader le premier réseau de polymères, ledit premier réseau de polymères étant

susceptible d'effectuer, sous l'action de ladite seconde enzyme, une transition gel (A) /solution.

Selon l'invention, la seconde enzyme, différente de la première enzyme, peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM, les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, et l'alginate lyase.

Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la seconde enzyme peut être comprise entre 2x10 ⁷ et 50 U/ml, de préférence de 2x 10^ à 20 U/ml.

Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une troisième enzyme différente des première et deuxième enzymes et capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères ou mélange de premiers polymères, ladite troisième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (A).

Selon l'invention, la troisième enzyme peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.

Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la troisième enzyme peut-être comprise entre 0,01 et 50 U/ml, de préférence de 0,1 à 5 U/ml.

Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une quatrième enzyme différente des première, deuxième et troisième enzyme et capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères ou

mélange de seconds polymères, ladite quatrième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (B).

Selon l'invention, la quatrième enzyme peut être choisie par exemple dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.

Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la quatrième enzyme peut être comprise entre 0,01 et 50 U/ml, de préférence de 0,1 à 5 U/ml.

Selon l'invention, la première, deuxième, troisième et quatrième enzyme sont des enzymes pouvant être, indépendamment, actives ou pouvant être activées

Selon l'invention, la phase aqueuse du biomatériau peut comprendre en outre une substance active. Cette substance active peut se trouver par exemple en solution dans la phase aqueuse du gel (A) et/ou dans le gel (B).

Selon l'invention, par « substance active » on entend toute substance ou composition ayant une activité biologique ou biochimique à la surface d'un organisme (microorganisme ou organisme pluricellulaire, par exemple peau, os, organe, etc.) ou dans un organisme. Cette substance active peut posséder par exemple des propriétés curatives ou préventives à l'égard de maladies humaines ou animales. Il peut s'agir de tout produit pouvant être administré à l'homme ou à l'animal, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions organiques. Il peut s'agir de substances bactériostatiques et/ou bactéricides, d'antibiotiques, d'aseptisants, de colorants, etc.

Selon l'invention, la substance active peut être choisie par exemple dans le groupe comprenant, les bactériostatiques, les bactéricides, les vasodilatateurs, les colorants dont l'éosine, le bleu de

dextran, le bleu de méthylène, le bleu azur, des protéines, des saccharides dont l'acide hyaluronique et les alginates, un liposome, une nanoparticule, une micelle, les antiacnéiques, les antiallergiques, les anxiolytiques, les antiasthmatiques, les anticancéreux, les hypolipémiants , les contraceptifs hormonaux, les antidépresseurs, les antidiabètiques, les antalgiques, les antiasthéniques, les antihypertenseurs, les antifongiques, les antibiotiques, les somnifères, les traitements hormonaux, les antimigraineux, les médicaments du surpoids, les antiparkinsoniens, les neuroleptiques, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les inducteurs d'ovulation, les fluidifiants bronchiques, les antitussifs, les inducteurs d'ésrection et les antiulcereux.

Selon l'invention, il peut s'agir d'une substance active seule ou d'un mélange de substances actives.

Selon l'invention, la quantité de substance active peut dépendre par exemple de facteurs tels que son activité et de la dose souhaitée par l'utilisateur. La dose souhaitée peut être aisément déterminée par l'homme du métier puisqu'il peut s'agir par exemple de doses connues pour des produits connus.

Selon l'invention, le biomatériau de la présente invention peut donc être utilisé pour la libération contrôlée d'au moins une substance active.

L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'un biomatériau tel que décrit précédemment comprenant les étapes suivantes : a) formation en phase aqueuse d'un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques ou saccharidiques, le premier polymère protéique ou saccharidique ou mélange de premiers polymères protéiques ou saccharidiques formant ledit premier réseau de polymères,

b) addition d'un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, différent du premier polymère ou du mélange de premiers polymères, l'étape d'addition étant effectuée avant la formation du premier réseau de polymères.

Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé, par exemple, avec des seconds polymères ou un mélange de seconds polymères inclus dans la phase aqueuse du réseau de premiers polymères.

Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé avec des seconds polymères ou un mélange de seconds polymères formant, par exemple, un réseau de seconds polymères inclus dans le réseau de premiers polymères.

Selon l'invention, la formation ou la dégradation des différents polymères ou réseau de polymères peut être induite par l'ajout d'une à quatre enzymes à l'étape b). La concentration de ces différentes enzymes peut permettre, par exemple le contrôle des propriétés viscoélastiques du biomatériau de l'invention.

Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé par exemple à une température comprise entre 10 et 45°C.

Les premiers et second polymères sont tels que définis ci- dessus. La concentration des premiers et/ou des seconds polymères peut également être telle que décrite précédemment.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une première enzyme capable de dégrader lesdits seconds polymères ou le second réseau de polymères. La première enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une seconde enzyme capable de dégrader les liaisons du premier réseau de polymères. La deuxième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une troisième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères. La troisième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une quatrième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères. La quatrième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'au moins une substance active. La substance active est définie ci-dessus.

Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape c) de lyophilisation du biomatériau. Selon l'invention, il peut s'agir également d'une étape de déshydratation. Ces étapes permettent de stocker sur de longues périodes le matériau de la présente invention, pour ensuite le réhydrater pour utilisation.

L'invention se rapporte également à un dispositif de libération contrôlée d'une substance active comprenant le biomatériau de la présente invention.

Selon l'invention, le dispositif de libération peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les dispositifs médicaux dont les lentilles de contact, les électrodes, les capteurs, les dispositifs pour les soins, les pansements, les compresses imbibées, les bandages, les pansements chirurgicaux, les pansements ophtalmiques, les pansements dentaires, les produits de sutures, les dispositifs pour les thérapies, les articles orthopédiques, les implants chirurgicaux, les patchs, les gels transdermiques, les patchs actifs, les endoprothèses et les implants pour tissus mou, les dispositifs pour l'ingénierie tissulaire, les matériaux de reconstruction, dispositifs pour la culture cellulaire, les milieux de culture des supports de culture.

Le biomatériau de la présente invention peut par exemple, remplacer partiellement ou en totalité le matériau utilisé dans les dispositifs précités, notamment le matériau en contact avec la peau, les muqueuses, les organes, les os, les cellules, etc.

Dans le domaine cosmétique, le biomatériau selon l'invention peut ainsi permettre de réaliser de nouveaux cosmétiques tels que des patchs ou des masques de beauté pouvant relarguer une substance, par exemple une substance favorisant le bien être de l'utilisateur ou un actif cosmétique, par exemple l'acide hyaluronique ou le rétinol.

Dans le domaine pharmaceutique ou cosmétique, le biomatériau selon l'invention peut également permettre d'obtenir des gels emprisonnant un principe actif et capables de relarguer ledit principe actif en repassant à l'état de solution avec une cinétique déterminée, par exemple des gels ou des gélules relarguant le principe actif après un temps donné.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées.

Brève description des figures

La figure 1 , représente l'évolution de la libération d'Eosine au cours du temps dans un biomatériau selon l'invention, la flèche représente le temps de resolubilisation du gel comprenant la collagénase.

La figure 2 représente le pourcentage de relargage de bleu dextran en fonction du temps dans un biomatériau selon l'invention.

La figure 3 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel physique à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 4 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%) sur la formation de triples hélices du gel physique en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles blancs), sans enzyme (symboles noirs) et gélatine seule (symboles gris).

- La figure 5 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel chimique à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 6 A représente l'effet de l'acide hyaluronique sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) d'un gel physique contenant de la collagènase (1 ,12XiO ^"4 U/mL) à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps. 1% d'acide hyaluronique (symboles noirs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 6 B représente l'évolution des propriétés viscoélastiques (G' : carrés, G": triangles) des gels physiques, en présence d'acide hyaluronique (1%) et en fonction du temps, contenant différentes concentrations de collagènase : 0,95XiO ^"4 U.mL ^"1 (symboles noirs), 1 ,12XiO ^-4 U-InL ^"1 L (symboles gris), 1 ,29x1 O^ U.mL ^"1 (symboles blancs).

La figure 7 A représente l'effet de l'acide hyaluronique sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) de gel chimique contenant de la collagènase (2,32XiO ^"4 U/mL) et de la transglutaminase (1 ,5 U/ml) à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps. 1% d'acide hyaluronique (symboles noirs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 7 B représente l'évolution des propriétés viscoélastiques (G ¹ : carrés, G": triangles) des gels chimiques, en présence d'acide hyaluronique (1%) et en fonction du temps, contenants de la transglutaminase (1 ,5 U/ml) et différentes concentrations de collagènase : 2,06XiO ^"4 U.mL ^"1 (symboles noirs), 2,32XiO ^"4 U.mL ^"1 (symboles gris), 2,58XiO ^-4 U-InL ^"1 (symboles blancs).

La figure 8 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel physique contenant de la collagènase (1 ,12x10 ^'4 U/mL), à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 9 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) de gel chimique contenant de la transglutaminase (1,5 U/ml) et de la collagènase (2,32XIfX ⁴ U/mL), à une fréquence donnée (6,3 rad.s ^"1 ) en fonction du temps. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).

La figure 10 représente le relargage, en fonction du temps, à 40 ⁰ C, de bleu azur à partir de différents gels de gélatine (7%) obtenus avec 1 U/mL de transglutaminase. Sans acide hyaluronique (barre noire), avec 1 % d'acide hyaluronique (barre grise) avec 1% d'acide hyaluronique et 15U/mL de hyaluronidase (barre blanche).

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé de préparation d'un biomatériau selon l'invention

Une gélatine de type A1 a été utilisée dans cet exemple. Elle est commercialisée par la société SIGMA (Marque enregistrée) (G2500) et est issue de la peau de porc. Sa procédure d'extraction est un traitement acide, son pHi est égal à 8. Enfin, elle a un indice de Bloom de 300.

L'acide hyaluronique utilisé dans cet exemple est produit par la bactérie Steptrococcus Equi species. Il a été obtenu par la société Fluka (Marque enregistrée) (48178). C'est un polysaccharide d'à peu près 1

million de daltons. Le pKa des carboxyles de l'acide glucuronique est de 2,4.

L'alginate utilisé dans cet exemple est extrait de l'algue Macrocystis pyrifera. Il est commercialisé par la société SIGMA (Marque enregistrée) (A 2158).

Le fibrinogène utilisé dans cet exemple est un fibrinogène de type IV d'origine bovine. Il est commercialisé par la société SIGMA (Marque enregistrée) (F 4753). Il est pur à 68%

La transglutaminase (TG) utilisée a été produite par la société Ajinomoto sous le nom d'Activa WM (marque enregistrée). Elle est sécrétée par la bactérie Sterptoverticillium sp. Son poids moléculaire est de 43 000 et elle a une activité de 100 U.g ^"1 à 40 ⁰ C.

La collagènase utilisée dans les exemples, est une zinc métalloprotéase de type IA, isolée à partir de Clostridium histolyticum (Sigma, marque enregistrée, C-9891). Son poids moléculaire est de 116 000. L'activité maximum de l'enzyme est obtenue en présence de CaC^ et de NaCI. Il a été montré que ces éléments interfèrent avec la gélatine (résultats non fournis), ils n'ont pas été utilisés dans les tests d'activité de la collagènase dans les exemples de la présente demande.

La thermolysine est une protéase de type X isolé de Bacillus thermoproteolyticcus rokko (fournie par SIGMA, P-1512). C'est une métalloprotéase à zinc et son poids moléculaire est de 34 600.

La trypsine est une serine protéase isolée à partir du pancréas bovin. Elle est commercialisée par SIGMA (marque de enregistrée), T- 1426. Elle possède un P.M. de 23 800. Avant son conditionnement par le préparateur, l'enzyme a été traitée par du 2-1 tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl cétone (TPCK) afin de réduire l'activité chymotrypsine présente avec la trypsine.

L'alginate lyase est extraite de Flavobacterium sp. Elle présente une activité de 38730 U/g, elle est commercialisée par la société SIGMA (marque de enregistrée). (A 1603).

La thrombine utilisée est extraite du plasma bovin, elle présente une activité de 34.8 U/mg. Elle est commercialisée par la société SIGMA. (T 4648).

A/ Procédé de préparation d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère et une première enzyme a) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique et une première enzyme qui est la hyaluronidase.

Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume) et différentes concentrations de hyaluronidase (1 ,5 et 10 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 ⁰ C, l'acide hyaluronique est alors déposé en surface de la solution. La préparation a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 ⁰ C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique.

Afin d'obtenir un gel physique, une rampe de température de 40 ⁰ C à 27 ⁰ C a été appliquée à la solution, avec une baisse de température de 0,5 ⁰ C par minute. b) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le

second polymère qui est de l'alginate et une première enzyme qui est l'alginate lyase.

Le biomatériau est constitué de 5% de gélatine, de 1% d'alginate et de 0,2U/ml_ d'alginate lyase. Afin d'obtenir ce gel, une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, est ajoutée à de la poudre de gélatine. Une solution d'alginate est préparée au préalable (dans le même tampon) et ajoutée à la gélatine. Le mélange est incubé 30 minutes à 40 ⁰ C. Une solution d'alginate lyase est ensuite ajoutée au milieu réactionnel et le mélange est incubé à 27°C. c) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel d'alginates, le second polymère qui est de la gélatine et une première enzyme qui est soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine.

Le biomatériau est constitué de 1% d'alginate, de 1% de gélatine et d'une protéase. L'alginate de sodium (0.1g) est dissous dans une solution fraîchement préparée de calcium-EDTA (282 mg CaCl ₂ .2H ₂ θ and 798 mg Na ₄ EDTA.2H ₂ O dans 10 mL) sans chauffage. Une solution de gélatine à 5% est préparée dans de l'eau, le mélange est conservé à 4°C pendant au moins 4 heures avant utilisation. Les solutions sont mélangées de façon à obtenir des concentrations finales de 1% d'alginate et 1% de gélatine, le mélange est incubé à 40 ⁰ C pendant 30 min. Une solution à 3 M de D-Glucono-δ-lactone est préparée extemporanément et on en ajoute 312 μL au mélange précédent en même temps que la protéase. La concentration de collagénase finale est de 1 ,12.10 ⁵ U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 3,25. 10 ^"4 UZmI. La concentration finale de trypsine est de 2,46. 10 ^"4 UZmI Le mélange est incubé à 40 ⁰ C et la gélatine est alors sous forme de solution. Si le mélange est incubé à une température de 25°C ou 10 ⁰ C, la gélatine est sous forme de gel.

B/ Procédé de préparation d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, une première enzyme et une seconde enzyme

Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase et une seconde enzyme qui est soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine.

Les biomatériaux sont préparés avec le même protocole expérimental que le biomatériau présenté en A-a) et de la protéase (soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine) est ajoutée à la solution de gélatine. Le volume des échantillons d'enzyme correspond au moins à 20% du volume final, afin d'optimiser la répartition dans la solution de gélatine. Une seule solution contenant la première et la seconde enzyme est préparée dans un bain marie sous agitation électromagnétique à 40 ⁰ C avant d'être ajoutée à la gélatine. La concentration de collagénase finale est de 1.12.10 ^"4 U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 3,25. 10 ^"3 U/ml. La concentration finale de trypsine est de 2,46. 10 ³ U/ml.

C/ Procédé de préparation d'un biomatériau selon l'invention comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, une première enzyme et une troisième enzyme. a) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la transglutaminase.

Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume), 1 ,5 U/ml de transglutaminase et

différentes concentrations de hyaluronidase (1 ,5 et 10 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 ⁰ C, l'acide hyaluronique, est alors déposé en surface de la solution. La préparation a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 ⁰ C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase et de transglutaminase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique. b) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de fibrine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la thrombine.

Le biomatériau contient 4,8 mg/mL de fibrinogène, 0,24 mg/mL d'acide hyaluronique, 0,2 U/mL de thrombine, 1 U/mL de hyaluronidase, 2x10 ² mol/L de CaCI ₂ et 15x10 ² mol/L de NaCI. L'ensemble des constituants est mis en solution dans du tampon Tris-HCI 50 mmol/L à pH 7,4 et préchauffé à 37 ⁰ C. Le fibrinogène est au préalable mélangé au CaCI ₂ , au NaCI et à l'acide hyaluronique. Ensuite la solution de thrombine et de hyaluronidase est ajoutée au milieu réactionnel et le mélange est incubé à 37°C.

D/ Procédé de fabrication d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, et une première, une seconde et une troisième enzyme.

Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique et une première enzyme qui est la hyaluronidase, une seconde enzyme qui est soit la collagénase, soit la

trypsine, soit la thermolysine et une troisième enzyme qui est la transglutaminase.

Ce biomatériau est préparé comme le C-a) mais cette fois-ci une protéase (soit la collagénase soit la trypsine soit la thermolysine) est ajoutée au mélange enzymatique de transglutaminase et de hyaluronidase. La concentration de collagénase finale est de ; 2,32.1CT ⁴ ; U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 6,5. 10 ³ U/ml. La concentration finale de trypsine était de 4,35. 10 ^~3 U/ml.

Exemple 2 : Libération de l'éosine par des gels

Dans cet exemple, le premier réseau de polymères est un gel de gélatine, avec ou sans la seconde enzyme qui est la collagénase et la troisième enzyme qui est la transglutaminase.

Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 5% de gélatine, 1 U/ml de transglutaminase 0,1 mg/ml d'éosine (Sigma) et éventuellement 3,5. 10 ^"5 U/ml de collagénase. La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 contenant l'éosine et conservée pendant 15 minutes à 4 ⁰ C. Elle a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 ⁰ C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de transglutaminase et éventuellement de collagénase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine.

Le but de cet exemple est de montrer que les gels ne comprenant pas de second polymère ne permettent pas la libération contrôlée de substance de faible poids moléculaire.

Le gel contenant la collagénase a été formé en trente minutes et est redevenu liquide (temps de solubilisation) en une vingtaine d'heures.

Un second gel a également été formé. Ce second gel était composé de 5% de gélatine, 1 U/ml de transglutaminase. La libération de

l'éosine a été suivie au cours du temps par spectophotométrie à 517 nm, l'augmentation du signal est directement corrélée à au relargage d'éosine. La libération de l'éosine par le gel est continue (Figure 1) en présence ou en absence de collagénase dans le gel.

Exemple 3 : Libération du bleu dextran par un gel

Les biomatériaux utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans l'exemple 2, sauf que l'éosine a été remplacée par le bleu Dextran (PM 2 000 000) à une concentration finale de 5 mg/ml.

Le suivi de la libération du bleu de dextran a été effectué par spectophotométrie à 620 nm, l'augmentation du signal est directement corrélée à au relargage de bleu dextran..

Aucun relargage du bleu de dextran n'a été observé tant que le gel est sous forme de gel (Figure 2) Le relargage du colorant a été observé lors de la solubilisation du gel, c'est à dire 24 heures après la gélification.

La libération de molécules présentes dans des gels dépend des propriétés viscoélastiques du gel. Ici la libération de substance active est uniquement liée au temps de resolubilisation du gel. Le relargage de substance active pendant la phase gel n'est pas donc pas contrôlée.

Exemple 4: Méthode d'étude de l'élasticité et de la viscosité du biomatériau

L'étude de l'élasticité et de la viscosité des gels a été effectuée en étudiant les paramètres rhéologiques du gel.

La définition de la rhéologie a été établie en 1929 par la Société Américaine de Rhéologie. Elle comprend l'ensemble des études sur les flux et les déformations des matériaux. Son principe consiste à appliquer une contrainte (élongation, compression, cisaillement, ...) à un échantillon et résulte en la déformation de celui-ci. La relation entre la contrainte et la

déformation dépend des propriétés intrinsèques de l'échantillon et des conditions extérieures. La déformation utilisée lors des études en rhéologie est le mouvement de cisaillement. Un exemple particulièrement simple de cisaillement concerne le mouvement d'un échantillon entre deux surfaces planes, dont l'une est immobile et l'autre dotée d'un déplacement parallèle à elle-même.

Sous l'effet du cisaillement, les couches planes de l'échantillon s'écoulent parallèlement les unes aux autres, avec des vitesses différentes. La couche au contact de la surface mobile se déplace avec elle à la même allure alors que celle au contact de la surface immobile ne se déplace pas ; c'est ce que l'on appelle l'hypothèse de non glissement à la paroi. De là s'établit un gradient de vitesse de déplacement des couches et deux grandeurs caractérisent le cisaillement :

- La vitesse de cisaillement qui correspond à la variation de vitesse entre les couches limites. Elle est exprimée comme l'inverse d'un temps (s ¹ ),

- La contrainte de cisaillement T qui est relative aux forces de frottement tangentielles entre les différentes couches. Son unité est le Pascal (Pa).

L'analyse oscillatoire ou dynamique consiste à imposer un mouvement de cisaillement qui oscille avec une pulsation donnée, ω. Dans ce cas, la contrainte (T) et la déformation (y) évoluent de façon sinusoïdale au cours de temps, avec la même pulsation mais avec un certain déphasage. Plusieurs grandeurs sont caractéristiques :

Le déphasage δ entre la déformation et la contrainte.

Le rapport G ^* = (τ _o )/( γo), où T ₀ et γo représentent respectivement la contrainte et la déformation d'amplitude maximale.

Ce rapport est appelé module de cisaillement. C'est un nombre complexe constitué d'une composante élastique (le module de

conservation) et d'une composante visqueuse (le module de perte). Les modules ont la dimension d'une contrainte avec une unité en Pascal (Pa).

3 M = ⁶ M ⁺ ^ (;U)

Le déphasage δ est relié à ces deux composantes par :

G'= G ^* cos δ

G"= G ^* sin δ De ce fait :

Tan δ = G ¹ VG'

Pour un système purement visqueux, le déphasage entre la contrainte et la déformation est égal à 90°, ainsi la valeur de G ¹ = 0, le G" est déterminé comme le module visqueux. Par contre, pour un solide élastique, c'est G" qui est égal à 0. Le module de conservation est aussi appelé module élastique. Il est clair que si δ est compris entre 0 et 45°, le matériau a un comportement plus élastique que visqueux, alors que c'est l'inverse si δ est compris entre 45 et 90°.

Les processus de gélification sont caractérisés par un point de gel, qui correspond à la fraction de liens créés nécessaire à la formation du gel. Le temps de gel est lui déterminé par le temps qu'il faut pour atteindre le point de gel.

En rhéologie, le temps de gel peut être considéré comme le temps nécessaire pour que l'angle de déphasage δ, entre une contrainte et une déformation oscillante, atteigne une valeur de 45° et donc que le rapport G ¹ VG' soit égal à 1. Dans ce cas :

- Lorsque G">G', et tan δ > 1 , on peut considérer que l'échantillon est liquide.

- Lorsque G'>G", et tan δ < 1 , l'échantillon est gélifié

- Lorsque G'=G" et tan δ =1 , on est au point de gel.

Cette définition du point de gel, prend en considération que les temps de relaxation sont infinis dans le domaine linéaire du gel et donc que les paramètres viscoélastiques sont indépendants des conditions de mesure.

Une autre façon de considérer le point de gel est le contrôle, par le rhéomètre, de la déformation oscillatoire.

Dans les exemples ci-dessous, le rhéomètre utilisé est un RheoStress 150 de chez ThermoElectron (Marque déposée). Le système du rhéomètre est Cône/plan, avec une déformation imposée (une contrainte imposée est possible). Le contrôle de la déformation réelle a été effectué par une méthode itérative qui consiste à appliquer un couple (une contrainte) et à enregistrer la déformation résultante jusqu'à obtenir la bonne déformation.

Deux cônes ont été utilisés pour les expériences. Ils sont tous deux constitués de titane et ont un angle de 2°. Par contre, ils diffèrent au niveau de leur diamètre, de 35 mm pour l'un et de 60 mm pour l'autre.

Le rhéomètre était relié à un cryostat F6 (ThermoElectron) qui permet de thermostater le support sur lequel repose l'échantillon. Afin d'éviter l'évaporation, un système est employé qui consiste à créer une chambre humide. En plus, de l'huile de silicone (50 mPa.s) a été ajoutée dans la rigole du support permettant d'éviter au maximum les échanges entre les échantillons et l'air.

Le rhéomètre était contrôlé par un ordinateur et un logiciel, Rhéowin (Marque déposée).

Exemple 5 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère sur le réseau de polymère.

Le but de cet exemple est de mettre en évidence l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme sur le biomatériau de l'invention.

Dans cet exemple, la préparation des gels a été faite selon les procédés décrits dans l'exemple 1 A-a).

Les composés utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux présentés dans l'exemple 1 A-a).

Les différentes mesures d'élasticité du biomatériau ont été réalisées avec le rhéomètre présenté dans l'exemple 4.

Dans les exemples, l'élasticité du biomatériau, ou module élastique a été mesurée selon la méthode présentée dans l'exemple 4

Dans les exemples, la viscosité du biomatériau a été mesurée avec la méthode présentée dans l'exemple 4.

Dans cet exemple, le biomatériau testé comprend :

- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)

- comme second polymère : l'acide hyaluronique, et

- comme première enzyme : la hyaluronidase,

Dans cet exemple, différentes concentrations de hyaluronidase ont été ajoutées à une solution de gélatine à 7% et d'acide hyaluronique à 1%. Une rampe de température de 40 ⁰ C à 27°C a été ensuite appliquée pour la gélification. Les concentrations de hyaluronidase utilisées sont de 1 , 5, et 10 U/mL. Cette gamme de concentration a permis d'évaluer l'effet éventuel de la dégradation de l'acide hyaluronique sur la gélification, mais également de quantifier ces effets.

Pour tous les gels contenant de la hyaluronidase, l'élasticité semble converger, au bout de 900 minutes, vers un G' de valeur équivalente à celui du gel physique de gélatine seule. A ce même temps, on remarque que la viscosité (G") diminue en fonction de la concentration de hyaluronidase (figure 3).

Ce résultat montre donc que la dégradation de l'acide hyaluronique peut s'effectuer dans le milieu gélifié.

Aucun effet des oligomères, produits de dégradation de l'acide hyaluronique, n'a été observé sur la gélification du gel physique (résultats non fournis).

Afin de montrer que la dégradation du second polymère n'agit pas sur le réseau de polymères, le biomatériau a été observé par polarimétrie.

Une solution contenant 1% d'acide hyaluronique, 7% de gélatine et 1 U/mL de hyaluronidase a été gélifiée selon le procédé décrit dans l'exemple 1. La formation de triples hélices, au cours du temps, a été suivie en polarimétrie et comparée avec celle de la même solution en absence de l'enzyme.

Le polarimètre utilisé est un Jasco 1100 (Marque déposée), muni d'un cryostat externe Julabo F 25 avec la température gérée par ordinateur. Il mesure l'angle avec une précision de 0,001°. La cellule en verre utilisée a un trajet optique de 0,1 dm et un volume de 1 mL. La cuve peut être thermostatée, grâce à une jaquette à circulation d'eau reliée au cryostat. La température, ainsi régulée, a été mesurée directement dans la cuve par le biais d'une sonde reliée au polarimètre. Toutes les mesures de l'étude ont été faites à 436 nm.

Un ordinateur a été connecté au polarimètre et un logiciel enregistre l'angle et la température dans la cuve en fonction du temps. Le logiciel du Jasco est le "Spectra Manager" (Marque déposée) tandis que le cryostat est géré à partir du logiciel "Julabo EasyTemp"(Marque déposée).

Comme le montrent les courbes de la figure 4, la cinétique de formation de triples hélices de gélatine est identique quel que soit le type de gel. Au bout de 900 minutes, la teneur en triple hélice varie entre 25,5 et 27%.

L'activité de la hyaluronidase, ainsi que ses produits de dégradation, n'ont donc pas de répercussion sur le réseau physique: la formation du réseau de protéines se fait donc indépendamment du remodelage de la phase soluble.

Exemple 6 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère sur le premier réseau de polymères formé par la troisième enzyme.

Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la transglutaminase. Le protocole étant décrit dans l'exemple 1 C-a)

Différentes concentrations de hyaluronidase ont été ajoutées à une solution de gélatine à 7% et d'AH à 1 %. La gélification du gel chimique est obtenue par l'ajout de 1 ,5 U/mL de transglutaminase à une température de 40 ⁰ C.

Comme pour le gel physique, les concentrations de hyaluronidase utilisées sont de 1 , 5 et 10 U/mL

La dégradation de I ¹ AH n'a d'effet sur la valeur du G' que sur les temps les plus courts. Ceci est lié au fait que plus la solution gélifie rapidement, plus le G ¹ augmente rapidement. Mais que ce soit au bout de 900min ou même à partir de 150min, les G' des différents échantillons sont équivalents à celui du gel ne contenant pas d'AH. Quel que soit l'état de dégradation du polysaccharide, il n'a pas d'influence sur le réseau gélatine ponté de façon covalente.

La dépolymérisation de l'acide hyaluronique a, par contre, beaucoup d'influence sur la viscosité des gels. En effet, quelle que soit la quantité d'enzyme, le G" atteint un maximum avant de chuter jusqu'à la valeur de la gélatine (figure 5). Cette exemple montre que la dégradation d'un second polymère (HA) compris dans la phase aqueuse d'un réseau

de polymère (gélatine) induit par une troisième enzyme (transglutaminase) formant un gel (gel A), n'influence pas l'élasticité (G') mais seulement la viscosité de la phase aqueuse (G").

Exemple 7 : Etude de l'effet du second polymère et de la seconde enzyme sur le qel(A) du biomatériau selon l'invention

Le but de l'exemple est de mettre en évidence l'effet du second polymère et de la seconde enzyme, sur le gel (A).

Dans cet exemple, le biomatériau testé comprend :

- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)),

- comme second polymère : l'acide hyaluronique,

- comme deuxième enzyme : la collagénase,

Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume) et différentes concentrations finales de collagénase : 0,95. 10^ ; 1.12.10 ^"4 ; 1 ,29.10^ U/ml. La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 ⁰ C, l'acide hyaluronique est alors déposé en surface de la solution. Il a été ensuite solubilisé sous agitation à 40 ⁰ C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de collagénase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique.

Afin d'obtenir un gel physique, une rampe de température de 40 ⁰ C à 27 ⁰ C a été appliquée à la solution, avec une baisse de température de 0,5 °C par minute.

En présence d'acide hyaluronique, le biomatériau gélifie en 31 min (contre 40 min sans polysaccharide), montre un G' _max de 116,5 Pa, un G" _max 64,4 Pa et ne présente pas de resolubilisation totale au bout de 900

min (estimée comme G'=G"), bien que la valeur de G ¹ diminue avec le temps au-delà de 170 min. Ainsi, la cinétique et la viscoélasticité des gels changent considérablement selon les modifications, physicochimiques et/ou moléculaires, apportées par le polysaccharide. (Figure 6 A). Il est possible d'obtenir une resolubilisation totale du gel (avec comme référence G'=G" pour le temps de transition gel/sol), en utilisant une concentration de 1 ,29XiO ^-4 UZmL de collagénase (Figure 6 B).

Ainsi nous avons montré qu'une double transition sol/gel puis gel/sol tel que décrit dans WO 2006/056700, est possible en intégrant un second polymère (HA).

Exemple 8 : Etude de l'effet du second polymère et de la seconde enzyme sur le qel(A) formé par la troisième enzyme du biomatériau selon l'invention

Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel puis gel/sol catalysée par l'action des seconde (collagénase) et troisième enzyme (transglutaminase) sur le premier réseau de polymères (gel de gélatine), est influencée par la présence du second polymère (AH).

Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume), 1 ,5 U/ml de transglutaminase et différentes concentrations finales de collagénase (2,06. 10 ^"4 ; 2,32.1U ^"4 ; 2,58.1U ^"4 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris- HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 ⁰ C, l'acide hyaluronique, est alors déposée en surface de la solution. Il a été ensuite solubilisé sous agitation à 40 ⁰ C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase et de transglutaminase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique.

Le système gélatine/AH gélifie en 3,1 min alors que le système gélatine seule gélifie en 15 min. La viscoélasticité maximum est aussi fortement augmentée en présence du polysaccharide puisque la valeur de G' _max est de 264 Pa (50 Pa sans AH) et celle de G" _max de 61 ,7 Pa (4,4 Pa sans AH). Enfin, le temps de resolubilisation totale du gel est de 396 min contre 152 min dans l'autre cas (figure 7).

La viscoélasticité intrinsèque de l'acide hyaluronique amène donc la viscoélasticité du système à augmenter plus rapidement lors de la gélification pour donner un gel plus fort et enfin limite sa resolubilisation par la collagènase.

Ainsi la double transition sol/gel(A) gel(A)/sol catalysée par l'action des seconde et troisième enzyme sur le premier réseau de polymères, est influencée par la présence du second polymère.

Exemple 9 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme combiné à l'action de la seconde enzyme sur le qel(A) d'un biomatériau selon l'invention

Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagènase) sur le premier réseau de polymères (gel de gélatine), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) par la première enzyme (hyaluronidase).

Le biomatériau est préparé selon le protocole de l'exemple B.

L'évolution de la viscoélasticité est différente selon la quantité de Hase utilisée (Figure 8). Par rapport au biomateriau avec de I ¹ AH et sans Hase , les paramètres rhéologiques chutent de façon plus importante. Une synergie s'établit entre les activités de la collagènase et de la hyaluronidase, observable aussi bien au niveau du module de perte qu'au niveau du module de conservation.

Ainsi la double transition sol/gel(A) gel(A)/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine), est influencé par la dégradation du second polymère (AH) par la première enzyme (hyaluronidase).

Les mêmes conclusions peuvent être émises lorsque l'on remplace, lors de la préparation du biomatériau, la collagénase par la thermolysine ou la trypsine, comme décrit dans l'exemple 1 B.

Exemple 10 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme combiné à l'action de la seconde enzyme sur le gel(A) formé par une troisième enzyme.

Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine) formé par une troisième enzyme (la transglutaminase), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) générée par la première enzyme (hyaluronidase).

Le biomatériau est préparé selon le protocole de l'exemple D.

Les caractéristiques du biomatériau, avec de l'AH, dépendent de la concentration en hyaluronidase utilisée (Figure 9).

Ainsi une synergie semble s'établir, entre les deux hydrolases, qui aboutit à une baisse plus importante de la viscoélasticité par rapport à au biomatériau sans Hase.

Ainsi la double transition sol/gel - gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine) formé par une troisième enzyme (la transglutaminase), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) générée par la première enzyme (hyaluronidase).

Les mêmes conclusions peuvent être émises lorsque l'on remplace, lors de la préparation du biomatériau, la collagénase par la thermolysine ou la trypsine, comme décrit dans l'exemple 1 D.

Exemple 11 : libération du bleu azur par le biomatériau selon l'invention

Dans cet exemple, le relargage de bleu azur à partir d'un biomatériau a été étudié. Le biomatériau testé comprend :

- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A))

- comme second polymère : l'acide hyaluronique

- comme première enzyme : la hyaluronidase,

- comme troisième enzyme : la transglutaminase, et

- du bleu azur.

Dans le présent exemple, la gélatine est à une concentration de 7% et la transglutaminase à 1 U/mL dans les différents gels. Lorsqu'il est présent l'acide hyaluronique est à une concentration de 1% et la hyaluronidase à 15 U/mL.

Une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, contenant 1 ,25mg/mL de bleu azur (SIGMA (Marque enregistrée)) est ajoutée à de la poudre gélatine. Une solution d'acide hyaluronique à 1 ,5% est ensuite ajoutée à la solution de gélatine, le mélange est incubé à 40°C pendant 30min. Une solution enzymatique (soit transglutaminase seule, soit transglutaminase et hyaluronidase), préparée dans le même tampon, est ensuite mélangée à la solution de gélatine. Le mélange est placé à 40 ⁰ C.

Un gel contenant de la gélatine et de la transglutaminase (TG) et du bleu azur a donc été obtenu. Un gel comprenant de la gélatine, de

l'acide hyaluronique (AH), de la transglutaminase (TG) et du bleu azur a été obtenu. Enfin un gel comprenant de la gélatine de l'acide hyaluronique (AH) et de la transglutaminase (TG), de la hyaluronidase et du bleu azur a été obtenu.

Une mesure de la libération du bleu azur en fonction du temps et en fonction du gel a été effectuée (Figure 10) par mesure de la densité optique (DO à 630nm) du milieu dans lequel se trouvaient les différents gels.

La mesure de la libération du bleu azur est fonction des composants du gel (Figure 10).

Cette expérience démontre clairement, que le biomatériau de l'invention permet la libération de substances et que cette libération est contrôlée.

Exemple 12 ; libération da l'acide hyaluronique par le biomatériau selon l'invention

Dans cet exemple, le relargage d'acide hyaluronique à partir d'un biomatériau a été étudié. Le biomatériau testé comprend :

- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)),

- comme second polymère : l'acide hyaluronique

- comme première enzyme : la hyaluronidase

Les biomatériaux contiennent tous 3% de gélatine et ont été obtenus par une incubation à 20 ⁰ C. Lorsqu'il est présent, l'acide hyaluronique est à une concentration de 1% et la hyaluronidase à 15U/mL.

Le gel a été obtenu par le procédé suivant: une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, a été ajoutée à de la poudre gélatine. Une solution d'acide hyaluronique à 1 ,5% a ensuite été ajoutée à la solution de gélatine, puis le mélange a été incubé à 40 ⁰ C pendant 15 min.

Pour le gel contenant de la hyaluronidase, une solution contenant l'enzyme, préparée dans le même tampon, a été ensuite mélangée à la solution de gélatine et le mélange est placée à 20 ⁰ C.

Le relargage d'acide hyaluronique à partir des gels a été évalué en polarimétrie. Le polarimètre utilisé était identique à celui de l'exemple 5. Ce relargage de substance est contrôlé en fonction de la taille et est contrôlé dans le temps.

Le biomatériau de l'invention permet donc un relargage contrôlé de l'acide hyaluronique inclus dans un gel de gélatine.

La modulation du relargage de substance contenue dans la phase aqueuse d'un gel simple est effectuée par modification de la viscosité de la phase aqueuse.

Le biomatériau de l'invention permet donc un relargage contrôlé de substances.