ENDÓGENA DEL TEJIDO HEPÁTICO SE ENCUENTRA INHIBIDA

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se enmarca en el campo técnico de composiciones biofarmacológicas útiles en recuperar la capacidad regenerativa tisular hepática en una situación de esteatosis hepática, y en particular cuando se realiza una hepatectomía parcial.

ANTECEDENTES Y ARTE PREVIO

El síndrome metabólico, la obesidad y la diabetes mellitus, son una serie de patologías metabólicas que han sufrido un dramático incremento en los últimos años. La manifestación hepática de estas patologías, es la esteatosis hepática, (acumulación de triglicéridos en los hepatocitos). Esta se considera la forma más común de enfermedad hepática crónica, afectando todas las razas, etnias y grupos etarios sin distinción de sexos. Si bien el hígado tiene una gran capacidad de regeneración en respuesta al daño tisular, hay abundante evidencia clínica que demuestra que la esteatosis hepática inhibe los procesos de regeneración endógenos, aumentando significativamente la morbilidad y mortalidad de los pacientes frente a situaciones clínicas como la hepatectomía parcial, el trasplante hepático, la infección por virus de la hepatitis C y el daño hepático inducido por consumo de drogas o alcohol, en comparación a pacientes que tienen un hígado normal. El problema abordado en la presente invención, es proveer una alternativa que permita recuperar la capacidad regenerativa tisular, en una situación de esteatosis hepática, es decir cuando los procesos de regeneración endógenos están inhibidos. La solución propuesta en la presente invención corresponde a la generación de una composición biofarmacologica que comprende componentes producidos y/o secretados por MSC, que permite recuperar la capacidad regenerativa tisular, en una situación de esteatosis hepática, o cuando los procesos de regeneración endógenos están inhibidos.

Si bien la administración de MSC en modelos pre-clínicos de diversas patologías ha demostrado tener efectos terapéuticos, aún falta recorrer un largo camino para que la terapia celular sea una realidad en la práctica clínica habitual. Esto se debe en parte, a que la

i administración de células vivas presenta una serie de riesgos entre los que se incluyen: i) diferenciación de las MSC administradas a estructuras no deseadas, generando formación de tejido ectópico. En este sentido, estudios pre-clínicos han mostrado que la administración endovenosa de MSC puede producir calcificación miocárdica, acumulación de fibroblastos y miofibroblastos en el pulmón o generación de adipocitos al interior de los glomérulos renales, generando alteraciones en el funcionamiento de estos órganos, ii) rápida eliminación de las MSC alogénicas por el sistema inmune: Se ha reportado que el efecto terapéutico que puede lograrse con la administración de MSC del propio paciente es muy reducido, dado que las diversas patologías, también afectan el potencial terapéutico del paciente, lo que obliga al uso de MSC alogénicas. Inicialmente se había reportado que las MSC alogénicas no eran reconocidas por el sistema inmune del paciente, permitiendo el trasplante entre individuos MHC incompatibles, sin embargo, cada vez hay más reportes que indican que si son reconocidas y rápidamente eliminadas por el sistema inmune, lo que limita el efecto terapéutico logrado, iii) riesgo de formación de tumores: En comparación al uso de otros tipos de células madre (embrionarias o troncales inducidas), el uso de MSC tiene menor riesgo de formación de tumores. Sin embargo, se ha reportado que estas células pueden transformarse en tumorales mediante la acumulación de anormalidades genéticas, cuando son sometidas a muchos ciclos de replicación.

En comparación a la administración de células vivas, una composición biofarmacológica de este tipo presenta las siguientes ventajas: i) disponibilidad inmediata: los compuestos pueden ser liofilizados y almacenados para su utilización inmediata, en comparación con las MSC que necesitan un tiempo previo para su expansión; ii) mayor bioseguridad: la administración de los componentes purificados tienen menos consideraciones bioéticas y metodológicas que la administración de células vivas; iii) mejor reproducibilidad: los estudios con MSC han mostrado una serie de variaciones en los resultados publicados, principalmente por la diversidad que presentan los protocolos de extracción, cultivo, expansión y administración en los diversos laboratorios, mientras que con los biofármacos se puede lograr una mayor reproducibilidad en sus componentes y actividad biológica; iv) facilidad en la administración: la administración de una composición biofarmacológica es más sencilla, segura y requiere instalaciones médicas menos complejas que las necesarias para la administración de MSC vivas.

La esteatosis hepática se define como la acumulación de lípidos (principalmente en forma de triglicéridos) en el interior de los hepatocitos y está relacionada a un amplio espectro de patologías de alta incidencia. Una esteatosis hepática leve se define cuando la infiltración de grasa alcanza el 5-30% de los hepatocitos, moderada cuando alcanza entre el 30-60% y severa cuando alcanza más del 60%. La esteatosis hepática representa la alteración inicial del espectro de lesiones hepáticas que finalmente progresan a esteatohepatitis y cirrosis.

El hígado de los mamíferos es único en cuanto a su capacidad de regeneración ante el daño tisular. El modelo de hepatectomía parcial (Hp), desarrollado en roedores y caracterizado por Higgins y Anderson hace más de 75 años (Higgins GM, Anderson RM "Experimental pathology of the liver of the white rat following partial surgical removal, Arch. Pathol. 1931 ; 12:186-202), sigue siendo la herramienta más ampliamente utilizada para el estudio de los procesos de regeneración hepática. Los análisis experimentales utilizando este sistema muestran que la regeneración hepática se encuentra regulada en forma precisa en su iniciación y duración, y una vez que se produce la restauración de la masa, estructura y función hepática, la respuesta regenerativa finaliza. En contraste con otros tejidos capaces de regenerar (médula ósea o piel), la regeneración hepática no depende de un grupo de células germinales, si no que se produce principalmente por la proliferación de todas las células maduras remanentes: los hepatocitos.

Un ejemplo donde la regeneración hepática es relevante ocurre luego de una resección hepática, que es utilizada en muchos casos de traumatismos y sigue siendo el único tratamiento curativo para la mayoría de los pacientes con tumores malignos, primarios o secundarios en el hígado. Dentro de los pacientes que desarrollan falla hepática, la mortalidad se mantiene entre el 60-90% a pesar de los intensos cuidados y tratamientos médicos. Esto ocurre particularmente en los pacientes con enfermedades del parénquima hepático como la esteatosis hepática que tienen un riesgo aumentado de morbilidad y mortalidad post quirúrgica, como consecuencia de la falla en la capacidad de regeneración endógena.

Otra aplicación de la presente invención corresponde a los trasplantes hepáticos. Actualmente los donantes vivos, al igual que los donantes cadavéricos que presentan un grado de esteatosis superior al 20-30% deben ser excluidos por la respuesta regenerativa reducida. Dado que la prevalencia de la obesidad y diabetes tipo 2 continuará en aumento, la morbilidad y mortalidad asociadas a las enfermedades hepáticas, continuará incrementando dramáticamente, al igual que la escases de órganos para reemplazo.

Resulta entonces fundamental disponer de una alternativa, que permita inducir la regeneración del hígado, en un estado de esteatosis. Por tanto, la presente invención provee una alternativa que permite recuperar la capacidad regenerativa del tejido hepático, ante una hepatectomía parcial, en estados de esteatosis hepática, en los cuales se ha demostrado que la capacidad de regeneración endógena, se encuentra altamente inhibida. A la fecha no hay alterativas terapéuticas para este problema, por lo que es necesario el desarrollo de nuevas metodologías y/o biofármacos, capaces de subsanar esta situación.

En la actualidad las únicas células troncales usadas en estudios clínicos para el tratamiento de las enfermedades hepáticas son las células troncales hematopoyéticas, las MSC obtenidas desde cordón umbilical y las MSC aisladas de médula ósea o tejido adiposo. Las MSC han sido evaluadas en modelos experimentales tanto de daño hepático crónico como agudo, donde en general se han asociado a una mayor regeneración y una mejora de la función hepática. Entre los modelos destacan los de hepatitis fulminante, fibrosis hepática y recientemente la hepatectomía parcial en condiciones normales de regeneración. Los mecanismos responsables de las respuestas terapéuticas asociados a las MSC son ampliamente desconocidos, pocos estudios han evaluado la distribución intrahepática de las células trasplantadas, su persistencia in vivo y el fenotipo después del trasplante. Sin embargo hasta la fecha, ninguno de estos tratamientos había sido evaluado en modelos de esteatosis hepática donde la regeneración endógena del hígado, se encuentra inhibida.

En comparación a la invención propuesta, se seleccionaron 7 publicaciones relevantes, que se discuten a continuación:

Intravenous administration of multipotent stromal cells prevenís the onset of non-alcoholic steatohepatitis in obese mice with metabolic syndrome. Ezquer el al. Journal of Hepatology, 201 1 (55)1 1 12-1 120. Esta investigación fue realizada por los inventores, sin embargo, no anticipa la presente invención pues i) se administraron MSC vivas y ii) en un modelo de esteatosis hepática, pero que no es desafiado a presentar un proceso regenerativo, solo de observa la prevención de la transición del estadio de esteatosis a esteatohepatitis.

Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. Herrera el al. J. Cell. Mol. Med. 2010(14)1605-1618. En esta publicación se utilizan microvesículas derivadas de células troncales, sin embargo: i) se obtienen a partir de células troncales ovales humanas, una población difícil de obtener, a partir del parénquima hepático (más importante que la localización de las células y su escases, es que las células ovales representan una población celular con un origen embrionario totalmente distinto que las mesenquimáticas); ii) son evaluadas en un modelo de hepatectomía, donde la regeneración endógena se mantiene, y la administración de microvesículas (MV) produce una aceleración del proceso regenerativo.

Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular regeneration in vitro and in vivo. Daan van Poli et al. Hepatology 2008(47)1634-1643 y Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. Parekkadan et al. 2007(9)941 . En estas publicaciones utilizan medio condicionado de MSC o las mismas células lisadas, sin embargo: i) son evaluadas en un modelo de hepatitis fulminante inducido por la administración de hepatotoxinas y ii) son evaluadas en hígados que mantienen la capacidad de regeneración endógena, iii) el mecanismo fisiopatologico por el que se produce la lesión hepática, no guarda ninguna relación con el proceso fisiopatologico de la esteatosis, ya que en este modelo se inyecta una droga hepatotóxica que mata por necrosis los hepatocitos en forma aguda.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells promote hepatic regeneration after partial hepatectomy in rats. Li et al. Pathobiology 2013(80)228-234 y Stimulation of liver regeneration after hepatectomy in mice by injection of bone marrow mesenchymal stem cells via the portal vein. Kaibori et al. Transplantation Proceeding 2012(44)1 107-1 109. En estas publicaciones se evalúan la administración de MSC en un modelo de hepatectomía parcial, pero: i) Se administraron MSC vivas en forma local (vena hepática), lo que también constituye un proceso más invasivo que la invención propuesta y ii) está evaluado en modelos que poseen un hígado normal, donde se observa que se acelera el proceso de regeneración endógeno.

Hepatic regeneration and functional recovery following partial liver resection in an experimental model of hepatic steatosis treated with omega-3 fatty acids. Br J Surg. 2013 Apr;100(5):674- 83. En esta publicación se utiliza una dieta deficiente en colina para el desarrollo de la esteatosis, lo que presenta las siguientes limitantes: i) solo se exponen a los animales por 5 semanas a una dieta esteatogénica, con lo cual solo desarrollan esteatosis hepática leve/moderada; con lo cual no se afecta significativamente la capacidad de regeneración endógena y ii) este modelo no presenta todos los demás componentes fisiopatológicos que están presentes en humanos: IR, obesidad, síndrome metabólico, hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia (estos componentes son responsables inhibir el proceso regenerativo); y iii) se les administra un suplemento dietario que lleva a la disminución del contenido de triglicéridos hepático.

BREVE DESCRIPCIÓN DE FIGURAS

Figura 1 : Evaluación de la proliferación y apoptosis de los hepatocitos 2 días después de la Hpx, a) evaluación del porcentaje de núcleos que expresan la maquinaria para la síntesis de ADN (complejo PCNA); b) evaluación del porcentaje de núcleos que efectivamente se dividieron, medido por la incorporación de BrDu marcado en el núcleo de los hepatocitos; c) evaluación del porcentaje de núcleos que se encuentran en apoptosis.

Figura 2: a) evaluación de la caída de peso después de la hepatectomía; b) Porcentaje de regeneración hepática de masa hepática 2 y 7 días después de la Hpx; c) cuantificación de hepatocitos binucleados; d) evaluación de la tasa de supervivencia a los 7 días después de la Hpx.

Figura 3: a) Nivel de aspartato aminotransferasa plasmática; b) nivel de alanina aminotransferasa en plasma; c) nivel de protombina en plasma.

Figura 4: Evaluación de la expresión de marcadores asociados con la activación del proceso de regeneración, a) Nivel mRNA de factores tróficos pro-regeneración; b) Nivel de mRNA de interleuquinas; c) Comparación factores tróficos pro-regeneración plasmáticos; d) Comparación de interleuquinas lasmáticas.

Figura 5: Tasa sobrevida post-Hpx

Figura 6: Expresión de IL-1 β, IL-6, bFGF y HGF en distintas condiciones.

Figura 7: Tasa se proliferación celular.

Figura 8: Tasa de regeneración hepática.

Figura 9: Hepatocitos binucleados en distintas condiciones, donde (a) significa distinto a el estado basal y (b) distinto al que solo recibió vehículo.

Figura 10: Niveles de enzima GOT plasmática.

Figura 11 : Niveles de enzima GPT plasmática.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a una composición biofarmacológica que comprende componentes producidos y/o secretados por células troncales mesenquimales (MSC), preferentemente humanas, que permite recuperar la capacidad regenerativa tisular, en una situación de esteatosis hepática.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores han desarrollado un modelo murino de esteatosis hepática (tiene inhibido el proceso de regeneración hepática), en que la administración intravenosa de MSC induce la regeneración tisular, después de una hepatectomía del 70%. Hasta el momento, y de acuerdo al mejor conocimiento de los inventores, este es el primer antecedente del uso de MSC para esta patología, y está en concordancia con estudios que muestran la efectividad de la administración de MSC para el tratamiento de otras afecciones hepáticas como son la hepatitis fulminante, la fibrosis hepática y la hepatectomía en hígados normales (sin inhibición de la regeneración).

La composición biofarmacologica de la presente invención se enfoca en generar un derivado celular derivado de MSC con igual capacidad de inducir la regeneración tisular, en casos de esteatosis hepática, es decir donde no existe una capacidad regenerativa endógena, (por ejemplo, derivado de obesidad y síndrome metabólico), donde se ha realizado la resección de un porcentaje de la masa hepática. En general las hepatectomías van desde un 30% a un 70- 75%, dado que en casos de remanentes hepáticos inferiores al 25%, la incidencia de falla hepática es muy alta. Por lo tanto, el realizar una hepatectomía del 70-75% sería un caso extremo. Esto permite extrapolar el funcionamiento de la composición biofarmacologica de la presente invención en ensayos con hepatectomías de alrededor de un 70-75%, indicando que si funciona para dichos porcentajes, también funcionaría en hepatectomías de porcentajes menores.

Por tanto, la presente invención comprende en un primer aspecto una composición biofarmacologica que permite recuperar la capacidad regenerativa tisular, en una situación de esteatosis hepática; en un segundo aspecto un método de obtención de la composición biofarmacologica.

En una realización específica, la composición biofarmacologica comprende al menos una proteína seleccionada de al menos una de las categorías indicadas más adelante, o combinaciones de proteínas provenientes de distintas categorías. Cabe destacar que una proteína, debido a sus diferentes estructuras y/o funciones podría estar clasificada en más de una categoría:

Proteínas involucradas en vías de señalización de factores de crecimiento; Proteínas involucradas en interacción matriz extracelular-receptores; Proteínas involucradas en señalización de TGF-β;

Proteínas involucradas en ciclo celular;

Proteínas involucradas en metabolismo celular. 1. Proteínas involucradas en vías de señalización de factores de crecimiento

En particular, las proteínas involucradas en vías de señalización de factores de crecimiento corresponden a factores humorales secretados y sus receptores, que intervienen en la regeneración hepática, se han clasificado en categorías de acuerdo a su función: i) Factores iniciadores: hacen competentes a los hepatocitos para responder a los factores de crecimiento, promoviendo la transición G0 G1 ; ii) Factores de crecimiento: permiten a los hepatocitos iniciados o competentes progresar en la transición G1 S; iii) Inhibidores del crecimiento: finalizan el proceso de regeneración.

En una realización particular de la presente invención, la composición biofarmacológica comprende al menos una de las siguientes proteínas clasificadas en esta categoría: Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein (PGBM), Connective tissue growth factor (CTGF), Insulin-like growth factor-binding protein 6 (IBP6), Insulin-like growth factor-binding protein 3 (IBP3), EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (FBLN3), Insulin-like growth factor-binding protein 4 (IBP4), Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IBP2), Insulin-like growth factor-binding protein 7 (IBP7).

2 y 3. Componentes de la matriz extracelular (2) y relación con señalización TGF-β (3)

El concepto clásico que consideraba a la matriz extracelular (MEC) como una estructura inerte con la única misión de servir de soporte, ha sido superado en la actualidad. Actualmente se ha llegado a la conclusión de que la MEC es una estructura "viva" en la que sus componentes o los productos de su degradación ejercen funciones importantes, ya que muchos de ellos son capaces de actuar como señalizadores a través de receptores específicos de la membrana plasmática. A su vez, las células que se encuentran en contacto, modulan sus respuestas a los componentes de la matriz extracelular, mediante la regulación de genes que codifican la expresión de receptores a los cuales se unen los componentes de dicha matriz.

La MEC hepática es una red estructural compleja formada por macromoléculas, que rodea las células del estroma sobre el que descansan la mayoría de las células endoteliales y epiteliales. La matriz no es sólo un esqueleto físico, sino que es también un modulador crucial de los procesos biológicos entre los que se incluyen la inserción celular, el desarrollo hepático, la regeneración e incluso el mantenimiento de la arquitectura normal y el estado diferenciado. La MEC modula estos fenómenos actuando a distintos niveles: como agonista de fase sólida, como polipéptidos que interaccionan con receptores de la superficie celular y en su papel de secuestrar y liberar citoquinas.

Durante la regeneración hepática, la degradación de la matriz extracelular (MEC) primero y su síntesis después, juegan un rol fundamental en el restablecimiento del fenotipo quiescente y diferenciado de los hepatocitos.

Dentro de los principales mecanismos que regulan la síntesis y degradación de la MEC se encuentran las metaloproteasas y el sistema de señalización de TGF-β

En esta reorganización también juega un importante papel el factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF), generado por los lipocitos y secuestrado por la matriz extracelular. Este factor pasa de su forma inactiva pro-HGF a su forma activa HGF, por acción de metaloproteasas.

Los factores de crecimiento que se unen a la matriz extracelular en el ambiente hepático son los siguientes: HGF, VEGF, FGF y TGF-β y es la degradación de la MEC combinada con la activación del HGF en las etapas iniciales de la regeneración hepática la que desencadena la proliferación de los hepatocitos.

En una realización particular de la presente invención, la composición biofarmacológica comprende al menos una de las siguientes proteínas clasificadas en estas categorías: Metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2), 72 kDa type IV collagenase (MMP2), Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI1 ), Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1 ), Growth arrest-specific protein 6 (GAS6), Mitochondrial intermedíate peptidase (MIPEP), Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA), L-lactate dehydrogenase B chain (LDHB), Transforming growth factor- beta-induced protein ig-h3 (BGH3).

En particular, Vasorin (VASN) y Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (BGH3) corresponden a la clasificación 3 (señalización TGF-β), y donde además BGH3 también puede clasificarse en la categoría 2 (componentes de la matriz extracelular).

4. Ciclo celular

La proliferación celular en condiciones normales requiere la acción de citoquinas y factores de crecimiento, los cuales promueven la activación ordenada de proteínas reguladoras que controlan la transición a través de la fase G1 del ciclo celular. Después que las células han superado el punto de restricción final de G1 , las células pueden progresar en el ciclo, incluso en ausencia de factores de crecimiento. En una realización particular de la presente invención, la composición biofarmacológica comprende Growth arrest-specific protein 6 (GAS6). 5. Metabolismo de los hepatocitos frente al proceso de regeneración

Durante el proceso de regeneración hepática, se produce un cambio metabólico que favorece el uso de lípidos como reserva energética, en lugar de los carbohidratos, esto favorecido por el aumento de los ácidos grasos circulantes. En esta situación es necesario que gluconeogénesis hepática aumente y la glucolisis disminuya, para mantener la homeostasis de la glucosa.

En una realización particular de la presente invención, la composición biofarmacológica comprende al menos una de las siguientes proteínas clasificadas en esta categoría: Mitochondrial intermedíate peptidase (MIPEP), Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA), L-lactate dehydrogenase B chain (LDHB).

La composición biofarmacológica de la presente invención entonces, puede comprender al menos una de las siguientes proteínas, o combinaciones de ellas: Basement membrane- specific heparan sulfate proteoglycan core protein (PGBM); Connective tissue growth factor (CTGF); Insulin-like growth factor-binding protein 6 (IBP6); Insulin-like growth factor-binding protein 3 (IBP3); EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (FBLN3); Insulin-like growth factor-binding protein 4 (IBP4); Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IBP2); Insulin-like growth factor-binding protein 7 (IBP7); Metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2); 72 kDa type IV collagenase (MMP2); Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI1 ); Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1 ); Vasorin (VASN); Growth arrest-specific protein 6 (GAS6); Mitochondrial intermedíate peptidase (MIPEP); Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA); L-lactate dehydrogenase B chain (LDHB); Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (BGH3).

En una realización más específica, y de manera de definir la composición biofarmacológica independiente de concentraciones específicas, es que se describe a continuación un rango de cantidades de cada una de las proteínas consideradas, basándose en una cantidad base de PGBM, es decir, por cada unidad de PGBM, por ejemplo por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacológica puede incluir distintas cantidades de las proteínas indicadas. Tabla 1 : Composición de la composición biofarmacologica de acuerdo a la presente invención, en base al contenido de PGBM.

Es decir, por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 9 μg y 22 μg de CTGF; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 1 1 μg y 32 μg de IBP6; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 20 μg y 49 μg de IBP3; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 18 μg y 51 μg de FBLN3; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 20 μg y 52 μg de IBP4; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 16 μg y 86 μg de IBP2; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 84 μg y 216 μg de IBP7; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 8 μg y 35 μg de TIMP2; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 10 9 y 38 μο de MMP2; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 80 μg y 165 μg de PAI1 ; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 1 18 μg y 237 μg de TIMP1 ; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 3 μg y 7 μg de VASN; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 2 μg y 7 μg de GAS6; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 2 μg y 6 μg de MIPEP; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 6 μg y 9 μg de ALDOA; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 9 μg y 26 μg de LDHB; por cada microgramo de PGBM, la composición biofarmacologica de la invención comprende entre 8 μg y 27 μg de BGH3.

En una realización de la invención, la composición biofarmacologica comprende medio condicionado que ha sido obtenido del cultivo in vitro de MSC.

En otro aspecto, la invención considera los siguientes métodos para obtener la composición biofarmacologica.

Método para obtención de composición biofarmacologica basada en medio condicionado (MC) derivado de MSC.

1 . Cultivar células mesenquimales en un 70-80% de confluencia (fase exponencial de crecimiento), y 5 pasajes como máximo (no senescentes) durante 24 horas en medio libre de rojo fenol y suero fetal bovino;

2. Colectar el medio centrifugando a una velocidad de entre 100 y 700g por un período de entre 5 a 30 a 4 ^e C, de manera de remover las células y recuperar el sobrenadante;

3. Centrifugar el sobrenadante recuperado del paso anterior a una velocidad de entre 5.000g a 20.000 g por un período de tiempo de entre 10 a 60 minutos a una temperatura de 4 ^e C y microfiltrar (con filtro de entre 10 a 300 mieras), obteniendo un medio filtrado;

4. Concentrar el medio filtrado del paso anterior en al menos 15 veces (en volumen) utilizando filtros con 3kDa como poro de corte, y congelar a -80 ^e C hasta su utilización. En una realización más específica, la composición biofarmacológica comprende entre 70-80 de proteínas secretadas por 2,5 x 106 MSC.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Evaluación de la administración intravenosa de MSC para estimular la regeneración del hígado en un modelo murino de esteatosis, sometido a una cirugía de resección hepática de 70%.

En humanos, la esteatosis hepática es una enfermedad multifactorial derivada del síndrome metabólico, obesidad y la diabetes mellitus tipo 2. En animales, el modelo que mejor refleja la fisiopatología humana consiste en el uso de ratones C57BL6 que desarrollan IR sistémica asociada a la obesidad, en respuesta a la exposición a una dieta con alto porcentaje de calorías en grasa (HFD). Mientras que los animales que se alimentan con dieta estándar son delgados, los animales expuestos a HFD presentan junto con el aumento de la IR, otras alteraciones metabólicas como incremento de la grasa corporal, hiperlipidemia, hiperglicemia, intolerancia a la glucosa e hiperinsulinemia. Desde el punto de vista hepático estos animales desarrollan esteatosis severa, donde se ha demostrado que presentan inhibición de la capacidad de regeneración endógena del tejido hepático.

Descripción del modelo experimental previo al desarrollo de la Hepatectomía del 70% (Hpx70)

Los animales fueron alimentados con una dieta normal (10% grasa, 20% proteínas y 70% carbohidratos) durante 30 semanas. Este grupo de animales es considerado el grupo Normal.

Los animales alimentados con una dieta HFD con alto porcentaje de las calorías representado por grasa (60% grasa, 20 % proteínas y 20% carbohidratos), corresponden al grupo obeso. El alimento utilizado corresponde a una marca reconocida internacionalmente ResearchDiets Cat D12462.

Después de 30 semanas de exposición a la dieta, se realizó la hepatectomía del 70% Hpx70 y se administraron células (MSC) resuspendidas en solución fisiológica + 10% de suero de ratón o vehículo (Vh), generando así 4 grupos experimentales:

• Normal+Vh

· Normal+MSC

• Obeso+Vh

• Obeso+MSC Las evaluaciones de los distintos parámetros fue realizado (dependiendo del parámetro evaluado), en diferentes momentos, como por ejemplo previo a la hepatectomía; 2 días después de la hepatectomía, que es cuando se produce la activación de marcadores claves del proceso de regeneración; o 7 días después de la hepatectomía, cuando el proceso de regeneración va finalizando.

Figura 1 : Evaluación de la proliferación y apoptosis de los hepatocitos 2 días después de la Hpx

Figl a: evaluación del porcentaje de núcleos que expresan la maquinaria para la síntesis de ADN (complejo PCNA). Este resultado significa que los hepatocitos salen de la fase GO en la que se encuentran para entrar en G1

Figl b: evaluación del porcentaje de núcleos que efectivamente se dividieron, medido por la incorporación de BrDu marcado en el núcleo de los hepatocitos (se les da un pulso de BrDu intraperitoneal 2 horas antes del sacrificio, por lo que se marcan los hepatocitos que se dividieron es esas 2 horas) En este ensayo se demuestra que no solo salen de GO, si no que entran en mitosis y completan en ciclo celular.

Fig 1 c: evaluación del porcentaje de núcleos que se encuentran en apoptosis, en el caso de los animales obesos, hay un basal de núcleos apoptóticos como consecuencia del grado avanzado de esteatosis.

P<0.05 vs normal

P<0.05 vs normal+Vh

P<0.05 vs obeso

P<0.05 vs obeso+vh

Figura 2:

Fig2a evaluación de la caída de peso después de la hepatectomía. Es un buen marcador del estado metabólico de los animales, es normal que los animales tengan alguna pérdida de peso después de la cirugía, pero mientras mejor se encuentran, menor es esa pérdida.

Fig2b: % de regeneración hepática de masa hepática 2 y 7 días después de la Hpx

Fig2c: cuantificación de hepatocitos binucleados.

Fig2d: evaluación de la tasa de supervivencia a los 7 días después de la Hpx

P<0.05 vs normal P<0.05 vs normal+Vh

P<0.05 vs obeso

P<0.05 vs obeso+vh

Figura 3

Junto con evaluar la regeneración de la masa hepática se evaluó la integridad de los hepatocitos regenerados y la capacidad de síntesis de los mismos, a los 2 y 7 días después de la Hpx

Fig3a: Nivel de aspartato aminotransferasa plasmática, lo que indica la integridad de los hepatocitos del hígado.

Fig 3b: nivel de protombina en plasma, lo que refleja el estado funcional de los hepatocitos

Figura 4 Evaluación de la expresión de marcadores asociados con la activación del proceso de regeneración, principalmente factores de crecimiento y citoquinas. Evaluados 2 y 7 días después de la administración de MSC.

Fig4a: Expresión de factores de crecimiento

Fig 4b: Expresión de citoquinas

EJEMPLO 2: Obtención y caracterización del medio condicionado derivado de MSC.

Para la recolección de medio se utilizaron células en un 70-80% de confluencia (fase exponencial de crecimiento), y 5 pasajes como máximo (no senescentes). En estas condiciones, las MSC presentan el mayor grado de secreción de factores tróficos.

Para la obtención del medio condicionado se estandarizó el siguiente método:

Las células fueron cultivadas durante 24 horas en medio libre de rojo fenol y suero fetal bovino.

El medio recolectado fue centrifugado a 400g x 10min a 4C, para eliminar células.

El sobrenadante fue centrifugado a 10.OOOg x 30 min a 4c y filtrado (200 mieras) para eliminar posibles restos celulares.

El medio fue concentrado 30 veces (v/v) utilizando filtros Millipore de 3kDa como poro de corte, y congelado a -80C hasta su utilización.

Cada "dosis" está constituida por el medio secretado por 2.5 x 10 ⁶ MSC y un contenido proteico de 70-80μ9. Se determinó: i) integridad y rango de tamaño de las proteínas del compuesto (gel de poliacrilamida) y ii) cantidad de proteínas x dosis (Bradford). Se corroboró una alta reproducibilidad en las características evaluadas en extracciones independientes.

En términos de caracterización, se sometieron 3 distintas muestras de medio condicionado provenientes de 3 cultivos distintos, a un análisis proteómico por triplicado. Dicho análisis permitió definir las proteínas esenciales al fin de la presente invención, como se describen en la memoria descriptiva.

EJEMPLO 3: Evaluación del efecto de la administración intravenosa de MC en la regeneración del hígado en animales con esteatosis sometidos a cirugía de resección hepática (respuesta aguda, 48 horas post hepatectomía).

El proceso de regeneración hepática después de una cirugía de resección consta de una etapa aguda donde se producen señales de activación de la proliferación celular y la salida de los hepatocitos de su estado de quiescencia G0, posterior transición entre las fases G1 -, S-, G2- y el comienzo de la proliferación celular. Si esta etapa no se desarrolla satisfactoriamente, se produce la falla hepática a partir de las 48 horas post hepatectomía.

Como marcadores del proceso de regeneración se utilizaron los siguientes indicadores: i) tasa de sobrevida, ii) expresión de genes inductores de la proliferación hepática, iii) tasa de proliferación celular y iv) tasa de regeneración hepática.

Tasa de sobrevida: un número significativo de animales obesos con esteatosis, muere por falla hepática a partir de las 48 horas post hepatectomía (75% de sobrevida). Tanto la administración de MSC como de sus derivados, produjo un aumento significativo de la sobrevida a las 48 horas post hepatectomía (MSC 100 %, MC 93%, MV 100%). Dado que la falla hepática se produce entre las 48-72hs, es esperable que la sobrevida de los animales no tratados, sea menor cuando se evalúe el proceso completo de regeneración (7 días post hepatectomía) (Figura 5).

Expresión de genes inductores de la proliferación hepática: Se evaluó por qRT-PCR la expresión hepática de citoquinas y factores de crecimiento, claves en la inducción de la regeneración hepática (IL-1 β, IL-6, bFGF y HGF). La expresión fue estudiada en el mismo animal pre-cirugía y 48 post hepatectomía. La administración intravenosa de MSC, medio condicionado y microvesículas, induce un aumento significativo de la expresión de IL-1 β, IL-6 y bFGF, mientras que los derivados celulares no tuvieron efectos en la expresión de HGF (Figura 6).

Tasa se proliferación celular: Evaluación de la expresión por qRT-PCR de factores de crecimiento y citoquinas que inducen la salida de los hepatocitos de su esto quiescente (G0), a un estado G1 , para inducir la proliferación. Se evaluaron los mismos animales pre- hepatectomía y 48 horas después de la intervención. Cabe notar que todos los marcadores indican lo mismo, de hecho no se ha podido identificar uno como más importante que otro para inducir la proliferación, sino que actúan en forma sinérgica). (Figura 7).

Tasa de regeneración hepática: Se evaluó la masa hepática regenerada a las 48 horas post hepatectomía. Mientras que la administración intravenosa de MSC induce un aumento significativo en la masa hepática regenerada, los derivados celulares mostraron una respuesta comparable al vehículo (Figura 8).

Porcentaje de hepatocitos binucleados, donde en la Figura 9 (a) significa distinto a el estado basal y (b) distinto al que solo recibió vehículo.

Niveles de enzimas, GOT y GPT: son enzimas intracelulares, por lo que en casos normales, los niveles en plasma deberían ser bajos, cuando hay lesión hepática, por ejemplo después de la hepatectomía, hay un aumento, mientras más rápida es la bajada (o menor el aumento), significa que los hepatocitos están más íntegros, es por eso que a los 7 días, los niveles son normales en todos los grupos, dado que los hepatocitos que estaban dañados, permitiendo la salida al plasma de dichas enzimas ya desaparecieron (Figura 10 muestra niveles de GOT plasmática y Figura 11 muestra niveles de GPT plasmática).

APLICACIÓN INDUSTRIAL

La presente invención encuentra aplicación en la industria farmacéutica.