ПОПОВ, Виктор Григорьевич (пр-т Биологов, 1-194 Оболенск Серпуховский район Московская обл, 9 Obolensk, 142279, RU)
PCHELINTZEV, Sergey Yur'evich (ul. Verkhnie Polya, 22/1-468Moscow, 1, 109341, RU)
ПЧЕЛИНЦЕВ, Сергей Юрьевич (ул. Верхние Поля, 22/1-468 Москв, 1 Moscow, 109341, RU)
ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО "ИНСТИТУТ ИНЖЕНЕРНОЙ ИММУНОЛОГИИ" (Любучаны Чеховский район Московская обл. 0, Lyubuchanyl., 142380, RU)
POPOV, Viktor Grigor'evich (pr-t Biologov, 1-194Obolensk,Serpukhovsky raio, Moskovskaya obl. 9, 142279, RU)
ПОПОВ, Виктор Григорьевич (пр-т Биологов, 1-194 Оболенск Серпуховский район Московская обл, 9 Obolensk, 142279, RU)
PCHELINTZEV, Sergey Yur'evich (ul. Verkhnie Polya, 22/1-468Moscow, 1, 109341, RU)
| Формула 1. Препарат для нейтрализации спор и вегетативных клеток Васillus апthгасis содержащий в качестве действующего начала смесь бактериофагов Васillus апthгасis OZR-I, Васillus апthгасis Ф-2, Васillus апthгасis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см ) Васillus апthгасis OZR-I : Васillus апthгасis Ф-2: Васillus апthгасis ФАУТ = l :(0,2-l):(0,l-l) и активатор прорастания спор L-аланин 2. Препарат по п.l отличающийся тем, что он представляет собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов в концентрации 1010 - 1012БOE/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.05 — 0.15мoль/л. |
Васillus апthrасis.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к дезинфицирующим средствам для уничтожения спор и вегетативных клеток Васillus апthrасis.
К средствам дезинфекции при сибирской язве, рекомендованным к применению в чрезвычайных ситуациях [1], относятся галогены и их производные (хлорная известь, гипохлорит кальция, ДП-2 и др.), окислители (пергидроль, перфторид калия и др.), альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид и др.). Также широко применяются щелочи, фенолы, спирты, газы (окись этилена, бромид метилена и др.).
Наиболее часто для дезинфекции применяется перекись водорода, препараты хлора (хлорная известь, хлорамин), надуксусная кислота, газы - диоксид хлора и окись этилена.
Большинство из разрешенных к применению химических дезинфицирующих средств токсичны, аллергенны, вызывают раздражение кожи и слизистых, раздражают верхние дыхательные пути (препараты хлора, альдегиды). Помимо этого, дезинфицирующие средства, обладающие спороцидной активностью, имеют короткий срок хранения (гипохлориты, альдегиды), низкую стабильность (препараты хлора, надуксусная кислота), обладают высокой коррозионной активностью (хлорсодержащие препараты), взрывоопасны и пожароопасны (надуксусная кислота). Также при применении химических дезинфицирующих средств требуется многократная отмывка помещений и приборов после проведения дезинфекции.
В 50-х годах XX века предпринимались попытки оздоровления зараженной почвы от Васillus апthrасis путем посева тех или иных культурных растений [2], однако, обнадеживающих данных по «ocвoбoждeнию» почв от возбудителя сибирской язвы получено не было.
Сведений о биологических препаратах, предназначенных для нейтрализации спор Васillus апthrасis, нами в литературе не обнаружено. Задачей заявляемого технического решения является расширение номенклатуры дезинфицирующих средств, используемых при сибирской язве путем создания биологического препарата для нейтрализации спор и вегетативных клеток Васillus апthrасis на базе комплекса бактериофагов.
Поставленная задача решается тем, что предложен препарат для нейтрализации спор и вегетативных клеток Васillus апthrасis, содержащий в качестве действующего начала смесь бактериофагов Васillus апthrасis OZR-I, Васillus апthrасis Ф-2, Васillus апthrасis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см 3 ) Васillus апthrасis OZR-I : Васillus апthrасis Ф-2: Васillus апthrасis ФАУТ = l :(0,2- l):(O,l-l) и активатор прорастания спор L-аланин
Существенным признаком изобретения является использование смеси трех новых фагов, каждый из которых обладает литической активностью к прорастающим спорам и вегетативным клеткам Васillus апthrасis и действие которых при совместном использовании дополняет друг друга. Однако, так как бактериофаги не действуют на покоящиеся споры Васillus апthrасis, препарат дополнительно содержит активатор прорастания спор, в данном случае - L-аланин, который способствует переходу покоящихся спор в стадию активации и последующего прорастания в вегетативные клетки.
Препарат получают смешением L-аланина с комплексом бактериофагов, выращенных по отдельности и смешанных в заданных соотношениях.
Препарат может использоваться в аэрозольной форме или в виде раствора.
Предпочтительно, препарат используют в виде водного раствора, содержащего смесь бактериофагов в концентрации 10 10 - 10 12 БOE/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.05 - 0.15мoль/л.
Как правило, для удобства использования смешение отдельно хранящихся L- аланина и комплекса бактериофагов осуществляют в растворе непосредственно перед применением. В качестве растворителя чаще всего используют физиологический раствор (0,9% раствор NaCl), однако, могут быть использованы также буферные растворы, например, фосфатный буфер, фосфатно-цитратный, трис- буфер и др.
Для лучшего хранения и удобства использования, комплекс бактериофагов дополнительно может содержать стабилизаторы и консерванты, в качестве которых могут быть использованы любые, обычно применяемые для этих целей химические соединения, например сахароза, желатин и хинозол.
Для получения препарата используют следующие штаммы бактериофагов. Бактериофаг Васillus anthracis OZR-I, депонирован 15.01.2007г в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер Jn-08.
Штамм бактериофага OZR-I получен из лизогенной культуры Васillus сеrеus штамм N°ИИИ-32 методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения, с помощью облучателя Vibег Lоurmаt, при длине волны 260 нм в течение 105 секунд по методу Lwоff A.[3]. Морфологические признаки. Головка 51-53 нм, хвостовой отросток 20-40 нм.
На газоне чувствительных бактериальных культур Васillus anthracis фаг OZR-I образует круглые, прозрачные пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК Физико-химические свойства.
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56 0 C. Пределы допустимых значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,4-8,7. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 5 мин при длине волны 260 нм. Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Васillus anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis CTИ-1, В. anthracis Stеrпе 34F2, В. anthracis 2-ая вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuriпgiепsis, 3 штамма В. brеvis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. сеrеus, В. апtrасоidеs N°217, В. mеgаtеrium Ne 1412.
Бактериофаг OZR-I лизирует вакцинные сибиреязвенные штаммы Васillus anthracis CTИ-1, Васillus anthracis Ценковского II, Васillus anthracis Stеrпе 34F2. Диапазон специфичности - лизирует Васillus апthrасis. Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Васillus апthrасis CTИ-1 (депонирован 01.10.1993г в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер 1/10-93). Оптимальные условия размножения.
Штамм фага размножается на чувствительной культуре Васillus апthrасis CTИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон [4]), при температуре 35±0,5°C, вызывая при этом просветление среды после 4-6-чacoвoй инкубации, а на простом питательном агаре [5] образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16- 18- часовой инкубации
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 30-35 мин, урожайность - 200- 220 частиц на одну клетку. Условия хранения.
Бактериофаг Васillus апthrасis OZR-I сохраняет литические свойства в течение 3 лет хранения при температуре (4-6)°C в лиофилизированном состоянии в герметически закрытой ампуле.
Бактериофаг Васillus апthrасis Ф-2 депонирован 05.02.2007г в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380,
Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер Jn-09.
Штамм бактериофага Ф-2 получен из сточных вод г.Пущино.
Морфологические признаки
Головка икосаэдрической формы 82-94 нм, сокращающийся хвостовой отросток 158-162 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Васillus апthrасis фаг Ф-2 образует круглые, прозрачные пятна лизиса диаметром 2-3 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК. Физико-химические свойства. Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56 0 C. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,5. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм. Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Васillus апthrасis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. апthrасis CTИ-1, В. апthrасis Stеrпе 34F2, В. апthrасis 2-ая вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuriпgiепsis, 3 штамма В. brеvis, 3 штамма В. subtilis, 1 1 штаммов В. сеrеus, В. апtrасоidеs N°217, В. mеgаtеrium N° 1412.
Бактериофаг Ф-2 лизирует сибиреязвенные штаммы: Васillus апthrасis CTИ-1, Васillus апthrасis Stеrпе 34F2, Васillus апthrасis 2-ая вакцина Ценковского. Диапазон специфичности - лизирует Васillus апthrасis.
Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Васillus апthrасis CTИ-1. Оптимальные условия размножения.
Штамм фага размножается на чувствительной к нему культуре Васillus апthrасis CTИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 37±0,5 0 C, вызывая при этом просветление среды после 6-8 часовой инкубации, а на плотной питательной среде - образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине (штамм CTИ-1) продолжительность латентного периода составляет 40-50 мин, урожайность - 130-160 частиц на одну клетку. Условия хранения.
Бактериофаг Ф-2 сохраняет литические свойства в лиофильно высушенном состоянии в герметически закрытой ампуле при температуре хранении (4-6)°C в течение 3 лет.
Периодичность пересевов 3 года. Бактериофаг Васillus апthrасis ФАУТ депонирован 19.02.2007г в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380,
Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер Jn-IO.
Штамм бактериофага Васillus апthrасis ФАУТ получен из лизогенной культуры
Васillus сеrеus штамм NeИИИ-47 методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения с помощью облучателя Vibеr Lоurmаt при длине волны 260 нм в течение 70 секунд по методу Lwоff А.
Морфологические признаки.
Головка икосаэдрической формы 80-82 нм, хвостовой отросток 270-280 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Васillus апthrасis фаг ФАУТ образует круглые, прозрачные, пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства.
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°C. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,0. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов В. апthrасis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. апthrасis CTИ-1, В. апthrасis Stеrпе 34F2, В. апthrасis 2-ая вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuriпgiепsis, 3 штамма В. brеvis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов
В. сеrеus, В. апtrасоidеs N°217, В. mеgаtеrium N°1412.
Бактериофаг Васillus апthrасis ФАУТ лизирует сибиреязвенные штаммы:
Васillus апthrасis CTИ-1, Васillus апthrасis Stеrпе 34F2, Васillus апthrасis 2-ая вакцина Ценковского.
Диапазон специфичности: лизирует Васillus апthrасis.
Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага вакцинный штамм Васillus апthrtасis CTИ-1.
Оптимальные условия размножения. Штамм фага размножается на чувствительной культуре Васillus апthгасis CTИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 33±0,5°C, вызывая при этом просветление среды после 6-8-чacoвoй инкубации, а на простом питательном агаре образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 48-60 мин, урожайность - 140- 160 частиц на одну клетку.
Условия хранения.
Бактериофаг Васillus апthгасis ФАУТ в лиофилизированном состоянии в герметически закрытой ампуле сохраняет литические свойства в течение 3 лет хранения при температуре (4 - 6)°C. Периодичность пересевов 3 года.
Пример JVsI. Культивирование фага Васillus апthгасis OZR-I.
В колбу объемом 500см с 50см питательной среды (ГРМ-бульон) вносят lсм споровой суспензии Васillus апthгасis CTИ-1, прогретой при 85 0 C в течение 5 минут, с концентрацией 1,0- 10 кл/см 3 и подращивают 7 часов при температуре 37 С, затем добавляют бактериофаг из расчета множественности инфекции 1 :50. После этого продолжают инкубировать при 37±0,5°C в течение 6 часов до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор l,2мкм, 0,45мкм и 0,22мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию (БОЕ/см ) по методу Грациа [6]. Титр штамма бактериофага 2,0x10 БОЕ/см .
Пример JV»2. Культивирование фага Васillus апthгасis Ф-2.
В колбу объемом 500см 3 с 50см 3 питательной среды (ГРМ-бульон) вносят 0,1см 3 споровой культуры (4,0 10 9 cпop/cм 3 ) Васillus апthгасis CTИ-1, прогретой при 85 0 C 5 минут, и подращивают 6 часов при температуре 37 0 C, затем добавляют бактериофаг из расчета фаг/клетка: 1 :10. После этого продолжают инкубировать при 37±0,5°C в течение 6 часов до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор l,2мкм, 0,45мкм и 0,22мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию (БОЕ/см 3 ) по методу Грациа. Титр штамма бактериофага 9,IxIO 8 БОЕ/см 3 .
Пример JVsЗ Культивирование фага Васillus апthrасis ФАУТ.
В колбу объемом 500см 3 с 50см 3 питательной среды (ГРМ-бульон) вносят lсм 3 споровой суспензии Васillus апthrасis CTИ-1, прогретой при 85 0 C 5 минут, концентрации l,0 10 9 кл./cм 3 и подращивают 5 часов при температуре 37 0 C, затем добавляют бактериофаг из расчета множественности инфекции: 1 :20. После этого продолжают инкубировать при 33±0,5°C в течение 7 часов до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор l,2мкм, 0,45мкм и 0,22мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию БОЕ по методу Грациа. Титр штамма бактериофага 8x10 8 БОЕ/см 3 .
Пример N°4 Получения комплекса бактериофагов.
Для приготовления комплекса бактериофагов берут сконцентрированные препараты каждого бактериофага со специфической активностью не менее 10 1 'БОЕ/см 3 .
Концентрирование суспензий фагов осуществляют на установке системы Реlliсоп 3 Мiсrо Мilliроrе.
После концентрирования титры штаммов по Грациа составили: фага Васillus апthrасis OZR-I - 7,0xЮ π БOE/cм 3 , фага Васillus апthrасis Ф-2 - 4,0xЮ u БOE/cм 3 , фага Васillus апthrасis ФАУТ - 5,0xЮ π БOE/cм 3 .
Для приготовления комплекса смешивают сконцентрированные суспензии каждого бактериофага в количестве по 25 см 3 . Соотношение активностей в комплексе составляет Васillus апthrасis OZR-I : Васillus апthrасis Ф-2: Васillus апthrасis ФАУТ = 1 :0,6:0,7.
При непрерывном перемешивании в смесь вводят стабилизаторы и консервант: сахарозу (ЗОг), желатин (7,5г), хинозол (0,045г). Полученный жидкий комплекс бактериофагов разливают по 0,2см 3 в ампулы объемом 2см 3 , лиофильно высушивают в ампулах, ампулы заполняют инертным газом (в данном случае аргоном) и запаивают.
Пример N°5 Получение препарата и его применение
Одну ампулу комплекса бактериофагов по примеру 4 разводят в 1 литре физиологического раствора и добавляют L-аланин (АррliСhеm, Германия) в количестве 8,909r, (ЮОмМ).
Получают препарат, содержащий смесь бактериофагов в концентрации 10 1 'БОЕ/л И активатор прорастания спор в концентрации О.lмоль/л.
Участки лабораторного помещения (пол, стены, столы), а также поверхностные участки имеющегося оборудования (спектрофотометр CФ-56M, ФЭК 56M, центрифуга T-23), обсемененные спорами Васillus апthгасis CTИ-1 в концентрации от 10 3 до 10 6 cпop/cм 2 обрабатывают препаратом из пульверизатора (NiTO МiпiSрrау). Общая площадь обрабатываемой поверхности составляет примерно Юм 2 .
Обработку проводят двукратно с интервалом 120мин.
Через 2 часа после повторной обработки смывы с обработанной контаминированной поверхности высевают на плотную питательную среду и подсчитывают количество колоний. При первоначальной обсемененности поверхности равной 10 6 cпop/cм 2 после двукратной обработки остается 1-2 живые споры/см 2 , что соответствует международным требованиям к дезинфектантам [7].
В силу своей природы, предложенный препарат обладает пролонгированным действием, так как его концентрация не уменьшается, а увеличивается в 150-200 раз каждые 35-50мин в геометрической прогрессии за счет размножения бактериофагов в прорастающих спорах и вегетативных клетках Васillus апthгасis. Действие препарата начинает проявляться через 20-3 Омин с момента начальной обработки и действует до полного уничтожения спор, поскольку действие фагов проявляется до тех пор, пока присутствует возбудитель инфекции. При этом, при отсутствии объекта дезинфекции бактериофаги самоликвидируются, и, следовательно, после проведения дезинфекции не требуется, в отличие от химических средств, дополнительной очистки.
Безопасность предложенного препарата обеспечивается тем, что специфические бактериофаги не взаимодействуют с другими микроорганизмами и клетками макроорганизмов, поэтому, попадая в окружающую среду, они не оказывают негативного воздействия.
Проведенная проверка показала, что препарат экологически безопасен, не токсичен, не вызывает местного раздражения кожи и слизистых, не вызывает аллергических реакций, не действует на эукариотические клетки. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 препарат является безвредным.
Список литературы.
1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Бeзoпacнocть работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)))
2. Ветеринария, 1951, N°3, с. 33-35
3. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. M., 1967
4. ТУ 9398-021-78095326-2006
5. ТУ 9398-020-78095326-2006
6. M. А. Адаме. Бактериофагия. M., 1961.
7. Современные средства и методы дезинфекции, применяемые при работе с патогенами. Материалы международного семинара (под ред. Г.Н. Лепешкина). - Киров: ООО НПЦ ЭМ «PAЦEM», 2006. 291с.
Next Patent: BIOPREPARATION FOR NEUTRALISING BACILLUS ANTHRACIS SPORES AND VEGETATIVE CELLS