Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una composición de lactobacterias heterofermentativas facultativas antagonistas de bacterias patogénicas de deterioradores de productos cárnicos cocidos.

Antecedentes de la Invención

Los lactobacilos constituyen uno de los principales grupos microbianos utilizados tradicionalmente para la fermentación de productos cárnicos.

Las bacterias lácticas se han utilizado en la fabricación de embutidos fermentados secos o semisecos.

Las especies de bacterias reconocidas como orientadoras de fermentación en salchichas y otros embutidos son L. sakei y L. Curvatus . En EUA se reconoce más frecuentemente la presencia de pediococos y micrococos que de lactobacilos .

El género micrococcus es un género presente en cultivos iniciadores de fermentación cárnica por razones de estabilidad en color y aroma. (Leroy de Devoist methods in biotechnology vol 18 Editorial Humana press) .

Sin embargo muchos de los productos de fermentación de productos cárnicos no tienen protección natural contra bacterias patógenas de cierto tipo, como histeria monocytogenes . En el caso particular de los fermentados se ha buscado la presencia de bacterias iniciadoras que además de tener la capacidad de generar productos de sabor grato para la fase de fermentación y madurez del producto, tengan la habilidad de producir bacteriocinas que controlen o inhiban la proliferación de patógenos como listeria monocytogenes . Las bacteriocinas de lactobacilos pueden ser definidas como pequeños péptidos o proteínas que tienen actividad antibacteriana contra cepas relacionadas cercanamente. Las bacteriocinas producidas por lactobacilos funcionan muy bien bajo condiciones óptimas de laboratorio aunque no necesariamente bien en condiciones reales de fabricación de embutidos. La razón de esto es la inactivación que sufren por proteasas propias de la carne o por el consorcio microbiano presente, o simplemente por incapacidad de la cepa para producir bacteriocinas bajo el sistema de aplicación de fabricación del embutido fermentado .

La producción de cárnicos fermentados ofrece una condición especifica de desarrollo de cepas orientadas a su uso como inoculantes o iniciadores. Sin embargo, en México la mayor parte del consumo de embutidos en la forma de jamón, mortadela o salchichas proviene de la generación de una pasta y de la posterior cocción por inmersión en sistemas de agua o vapor. El tratamiento térmico en ningún caso se desarrolla con alta presión y temperatura propias del sistema de autoclave.

La red fría asociada a la distribución de embutidos cocidos no siempre funciona de manera óptima. De igual manera, los productos cárnicos de res, puerco y aves de corral e incluso pescado tienen el mismo tipo de defectos.

De hecho la mayor parte de los cárnicos que se consumen en México no provienen de rastros certificados que se consideren TIF.

Existe una alta incidencia de enfermedades gastrointestinales y muertes causadas por estas en nuestro país .

En la República Mexicana uno de los problemas de salud más importantes lo constituyen los padecimientos gastrointestinales, de los cuales la salmonelosis ocupa un lugar relevante. Con el objeto de conocer en qué forma contribuyen los chorizos como vehículos de transmisión de esta enfermedad se realizó un muestreo en mercados y supermercados de la ciudad de Acapulco, Guerrero.

Dentro de los alimentos que se involucran con más frecuencia como causantes de salmonelosis, se encuentra la carne y los productos elaborados a base de ésta. La carne es uno de los alimentos fundamentales en la alimentación humana, las proteínas que contiene son de primera calidad para la nutrición, pero tiene la particularidad de que con mucha facilidad se contamina, lo cual representa un riesgo para la alimentación. Durante el tiempo que transcurre desde la matanza hasta que es vendida en el mercado, la carne llega a contener cientos de miles o millones de microorganismos por gramo; sin embargo, lo más significativo es la clase de bacterias y no su cantidad; de ahí la importancia del cuidado que debe tenerse en la preparación de la carne desde su origen hasta su consumo. En general, la carne que produce enfermedad procede de animales infectados, específicamente terneros y cerdos, pero puede contaminarse durante el almacenamiento o preparación . Entre los productos que se elaboran a base de carne se encuentran los embutidos, como chorizos y longanizas, los cuales se preparan con carne fresca de bovinos o porcinos e ingredientes tales como vinagre, ajo, pimentón, pimienta, orégano, canela, anís, clavo, comino y otros aderezos; estos productos no pasan por procesos de acción y en ciertas fábricas se someten a procesos de secado una vez embutidos .

Las gastroenteritis y enfermedades diarreicas ocupan el segundo lugar de morbilidad en el estado de Guerrero. Estos padecimientos en muchos casos son causados por la presencia de salmonella en los alimentos. Para conocer las condiciones higiénicas de algunos de ellos, en un estudio se analizaron un total de 336 muestras de carnes crudas, recolectadas en nueve localidades de la entidad para determinar la presencia de salmonella, utilizando los métodos estándar. Un total de 109 muestras estuvieron contaminadas con este patógeno, lo cual representa un 32.44 por ciento de positividad. Las muestras que presentaron los mayores índices de salmonella fueron chorizo y longaniza, carne de cerdo y cecina, comprobándose una calidad microbiológica un tanto deficiente en estos productos.

Para conocer la calidad microbiológica de los alimentos, la Secretaría de Salud del estado de Guerrero implemento, a partir de 1985, programas de vigilancia sanitaria en alimentos, los cuales se analizaron en el Laboratorio Estatal de Salud. Es así que se llevó a cabo la investigación de Salmonella sp en 336 muestras de productos cárnicos; se analizaron 89 muestras de chorizos y longanizas y se obtuvo un porcentaje de positividad del para este patógeno, como se aprecia en la siguiente

Tabla A (Parrilla MC , Sáldate EO, Nicoli LM. "Incidencia de

Salomonella en productos cárneos"; Salud Pública Mex, 1978;

20 : 569-574) .

Tabla A. Incidencia de salmonella en carnes crudas y productos derivados de la carne

Muestras

Producto

Analizadas Positivas Porcenta e

Longaniza 1272 457 36.0

Chorizo 877 295 33.6

Carne cruda 1762 488 27.6

Moronga 299 44 14.7

Paté 169 13 7.6

Entrecot 218 15 6.8

Queso de puerco 660 43 6.5

Salchicha 982 39 3.9

Fiambre 395 15 3.7

Jamón 1628 60 3.6

Tocino 247 11 4.4

Otras 813 21 2.5 Derivado de estos antecedentes es que se desarrolló la búsqueda de inoculantes, que no fuesen iniciadores de fermentación sino para uso en embutidos cocidos de carne fresca de diferente origen; amón salchicha etc, que permitan el control y proliferación de bacterias patógenas es importante para el caso particular de embutidos artesanales o industriales producidos en México. Cualquier cepa que deba utilizarse en escala industrial para la producción de cárnicos cocidos debe cumplir varias condiciones a saber:

1. Que permita por pruebas in vitro la funcionalidad en medios de cultivo adecuados como antagonista de bacterias o consorcios patogénicos de deterioradores de productos cárnicos cocidos.

2. Que sea potencialmente cultivable en medio de cultivo de bajo costo útil para producción industrial a niveles de bioreactores o fermentadores .

3. Que colonice y se establezca en los sistemas de aplicación es decir en productos cárnicos frescos o cocidos y que tenga la facultad de cultivarse en alta temperatura y prevalecer en baja temperatura.

4. Que al colonizar los productos cárnicos frescos o cocidos no sea un agente de deterioro, que no modifique el color ni la textura el sabor y el aroma y que en cambio prevenga el deterioro causado por patógenos. Otras características de un inoculante preservador para cárnicos frescos y cocidos, funciona mejor cuando es compatible con la presencia o aplicación en el sistema de uso de desinfectantes o sanitizantes de aplicación industrial que se usan superficialmente en productos crudos o cocidos. Además, en lo general deben ser bacterias que no sean obligadamente homofermentativas y que no produzcan como producto único de fermentación el ácido láctico que es un catabolito que genera un sabor picante ácido y que típicamente puede modificar los sabores de productos cocidos y puede modificarse el color el sabor y el aroma. Deben buscarse por tanto cepas que sean heterofermentativas facultativas y que acidifiquen por tanto parcialmente el producto. Hay que reiterar no modifiquen ni la textura ni el sabor del aspecto del alimento del cárnico ni del producto cocido ni del crudo.

Para aplicación en productos cárnicos frescos o cocidos el inoculante debe tener la máxima capacidad de exclusión o antagonismo de patógenos o deterioradores y la mínima facultad de modificación. Algunos de los mecanismos por los cuales las bacterias lácticas antagonizan y en la práctica inhiben el crecimiento de bacterias patógenas o deteriorativas son:

• Producción de ácidos (ácido Láctico como principal producto )

· Peróxido de hidrogeno;

• Bacteriocina;

• Producción de fagos.

Dentro de las anteriores características presentadas, la que más frecuentemente se atribuye a cepas con aplicación industrial es la producción de bacteriocinas . Las bacteriocinas son péptidos o proteínas pequeñas no susceptibles de modificación de proteasas comunes que tienen actividad análoga a antibióticos pero por mecanismos que no contribuyen a generar toxicidad en sistemas animales o tejidos humanos. Se encuentran perfectamente documentados y conocidos los espectros antimicrobianos de bacteriocinas como la nisina (Hoover D., Nisina, Editorial University of Delaware) , lactobiocina, lactocina y bavaricina. Algunas de estas se producen por las cepas productoras en los propios sistemas de aplicación, algunas otras no se producen más que en los medios sólidos de producción o también en caldo de cultivo sumergido. La aplicación de un microorganismo de manera directa como biopreservador o en contraste la aplicación de la bacteriocina producida, depende de varios factores, es decir, la decisión sobre la aplicación de la bacteriocina ya sea del biológico vivo o de la bacteriocina generada pero fundamentalmente es asociado al costo de la función que se busca y del sistema de aplicación. En productos cárnicos con biota deterioradora como patogénica se recomienda el uso tanto de los productos de fermentación como ácidos peróxidos o bacteriocinas como de los propios biológicos. El uso de ambos ofrece posibilidades de sinergización de actividad antimicrobiana. (Monteville T., winkowski K., Chikindas M., Food Microbiology Fundamentáis and frontiers 2da Edición, Editorial ASM Press Washington D.C. 2001)

Las bacteriocinas se agrupan en tipos bioquímicos de aminoácidos, el grupo 1 contiene aminoácidos inusuales alanina, beta metil antionina, el grupo 2 son proteínas estables a temperatura termoestable que tienen una secuencia líder común de glicina-glicina. Tanto bacteriocinas del grupo 1 como del grupo 2 tienen actividad mixta contra bacterias gram negativas y gram positivas (Drider D, Rebuffat S, The Prokariotes, Capítulos 4, 5, 6, 7 y 8 Editorial Springer) . Las bacteriocinas de los grupos 3 y 4 son muy diferentes de los grupos anteriores, son típicamente mayores a 30Kda y son termolábiles , (Monteville T., Chikindas M., Food Microbiology Fundamentáis and frontiers (Biopreservation of foods) 3a Edición, Editorial ASM Press Washington D.C. 2007. Capitulo 34, Páginas 747 - 765) .

El uso de cultivos iniciadores no acidificantes ha demostrado la reducción en la viabilidad e incluso la eliminación de cepas de histeria monocytogenes en sistemas cárnicos y lácteos, el uso de pediococcus y de su bacteriocina pediocina de forma sinérgica también ha generado mayor seguridad en alimentos fermentados. (H. Ghalfil, 2, N. Benkerroum2, D.D.K. Doguietl, M. Bensaid and P. Thonart Effectiveness of cell-adsorbed bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus CWBI-B28 and selected essential oils to control Listeria monocytogenes in pork meat during cold storage) . Desarrollo de un nuevo método para la detección de bacterias acido lácticas capaces de proteger el jamón contra enterobacterias (He ^' quet, V. Laffitte, E. Brocail, W. Aucher, Y. Cenatiempol J. Frere, C. Fremaux and J.M. Berjeaud, Development of a new method for the detection of lactic acid bacteria capable of protecting ham against Enterobacteriaceae, DANISCO INNOVATION, France, Editorial Letters in applied microbiology 2009, ⁾ .

Las pruebas de ensayo parecen ser la manera más segura de acercarse a evaluar el potencial de cultivos protectores de alimentos. Sin embargo, estos métodos consumen mucho tiempo y a menudo son de difícil implementación . Aquí se describe el desarrollo de un método secuencial de cultivo, un nuevo método para el escrutinio de cepas como cultivos protectores. Materiales y Resultados: el método secuencial de cultivo está basado en la estimulación, en un medio de estimulación de carne de la inhibición de enterobacterias por medio de lactobacilos , observados previamente in situ. Los resultados obtenidos con este método secuencial de cultivo armonizaron con aquellos de la prueba de ensayo en amón cocido rebanado y confirmaron el potencial antagonista de los lactobacilos.

Los resultados obtenidos del escrutinio de 187 bacterias lácticas indicaron que L. sakei _r Lactococcus lactis diacetylactis y Carnobacterium spp fueron inhibidores fuertes de enterobacteriaceae, mientras que Pediococcus spp, Leuconostoc spp y Weisselia spp y otras especies de lactobacilos y lactococos no tuvieron la misma capacidad inhibitoria . Conclusiones: el método de secuenciación de cultivo parece ser una herramienta útil para seleccionar rápidamente cultivos de lactobacilos los cuales son buenos candidatos para la bioprotección de la carne.

Significancia e impacto del estudio: el método de secuenciación de cultivo y el medio de simulación podrían eficientemente representar las pruebas experimentales en la selección de un cultivo protector potencial para todo tipo de alimentos, con la condición de tener el medio apropiado de estimulación que corresponda al alimento o para el cual los cultivos protectores fueron buscados. (Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254 668 Journal) .

Actividad antili sterial de una bacteriocinas producida por Lactobacillus curvatus CWBI-B28 y Lactobacillus sakei CWBI- B1365 en carne cruda de res y de pollo. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de las bacteriocinas producidas por L. sakei y L. curvatus en el crecimiento y supervivencia de Listeria monocitogenes en carne cruda de res y pollo.

Métodos y resultados: los genes estructurales de sakacina P y sakacina G fueron identificados en L. curvatus CWBI-B28 y L. sakei CWBI-B1365 usando amplificación por PCR respectivamente. El efecto de las dos cepas bacteriocinogénicas ya sea solas o en conjunto y la cepa no productora de bacteriocina L. sakei LMG17302 en Lysteria monocytogenes fue evaluado en carne de res y pollo. En la carne de res, las bacterias patógenas fueron inhibidas por las cepas bacteriocinogénicas, sin embargo estas cepas no tuvieron actividad en la carne de pollo crudo cuando se inocularon de forma separada mientras que si mostraron un claro efecto anti listeria cuando se aplicaron en conjunto. Conclusión: El L. sakei productor de sakacina G y el L. curvatus productor de sakacina P, puede aplicarse en carne de res cruda para inhibir L. monocytogenes . En la carne de pollo, la inhibición de L. monocytogenes solamente pudo lograrse por la aplicación combinada de estas cepas productoras de bacteriocinas .

Significancia e impacto del estudio: en algunos productos cárnicos la aplicación combinada de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas lia pueden mejorar la actividad antilisterial .

Efecto del ácido láctico y bacterias ácido lácticas en el crecimiento de microorganismos deterioradores carne de res empacada al vacio La aplicación en superficie de ácido láctico y bacterias lácticas en sustratos de carne fue reportada como un medio de control de poblaciones deterioradoras.

El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la inoculación de lactobacilos y ácido láctico en el desarrollo de bacterias deterioradoras en carne empacada al vacio .

Finalmente la carne rebanada o cortada fue inoculada con Pseudomonas fluorescens , Brochothrix thermosphacta y con Lactobacilos minor, después fue tratada con un inoculo de BAL (Lactobacillus carnis, Lactobacillus pentosus and Staphylococcus carnosus) y ácido láctico (200 mg/100 g de carne) . Las muestras fueron empacadas al vacio y almacenadas por 12 y 6 días a 4°C y 20°C respectivamente. Se analizó ph y cuentas de Bacterias aerobias, especies de enterobacterias , Pseudomonas spp. _r B. thermosphacta, y Lactobacilos heterofermentativos .

El ácido láctico fue el tratamiento más eficiente para controlar las poblaciones de deterioradores . Los lactobacilos deben ser considerados solamente como un factor adicional paralelo a otros métodos de preservación para mantener poblaciones deterioradoras en cantidades lo suficientemente bajas asi como para extender la vida de anaquel de la carne

El efecto que se busca en las bacterias heterofermentativas facultativas del tipo de las bacterias lácticas, es el de la producción continua de varios tipos de agentes antimicrobianos, de manera tal que en forma concurrente actúe el poder oxidante del peróxido de hidrógeno, el efecto bacteriostático del ácido láctico, y el efecto permeabilizante de membrana de las bacteriocinas descrito por Nes et al.

Los procesos y sistemas de aplicación que se generaron a partir de la invención descrita en la patente de los Estados Unidos No. 4886673, se refieren a un grupo de microorganismos, un lactobacilo, una bacteria del género Micrococcus, y una levadura (Debaryomyces) . Los cultivos, mayoritariamente acidificantes tienen aplicación en cárnicos, en los que la inoculación de los microorganismos seleccionados, genera productos acidificados del tipo de carne encurtida, o curados, estables, con mayor vida de anaquel que aquéllos no tratados.

Otra invención, la US 5576035, protege el uso de dos bacterias, una del género Lactobacillus y otra del género Hafnia, para la protección de productos cárnicos frescos por inoculación de las mismas. Sin embargo, en dicha invención, la gran mayoría de las aplicaciones, se refieren al uso de bacterias para la protección de cárnicos que se orientan al empacado al vacío.

La patente 5374433 orientada también a la protección de cárnicos, mayoritariamente fermentados, y no cocido o frescos, protege el uso de bacterias lácticas homofermentativas obligadas, productoras de ácido láctico como único efector antimicrobiano.

Sumario de la Invención

En vista de las desventajas antes descritas, la presente invención tiene como objetivo el proporcionar composiciones biopreservadoras a base de consorcios de lactobacterias heterofermentativas facultativas que prevengan y controlen el deterioro tanto de productos frescos, como de productos cocidos .

Otro objeto de la presente invención, es proveer composiciones biopreservadoras a base de consorcios de lactobacterias heterofermentativas facultativas que puedan emplearse exitosamente para prevenir y/o controlar el deterioro de productos frescos o cocidos tanto de pollo como de res y cerdo.

Un objetivo adicional de la presente invención, es el proporcionar composiciones biopreservadoras a base de consorcios de lactobacterias heterofermentativas facultativas, en las que los consorcios proliferen a temperaturas entre 4 °C y 70 °C.

También es objeto de la presente invención, el proporcionar composiciones biopreservadoras a base de consorcios de lactobacterias heterofermentativas facultativas, que incrementen la vida en anaquel de productos frescos o cocidos .

Los objetivos antes citados y las ventajas de la invención, serán aparentes de la siguiente descripción detallada de la misma .

Descripción Detallada de la Invención

Evaluación de cepas por su actividad antimicrobiana in vitro

Evaluación de antagonismo vs patógenos

Inicialmente, se aislaron consorcios microbianos de distintas fuentes de plantas procesadoras de alimentos en México, resistentes a condiciones de operación pH, presión osmótica, entre otras características, destacándose principalmente la presencia de lactobacilos . A todos los consorcios bacterianos aislados se les realizaron pruebas de antagonismo contra las siguientes cepas de bacterias patógenas :

Salmonella typhimurium

Samonella cholereae

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

- histeria Monocytogenes

La prueba de inhibición se realizó de acuerdo a la modificación descrita por Schilinger y Lucke, en la que el halo de inhibición se cuantifica como la magnitud del radio del halo, en rom .

La metodología para llevar a cabo estas pruebas fue la siguiente :

Se realizaron preinóculos de las bacterias patógenas que fueron incubadas durante 24 horas a 37 °C de la siguiente manera.

Una asada por cada tubo con 5ml de caldo lactosado para inocular Salmonella typhi

Una asada por cada tubo con 5 mi de caldo lactosado para inocular Salmonella cholerae

- Una asada por cada tubo con 5 mi de caldo lactosado para inocular Escherichia coli

Una asada por cada tubo con 5 mi de caldo soya tripticasa para inocular Staphylococcus aureus

Una asada por cada tubo con 5 mi de extracto de levadura al 1.5% para inocular histeria Monocytogenes Después incubados los tubos durante 24 horas se prosiguió a realizar un ajuste de una dilución en orden de 10 ^~8 con el estándar de Macfarland 5.0.

La dilución se ajustó mediante el uso de caldo lactosado estéril .

Una vez estandarizada la dilución del crecimiento bacteriano cada una de las cepas fue sembrada en con un hisopo estéril en placas con agar Müeller Hinton de forma masiva .

Transcurridos 15 min de haber sembrado masivamente cada bacteria patógena, se colocaron en el agar pocitos de 0.8 cm de alto (estériles) los cuales fueron enterrados en el agar dejando una porción sobresaliente para colocar en éste la solución del lactobacilos con potencial inhibidor.

Las bacterias que resultaron ser antagónicas de patógenos generaron un halo de inhibición en el patógeno correspondiente como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Presencia de halo de inhibición por antagonismo bacteriano

Clave de S L.

S _r cholerae E .coli S.aureus

Consorcio typhi monocytogenes

M17 Si Si No Si Si

C35 Si Si Si Si Si

C352 Si Si No Si Si

C261 Si Si No Si No

C262 Si Si No Si No

C14 Si Si Si Si Si Evaluación de antagonismo vs microorganismos deterioradores (slime) .

Se realizaron pruebas de antagonismo de los consorcios seleccionados contra un consorcio de microorganismos deterioradores que fueron aislados de muestras de salchichas en deterioro. La prueba de inhibición se realizó de acuerdo a la modificación descrita por Schilinger y Lucke, en la que el halo de inhibición se cuantifica como la magnitud del radio del halo, en rom. La metodología para llevar a cabo estas pruebas fue la siguiente:

Se realizaron preinóculos de las bacterias deterioradoras que fueron incubadas durante 72 horas a 37 °C de la siguiente manera.

Se tomó una asada del microorganismo deteriorador conservado en glicerol en un caldo con peptona de caseína al 2% y extracto de carne al 1%.

Una vez incubados los tubos durante 72 horas se prosiguió a realizar un ajuste de una dilución en orden de 10 ^~8 con el estándar de Macfarland 5. La dilución se ajustó mediante el uso de caldo lactosado estéril.

Una vez estandarizada la dilución del crecimiento bacteriano cada una de las cepas fue sembrada en con un hisopo estéril en placas con Agar Métodos Estándar de forma masiva.

Una vez transcurridos 15 min de haber sembrado masivamente cada bacteria deterioradora, se colocaron en el agar pocitos de 0.8cm de alto (estériles) los cuales fueron enterrados en el agar dejando una porción sobresaliente para colocar en éste la solución del lactobacilo potencial inhibidor. Todas Las bacterias resultaron ser antagónicas de los microorganismos deterioradores y generaron un halo de inhibición en el deteriorador de cada producto cárnico correspondiente .

Identi icación de las cepas seleccionadas

Morfología colonial microscópica

Para llevar a cabo la identificación de las cepas seleccionadas por su actividad antagónica in vitro tanto para microorganismos deterioradores como patógenos primeramente, se verificó la morfología de las cepas para que se confirmara que fueran lactobacilos .

Se sembraron las cepas por estría cruzada repetidas veces en agar MRS selectivo del crecimiento de lactobacilos en el cual se valoró la forma color y tamaño de las cepas que presumiblemente fueran lactobacilos.

Tinción de gram

Como parte de la identificación de las cepas de lactobacilos se corroboró su morfología al microscopio y además se determinó si eran microorganismos gram positivos o gram variables.

La metodología para hacer una tinción de Gram empleada fue la siguiente:

1. tomar la muestra del microorganismos a identificar 2. hacer un frotis sobre un cubreobjetos

3. dejar secar a temperatura ambiente

4. fijar la muestra mediante flameado (3 veces aprox.)

5. agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto, enjuagar con agua

6. agregar lugol y esperar 1 minuto, enjuagar con agua 7. agregaralcohol-cetona y esperar 1 minuto aproximadamente, enjuagar con agua,

8. agregar safranina o fucsina básica y esperar 30 segundos .

Observar al microscopio en lOOx con aceite de inmersión

Una vez realizada la identificación microbiana se prosiguió realizar :

Pruebas bioquímicas

El índice Analítico de Perfil (Analytical Profile Index o API) son métodos rápidos que permiten la identificación de microorganismos a través de la realización de diferentes pruebas bioquímicas. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico con varios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere montar.

Cada microtubo del sistema se inoculó con una suspensión en solución salina al 0.85% de un cultivo puro del microorganismo a ser identificado. En algunos casos estos microtubos se llenaron completamente con la suspensión, mientras que en otros se requirió del añadido de parafina líquida estéril, que proporcionó las condiciones anaeróbicas necesarias.

Identificación taxonómica (secuencia 16s)

Se inicia con una fuente simple, ya sea una única colonia aislada, extracto de etanol, extracto de ADN o una tarjeta de elución FIA; de cualquiera de estas muestras; se procede a extraer el ADN genómico de la colonia aislada y por medio del uso de PCR se amplifican los primeros 500 pares de bases del gen 16S, se realizó un ciclo de secuenciación para etiquetar el ADN fluorescente y se visualizaron los datos de secuencia en un secuenciador automatizado, una vez hecho esto, se analizaron los datos con una base de datos y se generó un Informe de Identificación avalado por el departamento de calidad con un 98% de exactitud y un 0.2% de Tasa de error.

La identificación de cada cepa se muestra en la siguiente Tabla 2:

Tabla 2. Identificación de consorcios.

Clave de Identificación primaria Clave de

Consorcio NRRL

M17 A Lactobacillus paracasei tolerans B- ^■ 50Í 331*

C35 Lactonacillus curvatus B- ^■ 50Í 326*

C352 Lactobacillus sakei B- ^■ 50Í 327*

C14 Lactobacillus pentosus plantarum B- ^■ 50Í 330*

C261 Lactobacillus acidophillus B- ^■ 50Í 328*

C262 Lactobacillus allimentari us B- ^■ 50Í 329*

M17G Lactobacillus plantarum B- ^■ 50Í 325*

Información del depósito

*Se mantiene un depósito de cada uno de los consorcios del genero Lactobacillus sp de esta invención en Agricultural Research Culture Collection (NRRL) International Depositary Authority 1815 N. University Street Peoría, Illinois 61604 U.S. A. Agricultural Research Culture Collection (NRRL), quien ha autorizado al solicitante a hacer referencia al material biológico depositado en la solicitud, y ha dado su consentimiento irrestricto e irrevocable para que el material depositado se ponga a disposición del público.

Para satisfacer los requisitos de permisividad de 35 U. S. C. § 112, y para certificar que el depósito de los consorcios del genero Lactobacillus sp de la presente invención cumple con los criterios establecidos en 37 C. F. R. §§ 1.801 - 1.809, los solicitantes por medio de la presente hacen las siguientes declaraciones respecto a los consorcios bacterianos del genero Lactobacillus sp depositados bajo los números NRRL B-50825, B-50826, B- 50827, B-50828, B-50829, B-50830 y B-50831 (depositados el 18 de Marzo de 2013) :

1. Durante el trámite de esta solicitud, se dará acceso a la invención al Comisionado, cuando lo solicite.

2. Cuando se conceda la patente, el consorcio bacteriano estará disponible al público bajo las condiciones especificadas en 37 CFR 1.808.

3. Se mantendrá el depósito en un almacén público durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante a vida legal de la patente, lo que sea más largo.

4. Se probará la viabilidad del material biológico en el momento del depósito; y

5. Se reemplazará el depósito en caso de que quedara no disponible.

El acceso a este depósito estará disponible durante la tramitación de esta solicitud, para las personas determinadas por el Comisionado de Patentes y Marcas que tengan derecho a ello, conforme a 37 C. F. R § 1.14 y 35 U. S. C. § 122. Cuando se concedan cualesquiera reivindicaciones de esta solicitud, se eliminarán irrevocablemente todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los consorcios, proporcionando acceso a un depósito de consorcio bajo el mismo de Género, en el Agricultural Research Culture Collection (NRRL) International Depositary Authority.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos de la presente tienen los mismos significados que se entienden comúnmente entre los expertos ordinarios en la materia a la que pertenece la presente invención. Si bien se pueden usar cualesquiera métodos y materiales, similares o equivalentes a los descritos aquí, en la práctica o en las pruebas de la presente invención, los métodos y los materiales preferidos están descritos aquí. Todas las publicaciones, las patentes y las publicaciones de patente citadas quedan incorporadas aquí en su totalidad, para todos los propósitos, mediante la referencia .

Las publicaciones discutidas aquí se proveen únicamente por su descripción anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de la presente debe considerarse como admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder en fecha a dicha publicación, en virtud de una invención previa.

Si bien se describe la invención con relación a modalidades específicas de ella, se entenderá que es susceptible de otras modificaciones; y esta solicitud está destinada a amparar cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención que sigan, en lo general, los principios de la invención e incluyendo aquellas diferenciaciones de la presente descripción que queden dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención, y que se puedan aplicar a los aspectos esenciales señalados en lo que antecede, y que sigan el alcance de las reivindicaciones.

Producción de microorganismos en medios líquidos

Los lactobacilos aislados fueron cultivados en medios de cultivo que permitieron su desarrollo y proliferación. A continuación se describe el contenido de los medios de cultivo .

Descripción de los medios de cultivo

Fuentes de carbono adecuadas que incluya azúcares de alta pureza como maltodextrinas , sacarosa, glucosa, fructosa, lactosa, mañosa y xilosa entre otros. Además fuentes de carbono complejas como; mieles, jugos, sueros de leche, melazas de ingenio, extractos vegetales e hidrolizados vegetales .

Fuentes de nitrógeno apropiadas tales como fuentes de amonio, nitratos, aminoácidos, extracto de levadura y de carne entre otros.

Fuentes minerales, micronutrientes y macronutrientes tales como; fosfatos sales de magnesio, fósforo, manganeso entre otras .

Fuentes naturales de vitaminas y cofactores.

Estos medios de cultivo liquido son producidos en matraces en agitación o en forma estática, aumentando su volumen en fermentadores o bioreactores .

Cuando los lactobacilos crecen aquí se puede utilizar el caldo de cultivo completo o fraccionarse separando la biomasa por filtración. De tal manera que puede utilizarse la biomasa o el sobrenadante que haya demostrado actividad antimicrobiana ya que éste es presumiblemente rico en bacteriocinas .

Evaluación de los consorcios por su actividad antimicrobiana en cárnicos frescos y cocidos

Actividad antimicrobiana en pollos

Las aves de corral muertas son desangradas, desplumadas y evisceradas y sanitizadas con agua y una solución de cloro primeramente .

Posteriormente, se adiciona el producto formulado del consorcio bacteriano M17 en una solución de un medio con algún ácido orgánico, que preferentemente es ácido acético al 1% y para llevar esto a cabo, el consorcio se cultiva de la siguiente manera:

El consorcio M17 se siembra en un caldo MRS; una asada en 10ml y se incuba 48hrs, posteriormente este volúmen se siembra en 100 mi 24 hrs a 30°C y finalmente este volúmen se siembra en un matraz con 500 mi durante 48 hrs.

Una vez que se tiene el inoculo, éste se utiliza completo es decir, las células crecidas más el medio de cultivo y se adiciona el 1% de ácido acético.

Las piezas de pollo sin piel se colocan en una charola y toda la solución anterior se adiciona directamente en el pollo a modo de marinado, de 15 a 20 mi de solución por pieza de pollo (lOOg) .

Una vez que se tengan en inmersión las piezas en la charola, ésta es cubierta por un plástico adherente (sin vacio) y se coloca en refrigeración para su venta en un supermercado .

La inoculación de los lactobacilos incrementa la vida de anaquel del pollo fresco en un 40% a partir de que se encuentra empacado en la charola.

Esto implica que si su vida de anaquel en refrigeración a 4°C es de 7 días máximo considerando que en el 7 ^o día ya se presentan olores a putrefacción, con el tratamiento del consorcio M17, vida útil llega en las mismas condiciones al menos a 11 días.

Interacciones con productos químicos antimicrobianos

Se realizaron pruebas de supervivencia del formulado del consorcio M17 a ácidos orgánicos y sanitizantes químicos utilizando las siguientes concentraciones:

• Ácido acético 2%

• Ácido acético 1%

• Percitrros 300 ppm

• Perlactirros 300 ppm

Los ácidos orgánicos y sanitizantes son empleados con regularidad para reducir la carga microbiana a fin de que los microorganismos deterioradores no produzcan características indeseables al producto y tenga una mayor tiempo de vida en anaquel. Para fines de la presente invención se empleó el Ácido acético al 2% y 1% de concentración .

Se cultivó el consorcio Mil en un caldo de cultivo durante 48 horas a 30°C, a partir con una inicial de inoculo de 10 ⁸ a 10 ⁹ , después de haber transcurridos las 48 horas se agregó el caldo del consorcio bacteriano en el pollo fresco, adicionando por cada 100 gramos de pollo, 20 mi de caldo con el consorcio y 1%, 2% de (de la solución empleada de lactobacilos ) ácido acético glacial concentrado, por cada 20 mi se agregaron 0.4 mi y 0.2 mi de ácido acético respectivamente. Se colocaron las piezas de pollo en una charola con su caldo de inmersión, se cerró el empaque con el pollo teniendo como resultado que la concentración al 1% de ácido acético concentrado le proporciona una vida de anaquel incrementada hasta en más de un 50% con respecto a la vida útil del producto sin tratamiento; siendo de 7 días sin el tratamiento y de al menos 11 días con tratamiento con el consorcio y el ácido. - Actividad antimicrobiana en salchichas

Se realizaron pruebas de antagonismo de los consorcios seleccionados C35 y M17 contra un consorcio de microorganismos deterioradores que fueron aislados de muestras de salchichas en deterioro de diferentes marcas comerciales.

Extracción del material deteriorador

Para generar el deterioro en las salchichas se preparó un concentrado de material de cepas deterioradoras de la siguiente manera:

Se incubaron muestras comerciales de salchichas (4) a 35 y 45 °C durante 48 horas para fomentar el crecimiento de microorganismos deterioradores.

Una vez incubadas las muestras, se sometieron a una extracción con una mínima proporción de agua estéril, es decir, una proporción 9:1 de salchicha con agua.

La extracción se realizó de dos maneras:

Por un proceso tipo stomacher

Extracción del deterioro en superficie

El liquido obtenido concentrado se guardó en una solución 1:1 de glicerol al 70% para conservar el material celular deteriorador .

El material en glicerol se almacenó en tubos eppendorf a - 20°C.

Para reproducir el crecimiento de bacterias deterioradoras se realizó el siguiente procedimiento:

Se tomó una asada del material en glicerol en tubos estériles con extracto de carne al 1 % .

- Los tubos fueron incubados a 35°C durante 72horas

Se manejaron diluciones de 10 ^_1 a 10 ^~3 de todos los tiempos de incubación manejados.

Una vez generado el crecimiento bacteriano en el tubo; observado por turbidez, se llevó a cabo el proceso de deterioro en las salchichas elaboradas.

Se colocaron muestras de salchichas, elaboradas en una planta piloto, en frascos estériles y éstas fueron inoculadas con 100 microlitros de diluciones en orden de 10 ^_1 y 10 ^~3 del material generado.

Los frascos fueron incubados a 35°C, temperatura ambiente (25°C) y en refrigeración a -4°C.

El deterioro de las salchichas elaboradas se manifestó con la producción de película blanca en la superficie después de haber inoculado los microorganismos deterioradores . Por otro lado se inocularon salchichas con los consorcios bacterianos seleccionados C35 y M17 (300 microlitros ) y se dejó absorber el material y después se inoculo el consorcio deteriorador (300 microlitros) y se dejó en temperatura de refrigeración y de 30°C. Para valorar la protección del formulado de los consorcios C35 y M17 en el deterioro.

La prueba demostró una protección en la salchicha de la manifestación del "slime" o película blanca en la superficie debido al antagonismo creado por el formulado de los consorcios C35 y M17 previamente inoculados.

Actividad antimicrobiana en jamón

Aislamiento de consorcios de microorganismos deterioradores de jamón

Se utilizó jamón en un paquete cerrado nuevo y se dejó incubando a temperatura de 30 °C durante 4 días. Después de haber transcurrido 4 días se recuperó un exudado blanco en el paquete del jamón.

Este exudado fue conservado en crioprotector (glicerol al 70%) guardándolo en tubos eppendorf en una relación 1:1

(exudado + glicerol) a una temperatura de -70°C.

Posteriormente se utilizó este consorcio para ser inoculado en rebanadas de jamón FUD® para reproducir el deterioro

(exudado) .

Por otro lado, se colocaron rebanadas de jamón de manera individual y se dejaron incubar a 35°C durante 48 horas. Una vez transcurrido ese tiempo se plaqueó el jamón deteriorado y se aislaron colonias de manera individual de la placa petri .

Se aislaron dos morfotipos principalmente: una colonia pequeña blanca y una colonia naranja grande.

Ambas colonias fueron purificadas y criopreservadas a -70°C para su posterior inoculación en las rebanadas de jamón. El deterioro derivado de la colonia blanca pequeña fue menor en el jamón siendo apenas perceptible.

El deterioro derivado de la colonia naranja fue más perceptible ya que al ser inoculada en el jamón después de unas 48hrs se pudo observar un deterioro en el color de la rebanada (decolorándose) y además un deterioro proteolitico en la rebanada resultando en un efecto visual de deshacerse al reblandecerse el tejido.

Otro de los experimentos se desarrolló tomando una de las rebanadas colocadas en incubación para generar deterioro acelerado en el experimento, presentó tonalidades verdosas, ésta misma fue plaqueada y el consorcio resultante fue conservado nuevamente en glicerol a -70°C. Una vez que se generaron los tres diferentes consorcios, se prosiguió con las pruebas de antagonismo en el jamón.

Las Pruebas de antagonismo consistieron en inocular el jamón rebanado con los microorganismos deterioradores aislados .

Por otro lado se inocularon las rebanadas de jamón con el formulado de los consorcios bacterianos seleccionados C262 y C14 y se dejó absorber el material y después se inoculó el consorcio deteriorador y se dejó en temperatura de refrigeración y de 30°C. Para valorar la protección del lactobacilo en el deterioro.

La prueba demostró una protección en las rebanadas de jamón de la manifestación del "slime" o película blanca en la superficie o de las manchas verdes en superficie o de la degradación del tejido debido al antagonismo creado por el formulado de los consorcios C262 y C14 previamente inoculados . Aplicación del formulado del Consorcio Bacteriano M17.

Las aves de corral muertas son desangradas, desplumadas y evisceradas y sanitizadas con agua y una solución de cloro primeramente .

Una vez que esto ocurre se adicionan el consorcio formulado en una solución de un medio con un ácido orgánico, preferentemente ácido acético al 1% como parte de la formulación y para llevar esto a cabo se cultiva de la siguiente manera:

El consorcio M17 es sembrado en un caldo MRS; una asada en 10 mi y se incuba 48 hrs, posteriormente este volumen se siembra en 100 mi durante 24 hrs a 30°C y finalmente este volumen se siembra en un matraz con 500ml durante 48hrs. Una vez que se tiene el inoculo este se utiliza completo es decir, las células crecidas más el medio de cultivo y se adiciona el 1% de ácido acético.

Las piezas de pollo sin piel se colocan en una charola y toda la solución anterior se adiciona directamente en el pollo a modo de marinado, de 15 a 20ml de solución por pieza de pollo (lOOg) .

Una vez que se tengan en inmersión las piezas en la charola esta es cubierta por un plástico adherente (sin vacio) y se coloca en refrigeración para su venta en un supermercado. La inoculación del formulado del consorcio M17 incrementa la vida de anaquel del pollo fresco en un 40% a partir de que se encuentra empacado en la charola. Esto implica que si su vida de anaquel en refrigeración a 4°C es de 7 días máximo considerando que el 7o día ya se presentan olores a putrefacción, con el tratamiento de los lactobacilos su vida útil llega en las mismas condiciones al menos a 11 días.

Aplicación del Formulado de los Consorcios Bacterianos C35 y M17:

La carne de cerdo (2kg) es trozada y molida en un digestor hasta obtener una pasta. La pasta es mezclada con una solución al 0.08% nitratos, 1.5g de azúcar, 20g de sales curadas, 5g de polifosfatos, 15g de condimento para salchicha, 0.4g de colorante rosa, 0.25g de nuez moscada y 0.25g de pimienta y hielo.

Una vez que se mezcla con todos estos ingredientes, se vuelve a moler y la pasta es colocada en una embutidora en donde posteriormente es colocada en una tripa de celulosa la cual se ajusta al tamaño del que se desee la salchicha. Cuando toda la carne ha sido embutida se somete a cocción durante 30 min a 65°C, inmediatamente después se le da un choque térmico en agua a 4°C.

Las salchichas son entonces peladas de la tripa de celulosa para ser tratadas con el formulado de los consorcios bacterianos C35 y MI l _r los cuales se preparan de la siguiente manera:

Los consorcios C35 y MI Ί _r son sembrados en un caldo Melaza; una asada en 10 mi y se incuba 48 hrs, posteriormente este volumen se siembra en 100 mi 24 hrs a 30°C y finalmente este volumen se siembra en un matraz con 500 mi durante 48hrs. Una vez que se tiene el inoculo este se utiliza completo es decir, las células crecidas más el medio de cultivo.

Las salchichas se colocan en una marmita que contiene el caldo de cultivo donde quedarán en una inmersión que cubra toda su superficie, el medio de cultivo les dará un toque de ahumado en la coloración inicial sirviendo de indicador para determinar que toda la superficie de la salchicha ha sido cubierta por el cultivo.

Una vez que se lleva a cabo la inmersión estas son empacadas al vacio y almacenadas a 4°C.

El producto incrementa su vida de anaquel en un 30%, es decir, si las salchichas normalmente duran 4 semanas en su empaque sellado con el tratamiento incrementan a 6 semanas en refrigeración y el empaque sellado.

Aplicación del Formulado de los Consorcios Bacterianos C262 y CIA.

La carne de cerdo es únicamente cortada en trozos y se le adiciona condimento para jamón, solución al 0.08% nitratos, 1.5g de azúcar, 20g de sales curadas, 5g de polifosfatos, 0.25g de nuez moscada y 0.25g de pimienta

La carne con esta mezcla es masajeada durante 3 a 4 horas hasta lograr que se reblandezca el tejido y por lo tanto una incorporación de los ingredientes al interior de la carne .

Posteriormente esta mezcla es colocada en moldes de acero inoxidable de 50 x 35cm los cuales se cierran y se meten a hornear a 100°C por 2 horas para que se lleve a cabo la cocción .

Una vez que los moldes salen del horneado deberán dejarse enfriar 12 horas aproximadamente.

Una vez frío el material este es rebanado en rebanadas iguales y cada rebanada es espreada con una solución de los consorcios bacterianos C262 y C14, complementando con M17 cual es cultivado de la siguiente manera:

Los consorcios bacterianos C262, C14 y M17, son sembradas en un caldo MRS; una asada en 10ml y se incuba 48hrs, posteriormente este volumen se siembra en 100ml 24 hrs a 30°C y finalmente este volumen se siembra en un matraz con 500ml durante 48hrs en el cual se tienen aproximadamente una cantidad de células viables de 2x10 ⁸ UFC/ml

Esta solución se sprea en las rebanadas de amón empleando un volumen de aproximadamente 5ml por rebanada.

Posteriormente esto es empacado y sellado al vacio y almacenado a 4°C.

La vida de anaquel del producto se incrementa en un 25% si el producto tiene una vida útil de 6 semanas se ve incrementada hasta por 8 semanas.