La présente invention concerne le domaine des bio-procédés pour produire des molécules d'intérêt. Plus particulièrement, elle concerne une souche de levure modifiée, ainsi qu'un procédé utilisant cette souche, pour la production d'acétaldéhyde.

L'acétaldéhyde est une molécule très réactive. Pour cela, il est utilisé dans l'industrie chimique comme produit intermédiaire, en synthèse organique, pour la production d'acides acétique et peracétique, d'acétate d'éthyle, de pentaérythritol, de pyridine et de glyoxal. L'acétaldéhyde est utilisé dans la fabrication de colorants et dans la synthèse du caoutchouc. Cette molécule est également utilisée dans l'industrie alimentaire comme arôme artificiel, notamment pour le chocolat, les glaces, les desserts à base de gélatine, les pâtisseries et le chewing-gum. La consommation mondiale annuelle d'acétaldéhyde s'élevait à 1 233 103 tonnes en 2009. La majeure partie de cette consommation était liée à la production d'acide acétique (33%), d'acétate d'esters (21 %) et de pyridine (17%).

Aujourd'hui, l'acétaldéhyde est majoritairement issu de trois procédés industriels : l'oxydation de l'éthylène, l'hydratation de l'acétylène et l'oxydation de l'éthanol.

Plusieurs bioprocédés de production d'acétaldéhyde ont également été développés. Certains permettent la conversion de l'éthanol en acétaldéhyde par l'utilisation d'enzymes alcool oxydase ou alcool déshydrogénase, produites par des levures (Armstrong, Martin, & Yamazaki, 1984 ; Shachar-Nishri & Freeman, 1993 ; Murray, Duff, & Lanthier, 1989). D'autres procédés permettent la conversion du glucose en acétaldéhyde par l'action de cellules entières. Ces procédés sont généralement multi-étapes et basés sur l'utilisation de levures ou bactéries entières obtenues après une phase de culture, de synthèse enzymatique et de concentration (Wecker & Zall, 1987 ; US2009/0246841 A1 ; Zhu, Gonzalez, & Bobik, 201 1 ; Bongers, Hoefnagel, & Kleerebezeml , 2005). Les principaux bioprocédés utilisés sont décrits ci-après.

Procédé de production d'acétaldéhyde par oxydation biologique de l'éthanol

Il s'agit d'un bioprocédé de conversion de l'éthanol en acétaldéhyde par l'action d'une levure Candida utilis. Dans un premier temps, une souche est sélectionnée pour son potentiel à produire une enzyme, l'alcool oxydase. Une culture de ces levures est ensuite menée en milieu minimum contenant 10 g/L d'éthanol. Suite à cette pré-culture, les cellules sont récoltées et transférées dans un milieu contenant de l'éthanol à une concentration de 45 g/L. Il a été démontré qu'une telle concentration en éthanol permet de contraindre le métabolisme de la levure à former de l'acétaldéhyde plutôt que de l'acide acétique ou de l'acétate d'éthyle. Dans ces conditions, 4,3 g/L d'acétaldéhyde sont formés pour 6 g/L d'éthanol consommés. Ainsi, le taux de conversion est de 13%, la sélectivité de 71 % et le rendement de 9,5%. Afin d'améliorer ce procédé, Armstrong et al. ont proposé d'augmenter la concentration initiale d'éthanol dans le milieu à 65 g/L et de maintenir cette concentration tout au long du processus de conversion biologique. Avec ce procédé alimenté en continu, les auteurs estiment pouvoir augmenter la sélectivité au-delà de 80% (Armstrong, Martin, & Yamazaki, 1984 ; US4720457 A, 1988). Evidemment, la performance de ce procédé dépend alors de la capacité des levures à entretenir cette conversion biologique pendant une durée importante.

Dans cette logique, Shachar-Nishri et Freeman (Shachar-Nishri & Freeman, 1993) ont cherché à déterminer les conditions optimales pour le maintien de la conversion de l'éthanol en acétaldéhyde par des levures au cours du temps. Ainsi, ils ont comparé la stabilité du procédé de conversion de l'éthanol en acétaldéhyde pour deux espèces de levures, Candida utilis et Candida boidinii. Ces auteurs ont démontré que la voie métabolique reposant sur l'utilisation de l'alcool déshydrogénase de C. utilis est plus performante que celle de l'alcool oxydase de C. boidinii. D'autre part, ils ont mis au point un procédé basé sur l'immobilisation des cellules dans des billes d'alginate. Ces billes, placées dans un tampon Tris-HCI contenant de l'éthanol à 60 g/L, ont été capables de maintenir l'activité de conversion de l'éthanol en acétaldéhyde pendant 5 jours.

Un autre procédé d'oxydation biologique de l'éthanol a également été mis au point par Murray et al. (Murray, Duff, & Lanthier, 1989). Ici, la production d'acétaldéhyde est assurée par une levure méthylotrophe, Pichia pastoris, à partir d'éthanol. La première étape consiste en l'activation de la biosynthèse d'alcool oxydase par Pichia pastoris par une étape de culture en présence de méthanol, suivie du transfert des levures dans un milieu concentré en éthanol. Il s'opère alors une conversion de l'éthanol en acétaldéhyde par l'action de l'alcool oxydase. Cette étape est effectuée en présence de Tris-HCI comme agent de piégeage de l'acétaldéhyde. Dans ces conditions, les auteurs ont observé la conversion de 30,2 g d'éthanol en 28 g d'acétaldéhyde en 12 heures.

Les procédés de conversion biologique de l'éthanol en acétaldéhyde sont donc intéressants du point de vue de leur rendement. En revanche, ils nécessitent une première étape de culture afin de permettre à la cellule de mettre en place son arsenal enzymatique. De plus, ces procédés doivent se dérouler en continu, en maintenant une concentration suffisante en éthanol dans le milieu de culture. Enfin, dans les procédés décrits, l'acétaldéhyde est piégé dans le milieu réactionnel à l'aide de Tris-HCI et doit donc être libéré et extrait lors d'une étape supplémentaire.

Procédé de production d'acétaldéhyde à partir de pyruvate biosourcé La méthode décrite par Jamieson et al. comprend une étape de culture d'un microorganisme photosynthétique modifié génétiquement capable de produire une grande quantité de pyruvate à partir d'une source de carbone (US2009/0246841 A1 ). Les conditions décrites permettent l'excrétion et l'accumulation extracellulaire du pyruvate. Ensuite, un agent enzymatique ou chimique (pyruvate décarboxylase ou thiamine) est utilisé pour la conversion du pyruvate et l'obtention d'acétaldéhyde en forte concentration dans le milieu. Enfin, l'acétaldéhyde est extrait du milieu par distillation. L'inconvénient majeur de ce procédé de production réside dans le fait que celui-ci doit impérativement se dérouler en plusieurs étapes : une première étape de production de pyruvate, puis une extraction du pyruvate, suivie d'une conversion du pyruvate en acétaldéhyde et enfin une extraction de l'acétaldéhyde.

Procédé de production d'acétaldéhyde à partir de glucose par Zymomonas mobilis

Ce procédé, développé par Zall et al., s'appuie sur une première étape de sélection de mutants de Zymomonas mobilis ayant une faible activité alcool déshydrogénase (Wecker & Zall, 1987 ; US4900670 A), puis une étape de sélection de souches résistantes à de fortes concentrations d'acétaldéhyde. Enfin, le procédé de production d'acétaldéhyde en tant que tel consiste en une culture en batch avec aération. Le milieu utilisé contient 4% de glucose. L'acétaldéhyde est extrait du milieu de culture par évaporation et entraînement par aération. Dans ces conditions, jusqu'à 4,08 g/L d'acétaldéhyde sont produits pour 40 g/L de glucose dans le milieu de culture, soit environ 10% de rendement. La sélectivité du procédé est de 20% et la conversion de 50%. Cette conversion reste faible malgré l'utilisation d'un procédé d'extraction de l'acétaldéhyde en continu, basé sur sa distillation et son entraînement par un flux d'air. En effet, le microorganisme dont l'activité alcool déshydrogénase est réduite montre des difficultés à se développer en conditions fermentaires.

Le point faible de ce procédé est lié au microorganisme utilisé. En effet, les mutations apportées à la souche de Z. mobilis ont été obtenues par mutagenèse aléatoire. Ainsi, rien n'assure que ces mutations seront maintenues au cours des générations. Cela peut être problématique pour une utilisation industrielle.

Coproduction d'acétaldéhyde et d'hydrogène par fermentation du glucose par E. coli

Ce procédé de production est basé sur l'utilisation d'une souche d'E. coli modifiée génétiquement. Cette souche surexprime une acétaldéhyde déshydrogénase/acétyl coenzyme A réductase (gène eutE) issue du génome de Salmonella enterica. Cette enzyme permet la conversion de l'acétyl coenzyme A, produit naturellement par le métabolisme respiratoire de la bactérie, en acétaldéhyde. La souche utilisée pour surexprimer ce gène est mutée pour la voie de fermentation du glucose (AadhE, AackA-pta, AldhA, et AfrdC). Dans les conditions optimales, cette souche convertit le glucose en acétaldéhyde, dioxide de carbone et dihydrogène avec un ratio de 1 :1 et une production spécifique d'acétaldéhyde de 0,68 g/h/g de cellules, avec un taux de conversion de 86% par rapport au taux maximum théorique (Zhu, Gonzalez, & Bobik, 201 1 ).

Procédé de production par Lactococcus lactis à partir de glucose, cellule entière

Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une souche de bactérie Lactococcus lactis modifiée génétiquement de manière à surproduire l'enzyme NADH oxydase et pyruvate décarboxylase. Ce procédé nécessite une première étape de pré-culture des cellules dans des conditions permettant la surexpression de ces enzymes. Le milieu utilisé contient du glucose et de la nisine pour l'induction des gènes. Les auteurs optent pour l'induction des gènes afin d'éviter l'effet toxique de l'acétaldéhyde lors de la phase de pré-culture et de concentration des cellules. Ensuite, les cellules sont récoltées et lavées dans du tampon phosphate, puis suspendues dans ce même tampon contenant du glucose à 9 g/L. Les cellules sont concentrées dans ce milieu réactionnel de manière à obtenir une densité optique de 10 à 600 nm (soit concentrée environ 20 fois par rapport à la pré-culture). Ensuite la phase de conversion du glucose est réalisée (Bongers, Hoefnagel, & Kleerebezeml , 2005). Les résultats indiquent que 0,4 g d'acétaldéhyde sont produits pour 1 ,8 g de glucose consommés. Le rendement de production d'acétaldéhyde n'est pas communiqué. Ce procédé nécessite une étape de pré-culture afin d'obtenir une grande quantité de cellules pour la phase de conversion. Cette première étape du procédé consomme du glucose et ne permet pas la production d'acétaldéhyde, elle se fait donc à perte.

Dans ce contexte, et afin de proposer une alternative efficace aux procédés pétrochimiques classiques, les inventeurs ont développé un procédé de bioproduction d'acétaldéhyde à partir de matières premières renouvelables, qui peut être mis en œuvre de façon monotope (ou one-pot). Ce procédé, décrit ci-dessous en détail, permet la production d'acétaldéhyde par la levure S. cerevisiae à partir de dérivés d'agro ressources.

L'invention repose sur l'utilisation d'une souche de S. cerevisiae présentant la double particularité suivante : (i) un gène endogène codant pour une alcool deshydrogénase catalysant la réduction d'acétaldéhyde en éthanol est inactivé, de manière à supprimer une partie de l'activité de conversion de l'acétaldéhyde en éthanol (délétion du gène ΑΩΗλ ), et (ii) la souche exprime une NADH oxydase exogène (par exemple, le gène Nox2 de L. plantarum NN1 1 ), ce qui permet la réoxydation du cofacteur NADH en NAD.

Cette souche, mise en culture dans des conditions physicochimiques adaptées, permet une production d'acétaldéhyde en une étape unique et avec un bon rendement. Ainsi qu'il apparaît dans l'exemple 5 ci-dessous, les inventeurs ont observé une synergie entre les deux modifications génétiques apportées à la levure S. cerevisiae, puisque l'augmentation de la part d'acétaldéhyde dans le bilan massique d'une fermentation utilisant la souche doublement modifiée est supérieure à la somme des augmentations mesurées avec des souches présentant une seule des modifications. Cette synergie n'était pas attendue.

Les inventeurs ont également mis au point un procédé dans lequel la souche modifiée décrite ci-dessus est cultivée, en présence d'oxygène, dans un fermenteur muni d'un système permettant l'extraction de l'acétaldéhyde du milieu de culture à mesure qu'il est produit.

Plusieurs milieux ont été employés et comparés (SD glucose, SD dextrose, SD saccharose, mélasse diluée dans de l'eau, chacun avec une concentration initiale en sucres de 5%). Les bilans massiques obtenus à l'issue des fermentations réalisées à partir de ces quatre milieux, présentés dans la Figure 6, sont assez similaires. La production d'éthanol varie entre 16,3 et 19,9%. Celle-ci est largement réduite par rapport à la production d'éthanol observée lors de fermentation œnologiques classiques (45%) (Scriban R. Biotechnologie, 1999). En revanche, la part de glycérol varie entre 24,4% et 34,6% selon les milieux utilisés. Lors de fermentation œnologiques classique, cette part est de l'ordre de 5% à 10%. Enfin, la quantité d'acétaldéhyde représente entre 16% et 18% du bilan massique, selon le milieu étudié, soit 16 g à 18 g d'acétaldéhyde produits pour 100 g de glucose consommés. Cette valeur est de l'ordre de 0,1 g lors de fermentations alcooliques classiques.

Les modifications génétiques de la souche utilisée, ainsi que le procédé de mise en œuvre, permettent donc de réorienter une partie du métabolisme fermentaire vers la production d'acétaldéhyde en abaissant la part d'éthanol et en augmentant la part de glycérol dans le bilan massique, pour les quatre milieux étudiés.

La comparaison des performances du procédé en fonction du milieu employé révèle de fortes différences en termes de conversion (Tableau 1 ). En revanche, pour ces quatre milieux de culture, la sélectivité est du même ordre de grandeur. Les rendements observés pour la production d'acétaldéhyde à partir des milieux glucose, dextrose et mélasse sont meilleurs (29%-31 %) que le rendement obtenu en milieu à base de saccharose (15%). Lors d'une fermentation œnologique classique (concentration initiale en sucres de 200 g/L environ), le rendement de production d'acétaldéhyde est de l'ordre de 0,05% (soit environ une concentration finale de 0,1 g/L d'acétaldéhyde dans le milieu de culture en fin de fermentation). Le procédé de culture et extraction mis au point, ainsi que les modifications génétiques apportées à S. cerevisiae ont donc permis de multiplier le rendement de production d'acétaldéhyde, à partir de différents milieux, par 600.

Tableau 1 : Comparaison des performances obtenues avec la souche S. cerevisiae BY4742 ; MA Ta, ft/s3A1 , leu2 0, lys2 0, ura3 0 ; YOL086c::KanMX4, transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2, cultivée en conditions de fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde

SD SD SD Mélasse glucose Saccharose Dextrose

Lonversion OJ 70 Q oOyO //o„ O QJCO//O,

Sélectivité 37% 36% 33% 35%

Rendement 31% 15% 29% 30% La présente invention porte donc, en premier lieu, sur une souche de levure génétiquement modifiée, par exemple une souche du genre Saccharomyces génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression codant pour une NAD(P)H oxydase exogène, et en ce qu'un gène endogène codant pour une alcool deshydrogénase catalysant la réduction d'acétaldéhyde en éthanol est inactivé.

Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, illustrée dans les exemples, la souche de levure est une souche de Saccharomyces cerevisiae dont le gène AD \ est inactivé. Cette inactivation peut être le résultat d'une manipulation génétique, comme cela est le cas pour la souche utilisée dans la partie expérimentale ci-dessous, mais l'utilisation d'un mutant naturel peut également être envisagée.

Par "NAD(P)H oxydase", on entend ici une enzyme ou un complexe enzymatique catalysant la réaction d'oxydation du NADPH pour produite du NADP, et/ou du NADH pour produire du NAD. Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, également illustrée dans la partie expérimentale ci- dessous, la NAD(P)H oxydase exogène exprimée dans la souche de levure est l'enzyme Nox2 de Lactobacillus plantarum. Bien entendu, l'homme du métier est libre d'utiliser toute autre NAD(P)H oxydase telle que, par exemple, l'enzyme NoxE de Lactococcus lactis utilisée par Heux et al. (Heux et al., 2006).

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche de levure est une souche de Saccharomyces cerevisiae dont le gène AD \ est inactivé et qui exprime le gène Nox2 ûe Lactobacillus plantarum. A cet égard, la souche CNCM 1-51 15, déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes le 12.07.2016, fait partie intégrante de la présente invention.

La présente invention porte également sur un procédé de production d'acétaldéhyde, comportant la mise en culture d'une souche telle que décrite ci- dessus, dans un milieu comprenant entre 1 et 25% de sucres, en présence d'oxygène.

Selon une mise en œuvre préférée du procédé selon la présente invention, l'acétaldéhyde produit est extrait du milieu de culture par bullage d'air. Les inventeurs ont en effet observé (exemple 2 ci-dessous) qu'une concentration élevée en acétaldéhyde dans le milieu de culture conduit à un ralentissement, puis à un arrêt du métabolisme fermentaire.

Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, l'acétaldéhyde produit est extrait en continu, par exemple par bullage continu d'air dans le milieu de culture. L'acétaldéhyde peut ensuite être piégé par mise en contact de l'air chargé en acétaldéhyde avec une solution de trishydroxyméthylaminométhane ayant un pH compris entre 7 et 9, de préférence entre 7,5 et 8,5, par exemple du Tris-HCI à pH 8.

Un avantage du procédé selon l'invention est qu'il peut être mis en œuvre en "one-pof, autrement dit de façon monotope, c'est-à-dire sans nécessiter différentes étapes de changement du milieu dans lequel les levures sont cultivées, contrairement aux procédés de l'art antérieur. Ceci constitue une simplification appréciable en termes de coûts et de robustesse du procédé. Le cas échéant, un apport complémentaire de sucre et/ou d'azote peut être prévu en cours de fermentation.

Les inventeurs ont mis en évidence (exemple 3) que l'ajout d'acide acétique, à une concentration de 2,5 g/L, dans le milieu de culture SD de départ, permet d'éliminer la phase de latence (phase pendant laquelle, après ensemencement du milieu de culture par les levures, ces dernières n'effectuent pas - ou peu - la conversion du glucose en acétaldéhyde). Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, de l'acide acétique est donc ajouté au début de la culture, à une concentration comprise entre 1 et 4 g/L, de préférence entre 2 et 3 g/L, par exemple à 3,5 g/L.

Les inventeurs ont également mis en évidence qu'une concentration initiale autour de 5% en sucre(s) dans le milieu de culture permet d'obtenir de bons rendements de conversion en acétaldéhyde. Selon une mise en œuvre avantageuse du procédé de l'invention, la concentration en sucres dans le milieu de culture est donc comprise entre 1 et 15%, de préférence entre 3 et 10%. Par exemple, la concentration initiale en sucres peut être comprise entre 4 et 6%, de préférence autour de 5%. Le cas échéant, un apport complémentaire de sucre peut être prévu en cours de fermentation, pour maintenir cette concentration.

Parmi les sucres utilisables pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, on peut citer, de façon non limitative, le glucose, le saccharose, le galactose, le maltose, le mélibiose, le raffinose, le mélézitose et l'amidon. En particulier, les sucres présents dans le milieu de culture peuvent être sélectionnés parmi le dextrose, la mélasse (comprenant un mélange de saccharose, de glucose et de fructose), le saccharose, le glucose et le maltose. Les sucres peu coûteux, tels que le saccharose et la mélasse, qui en outre permettent d'obtenir de très bons rendements, seront de préférence utilisés.

Selon une mise en œuvre préférée du procédé selon l'invention, la culture est conduite sous agitation. Les inventeurs ont montré que la température (entre 18°C et 30 °C) n'a pas une grande influence sur le bilan de fermentation, en particulier sur le rendement de la production d'acétaldéhyde, mais qu'à une température de 30°C, la vitesse de conversion est supérieure à celle observée à 18°C. Aussi, selon une mise en œuvre particulière, la culture est conduite à une température comprise entre 18 et 35 °C, de préférence entre 25 et 30 °C.

Un autre aspect de la présente invention est un dispositif pour la mise en œuvre d'un procédé tel que décrit plus haut, caractérisé en ce qu'il comprend un fermenteur comprenant une souche selon l'invention, dans un milieu de culture approprié, des moyens permettant un bullage d'air dans le fermenteur et des moyens de piégeage de l'acétaldéhyde produit dans le fermenteur.

Selon un mode de réalisation particulier du dispositif ci-dessus, les moyens de piégeage de l'acétaldéhyde sont constitués par un ou plusieurs récipients contenant une solution de trishydroxyméthylaminométhane (Tris, par exemple Tris-HCI), à un pH compris entre 7 et 9, de préférence entre 7,5 et 8,5, par exemple à un pH de 8.

Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue. Figure 1 : Cinétique de consommation de glucose et accumulation d'acétaldéhyde observée chez la souche S. cerevisiae FL100 MATa, ura3A, ΐφλ -Α transformée ou non avec le plasmide pVTDH3-2-nox2 en condition de fermentation avec aération, o : concentration en acétaldéhyde dans le milieu de cutlure pour la culture réalisée avec la souche transformée avec pVTDH3-2- nox2; Δ: Concentration en acétaldéhyde dans le milieu de cutlure pour la culture réalisée avec la souche non transformée avec le pVTDH3-2-nox2; ·: Concentration en glucose dans le milieu de cutlure pour la culture réalisée avec la souche transformée avec le pVTDH3-2-nox2.

Figure 2 : Cinétique de consommation de glucose et accumulation d'acétaldéhyde observée chez la souche S. cerevisiae FL100 MATa, ura3A, ΐφλ -4 transformée par le pVTDH3-2-nox2 en condition de fermentation avec aération. Des purges ont été réalisées (flèches noires) afin d'observer le renouvellement de l'acétaldéhyde (· : concentration en acétaldéhyde ; ■ : concentration en glucose).

Figure 3 : Schéma du montage d'un fermenteur équipé avec un système de piégeage de l'acétaldéhyde (le flacon de gauche correspond au fermenteur et les trois flacons de droite correspondent au système de piégeage).

Figure 4 : Bilans de fermentation obtenus pour différentes souches de

S. cerevisiae mutées ou non pour le gène AD \ et transformées ou non avec le plasmide pVTDH3-2-nox2. Culture réalisée à 18°C dans un milieu SD 180 g/L de glucose.

Figure 5 : Consommation des sucres par la souche S. cerevisiae adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2 cultivée en milieu SD saccharose 5% (♦ : sucre total ; · : fructose ; A : glucose ;■ : saccharose).

Figure 6 : Bilans massiques de fermentation pour S. cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1, leu2A0, lys2A0, ura3A0 ; YOL086c::KanMX4, transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2, cultivée en condition de fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde. EXEMPLES

Les matériels et méthodes utilisés dans la partie expérimentale sont indiqués ci-dessous. Les matériels et méthodes non détaillés ici correspondent à des techniques standard de biologie moléculaire et de biologie cellulaire.

Souches de levure

La souche de Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1, leu2A0, lys2A0, ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 a été utilisée car elle présente une délétion du gène AD \ , et donc une activité de conversion de l'acétaldéhyde en éthanol réduite (accession number Y16236) (Winzeler et al., 1999).

L'autre souche de Saccharomyces cerevisiae utilisée est la souche standard FL100 MATa, ura3A, trp1-4.

Milieu de culture

Toutes les cultures et fermentations décrites ci-dessous ont été réalisées en milieu SD, dont la composition est la suivante :

YNB (yeast nitrogen base) sans acides aminés (Difco) 6,7 g/L

Glucose (Euromedex) 20 g/L

Pour la sélection et la culture de levures transformées, ce milieu a été complémenté en fonction des auxotrophies comme indiqué ci-dessous (la complémentation éventuelle n'est pas signalée dans le texte qui suit, l'homme du métier sachant pertinemment quand elle est nécessaire) :

L-tryptophane (Sigma Aldrich) 20 mg

Uracile (Sigma Aldrich) 20 mg

L-lysine (Sigma Aldrich) 30 mg

L-histidine (Sigma Aldrich) 20 mg

L-leucine (Sigma Aldrich) 60 mg

Quantification des produits de fermentation et réalisation de bilans massiques

Les bilans massiques ont été réalisés en fin de fermentation, c'est-à- dire après culture du microorganisme dans un milieu avec une concentration initiale en sucre, jusqu'à épuisement de ce sucre dans le milieu ou arrêt de sa consommation (parfois la totalité du sucre n'est pas consommée). Dans le cas d'un arrêt de fermentation prématuré (alors qu'il reste du sucre disponible) il est inutile d'ajouter du sucre dans le milieu car l'arrêt de fermentation n'est pas provoqué par la carence en sucre. Certains des essais décrits ci-dessous ont dû être écourtés alors que la fermentation n'était pas terminée. La durée de culture est donc indiquée pour chacun des essais décrits ci-dessous.

La détermination des quantités d'éthanol, d'acide acétique, de glycérol, et d'acétaldéhyde dans les milieux de culture est réalisée à partir du surnageant obtenu à partir des échantillons centrifugés 5 minutes à 5000 g et 4°C. Le dosage est réalisé par chromatographie en phase gazeuse (CPG).

La détermination des quantités de sucres présents dans le milieu de culture est également réalisée à partir de ces mêmes surnageants. Les dosages sont réalisés à l'aide de kit enzymatiques (D-glucose GOPOD Format ; Sucrose/D-glucose/D-fructose Megazyme).

Enfin, la détermination des quantités d'acétaldéhyde piégées dans les flacons de Tris-HCI (exemples 4 et suivants) est réalisée de la façon suivante. Après centrifugation des échantillons 5 minutes à 5000 g et 4°C, le surnageant est récupéré et son pH abaissé à 6 par ajout d'un volume d'une solution d'HCI à 1 ,75% (Murray, Duff, & Lanthier, 1989). L'échantillon ainsi traité est ensuite dosé par CPG.

Le dosage de l'acétaldéhyde, de l'éthanol, de l'acide acétique et du glycérol par CPG est réalisé dans les conditions suivantes. Un étalon interne d'hexane préparé extemporanément est ajouté à raison de 500 mg/mL dans chaque échantillon. Le solvant utilisé pour ces analyses est le dioxane.

La CPG utilisée est une Varian HP 6890 séries, la colonne capillaire est une DB-5 de 60m, 0,25 mm, 1 ,00 μιτι (J&W Scientifics). Le détecteur associé est un FID (Détecteur à ionisation de flamme).

Les conditions de l'analyse chromatographique sont détaillées dans le Tableau 2. Tableau 2 : Conditions chromatographiques utilisées pour le dosage de l'acétaldéhyde.

Paramètres Valeur

Température de l'iniecteur ! 250°C

Split ratio ! 50.1 : 1

Gaz vecteur ; Hydrogène

Volume d'injection ΙΠ Ε.ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΖ

Température du détecteur à ionisatioi î i 350°C

de flamme

Débit d'hydrogène pour flamme du 30 mL/min

détecteur

Débit d'air pour flamme du détecteur ! 300 mL/min

Température initiale 40°C pendant 5 minutes

Gradient de température j 10°C/min

Température finale 320°C pendant 4 minutes

Le logiciel utilisé pour l'acquisition des données et le traitement est Chemstation Rev. A.1 0.02 [1 757] (Agilent Technologies)

En ce qui concerne la quantification de la biomasse produite au cours des fermentations, celle-ci a été réalisée par mesure de la DO à 600nm dans les conditions suivantes. Un mL d'échantillon de culture est analysé au spectrophotomètre (Ultraspec 1 0, Amersham Biosciences) à une longueur d'onde de 600nm. 1 unité de DO600nm correspond environ à une concentration de 9.1 0 ⁶ cellules/mL et à environ 0,3 g/L de levures (matière sèche). L'échantillon peut être dilué si besoin au 1 /10ème ou au 1 /100ème.

Les résultats obtenus par dosage des sucres résiduels et des produits de fermentation permettent de dresser un bilan massique pour chaque essai de fermentation. La concentration en CO ₂ est déduite par calcul. Dans le cas des fermentations menées avec extraction de l'acétaldéhyde par bullage d'air, une partie de l'éthanol est entraînée par le flux d'air. Or, l'éthanol, contrairement à l'acétaldéhyde, n'est pas retenu par le système de piégeage au Tris-HCI. Ainsi, la quantité d'éthanol produite lors de ces fermentations doit être déduite par calcul.

En ce qui concerne le calcul de la quantité de CO ₂ produite, il a été considéré qu'une mole de CO ₂ est dégagée pour chaque mole d'éthanol, d'acide acétique et d'acétaldéhyde produite. En ce qui concerne la quantité d'éthanol, celle-ci est estimée de façon à ajuster le bilan massique à 100%. Cette méthode a été validée par des données de fermentation réalisée au préalable, sans flux d'air et sans système d'extraction. Dans ces conditions, les bilans réalisés montrent que l'addition des quantités d'éthanol, acétaldéhyde, acide acétique, glycérol et biomasse mesurées, ainsi que le C0 ₂ calculé, permettent bien de boucler un bilan massique à 100%.

Afin de comparer les performances de chaque essai de fermentation, en termes de production d'acétaldéhyde, les calculs de rendement, sélectivité et conversion sont réalisés de la manière suivante : masse de glucose consommée

Conversion = ; ; ; x 100

masse de glucose totale

Sélectivité

masse d' acétaldéhyde formée x 100

2 x masse de glucose consommée x (MM acétaldéhyde /MM glucose) masse d' acétaldéhyde formée x 100

Rendement

masse de glucose totale x (MM acétaldéhyde / MM glucose)

Exemple 1 : Construction d'un plasmide permettant l'expression d'un gène codant pour une NADH oxydase chez S. cerevisiae

Le plasmide PVTDH3-2-nox2 a été construit pour permettre l'expression du gène Nox2 chez S. cerevisiae cultivée en conditions fermentaires.

Construction du plasmide navette

Le plasmide pVTDH3-2 a été construit par les inventeurs à partir des plasmides pVT102-U (Vernet T., 1987) et p406TDH3 (Addgene ; #15977). La cassette d'expression du plasmide pVT102-U a été éliminée par génie génétique et remplacée par la cassette d'expression du plasmide p406TDH3, au niveau du site Sma\. Le plasmide obtenu est un plasmide navette réplicatif identique au pVT102-U mais permettant l'insertion de l'ORF d'un gène d'intérêt sous la dépendance du promoteur du gène TDH3 { TDH3p). Obtention du gène Nox2 de L. plantarum NN1 1

La souche L. plantarum NN1 1 a été cultivée en bouillon MRS. Après une nuit à 30 °C, la culture a été centrifugée et les cellules récoltées afin d'en extraire l'ADN génomique (ADNg). Une fois l'ADNg purifié obtenu, celui-ci a été utilisé comme matrice pour l'amplification du gène Nox2 par PCR, à l'aide d'amorces spécifiquement conçues. Le produit de l'amplification a ensuite été inséré entre les sites BamH\ et Hind\\\ de pVTDH3-2. Le plasmide pVTDH3-2- nox2 obtenu a été produit en grande quantité par le biais d'E. co// ^' et utilisé pour la transformation de différentes souches de S. cerevisiae réceptrices (transformation à l'acétate de lithium).

Exemple 2 : Fermentations avec S. cerevisiae FL100 transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2. Température de culture 18°C, concentration initiale en glucose 18%

Afin d'étudier l'effet de l'enzyme NADH-oxydase sur la production en acétaldéhyde, un essai en fermentation a été mené avec la souche S. cerevisiae FL100 MATa, ura3A, trp1-4 transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2 en conditions de fermentation avec aération.

La culture est réalisée dans un flacon en verre de 250 mL équipé d'un bouchon laveur contenant 200 mL de milieu SD à 18% de glucose et à une température de 18°C. Le milieu est aéré par un système de bullage d'air à un débit de 5 mL/minute. Le milieu de culture est constamment agité par l'action d'un barreau magnétique de 3x0,5 cm. L'échappement des gaz du flacon est assuré par la présence d'un tube en verre traversant le bouchon du flacon. Ce tube est bouché par un coton cardé stérile.

Le milieu de culture est ensemencé à l'aide d'une pré-culture d'une nuit, réalisée dans les mêmes conditions, à une concentration initiale de 5.10 ⁵ cellules/mL.

Suite à l'ensemencement du milieu, des prélèvements sont réalisés régulièrement afin de suivre la consommation de glucose, la production d'acétaldéhyde et la production de biomasse. La concentration en glucose dans le milieu est mesurée par kit enzymatique, la concentration en acétaldéhyde par CPG et la biomasse par mesure de la DO à 600nm.

Les données obtenues de production de biomasse, de consommation de glucose et d'accumulation d'acétaldéhyde sont présentées sur la Figure 1 .

Après 8 jours de culture, on observe, pour la levure transformée, qu'un maximum de 0,9 g/L d'acétaldéhyde est atteint dans le milieu contre seulement 30 mg pour la levure non transformée.

De plus, le suivi de la consommation de glucose pour la souche transformée indique un ralentissement (jour 6) puis un arrêt du métabolisme (jour 10).

D'après la littérature, cet arrêt est dû à la présence d'acétaldéhyde dans le milieu de culture. En effet, une étude réalisée par Heux et al. montre qu'une levure exprimant un gène codant pour une NADH oxydase produit davantage d'acétaldéhyde qu'une levure non modifiée. La production d'acétaldéhyde dans cette étude atteint une valeur maximale d'1 g/L. D'après les auteurs, cette concentration élevée en acétaldéhyde dans le milieu de culture entraine un arrêt du métabolisme fermentaire, lié à la toxicité de cette molécule (Heux, Sablayrolles, Cachon, & Dequin, 2006). Exemple 3 : Fermentations avec S. cerevisiae FL100 transformée avec PVTDH3-2-nox2. Réalisation de chasses successives de l'acétaldéhyde. Température de culture 30 °C, concentration initiale en glucose 18%

Afin de tester la capacité de la levure S. cerevisiae FL100 MATo, ura3A, trp1-4 surexprimant le gène Nox2 à renouveler l'acétaldéhyde, une culture a été réalisée dans les mêmes conditions que celles utilisées lors de l'exemple 2 (température de culture 18°C, agitation constante, aération débit 5 mL/min, concentration initiale en glucose 18%). Lorsque la concentration en acétaldéhyde dans le milieu de culture atteint une valeur maximale (soit environ 0,9 g/L), une chasse de l'acétaldéhyde est réalisée. Cette chasse permet de réduire la concentration en acétaldéhyde dans le milieu de culture à une valeur proche de 100mg/L. Celle-ci est réalisée en séparant la biomasse du milieu de culture par centrifugation, puis en appliquant un fort bullage d'air stérile (150 mL/min) au travers du milieu de culture pendant 1 heure à 30°C. Pendant ce temps, la biomasse est conservée à 18°C. Une fois la chasse terminée, la biomasse est remise en suspension dans le milieu de culture dont la température a été ramenée à 18°C. Les résultats obtenus pour un essai de fermentation sont présentés dans la Figure 2.

Lors des 6 premiers jours de fermentation, l'acétaldéhyde s'accumule jusqu'à une concentration de 0,8 g/L. La consommation de glucose au cours de la fermentation est légèrement plus rapide par rapport aux résultats obtenus précédemment puisqu'une consommation de 70 g/L en 6 jours de fermentation était observée (Figure 1 ) contre 1 10 g/L dans le cas présent. Cette différence peut éventuellement s'expliquer en partie par la différence de quantité d'inoculum qui était dans le cas précèdent de 6.10 ⁵ cellules/mL et dans le cas présent de 2.10 ⁶ cellules/mL, ainsi que par la différence de taux de croissance, deux fois plus élevée dans le cas présent.

Une fois cette valeur maximale de 0,8 g/L atteinte, une première chasse de l'acétaldéhyde a été réalisée par un flux d'air (150 mL/min pendant 1 heure). Cette purge a permis d'abaisser la concentration d'acétaldéhyde de 0,8 à 0,1 g/L.

Suite à cette première purge, entre les jours 7 et 7,5, les résultats indiquent que la levure produit à nouveau et accumule rapidement de l'acétaldéhyde. La concentration atteint alors une concentration 0,9 g/l en une demi-journée. Ces données montrent que le métabolisme fermentaire a un turnover optimal.

Afin de déterminer si ce phénomène pouvait être répété, des cycles de purges ont été reproduits avec le même débit d'air appliqué précédemment. Une accumulation rapide d'acétaldéhyde a été observée après chaque purge réalisée. Au 8ème jour, après la purge, la levure a une nouvelle fois produit de l'acétaldéhyde pour obtenir à 10 jours de fermentation une concentration de 1 ,1 g/L. Enfin, au 1 1 ème jour, une dernière purge, laissant 0,4 g/L d'acétaldéhyde dans le milieu, a conduit à la synthèse de novo d'un peu moins d'1 g/L au 13ème jour de culture. Finalement, après 14 jours de fermentation, le suivi de la consommation de glucose indique que la fermentation est interrompue. La levure devient inactive sur le plan métabolique et ne convertit plus le glucose en sous-produits de la fermentation. Au bilan, environ 140 g/L de glucose ont été utilisés pour la croissance (40 g/L) et la production d'énergie et sous-produits de la fermentation par levure (100 g/L).

Ces résultats indiquent que la levure S. cerevisiae FL100 MATo, ura3A, trp1-4 surexprimant le gène Nox2 a bien la capacité de renouveler l'acétaldéhyde après que la molécule ait été extraite du milieu de culture. Ces données confirment que l'accumulation de l'acétaldéhyde est bien responsable de l'arrêt prématuré de fermentation observé dans l'exemple précédent (exemple 2). De plus, les résultats obtenus indiquent que le bullage d'air permet bien d'extraire l'acétaldéhyde du milieu de culture et indirectement du cytoplasme de la cellule. Ce mécanisme n'était pas forcément évident. Aranda et al. 2004 (Aranda & Del Olmo, 2004) ont notamment établi que l'acétaldéhyde s'accumule dans le cytoplasme de la levure. En effet, cette molécule diffuse mal au travers de la membrane plasmique, comparée à l'éthanol, ce qui conduit à son accumulation dans la cellule, jusqu'à 10 fois plus que la concentration extracellulaire (Stanley & Pamment, 1993).

De plus, ces résultats montrent que l'arrêt du métabolisme induit par la toxicité de l'acétaldéhyde est réversible.

Enfin, il a été noté qu'après chaque purge, l'accumulation de l'acétaldéhyde n'est pas soumise à une phase de latence comme pour la première accumulation en acétaldéhyde (premier pic), où il faut attendre 7 jours. Lors des phases d'accumulation suivantes, seuls 1 à 3 jours sont nécessaires. Il semble donc que suite à cette phase de latence, liée entre autre à la production de biomasse pendant 3 jours, la levure soit dans de meilleures conditions pour effectuer la conversion du glucose en acétaldéhyde.

Afin de maximiser la production d'acétaldéhyde lors des premiers jours de fermentation, les inventeurs ont entrepris de déterminer les conditions permettant de réduire cette phase de latence, en utilisant des données issues d'expériences précédentes où les quantités d'autres sous-produits du métabolisme fermentaire avaient été mesurées, ainsi que les concentrations en métabolites au moment où l'acétaldéhyde commence à s'accumuler dans le milieu. De manière à déterminer l'éventuel impact de chacun de ces métabolites sur la phase de latence, des milieux SD différents, contenant un ou plusieurs de ces métabolites (glycérol, acide acétique, éthanol), ont été utilisés. Ainsi, les inventeurs ont constaté (données non présentées) que l'ajout d'acide acétique, à une concentration de 2,5 g/L, dans le milieu de culture SD de départ permet l'élimination de cette phase de latence. Le mécanisme responsable de ce phénomène n'a pas été élucidé.

En ce qui concerne la performance du procédé d'extraction de l'acétaldéhyde permettant la production à nouveau de la molécule par la levure, l'addition des quantités d'acétaldéhyde produites donne environ 3,7 g d'acétaldéhyde produit pour 140 g de glucose consommé (soit 2,4 g d'acétaldéhyde produit pour 100 g de glucose consommé). Ces résultats sont encourageants et permettent d'envisager un procédé de production d'acétaldéhyde basé sur l'extraction continue de cette molécule par entraînement par flux d'air.

Afin de mettre au point ce procédé, il est nécessaire de réaliser un essai de fermentation avec la même souche de levure utilisée auparavant et une extraction en continu de l'acétaldéhyde. Le but de cette expérience est d'optimiser la production d'acétaldéhyde en n'atteignant jamais la limite de toxicité de la molécule pour la levure. Un tel procédé peut également présenter l'avantage de limiter le temps de séjour de l'acétaldéhyde dans le milieu de culture, empêchant sa réduction en alcool, sa conversion en d'autres sous- produits ainsi que sa réactivité avec d'autres métabolites présents dans le milieu de culture. Exemple 4 : Fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde réalisé avec S. cerevisiae FL100 transformée avec pVTDH3- 2-/70x2. Température de culture 18°C, concentration initiale en glucose 18%

Afin d'optimiser la production d'acétaldéhyde observée lors des cultures réalisées avec chasses (résultats présentés dans l'exemple 3), un système de culture permettant l'extraction continue de l'acétaldéhyde, son piégeage et sa quantification a été mis au point.

Dans cette configuration, les conditions de culture sont identiques à celles décrites dans l'exemple 3, à ceci près que le débit d'air est maintenu à 150 mL/min tout au long de la fermentation et que le flux d'air sortant du fermenteur est dirigé vers un système de piégeage de l'acétaldéhyde (Figure 3). La fermentation est menée dans un flacon de 500 mL équipé d'un bouchon ouvert fileté GL45, contenant 200 mL de milieu de culture. Un flux d'air sec déshuilé et stérile est injecté dans le fermenteur par l'intermédiaire d'un fritté de porosité 1 . Le débit de gaz est de 150 mL par minute, le milieu est soumis à une agitation constante (200 rpm) par un barreau magnétique (3 x 0,5 cm).

Le flux d'air sortant du fermenteur est dirigé vers un système de piégeage de l'acétaldéhyde. Ce système est constitué de trois flacons laveurs successifs (même montage que le fermenteur) reliés entre eux par de courts tuyaux flexibles en silicone. Ces flacons contiennent 200 mL de solution de Tris-HCI 0,5M, pH8. Une solution de Tris-HCI à pH8 a la capacité de piéger l'acétaldéhyde de manière stœchiométrique (Brevet US4,481 ,292).

Les résultats obtenus avec cette configuration sont présentés dans le

Tableau 3 sous la forme d'un bilan massique. Tableau 3 : Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae FL100 MATa, ura3A, trp1-4 transformée ou non avec pVTDH3-2-nox2. Culture réalisée à 18°C dans un milieu SD à 180 g/L de glucose, pendant 6 jours

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

* ^* déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

Le Tableau 3 montre que le produit majoritaire de fermentation, en dehors du C0 ₂ , pour la levure S. cerevisiae FL100 transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2, est l'éthanol avec 33,3 g produits pour 100 g de glucose consommés, suivi de l'acide acétique et de l'acétaldéhyde avec respectivement 8,3 g et 7 g. Le glycérol est produit à hauteur de 6,4 g pour 100 g de glucose consommé ; quant à la biomasse, elle représente 1 ,12 g des 100 g de glucose consommé.

A titre de comparaison, lors d'une fermentation alcoolique classique menée par S. cerevisiae en conditions œnologiques, ces valeurs sont de 4,2 g pour le glycérol, 46,2 g pour le C0 ₂ , 46,5 g pour l'éthanol et 0,4 g pour l'acétaldéhyde (Heux, Sablayrolles, Cachon, & Dequin, 2006).

En ce qui concerne les quantités de sous-produits obtenus avec la souche réceptrice non transformée et cultivée dans les mêmes conditions, seule la part en acide acétique et acétaldéhyde est diminuée, mais elle produit plus d'éthanol. Cela indique que la surexpression de Nox2 dans ces conditions permet, comme précédemment, de réduire la conversion de l'acétaldéhyde en éthanol. Pour cette souche témoin, la production d'acétaldéhyde est de 3,4 g pour 100 g de glucose. Exemple 5 : Apport des différentes modifications génétiques en termes de production d'acétaldéhyde

Des essais de fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde ont été réalisés à l'aide de différentes souches de levures S. cerevisiae, mutées ou non pour le gène AD \ et transformées ou non avec le plasmide pVTDH3- 2-nox2. Ces essais ont été menés à 18°C dans un milieu SD avec une concentration initiale en glucose de 18%. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 4.

Ces résultats indiquent que la transformation de S. cerevisiae avec le plasmide pVTDH3-2-nox2 permet d'augmenter la part d'acétaldéhyde dans le bilan massique de 3,6 points par rapport à la souche de S. cerevisiae non transformée. D'autre part, ces résultats indiquent que la mutation du gène AD \ permet d'augmenter la part d'acétaldéhyde dans le bilan massique de 9,6 points par rapport à la souche non mutée. Ainsi, on pourrait s'attendre à ce que l'effet combiné de ces deux mutations conduise à une augmentation de 13,2 points (3,6%+9,6%) pour la part d'acétaldéhyde par rapport à la souche non modifiée. Cependant, les résultats obtenus indiquent que la mutation du gène AD \ combinée à la transformation avec le PVTDH3-2-nox2 permet d'augmenter la part d'acétaldéhyde dans le bilan de massique de 16,4 points, soit 3,2 points de plus que ce qui était attendu.

Exemple 6 : Fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde, réalisée avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. leu2A0. lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Température de culture 18°C, concentration initiale en glucose 18%

Afin d'optimiser la production d'acétaldéhyde, une souche de S. cerevisiae mutée pour le gène AD \ a été utilisée pour réduire la conversion de l'acétaldéhyde en éthanol. Ainsi, la souche S. cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A 1, ieu2A0, iys2A0, ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 (appelée également BY4742 adh1Â::KanMX4) a été transformée avec le plasmide PVTDH3-2-nox2 et cultivée en fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde. La température de culture est de 18°C et la concentration initiale en glucose de 18%.

Tableau 4 : Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae FL100 MATa, ura3A, trp1-4 et S. cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1, leu2A0, lys2A0, ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Culture réalisée à 18°C dans un milieu SD à 180 g/L de glucose, pendant 6 jours

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

^** déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

On note (Tableau 4) que la conversion du glucose en acétaldéhyde est meilleure pour la souche S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 surexprimant Nox2 que pour la souche S. cerevisiae FL100 non transformée, puisque 19,8 g d'acétaldéhyde ont été produits pour 100 g de glucose consommé, contre 3,4 g/100 g.

Pour cette souche, la sélectivité de conversion du glucose en acétaldéhyde est de 42,9 % par rapport au rendement théorique maximal tenant compte du rendement de Pasteur. En revanche, la part de glycérol dans le bilan est plus importante pour la fermentation menée avec la souche S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 surexprimant Nox2, avec 37 g de glycérol pour 100 g de glucose consommée contre 6,7 g/100 g avec la souche S. cerevisiae FL100. Ainsi, ces modifications génétiques apportées à la levure S. cerevisiae, à savoir la délétion du gène ADH1 et la surexpression du gène Nox2, ont bouleversé le bilan de fermentation. Le produit majoritaire de la fermentation de la souche modifiée est le glycérol, suivi de l'acétaldéhyde et de l'éthanol.

Ces modifications génétiques ont permis de multiplier par 5,9 la valeur de la sélectivité pour l'acétaldéhyde (42,9% pour la souche modifiée contre 7,3% pour le témoin) par rapport à la souche S. cerevisiae non modifiée.

Cependant, si la sélectivité est proche de 40% pour l'acétaldéhyde, le rendement de conversion du glucose en acétaldéhyde est ici seulement de 15% car seul 34% du glucose présent dans le milieu a été consommé.

Exemple 7 : Fermentations avec extraction continue de l'acétaldéhyde réalisées avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. leu2A0. lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-no 2. Température de culture ^" \8°C ou 30 °C, concentration initiale en glucose 10%

L'effet de la température a été étudié lors de fermentations menées avec la souche S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Les cultures ont été menées dans un milieu SD dont la concentration en glucose a été fixée à 100 g/L. Les températures testées ont été fixées à 18°C et 30 °C. Des bilans massiques ont été réalisés aux termes des fermentations. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 5 et les vitesses de conversion dans le Tableau 6.

Tableau 5 : Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae BY4742 adftiA::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-no 2 à 18^ et 30^ dans un milieu SD à 100 g/L de glucose

Ethanol* 10

C0 ₂ ** 29,6

Glycéroi 37,2

Acide 0

acétique

Acétaldéhyde 19,9

Biomasse 0,8

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

* ^* déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

La comparaison des deux conditions de culture ne révèle pas de différences importantes en termes de profil de bilan de fermentation. En effet, la production d'acétaldéhyde à 18°C s'élève à 20 g/L, tandis qu'à 30°C cette concentration est de 21 ,2 g/L, pour 100 g de glucose consommés. De même, les productions de glycérol, éthanol et acide acétique sont analogues entre les cultures réalisées à 18°C et 30 °C.

Tableau 6: Comparaison des vitesses de consommation de glucose et production d'acétaldéhyde en g/jours.L de milieu pour les fermentations menées à 18°C et 30°C

Vitesse de consommation de Vitesse de production glucose d'acétaldéhyde

(g/jours.L de milieu) (g/jours.L de milieu)

18°C 12,26 2,58

30°C 14,39

En revanche, on observe (Tableau 6) une différence en termes de vitesse de production puisque la conversion est 15% moins rapide à 18°C par rapport à la culture à 30 °C. Ces résultats sont cohérents puisque le métabolisme de la levure est plus rapide à 30°C qu'à 18°C du fait d'un meilleur fonctionnement des enzymes. La culture à 30°C présente donc l'avantage d'être légèrement plus rapide mais n'offre pas un rendement de conversion du glucose en acétaldéhyde significativement plus important. On peut donc présager, étant donné des arrêts de fermentations obtenus, que le rendement de conversion du glucose en acétaldéhyde est identique pour des températures de culture situées entre 18°C et 30 °C.

La température n'a donc pas d'impact réel sur la production en acétaldéhyde par la levure S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. En effet, en dehors de son influence sur la vitesse du métabolisme et des enzymes, l'action de la température est essentiellement liée à l'évaporation de l'acétaldéhyde du milieu de culture. Or dans cette étude, les cultures sont soumises à un intense bullage d'air qui permet l'extraction continue de l'acétaldéhyde du milieu de culture. Cet effet de la température est alors annulé par le mécanisme d'extraction.

Cependant, étant donné que la vitesse de conversion est légèrement meilleure à 30 °C, il est préférable de travailler dans ces conditions pour la production d'acétaldéhyde. Exemple 8 : Fermentations avec extraction continue de l'acétaldéhyde, réalisées avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. leu2A0. lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Température de culture 30 °C, concentration initiale en glucose 5% ou 10%

L'effet de la concentration en glucose a été étudié lors de fermentations menées avec la souche S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Les cultures ont été menées dans un milieu SD contenant 50 g/L ou 100 g/L de glucose et incubées à 30 °C. Les bilans de fermentations sont donnés dans le Tableau 7. Ils ont été obtenus après 6 jours de fermentation pour la culture dans le milieu comprenant initialement 100 g/L de glucose, et 4 jours pour la culture dans le milieu comprenant initialement 50 g/L de glucose. Aucun apport de sucre n'a été fait au cours de ces fermentations.

Tableau 7 : Bilan de fermentation obtenu pour des cultures de S. cerevisiae adh1 A::KanMX4 pVTDH3-2-nox2 dans un milieu SD à 50 g/L ou

100 g/L de glucose à 30 °C

Produits formés (en g pour 100 g de glucose consommés)

$. cerevisiae adh !A::KanMX4 cerevisiae surexorimant nox2- milieu SD adhJA::KanMX4

glucose 5% surexprimant nox2 - milieu

SD glucose 10%

Ethanol* 10,7 7,6

-fc -fc

Glycérol 34 38,9

Acétaldéhyde 20 21,2

Bïomasse 1 0,6

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

^** déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

Les résultats semblent indiquer que la souche S. cerevisiae BY4742 adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2 accumule plus de glycérol (39,8 g contre 32,2 g) et moins d'éthanol (7,6 g contre 10,7 g) dans le cas des fermentations menées dans le milieu à 100 g/L que dans le cas des fermentations menées dans le milieu à 50 g/L. Par contre, le rendement obtenu pour l'acétaldéhyde est comparable dans les deux milieux puisqu'on obtient une quantité d'environ 20 g/L.

Les résultats obtenus pour ces deux concentrations en sucre n'indiquent pas d'effet positif sur la production de l'acétaldéhyde. Néanmoins, la levure S. cerevisiae BY4742 a été modifiée génétiquement et ces modifications ont un impact profond sur son métabolisme fermentaire. Ainsi, les éventuels mécanismes de régulation induits chez la levure BY4742 adh1Â::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2 par la concentration en sucre et la température de culture n'ont peut-être pas ou peu d'effet sur cette levure ou sont régulés de telle manière qu'on atteint un pic de production en acétaldéhyde de 21 g/L pour ces conditions de culture.

Par ailleurs, il est à noter que les résultats exposés sont exprimés en g/100 g de glucose consommés/L. Or, dans le cas des fermentations menées à 30°C dans un milieu à 100 g/L de glucose, la totalité du glucose n'est pas consommé. Pour les fermentations à 100 g/L, en moyenne, seul 33,4% du glucose a été consommé avant que les fermentations s'arrêtent contre 73,5% pour les fermentations menées dans le milieu à 50 g/L. Donc si la sélectivité est identique dans ces deux conditions, la conversion et le rendement sont plus faibles lorsque les fermentations sont menées dans un milieu à 100 g/L de glucose plutôt que dans un milieu à 50 g/L. Ainsi, une concentration en sucre de 5% a été choisie pour la suite des travaux.

Exemple 9 : Fermentations avec extraction continue de l'acétaldéhyde réalisées avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. leu2A0. lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Température de culture 30 °C, concentration initiale en saccharose 5%

Les résultats obtenus pour les fermentations menées en milieu minimum avec 5% de saccharose comme source de carbone, comparés à ceux obtenus en milieu glucose, sont présentés dans le Tableau 8. La durée de fermentation dans le milieu contenant initialement 5% de glucose a été de 4 jours, alors que dans le milieu contenant initialement 5% de saccharose, la fermentation s'est arrêtée après deux jours alors qu'il restait du sucre disponible. Ces résultats permettent toutefois de constater qu'il y a peu de différences dans les bilans de fermentation. Tableau 8 : Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae adh1A::KanMX4 transformée par le p VTDH3-2-r?ox2 à 30 °C dans un milieu SD à 50 g/L de glucose ou de saccharose

Ethanol* 17,4 17

C0 ₂ ** 35,4 35,3

GÎ éroi 27,4 26,9

Acide 1,2 1,9

acétique

Acétaldéh de 18 17,6

Biomasse 0,7 1,2

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

* ^* déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

Ces résultats ne sont pas particulièrement étonnants dans la mesure où la levure S. cerevisiae est naturellement capable d'hydrolyser le saccharose en glucose et fructose, grâce notamment à la présence d'une invertase (ou β-fructofuranosidase) (Barnett, Payne, & Yarrow, 2000) et capable d'utiliser le fructose comme source de carbone.

Sur la Figure 5, il apparaît que la levure dégrade la totalité du saccharose lors des deux premiers jours de fermentation. En parallèle, on observe une accumulation du glucose et du fructose, issu de l'activité de l'invertase dans le milieu de culture. Après deux jours de fermentation, la consommation des sucres s'arrête.

Ces résultats indiquent que cette étape enzymatique supplémentaire n'est pas limitante pour la conversion du saccharose en acétaldéhyde.

La levure S. cerevisiae est théoriquement capable de fermenter, selon les souches, le glucose, le saccharose, le galactose, le maltose, le mélibiose, le raffinose, le mélézitose et l'amidon (Barnett, Payne, & Yarrow, 2000). De plus, des essais complémentaires avec la souche S. cerevisiae adh1Â::KanMX4 transformée par le pVTDH3-2-nox2 ont permis de déterminer que celle-ci est effectivement capable de fermenter le maltose.

Tableau 9: Comparaison des performances obtenues avec la souche S. cerevisiae adft1A::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-no 2, cultivée en fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde, pour différentes sources de carbones

SD Glucose 5% SD Saccharose

5%

Les données liées aux performances du procédé de production d'acétaldéhyde (Tableau 9) permettent de mettre en évidence que la conversion du saccharose est plus faible de moitié comparée à celle du glucose. En revanche, la sélectivité est identique pour ces deux sources de carbone. Le rendement est également moins important de moitié pour la production d'acétaldéhyde à partir de saccharose, par rapport à celui pour la production à partir de glucose.

Exemple 10 : Fermentations avec extraction continue de l'acétaldéhyde, réalisées avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. leu2A0. lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Température de culture 30 °C, concentration initiale en dextrose 5%

Les résultats de bilans comparés entre les fermentations menées en milieu SD glucose 5% et SD dextrose 5% (après 4 jours de fermentation en milieu dextrose), présentés dans le Tableau 10, montrent qu'il y a peu de différences dans les résultats obtenus avec les milieux glucose et dextrose. Les parts d'éthanol (16,3 g/L et 17,4 g/L respectivement) et d'acétaldéhyde (16 g/L et 18 g/L) formées sont proches. Seule la quantité de glycérol formée est plus importante pour la culture sur dextrose puisque 27,4 g/L de glycérol sont produits contre 16 g/L avec glucose comme source de carbone. Ces différences doivent être relativisées du fait qu'un seul essai a été réalisé pour le milieu dextrose.

Tableau 10: Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae adh1A::KanMX4 transformée par le pVTDH3-2-r?ox2 à 30 °C dans un milieu SD à 50 g/L de glucose ou de dextrose (ces données sont issues de fermentations menées en double pour le glucose)

Produits formés (en g pour 100 g de sucres consommés) cerevisiae adh l \ KanMX4 cerevisiae adh l \ KanMX4 surexprimant milieu II surexprimant milieu II dextrose

^** déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées.

Ces résultats indiquent donc que le dextrose industriel permet d'obtenir une production en acétaldéhyde pratiquement identique à celle obtenue avec une préparation en glucose pure. Cela est intéressant au niveau du coût final de la production de la molécule car le dextrose est jusqu'à 20 fois moins cher que le glucose raffiné.

Tableau 11 : Comparaison des performances obtenues avec la souche S. cerevisiae adh1A::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-no 2, cultivée en fermentation avec extraction continue de l'acétaldéhyde, pour différentes sources de carbone

SD Glucose 5% SD Dextrose

5%

Conversion 85%

Séiectiyité 37% 33%

Rendement

Les données liées aux performances de notre procédé de production d'acétaldéhyde (Tableau 1 1 ) nous permettent de mettre en évidence que le taux de conversion du dextrose est légèrement plus élevé que celui du glucose. D'autre part, ces résultats indiquent que le taux de sélectivité est légèrement plus faible dans le cas des cultures réalisées en milieu dextrose. Ainsi, les rendements de production d'acétaldéhyde à partir de ces sources de carbone sont très proches. Exemple 11 : Fermentations avec extraction continue de l'acétaldéhyde réalisées avec Saccharomyces cerevisiae BY4742 ; MATa, his3A1. ieulAO, lvs2A0. ura3A0 ; YOL086c::KanMX4 transformée avec pVTDH3-2-nox2. Température de culture 30 °C, concentration initiale en sucres totaux 5% (milieu à base de mélasse industrielle)

Une fermentation a été menée avec la levure S. cerevisiae adh1Â::KanMX4 transformée avec le plasmide pVTDH3-2-nox2, dans un milieu à base de mélasse industrielle préparé de façon à obtenir une concentration en sucres initiale de 5% et dans les conditions établies précédemment. Il est à noter qu'un produit antimousse a dû être ajouté dans les fermenteurs lors de ces essais.

Les résultats de bilan de fermentation (après 4 jours dans le milieu comprenant la mélasse) sont présentés dans le Tableau 12 et montrent que d'une manière générale, les quantités de sous-produits formées sont équivalentes entre la culture menée en milieu glucose et celle réalisée en milieu mélasse. Notamment, la quantité d'acétaldéhyde est de 17 g/100 g de sucres consommés pour la culture en mélasse et de 18 g/100 g pour la culture menée en milieu glucose. Ces données indiquent que dans la mélasse utilisée, S. cerevisiae adh1Â::KanMX4 transformée avec le pVTDH3-2-nox2 trouve tous les nutriments nécessaires à son développement et d'autre part qu'il n'y a pas de substance inhibant cette croissance.

Tableau 12 : Bilan de fermentation obtenu pour S. cerevisiae adh1A::KanMX4 transformée par pVTDH3-2-no 2 à 30 'C dans un milieu SD à 50 g/L de glucose ou de mélasse.

Produits formés (en g pour 100 g de sucres consommés)

Ethanol* 19,9

m L-L>2 ## ^* 2 C A

Acétaldéhyde 18 17

1 Λ

^* calculé de manière à obtenir un bilan massique de 100%.

^** déduit à partir des quantités d'éthanol, acide acétique et acétaldéhyde formées. Les performances de production de l'acétaldéhyde obtenues dans ce milieu mélasse sont également équivalentes à celles obtenues pour la culture en milieu glucose (Tableau 13). Une fois de plus, ces résultats indiquent qu'aucune molécule présente dans la mélasse n'a d'effet négatif sur les performances des souches S. cerevisiae adh1Â::KanMX4 surexprimant Nox2, en ce qui concerne la production d'acétaldéhyde. Il est tout de même intéressant de noter qu'un peu plus d'éthanol est formé dans le cas de la culture en milieu mélasse (19,9 g/100 g de sucres consommés contre 17,4 g/1 00 g de glucose consommés). Cette légère augmentation de la part d'éthanol dans le bilan peut s'expliquer par l'utilisation d'antimousse. L'ajout de ce produit réduit également la taille des bulles d'air formées par le frité et donc par conséquent les échanges air/milieu et la performance du procédé d'extraction de l'acétaldéhyde. Une part de l'acétaldéhyde produit est donc convertie en éthanol.

Le milieu de culture à base de mélasse, qui contient 23,5 g/L de saccharose, 13,7 g/L en glucose et 13 g/L en fructose, présente un pourcentage de conversion, et donc un rendement de conversion du sucre en acétaldéhyde, différent de celui observé avec le milieu SD contenant le saccharose comme unique source de carbone (exemple 9). Ceci suggère que le mauvais taux de conversion obtenu était bien lié à un problème d'arrêt prématuré de la fermentation. La composition de la mélasse peut être à l'origine de cette différence de performance. En effet, la mélasse contient des éléments, tels que la biotine ou des sels minéraux, pouvant avoir un effet bénéfique sur le comportement de la levure, comme la croissance ou la production d'éthanol (Pejin & Eazmovski, 1996).

Tableau 13 : Comparaison des performances obtenues avec la souche S. cerevisiae adft7A::KanMX4 pVTDH3-2-no 2, en termes de production d'acétaldéhyde, entre un milieu à base de glucose et un milieu à base de mélasse de betterave industrielle

SD Glucose 5% Mélasse à 5% sucres totaux

REFERENCES

Aranda, A., & Del Olmo, M.-L. (2004). Exposure of Saccharomyces cerevisiae to Acetaldehyde Induces Sulfur Amino Acid Metabolism and Polyamine Transporter Gènes, Which Dépend on Met4p and Haal p Transcription Factors, Respectively. Applied and environmental microbiology, 70(4), 1913-1922.

Armstrong, D., Martin, S., & Yamazaki, H. (1984). Production of acetaldehyde from ethanol by Candida utilis. Biotechnology letters, 6(3), 183- 188.

Armstrong, D., Martin, S., & Yamazaki, H. (1988). US4720457 A.

Barnett, J., Payne, R., & Yarrow, D. (2000). Yeasts: Characetristics and identification (éd. third (first published 1983)). Cambridge, UK: Cambridge university press.

Bongers, R., Hoefnagel, M., & Kleerebezeml , M. (2005). High-Level Acetaldehyde Production in Lactococcus lactis by Metabolic Engineering. Applied and environmental microbiology, 71 (2), 1 109-1 1 13.

Drewke, C, Thielen, J., & Ciriacy, M. (1990). Ethanol formation in adhO mutants reveals the existence of a novel acetaldehyde-reducing activity in Saccharomyces cereviasiae. Journ. of Bacteriol., Vol.172, No7, 3909-3917.

Heux, S., Sablayrolles, J.-M., Cachon, R., & Dequin, S. (2006).

Engineering a Saccharomyces cerevisiae wine yeast that exhibits reduced ethanol production during fermentation under controlled microoxygenation conditions. Appl and Environ Microbiol, Vol.72, No.9, 5822-5828.

Jamieson, A., & Vandeyar, M. (2009). US2009/0246841 A1 .

Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, (s.d.). pp. Vo.1 ,

99.1 13.

Malveda, M., & Funada, C. (s.d.). CEH Marketing Research Report. Murray, W., Duff, S., & Lanthier, P. (1989). Induction and stability of alcohol oxidase in the méthylotrophic yeast Pichia pastoris. Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol.32, 95-100.

Pejin, D., & Eazmovski, R. (1996). Dependence of biotin content on molasses composition. Journal of food quality, 19, 353-361 . Raymond, W. (1984). US4481292 A.

Scriban R. (1999). Biotechnologie. Tec et doc,, 5ème Eds, 78.

Shachar-Nishri, Y., & Freeman, A. (1993). Continous production of acetaldehyde by immobilized yeast with in-situ product trapping. Applied biochemistry and biotechnology, 39/40, 387.

Stanley, G., & Pamment, N. (1993). Transport and intracellular accumulation of acetaldehyde in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and bioengineering, 42(1 ), 24-29.

Ullmann's Encylopedia of Industrial Chemistry. (s.d.). pp. Vol.1 , 191 - 201 .

Vernet T., D. D. (1987). A family of yeast expression vectors containing the phage f1 intergenic région. Gene, 52, 225-233.

Wecker, M., & Zall, R. (1987). Production of acetaldehyde by Z. mobilis. Applied and environnemental microbiology, 2815-2820.

Winzeler, E., Shoemaker, D., Astromoff, A., Liang, H., Anderson, K.,

André, B. Davis, R. (1999). Functional Characterization of the S. cerevisiae Génome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science, 285(5429), 901 -906.

Zall, R., & Wecker, M. (1990). US4900670 A.

Zhu, H., Gonzalez, R., & Bobik, T. (201 1 ). Coproduction of Acetaldehyde and Hydrogen during Glucose Fermentation by Escherichia coli. Applied and environmental microbiolgy, 77(18), 6441 -6450.