Titre : Biosynthèse de composés phénylpropanoïdes

Domaine technique

[0001] La présente invention relève du domaine de la production de composés phénylpropanoïdes, et notamment celui des souches génétiquement modifiées pour la production de composés phénylpropanoïdes tel que l’acide coumarique ou la frambinone.

Technique antérieure

[0002] La bioproduction d’arômes et fragrances « naturels » représente depuis de nombreuses années un axe de recherche important pour l’industrie afin de répondre aux consommateurs soucieux d’être de plus en plus éco-responsables. La biologie de synthèse, notamment par l’intermédiaire de microorganismes, permet cette production naturelle, mais les rendements ne sont pas toujours suffisants pour une production à grande échelle.

[0003] La saveur de la framboise (Rubus idaeus) est liée à plus de 200 composés, mais la frambinone, un composé phénolique naturel, est le composé qui a le plus d'impact, définissant son goût caractéristique (Klesk et al., 2004, J. Agric. Food Chem. 52, 5155- 61 ; Larsen et al., 1991 , Acta Agric. Scand. 41 , 447-54).

[0004] Dans la mesure où elle n'est présente qu'en petite quantité dans les framboises (1 -4 mg par kg de fruits), la frambinone naturelle est d'une grande valeur (Larsen et al., 1991 ). Cependant, comme sa disponibilité naturelle est limitée, sa production biotechnologique est hautement désirable.

[0005] Dans ce contexte, la voie de biosynthèse de composés phénylpropanoïdes, notamment la frambinone, peut être reconstituée au sein d’un microorganisme grâce à l’insertion de gènes hétérologues codants pour certaines enzymes clés de ladite voie.

[0006] La tyrosine est un acide aminé important pour la biosynthèse de composés phénylpropanoïdes car il est notamment le précurseur de l’acide coumarique ou de la frambinone. [0007] En effet, la frambinone peut être obtenue à partir de l'acide aminé aromatique L-tyrosine comme substrat initial via une voie de biosynthèse en 4 étapes.

[0008] Selon la première étape, la tyrosine est désaminée par une tyrosine ammonia lyase (TAL, EC 4.3.1.23) pour former de l'acide coumarique. Catalysée par une 4- coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), une molécule de Coenzyme A (CoA) est greffée sur l'acide coumarique. Le coumaroyl-CoA est alors converti par une benzalacétone synthase (BAS, EC 2.3.1.212) en 4-hydroxy benzalacétone. Cette réaction est une condensation décarboxylative et utilise une unité de malonyl- CoA en tant que co- substrat. L'étape finale est la réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone par une benzalacétone réductase.

[0009] Ainsi, le développement de souche surproductrice de tyrosine comme plateforme pour la production de composés phénylpropanoïdes, notamment la frambinone, est un point de départ crucial pour la biosynthèse de ces composés.

[0010] Cependant, la production de tyrosine chez les microorganismes est tout aussi complexe que très finement régulée. En effet, certaines enzymes de la voie de production de la tyrosine, également connue sous le nom de voie du shikimate (en anglais « shikimate pathway »), sont régulées négativement par cet acide aminé qui inhibe leur activité via la fixation sur un site d’inhibition lorsque la concentration devient trop élevée dans la cellule. Ce système de régulation lorsque la tyrosine est présente en trop grande quantité dans le microorganisme est appelée retro- régulation négative.

[0011] Malgré tout, il devrait être possible d’obtenir par mutagenèse des enzymes « insensibles » à cette inhibition et donc de déréguler la voie de production de tyrosine. Ces mutants insensibles à la rétro-régulation négative de la tyrosine sont appelés mutant fbr pour « feedback résistant ».

[0012] De nombreux articles décrivent la dérégulation de cette voie chez E. coli et une enzyme a été particulièrement très étudiée : la DAHP synthase (DAHP = 3- Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate). C’est la première réaction de la voie du shikimate qui consiste en la condensation d’un phospho(enol)pyruvate (PEP) et d’un erythrose-4-phosphate (E4P) en DAHP. [0013] Cette activité DAHP synthase est réalisée par l’intermédiaire de 3 isoenzymes chez E. coli : AroG (retro-régulée par la phénylalanine), AroF (retro- régulée par la tyrosine) et AroH (rétro-régulée par le tryptophane). Les structures de ces protéines sont connues et les sous-structures (ainsi que les acides aminés impliqués) liées à la retro-régulation sont également très bien décrits dans la littérature.

[0014] Kikuchi et al., 1997 et Cui et al., 2019, ont identifié, décrit et étudié chez E. coli respectivement des mutants AroGfbr et AroFfbr insensibles à la rétro-régulation de la phenylalanine et de la tyrosine. Des mutants fbr de la protéine TyrA (mutant tyrAfbr) ont également été décrits chez E. coli par Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, (2005) (Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, Appl. Environ Microbiol. 2005 Nov ; 71 (11 ) : 7224-8).

[0015] En 2007, Lütke-Eversloh and Stephanopoulos (Lütke-Eversloh and Stephanopoulos, Appl. Environ Microbiol. 2007 Nov ; 75(1 ) : 103-10) ont également décrit des souches d’E. coli surproductrices de tyrosine obtenues en combinant ces différentes enzymes mutées. Ces souches ont été utilisées pour produire des phénylpropanoïdes comme l’acide coumarique (Kang et al., 2012), ou la naringenine via notamment une mutation du gène rpoA en plus des mutations aroGfbr et tyrAfbr (Santos et al., 2011 ).

[0016] Une vue d’ensemble des modifications effectuées pour obtenir des souches d’E. coli surproductrices de tyrosine est bien décrite par l’article « Modular engineering of L-tyrosine production in E. coli » (Juminaga et al., 2011 ).

[0017] Des composés phénylpropanoïdes ont également été synthétisés à partir de souches Saccharomyces cerevisiae qui surexpriment la tyrosine, comme décrit par Rodriguez et al., 2015.

[0018] Le document GB 2416 769 décrit la possibilité de produire de la frambinone à l'aide de microorganismes contenant des gènes codant pour les enzymes 4CL et BAS dont au moins une est de source hétérologue. Le microorganisme préféré est E. coli (souche BL21 ) et peut en outre comprendre une séquence codant BAR, C4H, PAL et/ou CHS, la séquence codant BAR étant avantageusement endogène. [0019] Cependant, il apparait que les souches E. coli ou S. cerevisiae ne tolèrent pas bien la toxicité des composés phénylpropanoïdes et ne sont donc pas les microorganismes les mieux adaptés pour leur production.

[0020] Les bactéries du genre Pseudomonas sont plus tolérantes à ces molécules hautement toxiques, notamment la bactérie Pseudomonas putida (Calera et al., 2017). En revanche, les enzymes impliquées dans la production d’acides aminés aromatiques chez P. putida sont peu décrites.

[0021] Par conséquent, la surproduction chez P. putida de dérivés de la voie du shiikimate, tel que la tyrosine, implique l’utilisation de mutants AroGfbr et TyrAfbr provenant de chez E. coli, ce qui n’est pas très efficace (Calera et al., 2016).

[0022] La surproduction de tyrosine et de phénol a été décrite chez la bactérie Pseudomonas taiwanensis VLB120 grâce à la mise en oeuvre de mutations ponctuelles dans 3 gènes : trpEP290S, aroF-l P148L et pheAT310I (Wynands et al., Metab Eng. 2018 May ; 47 :121 -133).

[0023] Cependant, il existe toujours un besoin de développer des nouvelles enzymes et de nouvelles souches de Pseudomonas putida surproductrices de tyrosine permettant la production de composés phénylpropanoïde, notamment l’acide coumarique et la frambinone.

Problème technique

[0024] Les souches surproductrices de tyrosine développées à ce jour sont essentiellement des souches E. coli et S. Cerevisiae. Cependant, ces souches ne tolèrent pas bien la toxicité des composés phénylpropanoïdes et ne sont donc pas les microorganismes les mieux adaptés pour leur production.

[0025] Ainsi, il existe un besoin particulier de développer de nouvelles souches surproductrices de tyrosine permettant la production de composés phénylpropanoïdes.

[0026] La présente divulgation vient améliorer la situation. Résumé

[0027] Un des aspects de la présente invention porte sur une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène AroF-l muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase ayant la séquence SEQ ID NO :1 et présentant au moins une mutation P160L, une double mutation P160L/Q164A, ou une double mutation P160L/S193A, de préférence une double mutation P160L/S193A.

[0028] Un autre aspect de l’invention porte sur un procédé de synthèse de composé phénylpropanoïde ou d’un dérivé de phénylpropanoïde par la mise en oeuvre d’une souche génétiquement modifiée selon l’invention de Pseudomonas putida.

[0029] Enfin, l’invention porte également sur l’utilisation d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida pour la synthèse de composé phénylpropanoïdes.

[0030] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en oeuvre. Elles peuvent être mises en oeuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :

Brève description des figures

[0031] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1

[0032] [Fig. 1] Graphique du PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine AroF-l sauvage (WT). Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.

Fig. 2 [0033] [Fig. 2] Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-l WT comparativement aux simples mutants AroF-l-G191 , AroF-l-P160 et AroF-l-S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants. Fig. 3

[0034] [Fig. 3] Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-l WT comparativement aux doubles mutants AroF-l-P160_G191 , AroF-l-P160L_Q164, AroF-l-P160_S190 et AroF-l-P160_S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.

Fig. 4

[0035] [Fig. 4] Graphique représentant la part de PEP consommé en mM en présence ou absence d’acide aminé aromatique par la protéine aroF-l WT comparativement aux simples mutants AroF-l-P160 et AroF-l-S193 et au double mutant AroF-l-P160_S193. Les résultats présentés sont ceux de trois réplicas indépendants.

Fig. 5

[0036] [Fig. 5] présente le protocole de conjugaison utilisable pour transformer et modifier génétiquement P. putida.

Fig. 6

[0037] [Fig. 6] Graphique présentant la production d’acide coumarique (PCA) et d’acide cinnamique (CA) par des souches de Pseudomonas putida exprimant les enzymes AroF-l WT/TAL (aroF-l WT) et aroF-l fbr P160L/S193A/TAL (aroF-l fbr). Fig. 7

[0038] [Fig. 7] Graphique présentant la production de phénoliques totaux et la proportion d’acide coumarique parmi les phénolique totaux (%PCA) par des souches de Pseudomonas putida exprimant les enzymes AroF-l WT/TAL (aroF-l WT), AroF-l WT/TAL + plasmide vide (aroF-l WT + contrôle), AroF-l WT/TAL + plasmide phhA/B (aroF-l WT + phhA/B), aroF-l fbr P160L/S193A/TAL (aroF-l fbr), aroF-l fbr P160L/S193A/TAL + plasmide vide (aroF-l fbr + contrôle), et aroF-l fbr P160L/S193A/TAL + plasmide phhA/B (aroF-l fbr + phhA/B). L’expression des gènes phhA/B à partir du promoteur araC/pBAD est induite ou non.

Description des modes de réalisation [0039] Un premier objet de l’invention concerne donc une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène AroF-l muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase dont la séquence présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 et présentant au moins une mutation P160L, une double mutation P160L/Q164A, ou une double mutation P160L/S193A, de préférence une double mutation P160L/S193A.

[0040] Au sens de la présente description, les expressions « souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida », « souche modifiée de Pseudomonas putida », « souche génétiquement modifiée », ou encore « souche modifiée » sont considérées comme synonymes les unes des autres.

[0041] En particulier, on entend par « souche génétiquement modifiée », une souche qui comprend soit (i) au moins un acide nucléique recombinant, ou transgène, intégré de manière stable dans son génome, et/ou présent sur un vecteur, par exemple un vecteur plasmidique, soit (ii) une ou plusieurs mutations non naturelles par insertion, substitution ou délétion de nucléotides, lesdites mutations étant obtenues par des techniques de transformation ou par des techniques d’édition de gènes connues de l’homme du métier.

[0042] En effet, les techniques de modifications génétiques par transformation, mutagenèse ou édition de gènes sont bien connues de l’homme du métier et sont décrites par exemple dans « Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation », Journal of Zhejiang Univ- Sci B (Biomed & Biotechnol) 2016 17(2):83-99., et dans Martinez-Garcia and de Lorenzo, « Pseudomonas putida in the quest of programmable chemistry », Current Opinion in Biotechnology, 59 :111 -121 , 2019.

[0043] De préférence, pour l’intégration des gènes mutés ou recombinants chez Pseudomonas putida, on utilisera la technique de mutagenèse décrite dans l’exemple 2.

[0044] En particulier, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique modifiant l’expression d’un ou plusieurs gènes naturellement exprimés chez Pseudomonas putida. [0045] Selon un mode de réalisation particulier, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique codant une ou plusieurs enzymes, non naturellement exprimée chez Pseudomonas putida.

[0046] Les souches sauvages de P. putida KT2440 sont disponibles par exemple dans la Banque de souches NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource center https://www.nite.go.jp/en/nbrc/, NBRC100650).

[0047] De plus, des souches de Pseudomonas putida ou Pseudomonas taiwanensis optimisées pour la production de tyrosine sont connues de l’homme du métier qui pourra les utiliser comme souche de départ pour obtenir les souches génétiquement modifiées selon l’invention (Calera et al., 2016 ; Wierckx et al., 2005, Appl Environ Microbiol. 71 (12) :8221 -7 ; Wynands et al., 2018 ; Otto et al. 2019, Front Bioeng Biotechnol Nov 20 ;7 :312).

[0048] Au sens de la présente invention, le pourcentage d’identité fait référence au pourcentage de résidus identiques dans une séquence nucléotidique ou d’acides aminés sur un fragment donné après alignement et comparaison avec une séquence de référence. Pour la comparaison, on utilise un algorithme d’alignement et les séquences à comparer sont entrées avec les paramètres correspondants de l’algorithme. Les paramètres par défaut de l’algorithme peuvent être utilisés.

[0049] De préférence, pour une comparaison de séquence d’acide nucléique et la détermination d’un pourcentage d’identité, l’algorithme blastn tel que décrit dans https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi avec les paramètres par défaut est utilisé

[0050] Au sens de la présente invention, on entend par « gène AroF1 muté », un acide nucléique comprenant au moins une partie codant une version mutée de la 3- Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase sous contrôle d’un promoteur permettant son expression dans la souche génétiquement modifiée.

[0051] Au sens de la présente invention, on entend par 3-Deoxy-D-arabino- Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase, les enzymes (EC 2.5.1 .54) capables de réaliser chez les bactéries la première réaction de la voie du shikimate qui consiste en la condensation d’un phospho(enol)pyruvate (PEP) et d’un erythrose-4- phosphate (E4P) en DAHP. [0052] Selon un mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAHP synthase dont la séquence d’acides aminés présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 , et présentant au moins une mutation P160L, une double mutation P160L/Q164A, ou une double mutation P160L/S193A, de préférence une double mutation P160L/S193A.

[0053] Le gène AroF-l endogène à Pseudomonas putida code pour la DAFIP synthase de séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 . Dans un mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée selon la présente invention peut comprendre donc, en plus du gène AroF-l endogène, au moins une séquence d’acide nucléique recombinante AroF-l mutée codant une protéine mutée comprenant la mutation P160L, la double mutation P160L/Q164A, ou la double mutation P160L/S193A, de préférence la double mutation P160L/S193A.

[0054] Selon un mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase comprenant une mutation P160L telle que définie par la séquence d’acides aminés SEQ ID NO :2.

[0055] Selon une variante de ce mode de réalisation, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et contient la mutation P160L.

[0056] Selon un autre mode de réalisation particulier, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase et présentant au moins une double mutation P160L/Q164A. Selon ce mode de réalisation, le gène AroF-l muté code pour la DAFIP synthase comprenant la double mutation P160L/Q164A défini par la séquence d’acides aminés SEQ ID NO: 3.

[0057] Selon une variante de ce mode de réalisation, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 et contient la double mutation P160L/Q164A.

[0058] Selon un mode de réalisation préféré, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAHP synthase présentant au moins une double mutation P160L/S193A. Selon ce mode de réalisation, le gène AroF-l muté code pour la DAFIP synthase comprenant la double mutation P160L/S193A défini par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO: 4.

[0059] Selon une variante de ce mode de réalisation, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 4 et contient la double mutation P160L/S193A.

[0060] Dans un mode de réalisation, qui peut être combiné aux précédents, la séquence codante du gène AroF-l mutée est placée sous le contrôle d’un promoteur hétérologue, en particulier un promoteur constitutif ou inductible, par exemple choisi parmi les promoteurs ptrc, xyls/pm ou araC/pBAD, qui permet de surexprimer le gène AroF-l muté dans la souche génétiquement modifiée selon l’invention. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence codante du gène AroF-l muté dans la souche génétiquement modifiée selon l’invention est insérée de manière à rendre non fonctionnel le gène AroFI, par exemple par disruption du gène AroFI, ou par délétion du gène AroFI et en particulier de tout ou partie de sa séquence codante.

[0061] Le gène AroFI code pour une autre DAFIP synthase (isoenzyme d’AroF). Ainsi, dans un mode de réalisation, la souche génétiquement modifiée selon la présente invention comprend le gène AroFI délété ou disrupté et au moins un acide nucléique recombinant comprenant le gène AroF-l muté comme décrit précédemment ou une séquence codante du gène AroF-1 muté.

[0062] De manière tout à fait avantageuse, par la mise en oeuvre de mutations spécifiques, la Demanderesse a développé une souche de Pseudomonas putida capable d’exprimer une DAFIP synthase recombinante insensible à la rétro régulation négative par la tyrosine, dérégulant ainsi la voie de production de la tyrosine. En d’autres termes, la présente invention permet la réalisation de souches surproductrices de tyrosine, comme produit final ou comme produit intermédiaire dans la synthèse de composés phénylpropanoïdes. En particulier, cette surproduction est particulièrement avantageuse pour la production de composés phénylpropanoïdes par les souches modifiées selon l’invention.

[0063] Les composés phénylpropanoïdes sont une classe de composés organiques, dérivés de plantes, et biosynthétisés à partir de la phénylalanine ou de la tyrosine. A titre d’exemple de composés phénylpropanoïdes, on peut notamment citer l’acide coumarique, le p-coumaroyl-coA, le 4-hydroxybenzalacetone, la frambinone, la zingerone, la vanilline, les flavonoïdes et les stilbénoïdes.

[0064] On entend par « souche surproductrice de tyrosine » au sens de la présente invention, une souche modifiée de Pseudomonas putida capable de produire la tyrosine en quantité supérieure comparativement à une souche Pseudomonas putida sauvage comprenant le gène AroF-l codant la DHAP synthase de séquence d’acides aminés SEQ ID NO :1 (gène non muté), soit en tant que produit final, soit en tant que produit intermédiaire.

[0065] Afin de pouvoir convertir la tyrosine en composé phénylpropanoïde, tel que l’acide coumarique, la souche modifiée selon l’invention peut comprendre en outre avantageusement au moins un gène recombinant additionnel.

[0066] Par l’expression « gène recombinant additionnel », on entend au sens de la présente invention tout gène recombinant présent dans la souche Pseudomonas putida en plus du gène muté AroF-l tel que défini précédemment. Le gène recombinant additionnel peut résulter de l’insertion d’un promoteur hétérologue, par exemple un promoteur fort pour surexprimer un gène endogène de Pseudomonas putida, ou une séquence codante recombinante codant pour une protéine non naturellement exprimée chez Pseudomonas putida.

[0067] Selon un mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend au moins un gène recombinant additionnel codant pour un polypeptide à activité phénylalanine hydroxylase (phhA) et un gène recombinant additionnel codant pour un polypeptide à activité tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB). [0068] La Demanderesse a constaté que ces deux enzymes, bien que présentes de manière endogène chez Pseudomonas putida, pouvaient ne pas être assez actives et/ou leur expression pouvait être insuffisante dans le cadre d’une utilisation de la souche pour la production de composés phénylpropanoïdes. Selon ce mode de réalisation, les activités ont donc été optimisées en surexprimant ces deux enzymes phhA et phhB. La surexpression peut par exemple être obtenue en plaçant les gènes recombinants additionnels de ces enzymes sous le contrôle d’un promoteur hétérologue, en particulier un promoteur constitutif ou inductible. Des exemples de tels promoteurs sont notamment les promoteurs ptrc, xylS/pm, araC/pBAD.

[0069] De préférence, la surexpression des enzymes phhA et phhB est obtenue en plaçant les gènes recombinants additionnels de ces enzymes sous le contrôle d’un promoteur inductible fort araC/pBADopt (Prior et al., 2010).

[0070] La surexpression d’un gène s’entend comme une expression supérieure dudit gène dans une souche génétiquement modifiée par rapport à la même souche dans laquelle le gène est exprimée uniquement sous contrôle du promoteur naturel. La surexpression peut être obtenue en insérant une ou plusieurs copies du gène directement dans le génome de la souche, de préférence sous la dépendance d’un promoteur fort, ou également par clonage dans des plasmides, en particulier des plasmides multicopies, de préférence également sous la dépendance d’un promoteur fort.

[0071] Dans un autre mode de réalisation, qui peut être combiné au précédent, les séquences codantes endogènes phhA et phhB sont placées sous le contrôle d’un promoteur hétérologue tels que définis précédemment, par exemple afin de surexprimer les séquences codantes endogènes correspondantes dans la souche génétiquement modifiée selon l’invention.

[0072] En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant additionnel codant pour une phénylalanine hydroxylase (phhA) (EC 1 .14.16.1 ) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 5 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 et codant pour une enzyme à activité phhA, et un gène recombinant additionnel codant pour une tétrahydrobiopterine déshydratase (phhB) (EC 4.2.1.96) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 6 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 et codant pour une enzyme à activité phhB, en particulier sous le contrôle d’un promoteur hétérologue permettant leur surexpression.

[0073] Selon ce mode de réalisation la souche génétiquement modifiée selon l’invention est capable de surproduire la tyrosine mais également de transformer la phénylalanine en tyrosine par l’intermédiaire des enzymes phhA et phhB.

[0074] Selon un mode de réalisation particulier, les gènes recombinants additionnels codants pour la phénylalanine hydroxylase (phhA) et pour la tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB) comprennent les séquences codantes correspondantes de Pseudomonas fluorescens (phhA VVN86558.1/ phhB : AYF50180.1) ou Pseudomonas aeruginosa (phhA AAA25936.1/ phhB AAA25937.1 ).

Selon un mode de réalisation préféré, la souche modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène AroF-l muté codant pour la DAFIP synthase comprenant la double mutation P160L/S193A défini par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO: 4, ou une séquence présentant au moins 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, et les deux gènes recombinants additionnels ci-dessous :

- un gène recombinant codant pour une phénylalanine hydroxylase (phhA), de préférence une phhA définie par la séquence SEQ ID NO : 5, ou une séquence présentant au moins 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 5, et

- un gène recombinant codant pour une tétrahydrobiopterine déshydratase (phhB), de préférence une phhB définie par la séquence SEQ ID NO : 6, ou une séquence présentant au moins 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 6, de préférence lesdits gènes phhA et phhB étant placés sous le contrôle d’un promoteur hétérologue permettant leur surexpression.

[0075] Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être de préférence combiné avec le précédent, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant pour un polypeptide à activité tyrosine ammonia lyase (TAL). Un gène recombinant codant la TAL peut provenir du microorganisme Rhodotorula glutinis et être optimisé selon la référence Zhou et al., 2015 (trois mutations ponctuelles de cette enzyme TAL la rende plus efficace : S9N ; A11T ; E518V). Cette enzyme TAL est appelée TAL_rg_opt. En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) (EC 4.3.1 .23) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 7 (TAL_rg_opt ) ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 et codant pour une enzyme à activité TAL.

[0076] Selon ce mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée selon l’invention est capable de surproduire la tyrosine mais également de la convertir en acide coumarique par l’intermédiaire de l’enzyme TAL.

[0077] Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné avec les précédents, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant la 4-coumarate-CoA ligase (4- CL). En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une 4-CL (EC 6.2.1.12) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 8 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8 et codant pour une enzyme à activité 4-CL.

[0078] Selon ce mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée est capable de convertir l’acide coumarique en p-coumaryl-coA par l’intermédiaire de l’enzyme 4-CL.

[0079] Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné avec les précédents, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant un polypeptide à activité benzalacétone synthase (BAS). En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une BAS (EC 2.3.1.212) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 9 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 9 et codant pour une enzyme à activité BAS.

[0080] Selon ce mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée est capable de convertir le p-coumaryl-coA en 4-hydroxybenzalcetone par l’intermédiaire de l’enzyme BAS.

[0081] Selon un mode de réalisation préféré, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend plusieurs gènes recombinants additionnels, à savoir notamment les cinq gènes recombinants additionnels ci-dessous :

- un gène recombinant codant pour une phénylalanine hydroxylase (phhA), de préférence une phhA définie par la séquence SEQ ID NO : 5, en particulier sous contrôle d’un promoteur hétérologue permettant sa surexpression,

- un gène recombinant codant pour une tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB), de préférence une phhB définie par la séquence SEQ ID NO : 6, en particulier sous contrôle d’un promoteur hétérologue permettant sa surexpression,

- un gène recombinant codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT), de préférence une TAL_RG_OPT définie par la séquence SEQ ID NO : 7,

- un gène recombinant codant une 4-coumarate-CoA ligase (4-CL), de préférence une 4-CL définie par la séquence SEQ ID NO :8,

- un gène recombinant codant pour une benzalacétone synthase (BAS), de préférence une BAS définie par la séquence SEQ ID NO :9.

[0082] Les enzymes TAL, 4-CL et BAS sont toutes des enzymes impliquées dans la synthèse de composés phénylpropanoïdes.

[0083] Selon ce mode de réalisation préféré, la souche modifiée est capable de produire une multitude de composés phénylpropanoïdes, à savoir notamment l’acide coumarique, le p-coumaroyl-coA, le 4-hydroxybenzalcetone. [0084] Un autre objet de l’invention concerne une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène recombinant additionnel AroF-l codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) synthase dont la séquence présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 , et dans laquelle les gènes codants pour les enzymes phhA et phhB sont surexprimés.

[0085] Procédé de synthèse d’un composé phénylpropanoïdes

[0086] Un autre objet de l’invention concerne un procédé de synthèse d’un ou plusieurs composés phénylpropanoïdes.

[0087] Les composés phénylpropanoïdes peuvent être définis précédemment.

[0088] Le procédé de synthèse selon l’invention comprend la mise en oeuvre d’une étape de croissance d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida telle que définie précédemment dans un milieu de culture sous des conditions permettant l’expression du gène muté et/ou des gènes recombinants additionnels nécessaire à la synthèse d’un ou plusieurs composés phénylpropanoïdes.

[0089] Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de synthèse selon l’invention permet de produire de l’acide coumarique en grande quantité.

[0090] Selon une variante de ce mode de réalisation, le procédé peut comprendre une étape de croissance d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène AroF-l muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino- Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) synthase, par exemple de séquence SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :4, et au moins les gènes recombinants additionnels ci-dessous codants pour :

- une phénylalanine hydroxylase (phhA) de séquence SEQ ID NO : 5,

- une tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB) de séquence SEQ ID NO : 6, et

- une tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT) de séquence SEQ ID NO : 7.

[0091] Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé de synthèse selon l’invention permet de produire la frambinone, en particulier en quantité industrielle, et notamment avec un rendement au moins égal à 20 g/l de frambinone dans un fermenteur d’au moins 500 I. [0092] Selon ce mode de réalisation, le procédé comprend une étape de croissance d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène AroF-l muté codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) synthase de séquence SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :4. et comprenant les gènes recombinants additionnels ci-après codant pour :

- une tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT), de préférence une TAL_RG_OPT définie par la séquence SEQ ID NO : 7,

- une 4-coumarate-CoA ligase (4-CL), de préférence une 4-CL définie par la séquence SEQ ID NO :8,

- une benzalacétone synthase (BAS), de préférence une BAS définie par la séquence SEQ ID NO :9.

[0093] Le procédé de synthèse selon l’invention peut également comprendre une étape de purification et/ou de récupération du composé phénylpropanoïde, tel que l’acide coumarique ou la frambinone

[0094] Selon un mode de réalisation particulier, la souche est une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un gène recombinant additionnel AroF-l codant pour la 3-Deoxy-D-arabino-Fleptulodonate 7-phosphate (DFIAP) synthase dont la séquence présente au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO :1 , et dans laquelle les gènes codants pour les enzymes phhA et phhB sont surexprimés.

[0095] Utilisations des souches selon l’invention

[0096] Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation d’une souche de Pseudomonas putida telle que définie précédemment pour la synthèse de composé phénylpropanoïdes.

[0097] Selon un mode de réalisation préféré, le composé phénylpropanoïde est choisi parmi l’acide coumarique, le p-coumaroyl-coA, 4-hydroxybenzalacetone et la frambinone, de préférence parmi l’acide coumarique et/ou la frambinone.

[0098] La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas pour but de limiter la portée de cette invention qui est définie par les revendications. Exemples

[0099] Exemple 1 : Mise au point de mutant permettant la production de 3- Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) insensible à la rétro- régulation négative de la tyrosine [0100] A. Etude In Silico

[0101] L’enzyme de départ utilisée est l’enzyme AroF-l identifiée comme la 3- Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7-phosphate (DAHP) chez P. putida (identifiant Uniprot Q88KG6).

[0102] La structure tertiaire (en format PDB) de cette enzyme a été reconstruite à partir de sa séquence protéique par la méthodologie décrite dans Waterhouse, A. et al., (SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 46(W1 ), W296-W303 (2018)). La structure de base sélectionnée par homologie de séquences a été celle de la 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7- phosphate synthase de Saccharomyces œrevisiae. [0103] La région qui caractérise la rétro régulation à la tyrosine a été identifiée dans la littérature par l’intermédiaire d’une protéine homologue chez E. coli. Grâce à un alignement de structures tertiaires de ces deux enzymes, la région correspondante à cette rétro régulation sur AroF-l a été identifiée.

[0104] Ensuite, le « docking » d’une molécule de tyrosine avec l’enzyme AroF-l a été réalisé selon la méthodologie décrite par O. Trott et al., (« AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading », Journal of Computanional Chemestry, 2010).

[0105] Cette méthode a permis d’identifier les acides aminés impliqués dans la formation de liaisons chimiques avec la phénylalanine dans la poche de docking, à savoir, entres autres, les acides aminés en positions 160 (P160), 164 (Q164), 190 (S190), 191 (G191 ), 193 (S193) et 225 (I225).

[0106] Par recherche dans la littérature mais également dans les bases des données NCBI et Uniprot nous avons identifié des séquences protéiques similaires à AroF-l, mais présentant une certaine diversité d’acides aminés, en particulier dans les positions correspondantes à celles impliqués dans le docking. [0107] Cette démarche a permis d’identifier des acides aminés pouvant se substituer aux acides aminés naturellement trouvés dans la poche de « docking » de la protéine AroF-l sans modifier sa structure, ni son activité.

[0108] Ainsi, seule la liaison à la tyrosine est inhibée par les mutations mise en évidence. Le Tableau 1 ci-dessous, liste les positions et les acides aminés d’origine ainsi que les substituts qui caractérisent les mutations qui pouvaient potentiellement désactiver la fonction de rétrorégulation de AroF-l.

[0109] [Tableau 1] [0110] Parmi les différentes mutations identifiées dans le Tableau 1, un sous ensemble de mutations a été choisi selon les propriétés des acides aminés substituts ainsi que selon l’impact de ces mutations dans des protéines évolutivement proches déjà décrites dans la littérature ((Cui, D et al., Molecular basis for feedback inhibition of tyrosine-regulated 3-deoxy-d-arabino- heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli, 2019), (Ding, R. et al. Introduction of two mutations into AroG increases phenylalanine production in Escherichia coli . Biotechnol Lett 36, 2103-2108 (2014)), (Kikuchi Y et al. Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-d-arabino- heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 63:761-762 (1997). [0111] Le sous-ensemble choisi est le suivant : P160L, Q164A, S190A, G191 K, S193A, et I225P.

[0112] B. Expérimentations

[0113] Matériels et méthodes

[0114] Clonage des gènes codants pour l’enzyme AroF-l et les mutants dérivés

[0115] Afin d’exprimer et purifier l’enzyme AroF-l et les mutants qui en découlent, les gènes correspondant sont clonés dans un plasmide pET28_b(+) avec un His- Tag greffé sur la partie N-terminale de la protéine (en amont de l’ATG du gène).

[0116] Pour effectuer ces constructions, la méthode Gibson Assembly est utilisée (Gibson et al., 2009). Le produit de la réaction est transformé dans des souches E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Les cellules transformées sont étalées sur milieu gélosé avec antibiotique pour sélection. Les colonies obtenues sont ensuite vérifiées par PCR et séquencées afin de les valider.

[0117] Expression et purification des enzymes

[0118] Les souches E. coli BL21 (DE3) contenant les plasmides sont mises en culture durant 24h dans un milieu ZYM auto-inducteur dont la composition est la suivante :

[0119] a) Base saline :

- Extrait de levure : 5 g/l

- tryptone : 10 g/l

- Na ₂ SC>4 : 0,7 g/l

- NH ₄ CI :2,7 g/l

- KH2PO4 : 3,4 g/l

- Na2HPC>4 :4,45 g/l

[0120] b) Solution de sucres (concentrée 50 fois) :

- Glycérol : 250 g/l

- Glucose : 25 g/l

- Lactose : 100 g/l [0121] c) Solution de métaux (concentrée 5000 fois) : [Tableau 2]

[0122] d) Préparation du milieu complet : [0123] [Tableau 3] [0124] Le milieu est ensemencé à D0=0,05 à partir d’une préculture sur la nuit. La culture est réalisée dans un volume final de 50ml en erlenmeyer de 250ml. Les paramètres de culture sont les suivants : agitation 140rpm, 5 heures à 25°C puis 19 heures à 15°C.

[0125] Tous les produits chimiques utilisés pour la préparation du milieu proviennent de Sigma-Aldrich, Roth ou Euromedex.

[0126] Après incubation, les 50ml de culture sont centrifugés 10 minutes à 5000xg 4°C. Le surnageant est jeté et le culot repris dans 3ml de tampon LEW (Macherey- Nagel, voir ci-après), 1 mg/ml de lyzosyme sont ajoutés et la suspension est laissée sur glace durant 30 minutes.

[0127] Les cellules sont ensuite lysées par sonication (Omni Sonic Ruptor 400, Omni International, puissance 30%, puise 40 pendant 8 minutes). Après ajout de 0,22% de Streptomycine, les échantillons sont ensuite centrifugés 30 minutes à 15000xg 4°C. Le surnageant est récupéré et la purification des protéines solubles est faite selon les recommandations du fournisseur en utilisant le kit Protino® Ni- TED 2000 (Macherey-Nagel)

[0128] Finalement, les protéines purifiées sont concentrées ~10 fois en utilisant des filtres à centrifuger Amicon Ultra-430Kd (Merck) et le tampon d’élution est remplacé par du Tris-HCI 0,1 M pH7,5 + 10% Glycérol. Les protéines purifiées sont stockées à -80°C.

[0129] Test d’activité enzymatique

[0130] L’activité des enzymes est mesurée par le suivi de la disparition du substrat avec détection par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography).

[0131] La réaction est effectuée dans un volume final de 200mI avec 40mM de tampon phosphate pH 7, 300mM de phospho(enol)pyruvate (PEP), 20mg d’enzyme purifiée, 1 mM de tyrosine (ou autre acide aminé aromatique) ou 3mM d’HCI, et le volume est complété avec de l’eau ultrapure.

[0132] Après pré-incubation 2 minutes à 30°C, la réaction est démarrée en ajoutant 300mM d’erythrose-4-phosphate (E4P) et le mélange réactionnel est incubé 60 minutes à 30°C. [0133] Enfin, le mélange est chauffé 5 minutes à 80°C afin de stopper la réaction et précipiter les protéines.

[0134] Mesure de la consommation de PEP par HPLC

[0135] Les tests d’activité enzymatique sont premièrement centrifugés 10 minutes à 15000xg afin de précipiter les protéines. Le surnageant obtenu est filtré sur une membrane 0,22pm avant analyse HPLC.

[0136] La méthode utilisée est décrite ci-dessous :

- Système : Agilent 1100 (Agilent)

- Colonne : Luna OMEGA polar C18 (Phenomenex)

- Phase mobile : Acide phosphorique 1mM

- Débit : 0,3ml/min

- Détection UV : 220nm

- Injection : 5mI

- Durée d’analyse : 15 minutes

[0137] Afin de quantifier la quantité de PEP présente dans les échantillons, une gamme de standards est analysée avec des concentrations en PEP de 0,1 mM à 1mM.

[0138] Mesure de la concentration en PCA et CA par HPLC

La colonne utilisée est la suivante: Kinetex® 5pm F5 100A 150x4.6mm Phases Mobiles : Acide formique 0.1% et Acétonitrile Gradient :

5min : 100% Acide formique

5min à 25min : 75% acide formique - 25% acétonitrile

25min à 30min : 62% Acide formique - 38% Acétonitrile

30min à 35min : 100% Acide formique

Débit : 1 ml/min

Température du four : 40°C

Injection échantillon : 10mI Détection acide coumarique : 315nm Détection acide cinnamique : 280nm

[0139] Clonage des gènes phaA/B dans un plasmide d’expression arabinose dépendant Les gènes phhA/B sont amplifiés par PCR directement à partir d’ADNg de la souche Pseudomonas putida KT2440 et clonés dans un plasmide pBBR1-MCS2, sous la dépendance du promoteur araC/pBAD.

[0140] Pour effectuer ces constructions, la méthode Gibson Assembly est utilisée (Gibson et al., 2009). Le produit de la réaction est transformé dans la souche E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Les cellules transformées sont étalées sur milieu gélosé avec antibiotique pour sélection. Les colonies obtenues sont ensuite vérifiées par PCR et les plasmides séquencés afin de les valider.

[0141] Le plasmide d’expression est ensuite transformé dans la souche d’E. coli donneuse S17.1 afin d’être transféré dans les souches de Pseudomonas putida d’intérêt par conjugaison.

[0142] Résultats

[0143] L’activité de l’enzyme AroF-l sauvage de Pseudomonas putida est bien inhibée par la tyrosine (Figure 1). L’introduction de la mutation P160L permet de rendre l’enzyme partiellement insensible à cette inhibition par la tyrosine (Figure 2), et l’effet peut encore être légèrement amélioré par l’introduction d’une double mutation P160L/Q164A (Figure 3). Par contre, les double mutations P160L/G191K et P160L/S190, ont un effet délétère sur l’enzyme AroF-l qui n’a plus aucune activité, que ce soit en présence de tyrosine ou non (Figure 3).

[0144] En revanche, et de manière particulièrement intéressante et surprenante, l’introduction d’une double mutation P160L/S193A restaure la quasi-totalité de l’activité enzymatique et rend l’enzyme AroF-l presque complètement insensible à l’inhibition de la tyrosine (Figure 3). [0145] Ces résultats sont confirmés par la Figure 4 qui montre bien l’effet synergique de cette double mutation sur la rétro-régulation négative exercée par la tyrosine par rapport à la seule mutation P160L ou S193A.

[0146] Exemple 2: Souches de Pseudomonas putida génétiquement modifiées pour la synthèse de composé phénylpropanoïde

[0147] Afin de permettre la biosynthèse de composés phénylpropanoïdes, plusieurs modifications génétiques sont réalisées au sein de la souche de Pseudomonas putida. Pour cela, des gènes recombinants additionnels codant des enzymes de la synthèse de composés phénylpropanoïdes tels que l’acide coumarique ou la frambinone, sont intégrés au chromosome de Pseudomonas putida selon le protocole suivant.

[0148] Protocole de mutagenèse génétique de Pseudomonas putida :

[0149] La mutagenèse génétique chez Pseudomonas putida s’effectue au moyen de plasmides suicides qui s’intégrent dans le chromosome et en ressortent en laissant la délétion ou l’insertion de gènes désirées. Le plasmide suicide utilisé est le pK18mobsacB (Schàfer A, Tauch A, Jàger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: sélection of defined délétions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene 1994 Jul 22 ; 145(1 ) :69-73). Ce plasmide porte une cassette de résistance à l’antibiotique Kanamycine et la cassette de contre-sélection sacB. Il comporte également une origine de réplication qui ne fonctionne que chez la bactérie E. coli, et une origine de transfert oriT qui lui permet d’être transféré par conjugaison d’E. coli à une autre souche bactérienne comme Pseudomonas putida.

[0150] Les gènes à insérer sont clonés dans ce plasmide, ainsi que les zones d’homologie au lieu d’insertion choisi sur le chromosome bactérien. Ces zones d’homologie sont clonées de part et d’autre du gène à insérer, et doivent avoir une taille de 800 paires de bases minimum.

[0151] Les clonages se font dans une souche d’Escherichia coli capable de conjuguer (en général la souche S17.1 , Simon, R., Priefer, U. and A. Pülher, A broad host range mobilization System for in vivo genetic engineering : transposon mutagenesis in gram négative bacteria. Nature BioTechnology volume 1 , pages784-791 (1983)).

[0152] Le protocole de conjugaison est le suivant :

[0153] Une goutte de culture de S17.1/plasmide suicide (souche donneuse) est déposée sur un milieu riche LB Agar (Luria-Miller, Roth, référence X968.2 contenants de l’agar à 1 ,5%), et une goutte de culture de la souche Pseudomonas putida (souche receveuse) est déposée sur la première goutte. La boîte de culture est incubée une nuit à 30°C. La goutte est ensuite diluée dans du MgS04 10 mM et le protocole est réalisé comme décrit à la figure 6.

[0154] Le plasmide de conjugaison pK18mobsacB est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le génome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants. Le plasmide étant résistant à la Kanamycine, le milieu de sélection des transconjugants est du LB Agar contenant de l’Ampicilline 100 mg/ml ( Pseudomonas putida résiste naturellement à cet antibiotique), et de la Kanamycine à 50 mg/ml (Kanamycine, ROTH référence T832.4 ; Ampicilline, EUROMEDEX, référence EU0400-D). Ce milieu permet donc de sélectionner les bactéries Pseudomonas putida dans lesquelles un plasmide s’est intégré.

[0155] La suite du protocole comprend les étapes suivantes :

- Excision du plasmide suicide : prélever 8 clones Kn+AmpR et les mettre en culture dans 10ml de milieu LB+Amp 100 mg/ml (dilution 1/2000) à 30°C avec agitation. Incuber entre 12h et 24h.

- Contre-sélection sacB sur Sucrose 25% : strier la culture du pool de clones sur YT agar et YT+Sucrose 25% agar. Incuber à 30°C jusqu’au lendemain matin. Repiquer 20-25 clones Sucrose+ sur YT agar, YT+Sucrose 25% agar et YT agar +Kn 50 mg/ml. Incuber à 30°C jusqu’au lendemain matin.

YT : Yeast extract tryptone

- Vérification par PCR de l’insertion du gène

[0156] Des primers s’hybridant de part et d’autre de la zone chromosomique d’insertion permettent de vérifier les clones mutants en réalisant des PCR sur colonie pour les clones KnS et Sucrose+. [0157] Gènes à insérer dans Pseudomonas putida

[0158] Un ou plusieurs des gènes listés ci-après sont insérés dans Pseudomonas putida afin de permettre la biosynthèse de composés phénylpropanoïdes, comme par exemple l’acide coumarique ou la frambinone. [0159] Ces gènes ont été spécifiquement identifiés et sélectionnés chez des microorganismes connus. Les gènes sont synthétisés et les codons sont optimisés pour une expression maximale chez Pseudomonas putida.

[0160] Certains gènes sont endogènes à Pseudomonas putida, mais il est recommandé de tester l’activité des protéines pour lesquelles ils codent et si ces enzymes ne sont pas assez actives ou leur expression insuffisante, ces activités peuvent être optimisées.

[0161] Gènes codant une enzyme muté 3-Deoxy-D-arabino-Heptulodonate 7- phosphate (DHAP) synthase :

[0162] SEQ ID NO :10 : séquence du gène de la 3-Deoxy-D-arabino- Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) synthase avec mutation P160L ( Pseudomonas putida KT2440) codant la DHAP synthase de séquence SEQ ID NO :2.

[0163] SEQ ID NO :11 : séquence du gène de la 3-Deoxy-D-arabino-

Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) synthase avec double mutation P160L/Q164A ( Pseudomonas putida KT2440) codant la DHAP synthase de séquence SEQ ID NO :3.

[0164] SEQ ID NO :12 : séquence du gène de la 3-Deoxy-D-arabino-

Heptulodonate 7-phosphate (DHAP) synthase avec double mutation P160L/S193A ( Pseudomonas putida KT2440) codant la DHAP synthase de séquence SEQ ID NO :4. [0165] Gènes additionnels permettant la synthèse de composés phénylpropanoïdes

[0166] SEQ ID NO :13: gène (Pseudomonas putida KT2440) de la phénylalanine hydroxylase (phhA) codant la phhA de séquence SEQ ID NO :5. [0167] SEQ ID NO :14: gène (Pseudomonas putida KT2440) de la tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB) codant la phhB de séquence SEQ ID NO :6.

[0168] SEQ ID NO :15: gène ( Rhodotorula glutinis) de la tyrosine ammonia lyase codant la beta-xylosidase de séquence SEQ ID NO :7.

[0169] SEQ ID NO :16 : gène (gène fcs Pseudomonas putida KT2440) de la 4- coumarate-CoA ligase (4-CL) codant la 4-CL de séquence SEQ ID NO :8.

[0170] SEQ ID NO :17: gène ( Rheum palmatum) de la benzalacétone synthase (BAS) codant la BAS de séquence SEQ ID NO : 9.

[0171] Exemple 3: Activité in vivo d’une souche Pseudomonas putida génétiquement modifiées selon l’invention

[0172] Préparation d’un mutant AroF-l-fbr P160L/S193A

[0173] Une souche Pseudomonas putida KT2440 a été génétiquement modifiée tel que décrit dans l’exemple 1 de manière à exprimer le gène AroF-l codant pour la DHAP synthase comprenant la double mutation P160L/S193A définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO: 4, et à exprimer le gène recombinant additionnel codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL_RG_OPT) hétérologue de séquence SEQ ID NO : 7.

[0174] Cette souche est appelée « mutant AroF-l-fbr P160L/S193A ».

[0175] L’activité du mutant AroF-l-fbr P160L/S193A sur la production d’acide coumarique (CPA) ou d’acide cinnamique (CA) a été déterminée en mesurant les quantités produites de ces acides comparativement à une souche Pseudomonas putida KT2440 génétiquement modifiée de manière à exprimer l’enzyme AroF-l sauvage et qui sert de contrôle (Mutant AroF-l-WT).

[0176] Résultats

[0177] La production d’acide cinnamique augmente de façon significative dans une souche de P. putida exprimant l’enzyme AroF-l fbr ayant la double mutation P160L/S193A (Figure 6). [0178] Optimisation du mutant AroF-l-fbr P160L/S193A pour la production d’acide coumarique

[0179] Le mutant AroF-l-fbr P160L/S193A a été modifié afin d’exprimer les gènes recombinants additionnels codants pour une phénylalanine hydroxylase (phhA) de séquence SEQ ID NO : 5 et une tétrahydrobiopterine deshydratase (phhB) de séquence SEQ ID NO : 6. Les gènes codants pour ces enzymes ont été clonés dans un plasmide et exprimés sous la dépendance du promoteur inductible araC/pBADopt, l’induction étant réalisée avec 0,5% d’arabinose : plasmide pC2F387.

[0180] Cette souche est appelée « mutant AroF-l-fbr optimisé ».

[0181] La production d’acide coumarique (CPA) ou d’acide cinnamique (CA) du mutant AroF-l-fbr optimisé a été mesurée puis comparée à celle obtenue avec le mutant AroF-l-fbr P160L/S193A, et celle obtenue avec deux souches contrôles à savoir :

- une souche Pseudomonas putida KT2440 exprimant l’enzyme AroF-l sauvage (Mutant AroF-l-WT), et

- une souche Pseudomonas putida KT2440 exprimant l’enzyme AroF-l sauvage et les deux enzymes phhA et phhB de séquences SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 respectivement (Mutant AroF-l-WT phhA/B).

[0182] Résultats

[0183] Les résultats présentés en Figure 6 montrent que la surexpression des gènes phhA et phhB dans la souche mutante AroFI-WT entraîne une production plus importante de d’acide phénoliques (PCA + CA).

[0184] De manière particulièrement intéressante, le mutant AroF-l-fbr optimisé permet d’obtenir une production d’acides phénoliques totaux bien plus importante que le mutant AroF-l-fbr P160L/S193A et le mutant AroF-l-WT phhA/B. En proportion, l’acide coumarique représente la quasi-totalité des phénoliques totaux produits et c’est avantageux car l’acide cinnamique n’est pas un composé exploitable industriellement pour la production de composés phénylpropanoïdes. [0185] Ces résultats démontrent bien que le mutant AroF-l-fbr optimisé est particulièrement adapté pour la production de composés phénylpropanoïdes, et particulièrement d’acide coumarique.

Texte libre du listage de séquences [0186] Dans la présente demande, il est fait référence aux listages de séquences dont les identificateurs (ou « SEQ ID NO ») sont listés dans le tableau ci-dessous. Quelle que soit la forme sous laquelle les listages sont fournis, ils font partie de la présente demande.

[0187] [Tableau 4]

Liste des documents cités

Documents brevets

[0188] À toute fin utile, le(s) document(s) brevet(s) suivant(s) est (sont) cité(s) : - patcitl : FR1234567 (numéro de dépôt) ;

- patcit2 : US2004230550 (numéro de publication) ; et

- patcit3 : FR2795457 (numéro de publication).

Littérature non-brevet

[0189] À toute fin utile, les éléments non-brevets suivants sont cités : - nplcitl : Klesk et al., 2004, J. Agric. Food Chem. 52, 5155- 61 ;

- nplcit2 : Larsen et al., 1991 , Acta Agric. Scand. 41 , 447-54). - nplcit3 : Kikuchi Y et al. « Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli.” Appl Environ Microbiol 63:761-762 (1997).) : P160L, Q164A, S190A, G191 K, S193A, I225P.

- nplcit4 : Cui, Di et al., “Molecular basis for feedback inhibition of tyrosine-regulated 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Escherichia coli”, J Struct Biol. 2019 Jun 1 ; 206(3) :322-334.

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- nplcit7 : Kang et al., 2012 “Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain »

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