PASTAS DE OLEAGINOSAS.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el área de la biotecnología, más específicamente con procesos biológicos para la detoxificación de pastas oleaginosas para su uso en la formulación de alimento para animales, así como para la producción concomitante de biocarburantes/biolubrícantes, enfocados a la industria cosmética, automotriz y metal mecánica. OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es generar un proceso que permita la detoxificación y obtención concomitante de biocarburantes/biolubrícantes a partir de pastas de oleaginosas para la industria cosmética, automotriz y metal mecánica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Jatmpha curcas L. y Ricinus communis, comúnmente llamados Jatropha y Ricino o Higuerilla respectivamente, son plantas que producen semillas oleaginosas reconocidas mundialmente como sustratos Idóneos para la obtención de aceites no comestibles que son ampliamente utilizados para la síntesis de biodiesel. Por lo tanto, durante la extracción de los aceites para la producción de biodiesel, se genera una enorme cantidad de pastas como subproductos. Estas pastas, tienen un alto contenido de proteína y más de 5% de aceite residual. No obstante, debido a su alta toxicidad estas pastas causan una grave contaminación del medio ambiente y en la mayoría de los casos se desperdician tanto proteina de alta calidad como lípidos remanentes, que pudieran ser aprovechados para la formulación de alimento para animales como para la producción de biocarburantes/biolubrícantes de alto valor. Loe compuestos tóxicos de Jatropha son principalmente esteres de forbol, sus derivados, curcina e inhibidores de tripsina, mientras que en higuerilla la toxicidad se debe principalmente a la presencia de rícina, ricinina y el alérgeno CB-1A. Los esteres de forbol son diterpenos con estructura tetracíclica unidos a distintos ácidos grasos, con una fuerte actividad promotora de tumores. Por otro lado, la ricina es un dlmero glicoproteico compuesto por una subunidad enzimática que inactiva ribosomas, unida mediante un puente disulfuro a una lectina y es considerada como una de las sustancias proteicas más tóxicas. En estos tipos de pastas oleaginosas, los esteres de forbol y la ricina son los compuestos que se busca eliminar principalmente para disminuir o eliminar su toxicidad.

Los procesos más utilizados para la detoxificación de pastas oleaginosas de Jatropha e Higuerilla son térmicos, químico-enzimáticos y fermentativos. En Jatropha se han propuesto varios métodos para tratar de eliminar los ésteres de forbol, entre los que se incluyen, extracción con solventes, tratamientos térmicos, radiación ionizada entre otros. Por otra parte, los tratamientos más empleados para la detoxificación de Higuerilla son básicamente térmicos dada la labilidad intrínseca de la ricina a temperaturas superiores a 80°C. También hay reportes en la literatura referentes al cultivo de microorganismos por Fermentación en Medio Sólido (FMS) sobre pastas oleaginosas, que permiten disminuir la toxicidad de las mismas. Desgraciadamente en la mayoría de los casos, aunque la toxicidad de las pastas disminuye considerablemente después de los tratamientos, en el estado del arte no se logra la completa remoción de esteres de forbol y ricina en este tipo de pastas oleaginosas. Además, las pastas tratadas son en general destinadas para consumo como alimento animal y no se aprovechan para la obtención de otras moléculas de mayor valor agregado. Por otra parte, los procesos para la obtención de biocarburantes/biolubricantes a partir de lipidos, involucran la via química o enzimática. Un biocarburante es una mezcla de sustancias orgánicas que se utiliza como combustible en los motores de combustión interna y deriva de la biomasa, materia orgánica originada en un proceso biológico, espontáneo o provocado. Un biolubricante es un lubricante renovable, que es biodegradable, no tóxico y tiene una emisión neta de cero gases de efecto invernadero. Los biocarburantes/biolubricantes obtenidos a partir de lípidos son en su mayoría esteres alquílicos con distinta longitud de cadena; los esteres de cadena corta (alcoholes con 4 o menos carbonos) son generalmente empleados como biocarburantes tipo biodiesel, mientras que los de cadena mediana o larga (alcoholes de más de 4 carbonos) se emplean como biolubricantes en distintas aplicaciones. En catálisis homogénea, sin lugar a dudas la transesterificación catalizada por álcalis es la vía de síntesis más reportada, aunque también la esterificación directa catalizada por ácidos es utilizada, sobre todo cuando los sustratos contienen una concentración elevada de ácidos grasos libres (>5%). La catálisis heterogénea aunque menos empleada, puede resultar más conveniente ya que es posible separar y reutilizar los catalizadores, sin embargo los catalizadores heterogéneos químicos pueden ser tóxicos. Tanto la catálisis homogénea como heterogénea química requiere de solventes anhidros y genera subproductos contaminantes. Por lo anterior, la vía enzimática catalizada por lipasas para la obtención de biocarburantes/biolubricantes es altamente deseable, sin embargo es poco utilizada debido al alto costo de este tipo de enzimas. Por los motivos expuestos anteriormente, en la presente invención se propone un proceso biotecnológico integral que permita: detoxificar de manera efectiva pastas oleaginosas de Jatropha e Higuerilla después de un tratamiento térmico y el cultivo de hongos filamentosos por FMS, así como obtener lipasas que coadyuven tanto en la detoxificación de las pastas como en la catálisis concomitante de biocarburantes/biolubricantes, permitiendo de esta manera el aprovechamiento integral de estos residuos tóxicos.

La patente CN 104082525 A así como la patente CN 103734559 A revelan la aplicación de Klebsiella variicola o Enterobacter gergoviae y Morganella morganii respectivamente, en la detoxificación de pasta de Jatropha curcas por fermentación. El método mejora la tasa de degradación de esteres de forbol en la pasta, acorta el tiempo de fermentación, elimina componentes nutricionales, es simple, son de bajo costo y además en la patente CN 103734559 A se mejora el valor nutrimental de la pasta. Sin embargo, en ninguna de las dos patentes se utiliza la pasta para la obtención concomitante de otros productos de valor agregado.

La patente US 20110311710 A1 se refiere al proceso para eliminar los componentes tóxicos de la planta de Jatropha para la producción de un alimento. La detoxificación se realiza con álcali (hidróxido de sodio) y un alcohol de cadena corta (metanol), dando por resultado la eliminación de los ésteres de forbol. El proceso propuesto en la patente US 20110311710 A1 emplea químicos corrosivos y solventes tóxicos, a diferencia del proceso que se propone en la presente invención donde se emplean microorganismos reconocidos como seguros y alcohol etílico grado alimenticio que es además recuperado durante el proceso.

La patente CN 102907628 B propone un método de detoxificación de Jatropha por extrusión a una temperatura que oscila entre 80 - 200°C; aunque el proceso es simple y conveniente para su uso industrial a gran escala, no se logra la completa remoción de los ésteres de forbol. La patente CN 102334597 A proporciona un método para la preparación de piensos a partir de la pasta detoxificada de Jatropha curcas a través de la fermentación del hongo Pleurotus ostreatus. El método comprende los pasos de: preparación del medio de cultivo sólido o líquido utilizando la pasta de Jatropha curcas como ingrediente principal; esterilización; inoculación de la cepa Pleurotus ostreatus; 3 a 10 días de fermentación para eliminar los ingredientes tóxicos de la pasta de Jatropha curcas, en donde la pasta puede servir como alimento animal. No se reporta el uso de la pasta fermentada para otra aplicación.

La patente Pl 0906455-9 A2 se refiere a un método para la producción por fermentación en estado sólido de lipasas fúngicas de bajo costo a partir de residuos agroindustriales. A diferencia de Pl 0906455-9 A2 donde se emplean hongos filamentosos de los géneros Aspergillus, Trichoderma y Rhizopus en la presente invención se emplean hongos del género Rhizomucorque se caracterizan por ser microorganismos termófilos capaces de producir lipasas termoestables. La Invención Pl 0906455-9 A2 se limita a la producción de lipasas y la pastas no se detoxifican totalmente, en cambio el proceso de la presente invención la pastas de oleaginosas fermentadas y ricas en lipasas son empleadas en la síntesis concomitante de biocarburantes/biolubricantes asegurando al final del proceso una detoxificación de hasta el 99% de las pastas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Los detalles característicos del proceso de detoxificación y obtención concomitante de biocarburantes/biolubricantes a partir de pastas de oleaginosas, se muestran claramente en la siguiente descripción y en las figuras que se acompañan, con carácter ilustrativo y no limitativo:

La figura 1 , muestra un diagrama del proceso general para la producción de la lipasa de Rhizomucor miehei a partir de cultivos por fermentación en medio sólido en pasta de Jatropha, para posteriormente ser utilizada como biocatalizador para la producción de un biolubricante y adicionalmente para la producción de biodiesel. La figura 2, muestra la actividad Lipasa detectada en las pastas fermentadas de Jatropha e Higuerilla con Rhizomucor miehei a los 4 y 2 días de fermentación a 40°C. La determinación se llevó a cabo utilizando como sustrato p-nitrofenil palmitato (pNPP), bajo condiciones de temperatura de 37 °C y pH 7.0

La figura 3, muestra el análisis por cromatografía en capa fina (TLC) de los llpidos contenidos en pastas de Jatropha e Higuerilla en distintas fases del proceso propuesto. 1) Estándares: a - monooleína; b - dioleína; c - ácido oleico; d - trioleína; e - etíl oleato; f - butil oleato; g - ácido ricinoleico; y h - butil ricinoleato). 2) lípidos remanentes en las pastas antes de la fermentación con Rhizomucor miehei, se observa de manera general una presencia importante de ácidos grasos libres y otros lípidos; 3) lípidos remanentes en las pastas después de la fermentación con Rhizomucor miehei, con una presencia mayoritaria de ácidos grasos; 4) butil ásteres sintetizados con los lípidos remanentes de las pastas fermentadas; y 5) etíl esteres sintetizados con los lípidos remanentes de las pastas fermentadas.

La figura 4, muestra el análisis de esteres de forbol (EF) presentes en las pastas de Jatropha después de los diversos tratamientos durante el proceso para la obtención del butil esteres. Se determinó el contenido de ésteres de forbol (EF) en equivalentes de EF 12-miristato-13-acetato (12M13A) por gramo de pasta. JT: pasta de Jatropha tóxica; JT+E: pasta de Jatropha tóxica esterlízada; JT+E+Rm: pasta de jatropha tóxica esterilizada fermentada con Rhizomucor miehei durante 4 días a 40 °C; JT+E+Rm+S: pasta residual de Jatropha tóxica esterilizada fermentada con Rhizomucor miehei y empleada en la síntesis de butil ésteres. Se observa que, al final del proceso el contenido de EF es muy bajo.

La Figura 5, muestra el análisis del contenido de ricina en equivalentes de aglutinina 120 (RCA120) por gramo de pasta. H: pasta de higuerilla; JT+ Rm. pasta de higuerilla fermentada con Rhizomucor miehei durante 2 días a 40 °C; H+E: pasta de higuerilla esterilizada. Se observa que, al fermentar la pasta con Rhizomucor miehei se disminuye la toxicidad de manera importante y con un simple proceso de esterilización, se llega hasta eliminar casi por completo estos compuestos tóxicos.

La Figura 6, muestra el análisis bromatológico de las pastas de Jatropha tóxica con diferentes tratamientos. JT: pasta de Jatropha tóxica; JT+E: pasta de Jatropha tóxica esterilizada; JT+E+Rm: pasta de Jatropha tóxica esterilizada fermentada con Rhizomucor miehei durante 4 días a 40 °C; JT+E+Rm+S: pasta residual de Jatropha tóxica esterilizada fermentada con Rhizomucor miehei y empleada en la síntesis de butil ésteres. Se puede observar de manera general que el contenido de lípidos disminuye conforme aumentan las etapas del proceso, principalmente a una eliminación casi completa en la pasta residual para la obtención del biolubricante (JT+E+Rm+S). En caso contrario, el % de proteína, carbohidratos, cenizas y fibra cruda aumenta ligeramente de manera secuencial hasta el final del proceso. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al proceso que permite la detoxificación y obtención concomitante de biocarburantes/biolubrícantes a partir de pastas de oleaginosas, particularmente a partir de pasta de Jatropha, y de pasta de higuerilla. Como se muestra en el diagrama de la figura 1 , el proceso para la producción de biocatalizador con pasta de oleaginosas y el uso de la pasta residual detoxificada para la formulación de alimento consiste de 6 etapas: 1) se muelen los residuos en un molino de cuchillas, hasta lograr un tamaño de partícula entre 2 y 10 mm, preferentemente 5 mm. 2) se humecta la pasta agregando agua en un 10 a 40% y se trata térmicamente con vapor a una temperatura de 100 a 150'C durante 15 a 60 min, preferentemente se ajusta la humedad a 20% y el tratamiento térmico es a 120°C durante 15 min. El tratamiento térmico puede ser con ayuda de una autoclave o cualquier dispositivo generador de vapor. Para los objetivos de la invención es posible omitir el tratamiento térmico descrito en esta etapa e inocular directamente como en la etapa siguiente. 3) se ajusta la humedad de la pasta con o sin tratamiento térmico en un rango de 30 a 60%, preferentemente 40% y se Inoculan 1X10 ³ a 1X10 ⁹ , preferentemente 1X10 ⁷ esporas por gramo de materia seca del hongo filamentoso Rhizomucormieheiy se mantiene el cultivo durante 1 a 8 días a temperatura entre 25 a 50°C, preferentemente 4 días a 40°C, para obtener un fermento sólido logrando una remoción entre el 45-80% de los tóxicos contenidos en las pastas sin tratamiento térmico y entre el 45-99% en las pastas con tratamiento térmico. Para los objetivos de la invención, existen diversos hongos filamentosos que se pueden utilizar Aspergillus sp. Rhizopus sp., Rhizomu∞r sp., para obtener el fermento sólido. 4) se seca el fermento sólido en un homo de charolas de convección a una temperatura de 25°C a 45°C, preferentemente 30°C, hasta alcanzar una humedad entre 2 y 10%, preferentemente del 5%. Los residuos pueden secarse en cualquier otro tipo de homo o bajo el sol, colocándolos en una capa no mayor a 3 cm, no hay restricción alguna. 5) el fermento seco es empleado como biocatalizador para la síntesis de compuestos con aplicación en los sectores en industria cosmética, automotriz y metal mecánica. En este caso la reacción de síntesis de esteres alquílicos se lleva a cabo aprovechando los Kpidos remanentes (tri-di-mono-glicéridos y ácidos grasos) en las pastas oleaginosas después del proceso descrito en las etapas 1 a 4 o adicionando más lípidos (tri-di-mono- glicéridos y ácidos grasos) al sistema de reacción. La reacción de síntesis se lleva a cabo empleando alcoholes primarios o secundarios con cadenas alquilo con 1 a 12 carbonos, en presencia o ausencia de un co-solvente que puede ser hexano, heptano, iso-octano o cualquier solvente apolar con un log de P entre 2 y 5, preferentemente se emplean alcoholes primarios (anhidros o ligeramente hidratados < 5%) como el etanol absoluto o el etanol comercial 96 GL, que puede ser empleado como sustrato y solvente en la reacción (sistema libre de solvente). El biocatalizador se emplea en una proporción que varia entre el 10 al 40 % p/v y la reacción se lleva a cabo a una temperatura entre 25 ^e C y 65°C con una agitación de 100 y 1000 rpm, preferentemente la proporción de biocatalizador es de 20 % p/v y la reacción se efectúa a 50 "C y 500 rpm. 6) se separa la pasta de la fracción orgánica por filtración o decantación. Por una parte, la pasta detoxificada después de los tratamientos descritos anteriormente (etapa 1 a 5) se seca como en la etapa 4 para eliminar el solvente remanente y ésta puede ser empleada para su uso como forraje, composites, y muchos otros procesos biotecnológicos por no ser considerada como tóxica. Por otra parte, el solvente en la fracción orgánica es recuperado por destilación simple y el residuo oleoso empleado como biocarburante/biolubricante para su uso en industria cosmética, automotriz y metal mecánica o como intermediario precursor de otros químicos finos.

Ejemplo 1 : Síntesis de butil ésteres con pasta de Jatropha tóxica fermentada.

En un reactor agregar 1000 mL de isooctano. Agregar 200 g de pasta de Jatropha fermentada por 4 días con Rhizomucor miehei seca. Agregar 19 gr de 1-butanol y permitir la reacción durante 3 días a 50 °C y 500 rpm. Separar la pasta por filtración o decantación. Lavar la pasta con 2 litros de etanol y recuperar el etanol por filtración. Secar la pasta con aireación en un homo de charolas de convección a una temperatura de 30°C hasta alcanzar una humedad del 5%. Eliminar el agua del isooctano conteniendo la mezcla de ésteres butílicos adicionando 25 gr de MgSÜ4 anhidro o 1 gr de tamices moleculares de 3A. Separar el MgS04 o los tamices moleculares del solvente por decantación. De manera alternativa es posible eliminar el agua al pasar el isooctano conteniendo la mezcla de esteres butílicos a través de una columna empacada con tamices moleculares en la misma relación descrita anteriormente (1 gr de tamices/1 litro de solvente). El producto resultante del paso anterior puede ser empleado como biocarburante con propiedades similares a la gasolina pero con mayor poder calorífico. Por otro lado es posible recuperar el isooctano evaporar el solvente por destilación en un rotavapor a 40 °C y vacío, donde se obtiene una fracción oleosa caracterizada como un biolubrícante con propiedades similares a un estándar de butil oleato.

Ejemplo 2. Síntesis de butil esteres con pasta de Higuerilla fermentada. En un reactor agregar 1000 mL de isooctano. Agregar 200 g de pasta de Higuerilla fermentada por 2 días con Rhizomucor miehei seca. Agregar 19 gr de 1-butanol y permitir la reacción durante 3 días a 50 ^e C y 500 rpm. Separar la pasta por filtración o decantación. Lavar la pasta con 2 litros de etanol y recuperar el etanol por filtración. Secar la pasta con aireación en un homo de charolas de convección a una temperatura de 30°C hasta alcanzar una humedad del 5%. Eliminar el agua del isooctano conteniendo la mezcla de esteres butílicos adicionando 25 gr de MgSÜ4 anhidro o 1 gr de tamices moleculares de 3A. Separar el MgS0 ₄ o los tamices moleculares del solvente por decantación. De manera alternativa es posible eliminar el agua al pasar el isooctano conteniendo la mezcla de ésteres butílicos a través de una columna empacada con tamices moleculares en la misma relación descrita anteriormente (1 gr de tamices/1 litro de solvente). El producto resultante del paso anterior puede ser empleado como biocarburante con propiedades similares a la gasolina pero con mayor poder calorífico. Por otro lado es posible recuperar el isooctano evaporar el solvente por destilación en un rotavapor a 40 °C y vacío, donde se obtiene una fracción oleosa caracterizada como un biolubrícante con propiedades similares a un estándar de butil ricinoleato.

Ejemplo 3. Síntesis de etil ésteres con pasta de Jatropha fermentada.

En un reactor agregar 60 L de alcohol etílico al 96%. Agregar 7 kg de pasta de Jatropha fermentada por 4 días con Rhizomucor miehei seca. Permitir la reacción durante 4 días a 50 °C y 500 rpm. Separar la pasta por filtración o decantación. Lavar la pasta con 60 litros de etanol. Secar la pasta con aireación en un homo de charolas de convección a una temperatura de 30°C hasta alcanzar una humedad del 5%. Eliminar el agua del solvente conteniendo la mezcla de ásteres etílicos adicionando 1 kg de tamices moleculares de 3 A. El producto resultante del paso anterior puede ser empleado como biocarburante con propiedades similares al bioetanol pero con mayor poder calorífico. Por otro lado es posible recuperar el solvente por destilación simple donde se obtiene una fracción oleosa caracterizada como un biocarburante con mayor poder calorífico que el producto obtenido en el paso anterior y con propiedades similares a las del biodiesel.

Ejemplo 4. Síntesis de etil ásteres con pasta de Higuerilla fermentada.

En un reactor agregar 60 L de alcohol etílico al 96%. Agregar 7 kg de pasta de Higuerilla fermentada por 2 días con Rhizomucormiehei seca. Permitir la reacción durante 4 días a 50 °C y 500 rpm. Separar la pasta por filtración o decantación. Lavar la pasta con 60 litros de etanol. Secar la pasta con aireación en un horno de charolas de convección a una temperatura de 30°C hasta alcanzar una humedad del 5%. Eliminar el agua del solvente conteniendo la mezcla de ásteres etílicos adicionando 1 kg de tamices moleculares de 3 A. El producto resultante del paso anterior puede ser empleado como biocarburante con propiedades similares al bioetanol pero con mayor poder calorífico. Por otro lado es posible recuperar el solvente por destilación simple donde se obtiene una fracción oleosa caracterizada como un biocarburante con mayor poder calorífico que el producto obtenido en el paso anterior y con propiedades similares a las del biódiesel.

Ejemplo 5. Toxicidad aguda (DL50) de pastas de Jatropha. La toxicidad aguda (DL50) de la pasta de Jatropha no tóxica (JNT), pasta de Jatropha tóxica (JT) y pasta de Jatropha tóxica fermentada con Rhizomucormiehei (JT+E+Rm), se evaluó mediante ensayos in vivo, en un modelo animal de ratones machos Balb-c de 7 semanas de edad. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos; y se observa que para la pasta de Jatropha tóxica hubo una mortalidad (M) de todo el grupo a partir del 5 día, mientras que para la pasta de Jatropha no tóxica y la pasta fermentada con Rhizomucor miehei no hubo mortalidad (M), a excepción de esta última donde hubo un deceso. Tabla 1.