Stand der Technik Antibiotika bilden eine hinsichtlich ihrer Struktur und biologischen Wirkung heterologe Gruppe von Verbindungen, die zu den in der Human-und Veteri- närmedizin sowie im Pflanzenschutz am meisten angewandten Therapeutika zählen. Zu den Antibiotika gehören von Mikroorganismen gebildete Stoffe sowie daraus gebildete Derivate, die bei intrasomatischer Anwendung Infekti- onskrankheiten bekämpfen können. Neben den antibakteriellen Antibiotika wurden Antibiotika mit antifungalen, antiviralen trypanoziden sowie mit kan- zerostatischen Eigenschaften entdeckt. Durch die Anwendung von auf fer- mentativem Wege hergestellten Antibiotika in der Krebschemotherapie wurde die ursprüngliche Definition ebenso erweitert wie durch die Anwendung in der Tieraufzucht als Ergotropika und im Pflanzenschutz als Herbizide, Insektizide, Pestizide, Akarizide, Nematozide, Molluskizide (U. Gräfe : Biochemie der Antibi- otika, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, New York, 1992).

Die Auffindung neuer zellulärer Wirkorte für Antibiotika und ähnliche bioaktive Wirkstoffe ist bis heute noch nicht abgeschlossen und führt zu neuen Anwen- dungsmöglichkeiten in der Human-und Veterinärmedizin sowie beispielsweise im Pflanzenschutz.

Die extensive partialsynthetische Abwandlung von natürlich vorkommenden Antibiotika und die chemische Totalsynthese haben schließlich zu Heilmitteln geführt, die das originäre Potential von Naturstoffen erheblich übertreffen.

Schließlich wurden auch Totalsynthetika ohne Bezug auf mikrobielle Produkte aufgefunden, die hinsichtlich ihrer Wirkung auf Mikroorganismen und ihres Wirkungsmechanismus den klassischen Antibiotika gleichzusetzen sind (U. Gräfe : Biochemie der Antibiotika, Spektrum Akademischer Verlag, Heidel- berg, Berlin, New York, 1992).

Im folgenden wird der Begriff Antibiotika in diesem umfassenden Sinne für biologisch aktive Wirkstoffe mit selektiven Wirkungen an unterschiedlichen Wirkorten von pathogenen Mikroorganismen (Bakterien, Pilze Viren) und phy- logenetisch höherstehenden Organismen (z. B. Rickettsien, Trypanosomen, Tumorzellen oder Parasiten) gebraucht.

Antibiotika mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten für verschiedene Anwendungsgebiete werden ständig durch chemische Reaktionen modifiziert, um sie neuen Aufgabenstellungen anzupassen. Keine andere Gruppe von Anti- biotika hat eine so umfangreiche halbsynthetische Modifikation erfahren wie die der ß-Laktam-Antibiotika. Die Entdeckung der 6-Aminopenicillansäure als Grundkörper der Penicilline und der 7-Aminocephalosporansäure als Grundkör- per der Chephalosporine leitete eine neue Etappe der Modifikation mit der Zielrichtung wirkungsoptimierter Derivate ein, die bis heute nicht abgeschlos- sen ist.

Die Vorteile der ursprünglich entdeckten Penicilline und Cephalosporine wie sehr geringe Toxizität und hohe bakterizide Wirkung, wurden durch ständige chemische Modifikation den steigenden Anforderungen angepasst. US-A- 5,695,951 und US-A5,939,299 offenbaren Methoden, das Chephalosporin- Derivat Cephalexin mittels einer Haloperoxidase zu chlorieren. Eine Methode zur enzymatischen Einführung von Halogenen unter Nutzung von Haloperoxi- dasen wird in WO-A-00/15771 beschrieben.

Diese chemischen und biochemischen Modifikationen der ß-Laktamantibiotika konnte jedoch mit der Resistenzentwicklung der pathogenen Mikroorganismen nicht Schritt halten, so dass heute zahlreiche Keime, insbesondere mehrfach- resiste Staphylokokken, nicht mehr mit den zur Zeit verfügbaren ß- Laktamantibiotika therapiert werden können.

Laccasen (E. C. 1.10.3.2) sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrates ka- talysieren. Sie werden aus Mikroben, Pflanzen und Tieren gewonnen. In der Natur spielen Laccasen und Peroxidasen z. B. beim biologischen Abbau von Lignin eine wichtige Rolle, deshalb können sie u. a. aus Weißfäulepilzen isoliert werden. Solche ligninolytischen Enzyme sind fähig, verschiedene Umwelt- schadstoffe oxidativ umzusetzen (Jonas, U, Hammer, E, Schauer F., Bollag, J.- M. : Biodegradation 1998 ; 8 : 321-328 ; Bollag, J.-M., Shuttleworth, K. L., An- derson, D. H. : Appl Environ Microbiol 1988 ; 54 : 3086-3091 ; Bumpus, J. A., Aust, S. D. : Bioessays 1986 ; 6 : 166-170 ; Bumpus, J. A., Tien, M., Wright, D. A. : Science 1985 ; 228 : 143-147).

DE-A-197 26 241 offenbart ein erweitertes Multikomponentensystem zur Ab- wasserbehandlung, das u. a. auch aus Weißfäulepilzen gewonnene Oxidore- ductasen enthalten kann. Unter anderem kann auch Laccase in einer Kon- zentration von 0,001 bis 1 U/ml zur Abwasserbehandlung eingesetzt werden.

Das für die Abwasserbehandlung entwickelte Multikomponentensystem kann auch für organische Synthesen z. B. zur Oxidation von ungesättigten Aliphaten oder zur Oxidation von Alkoholen zu Aldehyden eingesetzt werden. Als vorteil- haft hat sich nach DE-A-24 02 452 hei-ausgestellt, durch Laccase vermittelte Oxidationen in einem zweiphasigen System aus Wasser und einem organi- schen Lösungsmittel vorzunehmen.

US-A-5,389,356 und US-A-5,468,628 beschreiben Methoden der selektiven Oxidation oder Reduktion, bei der eine Peroxidase als ein freie Radikale gene- rierender Katalysator dient. Diese Methode ist z. B. geeignet, um Tetrachlor- kohlenstoff abzubauen.

Es ist weiterhin bekannt, Phenole mittels Laccase oder Peroxidase zu oxidie- ren, wobei die Reaktionslösungen antimikrobiell wirksam sind und in indus- triellen Prozessen zur Keimbekämpfung eingesetzt werden können. Eine spe- ziefie Anwendung der schonenden Oxidation mit Hilfe von Tyrosinasen und Laccasen wird in US-A-6,015,683 beschrieben. Dabei wird mit Hilfe der Lacca- se intermediär ein farbgebendes Reagenz hergestellt, das den spektrophoto- metrischen Nachweis von Acetaminophen in wässrigen Lösungen ermöglicht.

Auf der Oxidationskraft beruht auch die bekannte antimikrobielle Wirkung der Laccasen in Gegenwart von Sauerstoff. Ebenfalls auf einer Oxidation beruht die Bildung von antimikrobiell wirksamen Phenoxazinon-Derivaten unter dem Einfluß von Laccase. Laccase und Manganperoxidase werden bereits für die verschiedensten Zwecke wirtschaftlich genutzt. Sie bleichen ligninenthaltendes Material und werden deshalb in der Papierindustrie eingesetzt. Aus WO-A- 95/01426 ist bekannt, dass organisch-chemische Verbindungen, die aus we- nigstens zwei aromatischen Ringen bestehen, die Aktivität der Laccase ver- stärken können. Diese Verstärkung wurde ausgenutzt, um Farbstoffe in Lö- sungen oder Lignin und ligninenthaltende Materialien zu bleichen.

In US-A-4,478,683 wird beschrieben, das Wachstum von Mikroorganismen bei der industriellen Abwasseraufbereitung durch Zusatz von Laccasen und Peroxi- dasen zu verhindern.

Laccase und Manganperoxidase wurden in wenigen Fällen eingesetzt, um eine Kopplung verschiedener biologischer Verbindungen vorzunehmen. Da dabei vorzugsweise mit einem Angriff auf für die Wirksamkeit essentielle funktionelle Gruppen gerechnet werden muss, ist in der Regel eine Verschlechterung der Wirksamkeit zu erwarten. Wahrscheinlich aus diesem Grund beschränken sich Versuche zum Einsatz von Manganperoxidase und Laccase zur Derivatisierung von Antibiotika auf wenige Beispiele. Bei den bisher realisierten Beispielen wurde das angestrebte Ziel einer Verstärkung der antimikrobiellen Wirkung nicht erreicht. Zum Beispiel wurde Laccase benutzt, um Antibiotika der Aureol- säuregruppe mit Hydrochinonen zu verbinden (Anyanwutaku, 1. O., Petrowski, R. J., Rosazza, I. P. : Bioorg. Med. Chem. 1994 ; 2 : 543-551). Die biologische Aktivität der Ausgangsstoffe ging dabei verloren. Agematu et al. (Biosci. Bio- technol. Biochem. 57 (8), 1387-1388 (1993) beschreiben die Transformation von 7- (4-hydroxyphenylacetamido)-cephalosporinsäure durch eine Laccase katalysierte phenolische Oxidation. Auch hier war das Reaktionsprodukt weni- ger wirksam als das ursprüngliche Cephalosporin. Uemtsu et al. (Jpn. Kokai Tokkyo JP 05,163,281) setzen Oxidasen zur Oxidation der Cephalosporine ein.

Aus Penicillinmethylester werden unter dem Einfluss von Laccase unter be- stimmten Bedingungen 3 verschiedene Typen von Dimeren erhalten, die alle biologisch inaktiv sind (Agematu, H., Tsuchida, T., Kominato, K., Shibamoto, N., Yoshioka, T., Nishida, H., Okamoto, R., Shin, T., Murano, S. : J. Antibiot.

Tokyo. 1993 ; 46 : 141-148). Die enzymatische Synthese von Dimeren des Phenols und von Penicillin wird von Agemato (Baiosainsu to Indasutori 1996, 54,715-718) zusammengefasst.

Bisher zur Modifikation von Antibiotika eingesetzte Enzyme wie Haloperoxidase besitzen ein eingeschränktes Substratspektrum. Die von Haloperoxidasen vermittelte Chlorierung ist nur in speziellen Fällen einsetzbar.

Wenn Mikroorganismen der Dauereinwirkung subletaler Antibiotika- Konzentration ausgesetzt sind, entwickeln sie als Teil ihres genetisch pro- grammierten Anpassungsmechanismus an wechselnde Umweltbedingungen Antibiotika-resistenzen, d. h. sie werden durch die ursprüngliche minimale Hemmkonzentration des betreffenden Wirkstoffes nicht mehr inhibiert. Da die Einwirkung subletaler Dosen niemals vollständig zu vermeiden ist, entwickelt sich gegen jeden neuen antibiotischen Wirkstoff seitens pathogener Mikroor- ganismen eine Resistenz. Unter dem Einfluss von Peroxidasen oder Laccasen gebildete Wirkstoffe mit Wirksamkeit gegen resistent gewordene Keime wur- den bisher nicht beschrieben.

Durch die zunehmende Resistenzproblematik besteht nach wie vor ein großer Bedarf an Antibiotika, der durch die dem Stand der Technik entsprechenden Wirkstoffe nicht gedeckt wird.

Das gilt insbesondere für den Einsatz von Antibiotika bei klinisch schwer be- herrschbaren Infektionskrankheiten. Bei Infektionen mit grampositiven Keimen sind z. Z. nur noch Glykopeptid-Antibiotika ausreichend wirksam. Grampositive Erreger wie Staphylokokken und Enterokokken entwickeln in zunehmendem Maße eine Mehrfachresistenz. Aber auch durch gramnegative Erreger verur- sachte Infektionskrankheiten werden in Zukunft klinisch nicht mehr sicher beherrscht werden können. Ebenso werden in der Veterinärmedizin Infektions- krankheiten von Nutztieren mit multiresistenten Staphylokokken immer be- drohlicher. Durch eine mögliche Übertragung resistent gewordener Keime auf den Menschen droht eine zusätzliche Gefahr.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, biologisch aktive Wirkstoffe mittels Biotransformation weiterzuentwickeln und als Kopplungspro- dukte mit anderen antimikrobiellen Wirkstoffen für eine arzneiliche Verwen- dung nutzbar zu machen. Der Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, den durch die zunehmende Resistenzentwicklung von Bakterien gegenüber herkömmlichen Antibiotika bestehenden Handlungsbedarf, insbe- sondere bei der Therapie von Infektionskrankheiten, in der Human-und Vete- rinärmedizin, durch Entwicklung eines Biotransformationsverfahrens, mit dem bisher unbekannte Wirkstoffe aus bekannten antimikrobiellen Wirkstoffen ge- wonnen werden können, zu decken.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gelöst zur Herstel- lung von biologisch aktiven Wirkstoffen, wobei ausgehend von Arznei-und Pflanzenschutzmitteln als Substrate, die als funktionelle Gruppe mindestens eine Amino-oder Hydroxylgruppe tragen, mittels einer durch Enzyme oder Mischungen mit enzymatischer Aktivität mit breitem Substratspektrum kataly- sierten ein-Elektronen-Reaktion Wirkstoffe mit zusätzlichen funktionellen Gruppen und modifiziertem Wirkungsspektrum und modifizierten Anwen- dungseigenschaften erhältlich werden, dadurch gekennzeichnet, dass als En- zyme radikalbildende Enzyme und/oder als Mischungen mit enzymatischer Aktivität Überstände ligninolytischer Pilze in Lösung eingesetzt werden, wobei als zusätzliche funktionelle Gruppen A) polyfunktionelle Synthone, die dem Wirkstoff ein verändertes Lösungsver- halten in wässrigen und lipophilen Systemen und eine hohe Grenzflächen- aktivität verleihen, B) aromatische Moleküle, heteroaromatische Verbindungen C) heterozyklische Verbindungen D) Wirkstoffe mit eigenständiger biologischer Wirksamkeit E) Wirkstoffe, die eine eigenständige Wirkung und Tensideigenschaften in ei- nem Molekül vereinen, einführbar sind, die mit den Ausgangsstoffen kovalent verknüpfte Kopplung- produkte mit verändertem Verteilungsverhalten ergeben, durch die polyfunkti- onale Interaktionen mit dem Zielorganismus ermöglicht werden.

Vorzugsweise sind die Substrate ß-Lactam-Antibiotika, Tetracyclin-Antibiotika, Anthracyclinantibiotika, Polyen-Antibiotika, Aminoglykoside, Benzofuran- Derivate, Sulfonamide, chinoide Verbindungen und organische Säuren.

Erfindungsgemäß können aus diesen antimikrobiellen Wirkstoffen durch Um- setzung nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12 Verbindungen erhal- ten werden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass eine bei den Ausgangs- stoffen nicht nachweisbare Wirksamkeit, vorzugsweise gegen multiresistente Keime erreicht wird. Die durch Umsetzung nach dem erfindungsgemäßen Ver- fahren erhältlichen Verbindungen können ferner dadurch gekennzeichnet sein, dass die Ausbildung von Resistenzen durch kovalente Verknüpfung von Mole- külen mit unterschiedlichem Wirkungsmechanismus und unterschiedlichen molekularen Angriffsorten erschwert wird. Es ist aber auch erfindungsgemäß, durch Einführung zusätzlicher hydrophiler und/oder hydrophober Komponen- ten eine Verbesserung der Anwendungseigenschaften zu erreichen, ohne das Wirkungsspektrum zu verändern.

Erfindungsgemäß eingesetzt werden vorzugsweise Enzyme, die der Klassifika- tion gemäß Internationaler Enzym-Nomenklatur (Enzym Nomenclature, Aca- demic Press, Inc, 1992, S. 24-154) E C 1.10.3.2. (Laccase), EC 1. 11. 1. 13 (Manganperoxidasen), EC 1.11.17 (Peroxidasen), EC 1.14.99.1 (Monophenolmonooxygenase), EC 1.10.3.3. (Ascorbat-Oxidase) angehören.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer wässrigen Lösung durchge- führt, weist diese vorzugsweise einen pH Wert von pH 2-8, vorzugsweise bei pH 3-5, sowie Temperaturen zwischen 5°C und 60°C auf.

Als polyfunktionelle Synthone zu A) kommen in Frage : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Cl-Cl8-Alkyl- ; Cl-CI8-Alkenyl- ; Cl-Cl8-Alkynyl- ; Cl-Cl8-Alkoxy- ; Cl-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> C18-Oxycarbonyl-; Ct-C18-Oxoalkyl-; C1-C18-Aikylsulfanyl-; C1-C18-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Alkylsulfonyl- ; C1-C18-Alkylimino-oder Alkylamino-Synthone.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß die aromatischen Moleküle zu B) im folgen- den : mono-, di-oder polycyclische aromatische Synthone, jeweils optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen oder Substituenten aus der Gruppe der Halogene ; Sulfo- ; Sulfon- ; Sulfamino ; Sulfanyi- ; Amino- ; Amido- ; Nitro- ; Azo- ; Imino- ; Carboxy- ; Cyano- ; Formyl- ; Hydroxy- ; Halocarbonyl- ; Carba- <BR> <BR> <BR> <BR> myl-; Carbamidoyl-; Phosphon-; Phosphonyl-; Ct-18-Alkyl-; Ct-18-Alkenyl- ; Cl-18-Alkinyl- ; Cl-18-Alkoxy- ; Cl-18-Oxycarbonyl- ; Cl-18-Oxoalkyl- ; <BR> <BR> <BR> <BR> C1-18-Alkylsulfanyl-; Cl-18-Alkylsulfonyl-; C1-18-Alkylimino-oder Alkyla- mino-Substituenten ausgestattet. Insbesondere bevorzugt sind als mono-, di- oder polycyclische aromatische Verbindungen solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Anthracen, Azulen, Benzen, Benzofuran, Benzothia- zol, Benzothiazolin, Carbolin, Carbazol, Cinnolin, Chroman, Chromen, Chrysen, Fulven, Furan, Imidazol, Indazol, Inden, Indol, Indolin, Indolizin, Isothiazol, Isoquinolin, Isoxazol, Naphthalen, Naphthylen, Naphthylpyridin, Oxazol, Pery- len, Phenanthren, Phenazine, Phtalizin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazol, Pyren, Pyridazin, Pyridazon, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Quinazolin, Quinolin, Quinoxa- lin, Sulfonyl, Thiophen, und Triazin, von denen jede jeweils substituiert sein kann. Beispiele für solche Verbindungen sind ohne andere auszuschließen aromatische Diamine, Aminophenole, Phenole, Naphthochinone sowie 2, 5- dihydroxylierte Benzoesäurederivate. Weiterhin kommen ohne andere auszu- schließen folgende Verbindungen in Betracht : 3,4-Diethoxyanilin, 2-Methoxy-p-phenylendiamin, 1-Amino-4-beta- methoxyethyl-aminobenzen, (N-. beta.-Methoxyethyl-p-phenylendiamin), 1- Amino-4-bis-(.beta.-hydroxy-ethyl)-aminobenzen, 2-Methyl-1, 3- diaminobenzen (2,6-Diaminotoluen), 2,4-Diaminotoluen, 1-Amino-4- sulfonsäurebenzen, 1-N-Methylsulfonsäure-4-aminobenzen, 1-Methyl-2- <BR> <BR> <BR> <BR> hydroxy-4-amino-benzen (3-Amino-o-cresol), 1-Methoxy-2, 4-diamino- benzene (2,4-Diaminoanisole), 1-Ethoxy-2, 3-diamino-benzene (2,4- Diaminophenetole), 1-beta-Hydroxyethyloxy-2, 4-diamino-benzen (2,4- Diaminophenoxyethanol), 1, 3-Dihydroxy-2-methylbenzene (2- Methylresorcinol), 1,2,4-Trihydroxybenzen, 1, 2,4-Trihydroxy-5-methylbenzen (2,4,5-Trihydroxytoluen), 2,3,5-Trihydroxytoluen, 4,8-Disulfonsäure-1- naphthol, 3-Sulfonsäure-6-amino-1-naphthol, 1,4-Phenylenediamin, 2,5- Diaminotoluen, 2-Chloro-1, 4-phenylenediamin, 2-Aminophenol, 3- <BR> <BR> <BR> <BR> Aminophenol, 4-Aminophenol, 1, 3-Phenylenediamin, 1-Naphthol, 2-Naphthol, 4-Chlorresorcinol, 1,2,3-Benzentriol (Pyrogallol), 1, 3-Benzendiol (Resorcinol), 1,2-Benzendiol (Pyrocatechol), 2-Hydroxyzimtsäure, 3-Hydroxyzimtsaure, 4- Hydroxyzimtsaure, 2,3-Diaminobenzoesäure, 2,4-Diaminobenzoesaure, 3,4- Diaminobenzoesäure, 3,5-Diaminobenzoesäure, Methyl-2, 3-diaminobenzoat, Ethyl-2, 3-diaminobenzoat, Isopropyl-2, 3-diaminobenzoat, Methyl-2, 4- diaminobenzoat, Ethyl-2, 4-diaminobenzoat, Isopropyl-2, 4-diaminobenzoat, Methyl-3, 4-diaminobenzoat, Ethyl-3, 4-diaminobenzoat, Isopropyl-3, 4- diaminobenzoat, Methyl-3, 5-diaminobenzoat, Ethyl-3, 5-diaminobenzoat, I- sopropyl-3, 5-diaminobenzoat, N, N-Diethyl-3, 4-diaminobenzoesaureamid, N, N- Dipropyl-3, 4-diaminobenzoesäureamid, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, Anthranii- säure, 4-Aminobenzoesaure, Ethylhydrochinon, Mandelsäure, o- Nitrobenzaldehyd, 1, 5-Dihydroxynaphthalen, 2,6-Dihydroxynaphthalen, 2,3- Dihydroxynaphthalen, Benzylimidazol, Salicylsäure, 3-Aminosalicylsäure, 4- Aminosalicylsäure, 5-Aminosalicylsäure, Methyl-3-aminosalicylat, Methyl-4- aminosalicylat, Methyl-5-aminosalicylat, Ethyl-3-aminosalicylat, Ethyl-4- aminosalicylat, Ethyl-5-aminosalicylat, Propyl-3-aminosalicylat, Propyl-4- aminosalicylat, Propyl-5-aminosalicylat, Salicylsäureamid, 4-Aminothiophenol, 4-Hydroxythiophenol, N, N-Dimethyl-l, 4-phenylendiamin, N, N-Diethyl-1, 4- phenylendiamin, N-Phenyl-1, 2-phenylendiamin, 6-Amino-2-naphthol, 3-Amino- 2-naphthol, 5-Amino-l-naphthol, 1,2-Phenylendiamin, 4-Aminoquinaldin, 2- Nitroanilin, 3-Nitroanilin, 2-Chloranilin, 3-Chloranilin, 4-Chloranilin, 4- Aminoacetanilid, Alizarin, 1-Anthramin (1-Aminoanthracen), 1- Aminoanthrachinon, Anthrachinon, 2, 6-Dihydroxy-anthrachinon, 1, 5- Dihydroxyanthrachinon (Anthrarufin).

Erfindungsgemäß werden als heterozyklische Verbindungen zu C) Pyrrolidin, Pyridin, Chinollizidin, Chinolin, Isochinolin, Indol, Acridin, Chinazolin und Purin jeweils optional mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen oder Substi- tuenten aus der Gruppe der Halogene ; Sulfo- ; Sulfon- ; Sulfamino- ; Sulfanyl- ; Amino- ; Amido-u. a. ausgestattet, bevorzugt eingesetzt.

Als Wirkstoffe gemäß D) kommen erfindungsgemäß insbesondere Imidazole, Azole, Flavone, Isoflavone, Tetracycline, Aminosäureanaloga und Nukleotida- naloga in Betracht.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann durch Einsatz rekombinanter Laccasen eine Veränderung des pH-Optimums erreicht wird.

Die Kopplungsreaktion kann erfindungsgemäß ggf. in Gegenwart mindestens eines Mediators aus der Gruppe der Hydroxylamine und/oder Hydroxamsäuren und ggf. eines Mediators aus der Gruppe der Amide stattfinden.

Gegebenenfalls können die Reaktionsprodukte nach Beendigung der Reaktion stabilisiert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen, die aus Wirk- stoffen verschiedener Stoffklassen durch eine Biotransformation gemäß der Erfindung erhältlich sind.

Die erfindungsgemäßen biologisch aktiven Verbindungen können in der Hu- man-und Veterinärmedizin sowie im Pflanzenschutz als alleiniger Wirkstoff oder in Form von Kombinationspräparaten Verwendung finden.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen biologisch aktiven Verbindungen können insbesondere bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten, vor- zugsweise als Mittel mit antimikrobieller und antiviraler Wirkung zur lokalen und/oder systemischen Anwendung, bei Infektionskrankheiten mit multiresis- tenten grampositiven oder gramnegativen Keimen, als Antimykotikum zur lokalen und/oder systemischen Anwendung sowie als Zytostatikum in der Hu- man-und Veterinärmedizin sowie im Pflanzenschutz als Herbizide, Insektizide oder Moluskizide eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel enthaltend eine oder meh- rere der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die Verwendung einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten mit grampositiven Erregern ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfin- dung.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt auch zu neuen Pflanzenschutzmitteln, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu biologisch aktiven Verbindungen, die als Zytostatika eingesetzt werden können.

Die nach der Biotransformation erhaltenen Verbindungen können allein sowie in Kombination untereinander eingesetzt werden.

Durch Einführung zusätzlicher hydrophiler und/oder hydrophober Komponen- ten kann erfindungsgemäß eine Verbesserung der Anwendungseigenschaften der Ausgangsverbindungen erreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbin- dungen können insbesondere als grenzflächenaktive Stoffe eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die aus antimikrobiellen Wirkstoffen durch Umsetzung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, zeigen vorteilhafterweise eine bei den Ausgangsstoffen nicht nachweisbare Wirksamkeit, vorzugsweise gegen multiresistente Keime.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die aus antimikrobiellen Wirkstoffen durch Umsetzung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, erschweren die Ausbildung von Resistenzen durch die durch Einwirkung von radikalbildenden Enzymen erreichte kovalente Verknüpfung von Molekülen mit unterschiedlichem Wirkungsmechanismus und unterschiedlichen molekularen Angriffsorten.

Aufbauend auf einer durch Laccasen sowie durch Laccase ähnliche radikalbil- dende Enzyme katalysierten Kopplungsreaktion wird erfindungsgemäß ein allgemein anwendbares Verfahren der Biotransformation zugänglich, mit dem verschiedene biologisch aktive Wirkstoffe, die als funktionelle Gruppe Amino- oder Hydroxylgruppen enthalten, so miteinander verbunden werden können, dass eine Verbesserung der biologischen Aktivität und/oder eine Verbesserung der Anwendungseigenschaften erreicht wird. Wesentliche kennzeichnende Schritte zur Herstellung der neuen Verbindungen sind enzymatisch katalysierte Ein-Elektronen-Oxidationen, eine enzymatisch katalysierte Bildung des Super- oxidradikals oder eine enzymatisch katalysierte Bildung des Arylradikals.

Überraschend wurde gefunden, dass durch diese enzymatisch katalysierten Umsetzungen Wirkstoffe mit einer biologischen Aktivität erhältlich werden, die den Ausgangsstoffen deutlich überlegen ist. Für diese enzymatisch katalysier- ten Reaktionsschritte ist erfindungsgemäß die Anwesenheit von insbesondere Laccase oder laccaseähnlichen Enzymen erforderlich. In diesem Zusammen- hang werden unter Laccasen und laccaseähnlichen Enzymen insbesondere die unter der Klassifikation EC 1. 10. 3. 2. zusammengefassten Enzyme sowie Cate- choloxidase (EC 1.10.3.1), Bilirubinoxidase (EC 1.3.3.5), Monophenolmonooxi- genase (EC 1.14.18.1) und o-Aminophenoloxidase (1.10.3.4.) verstanden. Die Laccasen werden vorzugsweise aus Pilzen der Gattungen Pycnoporus, Trame- tes, Coriolus, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Rhizoctonia, Aspergillus, Neurospora, Podospora, Phlebia oder Myceliophthora oder auf biotechnologi- schem Weg gewonnen. Es ist möglich, anstelle der Laccase andere ligninolyti- sche Enzyme wie Peroxidasen insbesondere Manganperoxidase (1.11.1.13) sowie Ligninperoxidase (1.11.1. 14) einzusetzen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Wirkstoffe aus verschiedenen chemischen Stoffklassen miteinander verbunden werden. Vorteilhafterweise weisen die Wirkstoffe, die miteinander verbunden werden sollen, biologische Wirkungen mit verschiedenen Angriffspunkten auf. Es ist jedoch auch möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einen biologisch aktiven Wirkstoff mit einer Substanz ohne antimikrobielle Eigenwirkung zu verbinden, um die An- wendungseigenschaften, z. B. das Verteilungsverhalten, zu verbessern. Durch die erfindungsgemäße Einwirkung von Laccase oder Manganperoxidase auf antimikrobiell wirksame Ausgangsstoffe werden neue biologisch aktive Verbin- dungen erhalten, die verbesserte Anwendungseigenschaften aufweisen. Es war völlig überraschend, dass sich insbesondere ß-Laktamantibiotika wie Penicilli- ne, Cephalosporine und Carbapeneme mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Erhalt der antimikrobiellen Wirksamkeit umsetzen lassen. Sulfonamidan- tibiotika sowie verschieden substituierte Salicylsäuren konnten ebenfalls mit dem erfindungsgemäßen Verfahren transformiert werden und die Produkte zeigten antimikrobielle Eigenschaften. Besonders vorteilhaft ist es, ß-Laktam- und Sulfonam. idantibiotika sowie substituierte Salicylsäuren durch eine lacca- sekatalysierte Reaktion mit chinoiden und hydrochinoiden Wirkstoffen zu ver- binden. Die durch die erfindungsgemäße Biotransformation erhältlichen neuen Wirkstoffe zeigen eine antimikrobielle Wirksamkeit selbst gegen multiresistente Keime. Damit werden die Voraussetzungen für eine Anwendung der neuen Wirkstoffe in der Human-und Veterinärmedizin zur Bekämpfung von Infekti- onskrankheiten geschaffen. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält- lichen neuen Wirkstoffe können sowohl lokal als auch systemisch, allein sowie in Form von Kombinationspräparaten eingesetzt werden.

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert, ohne sich auf diese Beispiele zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit 6-Aminopenicillansäure mittels Biotransformation Methodik : 1. 1. Herstellung der Enzymlösung Kultivierung der filamentösen Pilze Die Kultivierung der filamentösen Pilze erfolgte zuerst auf Schrägagar (Malzagar) bei 30°C 7 d und dann 7 d auf Malzagarplatten bei 30°C. Drei ca. 1 cm2 große, gut bewachsene Malzagarstücke wurden anschließend aus einer Agarplattenkultur mit einem sterilen Spatel ausgeschnitten und in 300-ml- Erlenmeyer-Kolben mit 60 ml BSM übertragen. Diese Vorkultur wurde bei 30°C über 7 Tage als Standkuftur inkubiert.

Das bei den Glucosevorkulturen der filamentösen Pilze gebildete Myzel wurde mit Hilfe eines Ultraturraxgerätes bei 17000 U/min dreimal 10 s homogenisiert.

2,5 ml des Homogenisats wurden für die Experimente in 100-ml-Erlenmeyer- Kolben mit 25 ml BSM überimpft. Kolben und Medium wurden getrennt von- einander sterilisiert, um Medienverluste bei der Hitzesterilisation im Autoklaven zu vermeiden. Vor der Beimpfung wurde das Medium in die Kolben gefüllt.

Diese Ansätze wurden mit einer 0,05 % igen sterilfiltrierten Tween 80-Lösung supplementiert. Die Kolben wurden in einem Schüttelinkubator bei 158 U/min und 30°C kultiviert.

Anionenaustauscherchromatographie Zur verstärkten Ausscheidung der ligninolytischen Enzyme in Kulturen von T. versicolor und Pycnoporus cinnabarinus wurde Veratrylalkohol eingesetzt. Da diese Verbindung und ihre Metaboliten bei späteren Inkubationsexperimenten mit Kulturfiltrat störend wirken, erfolgte ihre Abtrennung mit Q-Sepharose.

Dazu wurde 1 ml der Anionenaustauschermatrix mit 100 ml Histidinpuffer dreimal equilibriert. Anschließend wurde die equilibrierte Q-Sepharose mit 80 ml Kulturfiltrat 1 h langsam auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde der wässrige Überstand von der Q-Sepharose durch GF-6 Glasphaserfilter abfiltriert, die Matrix mit je 10 ml Histidinpuffer 20 mal gewaschen und das Protein mit 15 ml Hochsalz-Histidinpuffer eluiert.

Ultrafiltration Zur Vergleichbarkeit der Experimente mit Kulturfiltrat sollte in den Inkubati- onsansätzen mit gleicher Enzymaktivität gearbeitet werden. Dazu war es not- wendig, die gereinigten Kulturüberstände einzuengen und für die Umsätze entsprechend zu verdünnen. Die Konzentration erfolgte durch Ultrafiltration mit Centricon-30 und Centriprep-30 Mikrokonzentratoren in einer Kühlzentrifu- ge mit 3000 U/min bei 4°C für 60 min.

Entsalzung Für die Umsätze mit Kulturfiltrat war es erforderlich, die gereinigte und einge- engte Proteinprobe zu entsalzen. Auf eine gepackte Sephadex G-25 Superfine Säule wurden 2,5 ml Probe aufgetragen und mit 3,7 ml Histidinpuffer eluiert.

Das erhaltene Proteineluat wurde bei-20°C gelagert.

1.2. Kopplungsreaktion Das 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 6-Aminopenicillansäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Trame- tes versicolor) 35 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt.

Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extra- hiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 6-Aminopenicillansäure mit dem 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid führt zu einer antimikro- biell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 66%.

Die Analyse der erhaltenen Verbindung mittels massenspektrometrischer Me- thoden ergab eine Masse von 411.

In der Summe der Ergebnisse zur Strukturanalyse ist für das erhaltene Kopp- lungsprodukt die folgende Struktur anzunehmen : Fig. : Vorgeschlagene Struktur für das Kreuzkopplungsprodukt Beispiel 2 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit 7-Aminocephalosporinsäure mit- tels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Das 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 7-Aminocephalosporinsäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Pyc- noporus cinnabarinus) 35 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstüt- zung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min ge- schüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekan- festphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rück- stand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 7-Aminocephalo- sporinsäure mit dem 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 68%.

Beispiel 3 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2, 5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit 7-Aminodesacetoxycephalosporin- säure mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel l.

Das 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewon- nen aus Trametes versicolor) 40 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktade- kanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 7-Aminodesacetoxy- cephalosporinsäure mit dem 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 73%.

Die Analyse der erhaltenen Verbindung mittels massenspektrometrischer Me- thoden ergab eine Masse von 409. Die Ergebnisse der kernresonanzspektro- skopischen Analysen werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Zum Vergleich der'H-NMR-Signale wurde auch das 2,5-Dihydroxy-N- (2- hydroxyethyl) benzamid untersucht. Die Messungen erfolgten im Lösungsmittel DMSO-d6 mit dem internen Standard TMS mit einem ARX 300 (Bruker, Karls- ruhe).

Tabelle :'H-NMR-Spektrenvergleich des Kreuzkopplungsproduktes 3 mit der Ausgangsverbindung 2, 5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid Resonanzen Multiplizität, Resonanzen Multiplizität, Atomanzahl und-art, [ppm] Kopplungs- [ppm] Kopplungs-Zuordnung Kreuzkopplu konstante 2,5-Dihydroxy- konstante ngs-produkt N- (2- 3 hydroxyethyl)- benzamid 12 79 s 1H COOH 9,98 s 11,60 s, 1H OH am C2, C6H2 9 66 s 8,98 s 1H OH am C5, C6H2(3 8,50 t, 3J = 5,3 8,69 t, 3J = 5,3 1H, NH, CH2-NH 6,73 s 7,27 d(s), 4J = 2,8 1H, H am C6, C6H2(3) 6,65 s 6,85 dd, 3J = 8,7, 4J 1H, H am C4, C6H2(3) =28 6,73 d, 3J = 8,7 1H, H am C3, C6H2(3 6,42 d, 33 = 9,3 1H, NH am ß- Lactamring 5, 85 t, 3J = 5,4 4,78 t, 3J = 5 5 1H, OH, CH2-OH 5,48 m, 3J = 9, 3, 3J 1H, H7 ß-Lactamring 4, 4 5, 02 m, 3J = 4, 4 1H, H6 ß-Lactamring 3, 63 m 3, 54 m 2H, CH2, CH2-OH 3, 49 m 3,36 m 2H, CH2, Ch2-NH 3,29/3,50 ABq, 2J = 17, 2 - 2H, CH2, heterocycli- scher Ring 1,91 S 3H, CH3 In der Summe der Ergebnisse zur Strukturanalyse ist für das erhaltene Kopp- lungsprodukt die folgende Struktur anzunehmen : Fig. : Vorgeschlagene Struktur für das Kreuzkopplungsprodukt Beispiel 4 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit Amoxicillin mittels Biotransforma- tion Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Das 2, 5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit Amoxicillin (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Trametes versico- lor) 50 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzge- schwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufar- beitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hoch- leistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikums Amoxicillin mit dem 2,5-Dihydroxy- N- (2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 55%.

Die Analyse der erhaltenen Verbindung mittels massenspektrometrischer Me- thoden ergab eine Masse von 560. Die Ergebnisse der kernresonanzspektro- skopischen Analysen werden in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Zum Vergleich der'H-NMR-Signale wurden auch das 2,5-Dihydroxy-N- (2- hydroxyethyl) benzamid (siehe Tabelle zu Beispiel 3) und Amoxicillin unter- sucht. Die Messungen erfolgten im Lösungsmittel CD30D mit dem internen Standard TMS mit einem ARX 300 (Bruker, Karlsruhe).

Tabelle : tH-NMR-Spektrenvergleich des Kreuzkopplungsproduktes 4 mit der Ausgangsverbindung Amoxicillin Resonanzen Multiplizität, Resonanzen Multiplizität, Atomanzahl und -art, [ppm] [ppm] Zuordnung Kreuzkopplu Amoxicillin ngs-produkt 4 7, 48 d, 3J = 7,2 7,49 d, 3J = 7, 2 2H, H am C3/C5, C6H4 6, 85 d, 3J = 7,2 6,83 d, 3J = 7, 2 2H, H am C2/C6, C6H4 6,74 d, 3J = 8,6 - - 1H, H am C3, C6H2 6, 63 3J = 8,6 - - 1H, H am C4, C6H2 5, 99 m, 3J = 4, 2 5,99 m, 3J = 4, 2 1H H7 ß-Lactamring 5, 92 m 3J = 4 2 5 92 m 3J = 4 2 1H H6 ß-Lactamrinq 4,31 s 4,31 s 1H, CH, heterocycli- scher Ring 3 70 m 2H, CH2, CH2-OH 3, 49 m - - 2H, CH2, CH2-NH 1,57 s 1,57 s 3H, CH3, heterocycli- scher Ring 1,50 s 1,50 s 3H, CH3 heterocycli- scher Ring In der Summe der Ergebnisse zur Strukturanalyse ist für das erhaltene Kopp- lungsprodukt die folgende Struktur anzunehmen : Fig. : Vorgeschlagene Struktur für das Kreuzkopplungsprodukt Beispiel 5 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5-Di- hydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid mit Ampicillin mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Das 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit Ampicillin (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Trametes versico- lor) 50 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzge- schwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufar- beitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hoch- leistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikums Ampicillin mit dem 2,5-Dihydroxy- N- (2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 75%.

Die Analyse der erhaltenen Verbindung mittels massenspektrometrischer Me- thoden ergab eine Masse von 544.

In der Summe der Ergebnisse zur Strukturanalyse ist für das erhaltene Kopp- lungsprodukt die folgende Struktur anzunehmen : Fig. : Vorgeschlagene Struktur für das Kreuzkopplungsprodukt Beispiel 6 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit Sulfonamiden mittels Biotransfor- mation Das 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhalt- nis mit p-Aminobenzensulfonamid (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluß einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Pyc- noporus cinnabarinus) 30 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstüt- zung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min ge- schüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethyl- acetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verblei- bende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des biologisch aktiven Wirkstoffes p- Aminobenzensulfonamid mit dem 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 74%.

Beispiel 7 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit substituierten Salicylsäuren mit- tels Biotransformation Das 2, 5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0, 02 M) unter dem Einfluß einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B. Trametes versicolor oder Pycnoporus cinnabarinus) 50 min bei Raumtem- peratur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reakti- onslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungs- mittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung der 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure mit dem 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 73%.

Beispiel 8 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit 6-Aminopenicillansäure mittels Bio- transformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit 6-Aminopenicillansäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Pycnoporus cinnabarinus) I h bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt.

Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extra- hiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 6-Aminopenicillansäure mit dem 2, 5-Dihydroxybenzoesauremethylester führt zu einer bisher unbe- kannten antimikrobiell wirksamen Verbindung mit hoher Aktivität. Die Aus- beute an Kopplungsprodukt beträgt 66%.

Beispiel 9 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit 7-Aminocephalosporinsäure mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit 7-Aminocephalosporinsaure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B.

Trametes versicolor) 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüt- telt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril.

Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 7- Aminocephalosporinsäure mit dem 2, 5-Dihydroxybenzoesäuremethylester führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 63%.

Beispiel 10 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5-Dihydro- xybenzoesäuren und-estern mit 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure mit- tels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesauremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure (t mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0, 02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Pycnoporus cinnabarinus) 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstüt- zung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min ge- schüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekan- festphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rück- stand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung von 2,5-Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit 7- Aminodesacetoxycephalosporinsäure führt zu einer bisher unbekannten anti- mikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 71%.

Beispiel 11 Herstellung neuer antimikrobieffer Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit Amoxicillin mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit Amoxicillin (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Trametes versicolor) 45 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwin- digkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigch- romatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikums Amoxicillin mit dem 2,5- Dihydroxybenzoesäuremethylester führt zu einer bisher unbekannten anti- mikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 66%.

In der Summe der Ergebnisse zur Strukturanalyse ist für das erhaltene Kopp- lungsprodukt die folgende Struktur anzunehmen : Fig. : Vorgeschlagene Struktur für das Kreuzkopplungsprodukt Beispiel 12 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit Ampicillin mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit Ampicillin (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Trametes versicolor) 45 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwin- digkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungs- flüssigchromatographie gereinigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikums Ampicillin mit dem 2,5- Dihydroxy- benzoesäuremethylester führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirk- samen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 56%.

Beispiel 13 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit Sulfonamiden mittels Biotransforma- tion Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit p-Aminobenzensulfonamid (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) un- ter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B. Tra- metes versicolor oder Pycnoporus cinnabarinus) 45 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktions- lösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gerei- nigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikums p-Aminobenzensulfonamid mit dem 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester führt zu einer bisher unbekannten an- timikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 66%.

Beispiel 14 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxybenzoesäuren und-estern mit substituierten Salicylsäuren mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Der 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester wird im äquimolaren Verhältnis mit 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B.

Trametes versicolor oder Pycnoporus cinnabarinus) 45 min bei Raumtempe- ratur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reak- tionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslö- sung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gerei- nigt.

Ergebnis : Eine Kopplung der 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure mit dem 2,5- Dihydroxybenzoesäuremethylester führt zu einer bisher unbekannten anti- mikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 63%.

Beispiel 15 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von Hydrokaffee- säure mit 6-Aminopenicillansäure mittels Biotransformation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Die 3 (3,4-Dihydroxyphenyl) propionsäure wird im äquimolaren Verhältnis mit 6-Aminopenicillansäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus Pycnoporus cinnabarinus) 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reaktionslösung bei 100 U/min geschüttelt.

Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mittels Oktadekanfestphase extra- hiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril.

Ergebnis : Eine Kopplung des Antibiotikagrundkörpers 6-Aminopenicillansäure mit der Hydrokaffeesäure führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung mit hoher Aktivität.

Beispiel 16 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit Mercaptanen mittels Biotransfor- mation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Das 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 3-Mercapto-l, 2,4-triazol (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluß einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B.

Trametes versicolor oder Pycnoporus cinnabarinus) 50 min bei Raumtempe- ratur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reak- tionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslö- sung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution des Produktes erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gerei- nigt.

Ergebnis : Eine Kopplung des 3-Mercapto-1, 2,4-triazol mit dem 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamids führt zu einer bisher unbekannten antimikrobiell wirksamen Verbindung. Die Ausbeute an Kopplungsprodukt beträgt 45%.

Beispiel 17 Herstellung neuer antimikrobieller Wirkstoffe durch Kopplung von 2,5- Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid mit Mercaptanen mittels Biotransfor- mation Methodik : Die Herstellung der Enzymlösung erfolgte nach Beispiel 1.

Das 2, 5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid wird im äquimolaren Verhält- nis mit 2-Mercapto-nicotinsäure (1 mM) in Natriumacetatpuffer (pH 5 ; 0,02 M) unter dem Einfluss einer Laccase (975 nmol/2 ml/min ; gewonnen aus z. B.

Trametes versicolor oder Pycnoporus cinnabarinus) 50 min bei Raumtempe- ratur umgesetzt. Zur Unterstützung der Umsatzgeschwindigkeit wird die Reak- tionslösung bei 100 U/min geschüttelt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslö- sung mittels Oktadekanfestphase extrahiert. Die Elution der Produkte erfolgt mit Ethylacetat oder Acetonitril. Der nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende Rückstand wird mit Hochleistungsflüssigchromatographie gerei- nigt.

Ergebnis : Eine Kopplung der 2-Mercapto-nicotinsäure mit dem 2,5-Dihydroxy- N-(2-hydroxyethyl) benzamids führt zu bisher unbekannten antimikrobiell wirk- samen Verbindungen. Die Ausbeute an Kopplungsprodukten beträgt 55%.

Beispiel 18 Prüfung der erfindungsgemäßen Kopplungsprodukte auf antimikrobielle Akti- vität Methodik : Es wurde der Agardiffusionstest nach Burkhardt (Burkhardt, F.

(Hrsg.) Mikrobiologische Diagnostik. Georg-Thieme Verlag Stuttgart, New York 1992, S 724) durchgeführt. Die Prüfsubstanzen werden in abgestuften Kon- zentrationen auf Testplättchen Sensi-Disc (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, USA) aufgebracht. Für die Testung wurden Mueller- Hinton II-Agar in Stacker-Petrischalen (Becton Dickinson Microbiology Sys- tems, Cockeysville, USA) eingesetzt. Als Teststamm wurden S. aureus Stamm ATCC 6538 ausgewählt. Die Einsaat dieses Teststamms wurde so gewählt, dass sich nach 16-20 h Bebrütung dicht stehende, jedoch nicht konfluierende Einzelkolonien entwickeln. Nach dem Trocknen der beimpften Nährböden wer- den maximal 6 Testplättchen mit leichtem Druck auf die Agaroberfläche auf- gelegt. Nach 18 + 2 h Bebrütung bei 36°C werden die Hemmhöfe gemessen.

Zur internen Qualitätssicherung wurde die Methode mit S. aureus ATCC 25923 überprüft.

Ergebnisse : Die durch die erfindungsgemäße Biotransformation erhältlichen Wirkstoffe sind antimikrobiell wirksam (Tab. 1). Die höchste antimikrobielle Wirksamkeit wird bei den Kopplungsprodukten nach Beispiel 4, 9 und 10 beo- bachtet.

Tab. 1 Antibakterielle Wirksamkeit im Agardiffusionstest nach Burkhardt gegen S. aureus ATCC 6538 Wirkstoff Hemmhof (mm) 250 µg 125 µg 50 µg 10 µg Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansäure und 24 22 18 12 2, 5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid gemäßBeispiel 1 Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporinsäure und 22 18 14 r 2, 5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid Gemä# Beispiel 2 Kopplundprodukt aus 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure und 24 22 18 r 2, 5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid gemäß Beispiel 3 Kopplungsprodukt aus Amoxiciilin und 2, 5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid >30 >30 >30 > 30 gemäß Beispiel 4 Kopplungsprodukt aus p-Aminobenzensulfonamid und 22 20 r r 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid gemäß Beispiel 6 Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxybenzoes3ure und 10 r r r 2, 5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid gemäßBeispiel 7 Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansaure und 2, 5-Dihydroxybenzoesäuremethylester 30 24 r gemäß Beispiel 8 Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporinsäure und 10 r r 2,5-Dihydroxybenzoesäurementhylester gemäß Beispiel 9 Kopplungsprodukt aus 2, 5-Dihydroxybenzoesäurementhylester und 30 14 r 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure gemäß Beispiel 10 Kopplungsprodukt aus Amoxicillin und 2, 5-Dihydroxybenzoesäurementhylester >30 >30 >30 >30 gemäß Beispiel 11 Kopplungsprodukt aus p- Aminobenzensulfonamid und 2, 5- 10 r Dihydroxybenzoesäuremethylester gemäßBeispiel 13 Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxyben- zoesäure und 2,5-Dihydroxybenzoesäure-10 r methylester gemäß Beispiel 14 Beispiel 19 Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit an multiresistenten Keimen Methodik : Die Prüfung erfolgte im Agardiffusiontest nach der im Beispiel 13 geschilderten Methodik. Als Testkeim wurde der multiresistente S. aureus Referenzstamm"Norddeutscher Stamm" (Smith Kline Beecham) eingesetzt.

Ergebnisse : Die Kopplungsprodukte sind überraschenderweise auch gegen multiresistente Keime teilweise hoch wirksam (Tab. 2). Die Wirksamkeit der Ausgangssubstanzen wird deutlich übertroffen (Tab. 4) Tab. 2 Antibakterielle Wirksamkeit im Agardiffusionstest nach Burkhardt gegen S. aureus"Norddeutscher Stamm" Wirkstoff Hemmh of (mm) 205 µg 1250 µg 50 µg 10 µg Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansäure und 20 18 16 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid gemäß Beispiel 1 Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporin-säure und 28 24 20 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid Gemäß Beispiel 2 Kopplungsprodukt aus 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure und 24 22 20 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl) benzamid gemäß Beispiel 3 r Kopplungsprodukt aus Amoxicillin und 10 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid 24 22 18 gemäß Beispiel 4 Wirkstoff Hemmhof (mm 250) g 125 M 50 µg 10 p9 Kopplungsprodukt aus p-Aminobenzensulfonamid und 26 22 18 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid gemäß Beispiel 6 r Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure und r r r 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid gemäß Beispiel 7 r Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansäure und 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester 16 r gemäß Beispiel 8 r Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporin- säure und 2, 5-Dihydroxybenzoesäuremethyl-r r ester gemäß Beispiel 9 r Kopplungsprodukt aus 2,5-Dihydroxybenzoe-säuremethylester und r 7-Aminodesacetoxy-cephalosporinsäure gemäß r Beispiel 10 r Kopplungsprodukt aus Amoxicillin und 2, 5-Dihydroxybenzoesäurementhylester 20 16 10 gemäß Beispiel 11 R Kopplungsprodukt aus p-Aminobenzensulfon-amid und 16 12 2,5-Dihydroxybenzoesäurementhylester gemäß Beispiel 13 Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxy- benzoesäure und 2,5-Dihydroxybenzoe- r r säuremethylester gemäß Beispiel 14 Beispiel 20 Methodik : Die Prüfung erfolgte im Agardiffusiontest nach der im Beispiel 13 geschilderten Methodik. Als Testkeim wurde der aus Patientenmaterial isolierte multiresistente koagulasenegative S epidermidis Stamm 99847 eingesetzt.

Ergebnisse : Auch gegen die schwer bekämpfbaren koagulasenegativen Staphylokokken, die z. B. bei der Besiedlung von Kathetermaterialien eine Rolle spielen und deshalb zu den nosokomialen Problemkeimen gehören, sind die erfindungsgemäßen Kopplungsprodukte wirksam. Die Wirksamkeit der Aus- gangssubstanzen wird deutlich übertroffen (Tab. 4) Tab. 3 Antibakterielle Wirksamkeit im Agardiffusionstest nach Burkhardt gegen S. epidermidis Wirkstoff Hemmhof mm 250 veg 125 g 50 ll9 10 pig Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansäure und r r r r 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid gemäßBeispiel 1 Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporinsäure und 24 22 r r 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid Gemäß ß Beispiel 2 Kopplungsprodukt aus 7-Aminodesacetoxycephalosporinsaure und 20 24 r r 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid gemäß Beispiel 3 Kopplungsprodukt aus Amoxicillin und 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamid 30 28 18 r gemäß Beispiel 4 Kopplungsprodukt aus p-Aminobenzensulfonamid und 26 20 r r 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid gemäß Beispiel 6 Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure und r r r r 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)benzamid gemäß Beispiel 7 Kopplungsprodukt aus 6-Aminopenicillansäure und2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester gemäß Beispiel 8 Kopplungsprodukt aus 7-Aminocephalosporin- säure und 2, 5-Dihydroxybenzoesäurementhy- 14 r r ester gemäß Beispiel 9 Kopplungsprodukt aus 2, 5-Dihydroxybenzoesäurementhylester und r r r 7-Aminodesacetoxycephalosporinsäure gemäß Beispiel 10 Wirkstoff Hemmhof (mm) 250 µg 125 µg 50 µg 10 µg Kopplungsprodukt aus Amoxicillin und 2,5-Dihydroxybenzoesauremethylester 20 20 14 r gemäß Beispiel 11 Kopplungsprodukt aus p-Aminobenzensulfon- amid und 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethyl-12 r ester gemäß Beispiel 13 Kopplungsprodukt aus 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure und r r 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester gemäß Beispiel 14 Tab. 4 Antimikrobielle Wirksamkeit der Ausgangsstoffe Wirkstoff Konzen-Hemmhofgröße (mm) tration/disc S. aureus S. epidermidis #Nord. Stamm" Ethylacetat 0, 25 r r 2,5-Dihydroxybenzoesäure-0,25 mg r r methylester 2,5-Dihydroxy-N- 0, 25 mg 22 22 (2-hydroxyethyl) benzamid 0, 05 mg 14 r -Aminobenzensolfonamid 0, 25 m r r 4-Amino-2-hydroxybenzolsäure 0,25 mg r r Amoxicillin 0,25 mg 16 24 0,12 mg 14 20 0, 05 mg 10 18 0,01 mg r 12 Beispiel 21 Methode zur Stabilisierung der erfindungsgemäßen Kopplungsprodukte Zur Erhöhung der Stabilität des Kreuzkopplungsproduktes eines äquimolaren Ansatzes aus Amoxicillin und 2,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester, herge- stelit entsprechend Beispiel 10, wurde eine spezielle Extraktionsmethode an Oktadekanfestphasen entwickelt. Hierzu wurde die Festphase mittels Methanol aktiviert und mit Aqua dest. equilibriert. Anschließend wurden x mi des wässri- gen Kreuzkopplungsansatzes aufgetragen und nach dem Binden der Inhalts- stoffe für 20 min im Luftstrom getrocknet. Es schließt sich ein Waschschritt mit einem 10% Methanol/90% Aqua dest.-Gemisch an. Die Elution des Kreuz- kopplungsproduktes erfolgte mit ebenfalls 100% entgastem Acetonitril. Der so gewonnene Extrakt wurde bei 4°C dunkel gelagert.

Ergebnis : Das Kopplungsprodukte ist innerhalb des Beobachtungszeitraums von 21 d stabil.