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Title:
BIOTRANSFORMATION METHOD FOR TRANSFORMING PHENOLIC COMPOUNDS FROM SOY EXTRACT INTO EQUOL AND BIOACTIVE ISOFLAVONES BY FERMENTATION AND/OR ENZYMATIC APPLICATION, THUS OBTAINED COMPOSITION AND USE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/201536
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a biotransformation method for transforming phenolic compounds from soy milk into bioactive isoflavones and equol, with a high yield and production volume, for use in the biotechnological field, mainly in the food industry. The invention allows the glycosylated forms of isoflavones (daidzin and genistin) to be biotransformed into the respective aglycone forms (daldzein and genistein) by fermentation of soy milk with initiator cultures and probiotic lactic bacteria, and/or by treatment of the extract with the enzyme tanase from Paecilomyces variotti. In one of the embodiments, the present invention relates to an in vitro method for producing bioactive equol in the absence of intestinal bacteria, using only enzymatic biotransformation.

Inventors:
MACEDO, Gabriela Alves (rua Monteiro Lobato 80, Campinas - SP CEP: -970, 13083, BR)
MACEDO, Juliana Alves (rua ENG. Humberto Soares de Camargo, 404 Cidade Universitária - Distrito de Barão Geraldo, Campinas - SP - CEP: -740, 13083, BR)
DE QUEIRÓS, Lívia Dias (rua Maria Rita Alves, 127 Centro, Paula Candido - MG - CEP: -000, 36544, BR)
Application Number:
BR2016/000024
Publication Date:
December 22, 2016
Filing Date:
March 03, 2016
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (rua Roxo Moreira 1831 - Cidade Universitária "Zeferino Vaz", Distrito de Barão GeraldoCaixa Postal 6.131, Campinas - SP - CEP -970, 13083, BR)
International Classes:
A23C11/10; A23L11/00; A61K8/97; A61K31/352; A61K36/48; C07D311/06; C12N9/18; C12P17/06; C12P39/00; C12R1/225; C12R1/23; C12R1/46
Foreign References:
US20110189134A12011-08-04
BRPI1103791A22013-07-30
Other References:
QUEIRÓS, L. D.: "Biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja para obtenção de produto rico em compostos bioativos.", DISSERTAÇÃO (MESTRADO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS) - UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO., pages 67 f., Retrieved from the Internet [retrieved on 20160427]
DI CAGNO, R. ET AL.: "Synthesis of isoflavone aglycones and equol in soy milks fermented by food-related lactic acid bacteria and their effect on human intestinal Caco-2 cells", J AGRIC FOOD CHEM., vol. 58, no. 19, 13 October 2010 (2010-10-13), pages 10338 - 10346, XP002627012
CHUN, J. ET AL.: "Conversion of isoflavone glucosides to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria.", J FOOD SCI., vol. 72, no. 2, 2007, pages M39 - 44, XP002627004
CHIEN, H. L. ET AL.: "Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria.", FOOD MICROBIOL., vol. 23, no. 8, 2006, pages 772 - 778, XP024904367
FERREIRA, L. R. ET AL.: "Improving the chemopreventive potential of orange juice by enzymatic biotransformation.", FOOD RES., vol. 51, no. 2, 2013, pages 526 - 535, XP055337602
MADEIRA JR, J. V. ET AL.: "Rich bioactive phenolic extract production by microbial biotransformation of Brazilian Citrus residues", CHEMICAL ENGINEERING RESEARCH AND DESIGN, vol. 92, no. 10, 2014, pages 1802 - 1810, XP055337606
MADEIRA JR, J. V. ET AL.: "Efficient tannase production using Brazilian citrus residues and potential application for orange juice valorization.", B IOCATALYSIS AND AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY., vol. 4, no. 1, 2015, pages 91 - 97, XP055337615
BATTESTIN, V. ET AL.: "Tannase production by Paecilomyces variotii.", BIORESOUR TECHNOL., vol. 98, no. 9, 2007, pages 1832 - 1837, XP005876261
YUAN, J. P . ET AL.: "Metabolism of dietary soy isoflavones to equol by human intestinal microflora--implications for health", MOL NUTR FOOD RES, vol. 51, no. 7, July 2007 (2007-07-01), pages 765 - 781, XP055337619
Attorney, Agent or Firm:
SILVADO, Fernanda Lavras Costallat (rua Roxo Moreira 1831 - Cidade Universitária "Zeferino Vaz" Distrito de Barão Geraldo, Caixa Postal 6.131, Campinas - SP - CEP -970, 13083, BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1 . Processo de biotransformação enzimática de isoflavona caracterizado pelo fato de compreender a fermentação de um substrato composto de extrato hidrossolúvel de soja por bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e/ou de enzima tanase obtida a partir de Paecílomyces variottí.e as etapas:

A. Macerar os grãos de soja íntegros em água destilada a temperatura ambiente;

B. Descartar a agua utilizada para maceração;

C. Adicionar agua destilada;

D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 1 10gC por 3 a 10 minutos;

E. Adicionar agua destilada;

F. Triturar os grãos de soja com água destilada;

G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10OOOg por 10 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos a temperatura ambiente;

H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição por entre 10 a 15 minutos;

I. Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 °C por 15 a 20 minutos;

J. Realizar biotransformação; e

K. Manter o produto EHS com isoflavonas bioativas e equol conservado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado peio fato de que as bactérias iniciadoras serem Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L81 1 ) e Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (LB-340); e bactérias ácido lácticas probióticas serem Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (A) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1 :3.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (D) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de :2 e as condições processuais serem 00°C por 5 minutos.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (F) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1 :4.

6. Processo/de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (G) a centrifugação ocorrer a 9630 x g por 15 minutos a temperatura de 259C.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (H) a faixa preferencial de ebulição ser entre 96 e 100°C e tempo de 10 minutos.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1 . caracterizado por na etapa (I) o tempo ser de 15 minutos.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (I) compreender opcionalmente uma subetapa de armazenamento (l.a) em condição estéril do EHS.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por na subetapa etapa (l.a) as condições de armazenamento de EHS ser de refrigeração entre 4 a 12SC ou congelamento a -80eC.

1 1 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (J) a biotrasnformação ser realizada por Biotransformação fermentativa, Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ou Biotransformação enzimática.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação fermentativa ocorrer da seguinte forma:

i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 a 1 5% (v/v), preferencialmente 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido na etapa

( ; e

ií. Incubar a solução obtida em (i) entre 30 e 409C, preferencialmente a 37QC, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ocorrer da seguinte forma:

i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 - 15% (v/v), preferencialmente a 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido na etapa

(D; ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida em (i) entre 30 e 40QC, preferencialmente a 37SC, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose;

iii. Inocular em solução obtida em (ii) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS fermentado (ii);

iv. Incubar a solução de (iii) entre 35 a 45oC, preferencialmente 40eC, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e

v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2oC, preferencialmente 0QC (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação enzimática ocorrer da seguinte forma:

i. Inocular em EHS obtida em (I) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS (I);

ii. Incubar a solução em (i) entre entre 35 a 45oC, preferencialmente 409C, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e

iii. Incubar a solução de (ii) entre -2 a 2oC, preferencialmente 0gC (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (K) a conservação ocorrer preferencialmente por congelamento a -80°C.

16. Composição caracterizada por ser obtido de acordo o processo descrito nas reivindicações de 1 a 15 e compreender Daidzina na forma aglicona em concentração entre 90 e 946 Mg/mL, Genisteína na forma aglicona em concentração entre 50 e 323 Mg/mL e Equol em concentração entre 0,30 e 0,83 Mg/mL.

17. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ter aplicação em alimentos à base de soja.

18. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ser componente de produto nutracêutico.

19. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ter aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.

Description:
"PROCESSO DE BIOTRANSFORMAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DO EXTRATO DE SOJA EM EQUOL E ISOFLAVONAS BIOATIVAS ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO E/OU APLICAÇÃO ENZIMÁTICA,

COMPOSIÇÃO ASSIM OBTIDO E USO"

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um processo de biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja em isoflavonas bioativas e equol com alto rendimento e alta produção; composição assim obtido e uso.

[002] O presente processo tem aplicação na área biotecnológica, principalmente para a indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutrícosméticos e suplementos dietéticos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A principal aplicação da presente invenção consiste na biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja (EHS) para obtenção de produto rico em compostos bioativos. O propósito é aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas (agiiconas) e produzir equol em extrato de soja através da aplicação de culturas iniciadoras e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de tanase obtido a partir de Paecilomyces variotti.

[004] A presente invenção proporciona uma composição sob a forma de um ingrediente alimentício, o qual contém alto teor de isoflavonas bioativas e equol biodisponíveis.

[005] Outro possível uso é o da bioatividade do extrato hidrossolúvel de soja antes e após biotransformação com o extrato semipurificado de tanase de P. varíotii para modelos anti-inflamatórios e de quimioprevénção.

[006] Além disso, também é interessante a atuação do extrato semipurificado de tanase de P. varíotii em outras classes de flavonoides glicosilados em alimentos com grande quantidade de flavonoides na forma glisocilada.

[007] O documento de patente US8765445B2 refere-se a um processo empregando cepas de Lactobacillus no processo para produção de produto para consumo direto, ressaltando-se que este processo já se encontra em fase comerciai.

[008] O documento de patente WO2012033150 refere-se à produção de equol por fermentação em meio de fermentação complexo com adição de daizeina em meio gasoso. O processo usa a cepa de Streptococcus. Este documento ensina que o uso de hidrogénio na fermentação aumenta a produção de equol. O processo de acordo com este documento é adequado para produção industrial, obtendo-se alto rendimento de isoflavonas.

[009] O documento de patente US20120094336 descreve a produção de equol sem mistura racêmica, por síntese química. Descreve a síntese por catalisadores químicos específicos para produção do isômero preferencial de tipo S.

[0010] O documento de patente US201 10189134 descreve a produção de uma bebida fermentada à base de leite de soja, com adição de Lactobacillus vivos para produzir equol durante o tempo de prateleira (shelf life) do produto. O processo de acordo com os ensinamentos deste documento já se encontra em escala industrial. Destaca-se, ainda, que a adição de ácido ascórbico para a manutenção da produção é descrita.

[001 1] O documento de patente JP201 1083273 descreve um processo de produção de isoflavonas de soja e equol por fermentação utilizando Lactoccoccus isolados do produto japonês ekuoru. O processo de acordo com este documento se vale do uso de bactérias lácticas (Lactococcus garviaes).

[0012] O documento de patente US2013231291 descreve a produção de extrato de isoflavonas, equol e lunasil peptideo por fermentação utilizando bactérias lácticas isoladas. O processo de acordo com este documento tem como foco o uso em cosméticos.

[0013] O documento de patente CN102021 130 descreve o uso de Clostrídium bifermentans zx-7 para a produção de equol por fermentação.

[0014] O documento de patente TW20071221 1 revela a produção de equol com uma coleção de microorganismos da flora intestinal encontrados na flora intestinal humana.

[0015] O documento de patente CN104031875 traz a produção de equol por bactéria modificada geneticamente a partir de Lactococcus.

[0016] Ressalta-se que os processos descritos no estado da técnica são, em majoritariamente baseados em processos fermentativos, utilizando cepas de Lactobacillus (bactérias entéricas) diferentes, isoladas ou em grupos. Alguns dos documentos fazem a fermentação com os meios de cultivo sintéticos, adicionando o precursor de equol daizeina, outros formulam o meio de cultivo com leite de soja, estratégia também utilizada na presente invenção. [0017] Já a presente invenção se vale de processos distintos que são diferentes dos anteriormente descritos no estado da técnica. Um deles utiliza uma mistura de Lactobacillus (estratégia também utilizada no estado da técnica), com o diferencial de utilizar uma enzima isolada de fungo à tanase, um efeito técnico novo e inventivo.

[0018] Em um dos processos de acordo com a presente invenção utiliza-se somente um tratamento enzimático, outro efeito técnico novo e inventivo. Destaca-se que o preparado enzimático de acordo com a presente invenção (de fungo, outro efeito aspecto inovador) não é purificado e possui tanto enzimas conhecidas quanto ainda desconhecidas. Este é um processo novo, não tendo sido encontrado qualquer relato ou sugestão neste sentido no estado da técnica.

[0019] A enzima de acordo com a presente invenção foi extraída de fungo GRAS, que pode ser usado em alimentos.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0020] O presente invento consistiu no desenvolvimento de processos biotecnológicos in vitro capazes de biotransformar as isoflavonas em suas formas bioativas e aumentar o teor de equol em extrato hidrossolúvel de soja através da fermentação deste substrato por bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e aplicação da enzima tanase, obtida a partir de Paecilomyces variotti; composição assim obtido e uso na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.

[0021] Após os processos de biotransformação, obteve-se um ingrediente alimentar derivado de soja que apresentou grande teor de isoflavonas bioativas e equol, demonstrando, assim, que os processos biotecnológicos desenvolvidos consistiram em estratégias eficientes para melhorar o potencial bioativo do extrato de soja e demonstraram um potencial de aplicação do equol como agente nutracêutico para populações não produtoras deste isoflavonoide.

[0022] Produtos à base de soja são uma forma de incluir substâncias bioativas como as isoflavonas na dieta, sendo que o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) é um substrato que tem se apresentado com potencial para produção de novos alimentos com apelo saudável. Desse modo, com o propósito de aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas e avaliar a viabilidade de um processo biotecnológico para produção de equol in vitro, foi desenvolvido o processo descrito neste documento. Foi investigada a aplicação de culturas iniciadoras e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extraio bruto de enzima tanase obtido a partir do fungo Paecilomyces varíotti. Além disso, também foi avaliada a biotransformação dos compostos fenólicos e atividade antioxidante do produto obtido. O teor de fenóis totais foi avaliado por metodologia baseada na reação com o reagente de Folin-Ciocalteau, a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH e a especificidade do extrato semipurificado de tanase frente aos padrões comerciais de isfolavonas, bem como as alterações no perfil fenólico do extrato hídrossolúvel de soja foram avaliadas por CLAE-DAD. Após o processo fermentativo e/ou tratamento enzimático do extrato hídrossolúvel de soja, houve um significativo aumento no teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante, por ambos métodos testados (ORAC e DPPH), quando comparados com o controle de EHS sem reação. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico das amostras de EHS biotransformadas obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na concentração das formas agliconas em relação às glicosiladas, bem como o aumento da concentração de equol após os processos de biotransformação propostos. Os resultados obtidos, indicam que o extrato de tanase de P. variotty foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das ísoflavonas em suas respectivas formas agliconas (daidzeína e genisteína). Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de isoflavonóides glicosilados por tanase, bem como a formação de equol, é um relato inédito na literatura demonstrando que é possível desenvolver um processo in vitro para a obtenção deste composto bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.

A Figura 1 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD da reação dos padrões de isoflavonas glicosiladas (A) daidzina e (B) genistina com extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii a 40 s C por 30 minutos.

A Figura 2 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD do (A) EHS padrão, (B) EHS fermentado, {C} EHS fermentado reagido com 1 ,8 U de tannase e (D) EHS padrão reagido com 1 ,8 U de tannase a 40° C por 30 minutos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0023] A presente invenção refere-se ao processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato solúvel de soja para obtenção de produto rico em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação com bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e aplicação da enzima tanase; composição assim obtido e uso. Para tanto, o processo pode utilizar formas biotransformação que compreendem na aplicação de cepas de bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e/ou reação com a enzima tanase de Paecilomyces variotti em hidrossolúvel de soja.

[0024] O processo compreende as etapas descritas a seguir:

A. Macerar os grãos de soja íntegros a temperatura ambiente em água destilada (grãos de soja água; 1 :3 p/v);

B. Descartar a agua utilizada para maceração;

C. Adicionar agua destilada;

D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 1 10 Q C, preferencialmente a 100°C, (grãos de soja/água; 1 :2 p/v) por 3 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos;

E. Adicionar agua destilada

F. Triturar os grãos de soja com água destilada (grãos de soja/água; 1 :4 P/v);

G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10000 x g, preferencialmente 9630 x g, por 10 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos a temperatura ambiente (±25 5 C);

H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição entre 96 9 C e 100 9 C por 10 a 15 minutos, preferencialmente 0 minutos;

I. Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 °C, durante 15 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos;

a. Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração a 4 a 12 Q C, por até 10 dias, ou congelar o extrato a -80 Q C até sua utilização;

J. Realizar os processos de biotransformação do extrato hidrossolúvel de soja que podem ser realizados por qualquer uma das seguintes formas:

Processo 1 - Biotransformação fermentativa: Bactéria iniciadoras Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L81 1 ) e Lactobacillus delbrueckíi ssp. Bulgaricus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probióticas Bifidobacterium animales ssp. Laciis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus (LA-05);

i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 a 15% (v/v), preferencialmente 5% (v/v), e contagem mínima de 10 6 - 10 7 log UFC/mL e máxima de 10 14 log UFC/mL no EHS obtido em (I); e

ii. Incubar a solução obtida em (i) entre 30 e 40 e C, preferencialmente a 37 9 C, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose;

Processo 2 - Biotransformação fermentativa seguida por enzimática

i. Inocularas culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 - 15% (v/v), preferencialmente a 5% (v/v), e contagem mínima de 10 6 - 10 7 log UFC/mL e máxima de 10 14 log UFC/mL no EHS obtido em (I);

ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida em (i) entre 30 e 40 S C, preferencialmente a 37 5 C, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose; iii. Inocular em solução obtida em (ii) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por ml de EHS fermentado (ii);

iv. Incubar a solução de (iii) entre 35 a 45°C, preferencialmente 40 g C, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2°C, preferencialmente 0 Q C (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;

Processo 3 - Biotransformação enzimática

i. Inocular em EHS obtida em (I) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS (I); ii. Incubar a solução em (i) entre entre 35 a 45°C, preferencialmente 40 Q C, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e

íii. Incubar a solução de (ii) entre -2 a 2°C, preferencialmente

0 9 C (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente

15 minutos;

K. Manter o produto EHS com isoflavonas bioativas e equol congelado a - 80 9 C.

[0025] As composições obtidas do processo descrito compreendem as características segundo o tipo de biotransformação conforme a tabela 1 abaixo e têm aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.

Tabela 1 : Composições obtida a partir do processo descrito

Exemplificação

Preparo do extraio hidrossolúvel de soja

[0026] O extrato hidrossolúvel de soja foi preparado de acordo com metodologia descrita por Mandarino e Carrão-Panizzi (1999). Foram utilizados grãos de soja (Glycíne max) da marca "Natu's".

[0027] O processo pode ser representado pelas etapas a seguir:

1. Macerar os grãos de soja íntegros por 6 horas a temperatura ambiente em água destilada em água destilada (grãos de soja/água; 1 :3 p/v).

2. Descartar a agua utilizada para maceração 3. Ferver grãos em água (grãos de soja/água; 1 :2 p/v) por cinco minutos.

4. Triturar os grãos de soja com auxílio de liquidificador, com água destilada (grãos de soja/água; 1 :4 p/v) por 3 minutos.

5. Centrifugar a massa obtida a 9630 x g por 15 minutos a temperatura ambiente.

6. Aquecer o sobrenadante obtido, conhecido como extrato hidrossolúvel de soja, até ebulição por 10 minutos.

7. Distribuir o extrato de soja em frascos e esterilizar por aquecimento a 121 °C durante 15 minutos.

8. Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração até sua utilização nas análises.

Obtenção de extrato semipuríficado de tanase

[0028] A enzima tanase (E.C: 3.1.1.20), obtida a partir do microorganismo Paecilomyces variotii, como descrito por Battestin e Macedo (2007a), foi utilizada neste estudo.

Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:

a) Adicionar, em erlenmeyers de 250 ml_, 10 g de farelo de trigo (Natu's, Hortolândia, Brasil), 10 mL de água destilada e 10% de ácido tânico (p/p) (Tanal B, Prozyn BioSolution, São Paulo, Brasil)

b) Esterilizar o meio de cultura a 121 Q C por 15 minutos.

c) Inocular 2,5 mL (5,0x107 esporos/mL) da suspensão de pré-inóculo em água destilada

d) Incubar o meio a 30-C por 120 horas.

e) Adicionar 80 mL de tampão acetato (20 mM, pH 5,0) ao meio.

f) Agitar o meto a 200 rpm por 1 hora.

g) Filtrar a solução final e centrifugar a 9630 x g por 30 minutos a 4 Q C (Centrífuga Beckman J2-2 , Beckman-Coulter, INC Fullerton, CA, USA). h) Adicionar, ao sobrenadante, sulfato de amónio (Ecibra, Santo Amaro, São Paulo, Brasil) em concentração final de 80% de saturação (561 g/L). i) Manter sob refrigeração por 12 horas a 4 9 C.

j) Recolher o precipitado formado por centrifugação a (9630 x g por 30 minutos) e ressuspender o mesmo em água destilada

k) Dialisar por 48 horas em água destilada. 1) Congelar a -18°C e liofilizar, em liofilizador de bancada (Liotop L101 , Liobras Ind. Com. Serv. Liofilizadores Ltda., São Carlos, São Paulo, Brasil), durante 24 horas,

m) Manter o extrato semipuriíicado liofilizado a -18 g C.

Determinação de atividade enzimática

[0029] A medida de atividade enzimática do extrato semipuriíicado de tanase foi realizada de acordo com metodologia proposta por Battestin & Macedo (2007b). O substrato consistiu em uma solução de ácido tânico (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) 0,7% (p/v) em tampão acetato (0,2 M, pH 5,5). Para a realização da reação foram seguidos os seguintes passos:

a) Adicionar 0,3 ml_ da solução de substrato a 0,5 ml de extrato de enzima. b) Incubar a 60°C durante 10 minutos.

c) Paralisar a reação pela adição de 3 mL de uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1 ,0 mg/mL preparada em solução de cloreto de sódio 0,17 M em tampão acetato (0,2 M, pH 5,0).

d) Filtrar e centrifugar a solução a 10.070 x g por 15 min a 4°C.

e) Dissolver o precipitado a 3 mL em SDS-triethanolamina

f) Adicionar 1 ml do reagente FeCI3.

g) Manter em repouso por 15 minutos para a estabilização da cor.

h) Medir a absorbância a 530 nm (Mondai, Banerjee, Jana, & Pati, 2001 ). i) Calcular a atividade enzimática por Abs530 = Abscontrole-Absteste.

Uma unidade de atividade de tanase foi definida como a quantidade de ácido tânico hidrolisado por 1 mL de enzima por minuto de reação.

Biotransformação enzimática dos isoflavonoides

[0030] Os padrões comerciais de isoflavonoides genistina, daidzina, genisteína e daidzeína (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) foram utilizados como substrato para hidrólise enzimática por tanase isolada a partir de Paecilomyces variotti (Battestin & Macedo, 2007a).

[0031 ] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:

a) Dissolver 1 mg dos padrões de isoflavonoidess em 1 mL de tampão fosfato (pH 7,4, 75 mM).

b) Incubar a solução com 0,18U de tanase, por 30 minutos a 4 9 C em banho termostatizado (modelo B12D, Micronal, São Paulo, Brasil).

c) Paralisar o processo de hidrólise em banho de gelo por 15 minutos. d) Avaliar, por HPLC-DAD, os produtos finais dos padrões de isoflavonoides.

Processos de biotransformação do extrato hidrossolúvel de soja

Processo 1 - Biotransformação fermentativa

[0032] Foram utilizadas culturas comerciais liofilizadas (Christian Hansen Lab. Ind. e Com. Ltda) de culturas iniciadoras Streptococcus ssp. Thermophilus (YF- L811 ) e Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probióticas Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus (LA-05). Todas as culturas liofilizadas foram reativadas, individualmente, em extrato hidrossolúvel de soja estéril a 37 9 C por 12 horas em condições de anaerobiose utilizando uma jarra de anaerobiose. As culturas iniciadoras foram inoculadas na concentração de 1 % (v/v) e as bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5% (v/v), garantindo uma contagem mínima de 10 6 - 10 7 log UFC/mL (Cruz et al., 2013).

[0033] A fermentação do extrato hidrossolúvel de soja fermentado foi conduzida de acordo com metodologia tradicional (Tamime e Robinson, 2007) de acordo com as seguintes etapas:

a) Inocular, assepticamente, o extrato hidrossolúvel de soja estéril com o conteúdo total de cada cultura bacteriana reativada.

b) Incubar o EHS inoculado a 37 Q C por 24 horas em condições de anaerobiose utilizando uma jarra de anaerobiose.

As amostras do EHS fermentado foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).

Processo 2 - Biotransformação fermentativa seguida por enzimática

[0034] O EHS fermentado (1 mL), obtido no processo 1 , foi inoculado com 1 ,8 U de tanase, a 40 e C por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos.

[0035] As amostras do EHS biotransformadas foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).

Processo 3 - Biotransformação enzimática

[0036] O EHS não fermentado (1 mL) foi inoculado com 1 ,8 U de tanase, a 40-C por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos. [0037] As amostras do EHS biotransformados foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).

Avaliação do perfil químico

Teor cie fenóiicos totais

[0038] O teor de fenóiicos totais nas amostras foi determinado com o reagente Folin-Ciocalteu (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil) de acordo com o método de Chandler and Doods (1983), com algumas modificações.

[0039] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:

a) Diluir uma alíquota de 1 ml_ das amostras, na proporção de 1 :5, com metanol 70%.

b) Adicionar 5 ml_ de água destilada, seguido por 0,5 ml_ de reagente de Folin-fenol Ciacalteu 1 M (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil). c) Agitar as amostras.

d) Manter em repouso por 5 minutos.

e) Adicionar 1 ml_ de solução de carbonato de sódio 5% (m/v) ao meio reacional de cada amostra.

f) Agitadas e incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente por 1 hora.

g) Agitar novamente as amostras.

h) Realizar leitura das absorbâncias a 725 nm em espectrofotômetro (modelo DU®640, Beckman CoulterTM, EUA).

As concentrações de fenóiicos totais foram determinadas por comparação de absorbância dasamostras com uma curva de calibração utilizando catequina como padrão. Os resultados foram expressos em g de catequina por mL de amostra.

Análise dos isoflavonoides por HPLC

[0040] As isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina), agliconas (daidzeína e genisteína) e equol foram identificados e quantificados em todas as amostras por HPLC-DAD.

[0041 ] A extração dos isoflavonoides das amostras do extraio de soja foi realizada de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003), com modificações de acordo com as seguintes etapas: a) Misturar 1 ml_ das amostras dos extratos de soja biotransformados com 5 mL de metanol 70% a 25 Q C, por 60 minutos, a 100 rpm.

b) Centrifugar a mistura por 10 minutos a 5790 x g.

c) Filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 μιη, antes de ser injetado num HPLC de fase invertida.

[0042] As condições cromatográficas utilizadas foram previamente descritas por Park et al. (2001 ). Foi utilizado o equipamento Dionex Ulitmate 3000 (Alemanha) equipado com uma coluna C18 Atlantis® (Waters, 5 μιη, 4,6 x 150 mm) mantida a 30 9 C. A detecção foi realizada utilizando um detector de arranjo de díodos UV/VIS (DAD-3000). As fases móveis consistiram em água deionizada (solvente A) e metanol (solvente B). O gradiente de eluição foi o seguinte: 20% B (0-15 min), 20-80% B (15-75min), 80-100% B (75-80min), 100-20% B (80-90 min) e 20% B (90-95 min) com vazão de 0.5 mL/min. O volume de injeçâo de amostra foi de 20 μΙ_ e todas as amostras foram analisadas em triplicata. Os espectros foram obtidos entre 190 e 480 nm e os cromatogramas processados a 254 nm.

[0043] Os isoflavonoides foram identificados individualmente por comparação dos seus tempos de retenção e o espectro dos seus padrões: daidzina, genistina, daidzeína, genisteína e equol. A quantificação individual dos isfolavonoides foi realizada por integração das áreas dos picos utilizando curvas de calibração que foram estabelecidas no intervalo de concentração de 0,01 -1 ,0 mg/mL dos padrões de isoflavonas e equol. Os resultados foram expressos em de cada composto fenólico por mL de amostra.

Atividade antioxidante dos polifenóis do extrato de soja biotransformado

Capacidade de absorção do radical oxigénio (ORAC)

[0044] A determinação da capacidade antioxidante pelo método do ORAC foi realizada conforme metodologia descrita por Macedo et al. (201 1 ), utilizando fluoresceína (FL) como sinalizador. O teste automatizado de ORAC foi realizado em leitor de microplacas Fluostar Óptima (Fluostar Óptima - Labtech BMG, Alemanha) com filtros de fluorescência para um comprimento de onda de excitação de 485 nm e de emissão de 520 nm. As medidas foram realizadas em placas pretas opacas Costar® (Corning Costar Corporation, Cambridge, EUA) com 96 poços.

Antes da reação várias etapas de preparo das soluções devem ser seguidas: a) Decompor, a 37°C, o AAPH (2,2'-azinobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto) em tampão fosfato (75 mM, pH 7,4). Obs: tal fato ocorre devido à sensibilidade da FL ao pH.

b) Preparar diariamente a solução de FL (70 nM), em tampão de fosfato (PBS) (75 mM, pH 7,4).

c) Armazenar no escuro.

d) Preparar (diariamente) em PBS uma solução de Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromo-2-carboxylic acid) 75 μΜ (utilizada como padrão de referência).

e) Construir uma curva padrão de Trolox diluindo a solução de 1 ,5-1500 pmol/mL.

A reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas:

a) Diluir 1 ml de cada amostra utilizando metanol 70% na proporção de 1 :5. b) Misturar, em cada poço, 120 pL de solução FL com 20 pL de amostra, branco (PBS) ou solução padrão (Trolox).

c) Adicionar 60 pL de AAPH (12 mM).

d) Realizar, em triplicata e a cada 6 minutos durante 87 minutos, a medida da fluorescência imediatamente após a adição do AAPH

[0045] Os valores de ORAC foram definidos como sendo a diferença entre a área sob a curva de decaimento de FL e do branco (net AUC). Equações de regressão entre net AUC e concentração de antioxidantes foram calculadas para todas as amostras. Um controle de tanase foi realizado como uma amostra regular, e o valor de ORAC obtido foi subtraído das amostras tratadas com esta enzima. Os valores de ORAC-FL foram expressos em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.

Sequestro dos radicais livres do DPPH

[0046] O potencial de atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja, fermentado e não fermentado, também foi avaliado pela atividade de sequestro do radical livre estável 1 ,1 -difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), como descrito por Macedo et ai. (201 1 ).

a) Preparar várias concentrações (0,01 -0,1 mg/mL em metanol 70% (v/v)) de amostras testadas.

b) Misturar 50 pL das amostras testes com 150 pL de DPPH 0,2 mM em metanol) em placas de 96 poços (BMG LABTECH 96, Alemanha), c) Realizar a leitura em um leitor de microplacas Fluostar Óptima (BMG Fluostar Óptima - Labtech, Alemanha) com filtros de absorção para um comprimento de onda de excitação de 520 nm.

[0047] O processo de decaimento da cor das amostras foi registado depois de 90 minutos de reação e comparado com um branco controle; para as amostras de cores e amostras tratadas com tanase, foi realizado um controlo adicional, que continha a solução de extrato (ou solução de tanase) e metanol puro, em vez de DPPH. As soluções foram preparadas e armazenadas no escuro. As medidas foram realizadas em triplicata e a atividade antioxidante foi calculada a partir da equação obtida por regressão linear determinada traçando a atividade antioxidante de soluções padrão de Trolox com concentrações conhecidas. A atividade antioxidante foi expressa em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.

Análises estatísticas

[0048] Os resultados foram expressos como médias aritméticas e desvios padrões. A significância estatística das diferenças entre os grupos foi analisada pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05.

Efeitos dos bioprocessos no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante

[0049] Os efeitos da fermentação e/ou biotransformação enzimática no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja, medida pelos métodos do ORAC e DPPH, estão apresentados na Tabela 2. Diferenças significativas · (p <0,05) no teor de fenólicos totais, ORAC e DPPH foram encontradas em todos os bioprocessos.

Tabela 2. Teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ORAC e DPPH) das amostras do extrato hidrossolúvel de soja antes e após os processos de biotransformação.

Bioprocesso Amostras Fenólicos ORAC Equiv. DPPH Equiv.

Totais Equiv. Trolox (pmol/L) Trolox (pmol/L) Catequina

(pg /ml_)

Padrão EHS 101 a ± 6 1 1584 a ± 1022 821 a ± 14 1 EHS 254 b ± 11 25987 b ± 977 1729 b ± 27 fermentado

II EHS soja 387 c ± 9 31801° ± 858 4439 c ± 39 fermentado

+ tanase

III EHS + 847 d ± 7 45758 d ± 937 6724 d ± 36 tanase

*Os resultados apresentados são médias (n = 3) ± DP, e aqueles com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes, com p < 0,05.

[0050] Os resultados mostraram que houve um aumento significativo no teor de fenólicos totais para todas as amostras biotransformadas (p <0,05). Após o processo fermentativo com bactérias ácido láticas (processo 1 ), o teor de fenólicos totais do extrato hidrossolúvel de soja aumentou significativamente de 101 para 254 pg catequina/mL, um aumento de cerca de 2,5 vezes comparado com o padrão (EHS não biotransformado). No processo 2, quando analisado a reação do EHS fermentado com a enzima tanase, também foi observado um aumento significativo no teor de fenólicos totais em que o aumento foi cerca de 3,8 vezes (101-387 g catequina/mL), quando comparado com o padrão. O processo 3 mostrou o maior aumento em conteúdo de fenólicos totais (101 -847 Mg catequina/mL), aumento de cerca de 8,4 vezes após a reação do EHS com a enzima tanase. Estes resultados sugerem que o processo fermentativo e de biotransformação enzimática com tanase melhora a liberação de compostos fenólicos do extrato de soja. Além disso, os resultados parecem indicar um maior potencial catalítico da tanase obre os fenólicos do extrato de soja quando comparado à ação fermentativa das bactérias ácido lácticas.

[0051] A atividade antioxidante das amostras, antes e após os três processos de biotransformação do EHS, foi analisada pelos métodos do ORAC e DPPH, in vitro. Os resultados estão descritos na Tabela 2 e expressos em equivalentes de Trolox®. Os resultados demonstraram que houve um aumento significativo na atividade antioxidante das amostras biotransformadas em ambas as metodologias (p<0,05), correlacionando com os resultados encontrados para teor de fenóis totais.

[0052] Os resultados da tabela 2 indicam que o processo de fermentação do EHS (processo 1) resultou , no aumento significativo de cerca de 2,2 vezes na capacidade antioxidante pelo método ORAC e um aumento de aproximadamente 2,1 vezes pelo método de DPPH. A fermentação seguida pela biotransformação enzimática (processo 2) levou a um aumento na atividade antioxidante de 2,7 e 5,4 vezes pelos ensaios ORAC e DPPH, respectivamente. Do mesmo modo, na biotransformação do EHS catalisada apenas pela tanase (processo 3), houve um aumento significativo na atividade antioxidante de 4 e 8 vezes por ORAC e DPPH, respectivamente.

[0053] A soja e os produtos à base de soja são alimentos nutricionalmente ricos e possuem vários fitoquímicos (isoflavonas, fitoesteróis, saponinas, ácidos fenólicos, ácido fítico e inibidores de tripsina) que possuem propriedades funcionais, antioxidantes e de eliminação de radicais livres (Wardhani, Vázquez, e Pandiellaa, 2010). Os compostos fenólicos de soja apresentam atividade sequestradora de radicais livres (Shon et al., 2007), o que pode explicar a correspondência entre o aumento do teor de fenólicos totais com atividade antioxidante demonstrada na tabela 2.

[0054] Em resumo, os resultados da presente invenção indicam uma tendência do aumento do teor de fenólicos totais após os três bioprocessos propostos. Tal tendência foi semelhante à observada para a atividade antioxidante, tanto pelo método ORAC quanto pelo DPPH, apoiando os resultados obtidos pela biotransformação microbiana e enzimática do EHS.

Perfil das isoflavonas

[0055] A concentração de genistina, daidzina, genisteína, daidzeína e a formação de equol foram avaliadas, antes e após os três processos de biotransformação, utilizando HPLC-DAD (Tabela 3). As isoflavonas e equol foram separados e identificados de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003).

Tabela 3. Concentrações dos isômeros de isoflavonas e equol (Mg/mL) em extrato hidrossolúvel de soja antes (padrão) e após os processos de biotransformação.

Conteúdo de isoflavonoides (pg/mL)

Processo Amostras Glicosiladas Agliconas

s Daidzin Genistin I Daidzeín I Genisteín

a a a a Padrão EHS 313,0 a ± 393,8 a ± 25,6 a ± 10,2 a ± 0,08 a

2,0 3,2 0,6 0,5 +

0,000 3

1 EHS 194,2 b ± 202.5 ± 91 ,4 b ± 52,3 b ± 0,31 b fermentad 5,7 5,9 1 ,9 2,0 ±

0 0,000

8 li EHS n.d. * n.d. 717,2° ± 251 ,4 C ± 0,63 c fermentad 1 1 ,0 6,9 + o + tanase 0,014

2

III EHS + n.d. n.d. 944,5 d ± 321 ,6 d ± 0,82 d tanase 0,9 0,8 +

0,010 4 n.d. = Não detectado abaixo do limite de detecção para esta metodologia e equipamentos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (n = 3). A média na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes {p <0,05).

[0056] Os resultados demonstraram que todos os bioprocessos desenvolvidos foram capazes de aumentar significativamente o teor das formas agliconas (daidzeína e genisteína) e equol em extraio hidrossolúvel de soja. Devido à hidrólise da daidzina e genistina, o conteúdo das suas correspondentes formas agliconas, daidzeína e genisteína, em EHS aumentou após o processo fermentativo e enzimático (p <0,05).

[0057] Como demonstrado na tabela 3, as isoflavonas glicosídicas foram as formas predominantes no EHS padrão e fermentado. No entanto, as concentrações dos glicosídeos genistina e daidzina do EHS fermentado (processo I) diminuíram cerca de 1 ,6 e 2 vezes, respectivamente, e as algiconas daidzeína e a genisteína aumentaram cerca de 3,5 e 5 vezes, respectivamente, quando comparado com o EHS padrão. Portanto, estes resultados sugerem que as isoflavonas glicosiladas foram transformadas em formas agliconas como resultado do processo de fermentação. De acordo com Duenas et al., (2012), este fato pode ser devido à atividade de β-glicosidase inerente aos microrganismos utilizados no processo fermentativo.

[0058] Como pode ser observado na tabela 3, após os processos II e III, as formas glicosídicas (daidzina e genistina) não foram identificadas, mostrando que estas formas foram convertidas em suas respectivas formas agliconas, como mostrado por um aumento significativo nos níveis de daidzeína e genisteína após estes bioprocessos.

[0059] As concentrações das formas agliconas do EHS fermentado, após o processo II, aumentaram significativamente cerca de 28 vezes (25,6 - 717,2 mg/mL) para a daidzeína e 25 vezes (10,2- 251 ,4 mg/mL) para a genisteína, comparado com o EHS padrão. No processo ill as formas agliconas aumentaram significativamente, comparado com o EHS padrão, cerca de 37 vezes (25,6 - 944,5 mg/mL) para a daidzeína e 32 vezes (10,2 - 321 ,6 mg/mL) para a genisteína. Estes resultados indicam que a reação enzimática com tanasse (processo III) apresentou o maior aumento das formas bioativas das isoflavonas, o que também foi observado para os resultados do teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante pelos métodos do ORAC e DPPH.

[0060] As isoflavonas agliconas foram reportadas por exibir maior função bioativa do que as formas glicosídicas (Cederroth, e Nef, 2009; Setchell, 1998). Portanto, as agliconas são as principais responsáveis pela atividade antioxidante de alimentos à base de soja, embora outros componentes da soja, tais como compostos fenólicos também possam contribuir para a capacidade antioxidante em certa medida (Cheng, Lin, e Liu, 201 1 ).

[0061 ] Portanto, a bioconversão das isoflavonas gicosiladas em suas formas agliconas após os três processos de biotransformação propostos, provou ser muito eficaz para aumentar a capacidade antioxidante das amostras pelos métodos testados, como foi demonstrado com os testes in vitro de atividade antioxidante (ORAC e DPPH).

[0062] A habilidade da enzima tanase em bíotransformar padrões comerciais de isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina) foi provada em ensaios realizados in vitro. A figura 1 apresenta os cromatogramas obtidos após de 30 minutos de ração, a 40° C, em que padrões comerciais de daidzina (A) e genisteína (B) foram reagidos com com extrato semipurif içado de tanase de P. variotti. Também são apresentados os tempos de retenção e os espectros de absorção dos produtos da reação.

[0063] Como mostrado na figura 1 , é possível constatar que a reação entre a tanase e os padrões de isfolavonas glicosiladas (daidzina e genistina), levou à formação das suas respectivas formas agliconas (A) dadizeína e (B) genisteína. Tal fato pode ser confirmado a partir da similaridade entre o tempo de retenção dos produtos das reações. Estes resultados provam que a tanase é capaz de atuar na hidrólise das ligações glicosídicas das isoflavonas.

[0064] Como mostrado na tabela 3, a concentração de equol após a fermentação do EHS com bactérias do ácido láctico (processo I) levou a um aumento significativo no teor de equol, cerca de 3,9 vezes. No processo II, o tratamento enzimático do EHS fermentado levou a um aumento significativo de cerca de cerca de 7,9 vezes deste composto bioativo, quando comparado ao EHS padrão. No processo III, após o tratamento enzimático do EHS bruto o aumento foi de cerca de 10 vezes. Estes resultados indicam que a tanase de P. variotiii apresentou maior ação hidrolítica das isoflavonas glicosiladas em relação ao processo de fermentação e também foi capaz de melhorar o conteúdo de equol em EHS.

[0065] A capacidade da tanase em biotransformar as isoflavonas glicosiladas e aumentar o conteúdo de equol no EHS pode ser confirmada pelos cromatogramas presentes na figura 2.

[0066] A figura 2 apresenta o perfil cromatográfico da composição geral dos polifenóis do EHS padrão (A) e do EHS fermentado por bactérias do ácido lácticas (B), bem como para o EHS fermentado (C) e EHS não fermentado (D) tratado com 1 ,8 U de extrato semi-purificado de tanase.

[0067] Na figura 2, é possível observar que ambos os processos de fermentação e tratamento enzimático foram capazes de aumentar significativamente o conteúdo de isoflavonas agliconas (daidzeína e genisteína). Além disso, estes bioprocessos levaram à formação de equol.

[0068] Os resultados da tabela 3 demonstraram que a tanase de P. variotti foi capaz de sintetizar o equol a um nível superior quando comparada às cepas microbianas utilizadas no processo de fermentação. Para o melhor do nosso conhecimento, estudos nessa área são raros e há pouca informação sobre a correlação entre a formação equol e uso de enzimas. [0069] Também pode-se observar que a ação desta enzima não se limitou a uma degiicosilação da isoflavonas (figura 1 ), a tanase também foi capaz de aumentar o teor de equol. Estes resultados fazem desta enzima uma opção interessante para aplicação em alimentos à base de soja, com uma composição rica em polifenóis em que a tanase pode agir de diferentes maneiras no processo de biotransformação.

Referências Bibliográficas

Aleke!, D. L, Germain, A. S., Peterson, C. T., Hanson, K. B., Stewart, J. W., & Toda, T. (2000). Isoflavone-rich soy protein isolate attenuates bone loss in the lumbar spine of perimenopausal women, American Journal of Clinicai Nutrition, 72(3), 844- 852.

Aguiar, C. L; Suzuki, C. N.; Paredes, J. G.; Alencar, S. M.; Park, Y. K. (2003). Transformation of beta-glucoside isofíavones on solid-state fermentation of the soy flour with Aspergillus oryzae. Ciência y Tecnologia Alimentaria, 4(2), 1 15- 121 .

Battestin, V., & Macedo, G. A. (2007a). Tannase production by Paecilomyces variotii. Bioresource Technology, 98(9), 1832-1837.

Battestin, V., & Macedo, G. A. (2007b). Purification and biochemical characterization of tannase from a newly isolated strain of Paecilomyces variotii. Food Biotechnology, 21 (3), 207-216.

Battestin, V., Macedo, G. A., & de Freitas, V. A. P. (2008). Hydrolysis of epigalíocatechingallate using a tannase from Paecilomyces variotti. Food Chemistry, 108(1 ), 228-233.

Cao, S., Sofic, M., & Prior, R. L. (1996). Antioxidant capacity of tea and common vegetables. Journal of Agricultural Food Chemistry, 44(1 1 ), 3426-3431 .

Cederroth, C. R., & Nef, S. (2009). Soy, phytoestrogens and metabolism: a review. Molecular and Cellular Endocrinology, 304(1 ), 30-42.

Chandler, S. F., & Dodds, J. H. (1983). The effect of phosphate, nitrogen, and sucrose on the production of phenolics and socosidine in callus cultures of solanum tuberosum. Plant Celi Reports, 2:105-108.

Chang, C. T., Hsu, C. K., Chou, S. T., Chen, Y. C, Huang, F. S. & Chung Y.C. (2009). Effect of fermentation time on the antioxidant activities of tempeh prepared from fermented soybean using Rhizopus oligosporus. Internaíonal Journal of Food Science and Technology, 44(4), 799-806. Cheng, C, Wang, X., Weak!ey, S. M., Kougias, P., Lin, P. H., Qizhi, Y., et ai. (2010). Soybean isoflavonoid equol biocks ritonavir-induced endothe!ia dysfunction in porcine pulmonary arteries and human pulmonary artery endothelial cells. Journal of Nutrition, 140(1 ), 7-12.

Cheng, K. C., Lin, J. T., & Liu, W. H. (2011). Extracts from fermented b!ack soybean by immobilized Rhizopus oligosporous exhibit both antioxidative and cytotoxic acttvtties. Food Technology and Biotechnology, 49(1 ), 11-117.

Chien, H. L., Huang, H. Y., & Chou, C. C. (2006). Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bactéria and bifidobacteria. Food Microbiology, 23(8), 772-778.

Cho, K. M., Hong, S. Y., Math, R. K., Lee, J. H., Kambiranda, D. M., Kim, J. M. et al. (2009). Biotransformation of phenolics (isoflavones, flavanols and phenolic acids) during the fermentation of cheonggukjang by Bacillus pumilus HY1. Food Chemistry, 114(2), 413-419.

Clerici, C, Setchell, K. D., Battezzati, P. M., Pirro, ., Giuliano, V., Asciutti, S., Castellani, D., et al. (2007). Pasta naturally enriched with isoflavone aglycons from soy germ reduces serum lipids and improves markers of cardiovascular risk. Journal of Nutrition, 137(10), 2270-2278.

Cruz, A. G., Guerreiro, L., Nogueira, L. C, SanfAna, A. S., Faria, J. A. F., Oliveira, C. A. F., et al. (2013). Developing a prebiotic yogurt: rheologícal, physico-chemical and microbiological aspects and adequacy of survival analysis methodology. Journal of Food Engineering, 114(3), 323-330.

Duenas, ., Hernandez, T., Robredo, S., Lamparski, G., Estrella, & I., Munoz, R. (2012). Bioactive phenolic compounds of soybean (Glycine max cv. Merit): modifications by different microbiological fermentations. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 62(4), 241-250.

Di Cagno, R., Mazzacane, F., Rizello, C. G., Vincentini, O., Silano, M., Guilani, G., et al. (2010). Synthesis of isoflavone aglycones and equol in soy milks fermented by food-related lactic acid bactéria and their effect on human intestinal Caco-2 cells. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 58(19), 10338-10446. Ferreira, L R., Macedo, J. A., Ribeiro, M. L & Macedo, G. A. (2013). Improving the chemopreventive potential of orange juice by enzymatic biotransformation. Food Research International, 51 (2), 526-535. Huang, D., Ou, D., & Hampsch-Woodi, M. (2002). Deveiopment and validation of oxygen radical absorbance capacity assay for lipophilic antioxidants using randomly methylated b-cyclodextrin as the solubility enhancer. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(7), 1815-1821 .

King, R. A., & Bigneli, C. M., (2000). Concentrations of isoflavones phytoestrogens and their glucosides in Australian soya beans and soya foods. Australian Journal of Nutrition and Dietetics, 57(2), 70-78.

Macedo, J. A., Battestin, V., Ribeiro, M. L, & Macedo, G. A. (201 1 ). Increasing the antioxidant power of tea extracts by biotransformatton of polyphenols. Food Chemistry, 126(2), 491- 97.

Mandarino, J. M. G., & Carrão-Panizzi, M.C. (1999). A soja na cozinha. Embrapa Soja, doe. 136. p.13.

McCue, P. P., & Shetty, K. (2005). Phenolic antioxidant mobilization during yogurt production from soymilk using Kefir cultures. Process Biochemistry, 40(5), 1791— 1797.

Nam, D. H., Kim, H. J., Um, J. S., Kim, K. H, Park C, Kim J. H., et al. (201 1 ). Simultaneous . enhancement of free isoflavone content and potential of soybean by fermentation with Aspergillus oryzae. Journal of Food Science, 76(8), 194- . 200.

Nielsen, I. L, & Williamson, G. (2007). Review of the factors affecting bioavatlability of soy isoflavones in humans. Nutritional and Câncer, 57(1 ), 1 -10. Park Y. K., Alencar, S. M., Nery, I. A., Aguiar, CL, Pacheco, T. A. R. C. (2001 ). Enrichment of isoflavone aglycones in extracted soybean isoflavones by heat and fungai β-glucosidase. Food Science-South Korea, 34(4), 14-19.

Pyo, Y-H., Lee, T-C, & Lee, Y-C. (2005). Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented with β-glucosidase-producing lactic acid bactéria. Food Research International, 38(5), 551-559.

Setchell, K. D. (1 998). Phytoestrogens: the biochemistry, physíology, and implications for human health of soy isoflavones. American Journal of Clinicai Nutrition, 68(6), 1333-1346.

Shon, M. Y., Lee, J., Choi, J. H., Choi, S. Y., Nam, S. H., Seo, K. I., et al. (2007). Antioxidant and free radical scavenging activity of methanol extract of chungkukjang. Journal of Food Composition and Analysis, 20(2), 1 13- 18. Tamime, A. Y., & Robinson R.K. (2007). Yoghurt: Science and Technology. Ç3th ed.). Cambridge, UK: Woodhead Publishing, 791 p.

Tyug, T. S., Prasad, K. N., & Ismail, A. (2010). Antioxidant capacity, phenolics and isoflavones in soybean by-products. Food Chemistry, 123(3), 583-589. Wang, Y. C, Yu, R. C. & Chou, C. C. (2006). Antioxidative activities of soymilk fermented with lactic acid bactéria and bifidobacteria. Food Microbiology, 23(2), 128-135.

Wardhani, D. H., Vázquez, J. A., & Pandiellaa, S. S. (2010). Optimisation of antioxidants extraction from soybeans fermented by Aspergillus oryzae. Food Chemistry, 1 18(3), 731 -739.