"DISPOSITIVO E MÉTODO DE ANÁLISES DE SANGUE POR

PROCESSAMENTO DE IMAGEM"

Domínio técnico

A presente invenção refere-se um dispositivo de deteção de aglutinação imunológica. Mais especificamente, consiste num dispositivo que permite a deteção dos diferentes grupos sanguíneos, assim como de algumas doenças sanguíneas através da aglutinação das células sanguíneas através de técnicas de processamento de imagem.

Antecedentes

Atualmente, a determinação do grupo sanguíneo, em situações de emergência, é um teste moroso tendo em conta a necessidade imediata de sangue. Nestas situações, a prática corrente consiste em administrar o tipo de sangue O Negativo, dado constituir menor risco de incompatibilidade pois é considerado o dador universal. No entanto, apesar de o risco ser menor, ainda existem possíveis reações que podem ser evitadas com a administração de um tipo de sangue compatível com o do paciente, desde a primeira unidade de sangue a transfundir.

A presente invenção msere-se na area determinação alguns antigénios e anticorpos presentes no sangue paciente, utilizando métodos que se adequam a situações emergência de forma a tornar a determinação mais rápida.

Os glóbulos vermelhos possuem na sua superfície uma variedade de antigénios relevantes para a transfusão de sangue. Estes antigénios estão agrupados em sistemas como ABO, D (Rh) , Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran, Kidd e Xg, sendo os sistemas ABO e D (Rh) os mais relevantes no âmbito das transfusões.

A transfusão de sangue de um individuo para outro, há décadas atrás, permitiu verificar a importância das transfusões e as incompatibilidades existentes. A pessoa transfundida frequentemente ficava doente e ocasionalmente acabava por morrer após a transfusão. Assim, descobriu-se que existiam diferentes antigénios na superfície dos glóbulos vermelhos e anticorpos no plasma e que a transfusão de sangue de indivíduos com diferentes antigénios resultava na aglutinação do sangue devido à ocorrência de reação antigénio-anticorpo . O sistema ABO é então descrito, e inclui os tipos A, B, AB e O. Indivíduos com tipo A têm nos seus glóbulos vermelhos o antigénio A, enquanto no seu plasma contém anticorpos anti-B. Indivíduos do tipo B possuem nos glóbulos vermelhos antigénios do tipo B e no seu plasma anticorpos do tipo anti-A. Indivíduos do tipo AB possuem quer antigénios do tipo A, quer antigénios do tipo B e não possuem anticorpos no seu plasma. E finalmente, indivíduos do tipo O, ou mais corretamente tipo 0 (zero), não possuem antigénios nos glóbulos vermelhos e possuem anticorpos anti-A e anti-B no seu plasma.

O sistema D (Rh) é o segundo mais importante no âmbito das transfusões, sendo normalmente descrito em conjunto com o sistema ABO com o sufixo "positivo" ou "negativo", como por exemplo, AB positivo, O negativo. A sua importância deve-se à sua grande capacidade de criar aglutinação quando administrado a um tipo incompatível, como por exemplo, administrar um Rh positivo a um indivíduo Rh negativo. Para além destes dois sistemas mais significativos para a transfusão de sangue há muitos outros que estão presentes na superfície dos glóbulos vermelhos. Há alguns antigénios que são extremamente raros, enquanto outros podem ser encontrados na maioria da população. O sistema Kell encontra-se entre os menos raros, seguindo-se o Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran e Xg.

Os testes de determinação de tipos de sangue têm como base a reação de aglutinação. Nestes testes, o sangue do indivíduo é misturado com reagentes específicos que, por exemplo, identificam os antigénios presentes no sangue, como no caso dos reagentes anti-A, anti-B, anti-AB e anti- D. Assim, os glóbulos vermelhos presentes no sangue do indivíduo vão possuir determinados antigénios que em contacto com cada um dos reagentes, que contém anticorpos, vão despoletar reações conforme o tipo de antigénios presentes. Cada uma das reações ocorrida é observável a olho nu e através de processamento de imagem, no caso deste trabalho .

De modo a evitar problemas aquando a transfusão sanguínea, tem-se vindo a desenvolver um variado número de soluções. De acordo com o pedido de patente US 6,330,058, o sistema desenvolvido realiza a análise de sangue ABO e D (Rh) através de um método espectrofotométrico .

O pedido de patente US 8,318,439 apresenta um sistema capaz de realizar análises de tipo de sangue tais como determinação ABO e D (Rh) , fenótipos, prova reversa, prova cruzada, pesquisa de anticorpos e identificação de algumas doenças como malária, febre tifóide. Para tal utiliza deteção óptica que pode incluir transmitância e espectroscopia de refletância, turbidimetria - onde a luz é medida a um ângulo de 180 graus a partir incidente nefelometria - onde a luz é medida a 90 graus a partir de incidentes, ou algum outro de um ângulo a partir do feixe incidente, incluindo a frente dispersão e costas - laser espectroscopia de espalhamento, ou observação visual. Verifica-se que este sistema, para além de ser diferente da presente invenção, é um processo mais moroso e não identifica os antigénios presentes no sangue do individuo. Verifica-se ainda que este sistema requer a sua utilização apenas em laboratório, não se adequando a situações de emergências .

O documento de patente US 8,053,226 refere um sistema que realiza fenótipos e identificação de anticorpos com testes de fluxo lateral. A leitura dos resultados é realizada a olho nu ou através de uma câmara CCD. A diferença entre a nova invenção e este documento consiste no facto de, descrever um teste de fluxo lateral enquanto a nova invenção refere um teste em lâmina.

O documento de patente EP 1397679, refere-se a um dispositivo clinico de diagnóstico inteligente para diagnosticar doenças de acordo com sintomas associados, mas também para realizar análises de sangue ABO e Rh. Para além disso realiza testes de fenótipos e de identificação de doenças como HIV e sífilis. Este dispositivo utiliza microarrays e adapta-se às tecnologias utilizadas atualmente em laboratórios. Verifica-se que a metodologia e respetiva tecnologia são diferentes da nova invenção.

O documento de patente EP 1797426 apresenta um sistema que utiliza uma tecnologia baseada numa deteção microbalança de cristal de quartzo (quartz crystal microbalance QCM) . Esta tecnologia é utilizada para obter uma monitorização rápida dos tipos de sangue diretos e indiretos, realizando também o teste da hepatite. O sistema é totalmente diferente do que se pretende patentear.

Por sua vez, os documentos de Moreira, V. et al, referem-se a um dispositivo portátil de análise sanguíneas que incorpora no seu interior uma câmara que capta a imagem que é refletida por um espelho que se encontra numa posição lateral à placa a analisar. A placa de análise por sua vez é movimentada por uma carne - colocada na direção vertical, acoplada a um veio horizontal de um motor elétrico rotativo - que ao rodar, a velocidade constante, o respetivo perfil faz com que a placa horizontal oscile num movimento de subida e descida de forma que a mistura se realize. O sistema difere da presente invenção dado a aquisição de imagem ser feita com recurso a um espelho entre a câmara e a placa de amostras. Tal facto poderá levar à ocorrência de imprecisões de leitura (distorção da imagem adquirida e que não é compensada pelo sistema) , que depois poderão levar a uma análise com possíveis lapsos. Acrescenta-se ainda que a colocação da placa tem que obedecer a um guiamento mecânico da placa e parte da placa de análise não fica abrangida na totalidade o que levará a que as reações para análise também não fiquem abrangidas, resultando numa análise equívoca e problemática para o paciente. Acrescenta-se ainda que a invenção descrita nesses documentos refere que a seleção da área a analisar é manual.

A presente invenção consiste num novo sistema que permite automatizar a leitura e interpretação de resultados, que são uma das grandes fontes de erros na administração de sangue incompatível. O tempo de determinação é menor face aos documentos identificados anteriormente, uma vez que utiliza o teste em lâmina conjugado com técnicas de processamento de imagem que também não constituem um acréscimo de tempo à realização do teste.

O teste em lâmina é o teste de determinação de tipos de sangue que apresenta resultados num intervalo de tempo mais curto e com um procedimento bastante simples:

Coloca-se nas lâminas de vidro limpas as letras convenientes de forma a identificar o teste a realizar;

2. Pipeta-se uma gota de cada um dos reagentes nas lâminas ;

Ao lado de cada gota de reagente adiciona-se uma gota de sangue total, com 1/4 das dimensões da gota de reagente, ou plasma dependendo do teste em causa;

Utilizando uma vareta de mistura, mistura-se uniformemente o reagente e o sangue, ou plasma numa área de 2,5 cm2 ;

5. Verifica-se macroscopicamente os resultados, de forma a detetar sinais de aglutinação enquanto se faz rodar a lâmina .

Na maioria dos casos, a aglutinação ocorre em poucos segundos, mas para não omitir antigénios ou anticorpos mais fracos, interpreta-se os resultados passados apenas 2 minutos, tal como indicado na bula de referência do procedimento de teste em lâmina. A interpretação dos resultados está dependente do tipo de teste em análise, mas basicamente é determinada pela combinação de ocorrência ou não ocorrência de aglutinação.

A ocorrência de aglutinação identifica o antigénio ou anticorpo em análise, enquanto a não ocorrência significa que no sangue analisado não está presente o antigénio ou anticorpo em estudo. No caso da prova cruzada, a ocorrência de aglutinação significa que irá ocorrer reação entre o dador e o recetor pelo que não será indicado realizar aquela transfusão de sangue. Uma vez que atualmente se analisa os resultados a olho nu, isto é, de um modo visual, podendo existir a possibilidade de se ter uma interpretação errada do resultado, propõe-se o dispositivo desenvolvido para que através da captura dos resultados em forma de imagem e de um programa de computador desenvolvido para o efeito, se obtenha a correta identificação da aglutinação.

Não obstante, a contemplação de novos testes, como prova reversa, prova cruzada, fenótipos, pesquisa e identificação de anticorpos que são igualmente necessários e essenciais para a realização de uma transfusão de sangue, mesmo em situações de emergência, ainda não foi publicada nem revelada à comunidade cientifica, e apesar de já haver vários esforços para automatizar estas técnicas, como se pode ver nas patentes acima citadas, estes sistemas apresentam ainda tempos de obtenção de resultados superiores aos esperados com a metodologia apresentada.

Esta tecnologia permite ainda a identificação de algumas doenças, tais como, Febre tifóide, Brucela, Febre da carraça, Sífilis, Mononucleose, Infeções hospitalares, Bactéria streptococcus , Meningite e Pneumonia que embora outros sistemas sejam capazes de detetar algumas delas, a metodologia e o equipamento são diferentes sendo que no caso das doenças Brucela, Febre da Carraça, Mononucleose, Meningite e Pneumonia, não foi encontrado qualquer sistema que permita esta análise rápida.

Sumário

No presente pedido é descrito num dispositivo portátil de deteção de aglutinação imunológica de amostras sanguíneas, que permite a identificação de alguns antigénios e anticorpos presentes no sangue, caracterizado por compreender :

uma parte superior (1) fechada com uma tampa (2), composta por uma câmara (3) que se encontra centrada, rodeada de LEDS (4) e ligada a um computador portátil ou outro dispositivo móvel que analisa as imagens captadas através de técnicas de processamento de imagem;

- uma parte inferior (5), que por sua vez compreende uma plataforma rotativa (6) ligada a um motor (7) onde se fixa a placa de análise (8);

- uma fonte de alimentação.

Numa forma de realização preferencial, o dispositivo apresenta ainda uma ligação ao computador portátil ou outro dispositivo móvel ser efetuada via USB, Wireless ou Bluetooth, nomeadamente um telefone portátil (smartphone) ou um tablet.

Numa outra forma de realização preferencial, a câmara (3) do referido dispositivo incide diretamente sobre a plataforma rotativa (6) . Ainda numa outra forma de realização preferencial, a parte superior (1) e a parte inferior (5) do dispositivo estão ligadas por uma dobradiça de um dos lados e por um fecho no lado oposto.

Numa forma de realização preferencial, a câmara (3) incide diretamente sobre a placa de análise (8) .

Numa outra forma de realização preferencial, a placa de análise (8) é vedada e transparente, é uma peça inteira e compreende contentores circulares (9) separados, que são constituídos por um de material vedante e impermeável e que possuem orifícios (10) .

Ainda numa outra forma de realização preferencial, a placa de análise (8) é vedada e transparente, possuindo uma tampa (11) amovível, que é encaixada na base com os contentores através de um mecanismo de rosca que junta e fixa as duas peças (tampa e base com contentores) e veda a saída de líquido .

Numa forma de realização preferencial, a placa de análise (8) utilizada possui 6 contentores (9) .

Numa outra forma de realização preferencial, a placa de análise é também de centrifugação (12), possuindo contentores circulares e profundos (13) .

Ainda numa forma de realização preferencial, o número de LEDs (4) variar entre 4 a 6. Numa forma de realização preferencial, a fonte de alimentação do dispositivo descrito anteriormente é uma bateria .

Numa forma de realização preferencial, o método de deteção de aglutinação imunológica de amostras sanguíneas, utilizando o dispositivo descrito anteriormente compreende os seguintes passos:

a) Coloca-se cada um dos reagentes nos respetivos contentores da placa de análise e, de seguida, o sangue do paciente que se quer analisar, ambos nas respetivas proporções ;

b) De seguida, coloca-se a placa de análise (8) no dispositivo, fixando-a na plataforma rotativa (6);

c) Fecha-se o dispositivo, unindo a parte superior do dispositivo (1) com a parte inferior (5) e liga-se o dispositivo ;

d) O dispositivo ativa a câmara (3), os LEDS (4) e o motor (7), segundo as seguintes etapas:

i. O motor (7) movimenta rotativamente a plataforma (6) por um período entre 60 a 130 segundos, período no qual decorre a reação;

ii. O motor (7) pára e os LEDs (4) são ligados;

iii. Passados 2 minutos, a câmara (3) capta a imagem; e) Os LEDs (4) são desligados;

f) A imagem da câmara é enviada para dispositivo móvel, que por sua vez armazena essa imagem;

g) A imagem é tratada através de técnicas de processamento de imagem;

h) O algoritmo de classificação classifica a ocorrência ou não ocorrência de aglutinação conforme o valor de desvio padrão obtido em cada um dos contentores de teste. Numa outra forma de realização preferencial, a proporção entre sangue e reagentes consistir em uma gota de sangue total com um quarto das dimensões da gota de reagente.

Ainda numa outra forma de realização preferencial, as técnicas de processamento de imagem utilizadas compreendem as seguintes etapas:

a) Extração dos planos de cor verde da imagem captada, transformando a imagem original de 32 bits numa imagem de 8 bits para que possa ser utilizada;

b) Separação das misturas de sangue e reagente em duas regiões, designadas de região partícula e região fundo, através da atribuição do valor 1 (um) a todos os pixéis que pertencem a um intervalo de valores estabelecido e atribuindo o valor 0 (zero) a todos os outros pixéis na imagem que não pertencem a esse intervalo estabelecido;

c) Cálculo do valor de limite para cada pixel com base em estatísticas do pixel adjacente, utilizando uma matriz (kernel) por defeito, de 32 de largura e 32 de altura, com um fator de desvio que por defeito é 0.20;

d) Na imagem, atribuição do valor 1 (um) de pixel aos buracos existentes nas partículas correspondentes às misturas de sangue e reagente;

e) Em seguida eliminação as partículas com o valor de 1 (um) pixel para retirar o ruído de fundo da imagem e garantir que no final só restam as partículas referentes aos contentores de testes;

f) Remoção das partículas que estão nas fronteiras da imagem, preenchendo a posição com o mesmo valor do pixel adjacente, de forma a garantir que apenas restam para analisar as partículas referentes aos contentores de testes ; g) Cálculo das métricas acerca da imagem CenterofMassX e CenterofMassY, que juntas dão as coordenadas do centro de massa de cada uma das partículas na imagem;

h) Extração dos planos de luz da imagem original e transformação da imagem numa imagem de 8 bits, que passa a poder ser utilizada por outras funções;

i) Referenciação do objeto na imagem que constitui uma marca identificadora da ordem pela qual o teste foi realizado, guardando um perfil desse objeto e procurando por esse objeto em cada uma das imagens que o programa analisar, apresentando as suas coordenadas e calculando as distâncias aos outros objetos;

j) Identificação em cada imagem seis contentores e apresentação das coordenadas de cada um deles de modo a calcular as distâncias anteriormente referidas;

k) Quantificação de uma determinada região da imagem definida pelo programador, utilizando cada uma das coordenadas dos contentores dada na função anterior para quantificar um conjunto de métricas como média dos pixéis, valor mínimo, valor máximo, desvio padrão e área analisada pois o valor do desvio padrão é que determina se ocorreu ou não aglutinação em cada um dos contentores de teste.

Numa forma de realização preferencial, se o desvio padrão for superior a 16, o algoritmo de classificação classifica como aglutinado.

Numa outra forma de realização preferencial, se o desvio padrão for inferior a 16, o algoritmo de classificação classifica como não aglutinado.

Ainda numa outra forma de realização preferencial, os resultados são enviados por SMS ou e-mail. Numa forma de realização preferencial, a deteção do tipo de sangue através de determinação ABO e Rh; febre da carraça, Sífilis; Mononucleose; infeções hospitalares; bactérias Estreptococos; Meningite e Pneumonia.

Descrição geral

A presente invenção consiste num novo dispositivo e respetivo método de utilização, que permite a identificação de alguns antigénios e anticorpos presentes no sangue.

Como é do conhecimento de qualquer especialista na área de transfusão de sangue, antes de administrar uma transfusão sanguínea é essencial realizar alguns testes pré- transfusionais, como por exemplo a determinação ABO e D (Rh) ; realização da prova reversa ABO; fenótipo Rh (C, c, E e e) e Kell (K) ; fenótipo completo (Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran, Kidd e Xg) ; pesquisa de anticorpos; identificação de anticorpos (se a pesquisa de anticorpos der positiva) e prova cruzada. Estes testes são fundamentais para que não ocorra qualquer tipo de problema derivado da transfusão.

Com o objetivo de desenvolver um sistema que permita obter os resultados dos testes indicados anteriormente de uma forma rápida, assim como de obter resultados relativos aos testes à febre tifóide; brucela; febre da carraça; sífilis; mononucleose; infeções hospitalares; bactéria streptococcus ; meningite e pneumonia, desenvolveu-se um novo dispositivo que utiliza a metodologia da lâmina. Estas doenças poderão ser detetadas neste novo dispositivo e metodologia, recorrendo também aos testes já existentes para cada doença, nomeadamente: teste Widal; teste Wright; teste Weil-Felix (febre da carraça) ; VDRL (Sífilis); Mononucleose; Slidex MRSA e MSSA (infeções hospitalares); Slidex Stepto Plus (bactéria streptococcus ); Slidex Meningite-Kit5 (Meningite) e Slidex pneumo-Kit (Pneumonia) .

Comparativamente com documentos e sistemas já existentes, esta metodologia permitirá diminuir os tempos de obtenção de resultados para a realização de cada um destes testes, permitindo a sua adequação a situações de emergência em que o tempo é um fator de primordial importância; possibilitará também a diminuição física do sistema final a desenvolver.

Permite também a realização de testes rápidos de algumas doenças que os atuais sistemas não compreendem. Para além disso, o facto de a aplicação estar desenvolvida para diferentes sistemas operativos permitirá a sua utilização por uma maior gama de dispositivos o que irá permitir a adequação desta metodologia a qualquer parte do mundo, quer seja esta uma região subdesenvolvida ou desenvolvida. Dessa forma, pretende-se em poucos minutos ter um perfil completo do tipo de sangue do indivíduo e compatibilidades sanguíneas, bem como o estudo de algumas doenças que podem ser úteis dependendo do cenário clínico em que se encontre.

O sistema desenvolvido é de reduzidas dimensões para que seja portátil e de baixo custo. Assim, este sistema foi desenvolvido em duas vertentes, uma com a incorporação de um computador portátil, como um tablet ou mini-pc e outra com a possibilidade de funcionamento apenas com um telefone portátil ( smartphone ) , que com uma aplicação desenvolvida realizará toda a análise do teste realizado e obtenção dos resultados. Esta aplicação poderá ser utilizada com o sistema, que realizará todos os testes automaticamente, ou também poderá ser utilizada sem o sistema, em que por exemplo, em países subdesenvolvidos poderiam adquirir a aplicação e mesmo que realizassem o teste manualmente, teriam sempre um resultado não subjetivo, não sujeito ao erro de interpretação humana.

Dispositivo

O dispositivo da presente invenção consiste num dispositivo portátil composto por duas partes, a superior (1), fechada por uma tampa (2) , e a parte inferior (5) . A parte superior (1) compreende uma câmara digital (3) que se encontra fixa no centro da parte superior, incidindo diretamente sobre a região da amostra a analisar, rodeada de iluminação, podendo ter entre 4 a 6 LEDS (4) para uma boa visualização da imagem e consequentemente da ocorrência ou não de aglutinação. Os LEDS irão iluminar a placa de análise (8) que se encontra na parte inferior do dispositivo (5), mais especificamente na plataforma rotativa (6) . A parte inferior do dispositivo (5) compreende um motor (7), que está ligado à plataforma rotativa (6), onde se encaixa, de forma segura, a respetiva placa que possui a amostra a analisar ( 8 ) .

Na plataforma rotativa (6) encaixa, de forma segura, a placa de análise (8) fechada e com seis contentores separados, constituídos por material vedante e impermeável e que possuem um orifício (10) .

A câmara está ligada a um computador portátil ou a outro dispositivo móvel, como um telefone (smartphone) ou tablet através de USB, Wireless ou Bluetooth, que analisa as imagens captadas através de técnicas de processamento de imagem.

A incorporação de uma câmara ligada à internet com USB, Wireless ou Bluetooth permite o envio da imagem captada para os equipamentos mencionados no parágrafo anterior. Através de uma aplicação desenvolvida para diferentes sistemas operativos, a imagem vai poder ser utilizada em qualquer um desses equipamentos.

Métodos de análise

O método de deteção de aglutinação imunológica de amostras sanguíneas utiliza o dispositivo acima descrito e compreende os seguintes passos: a) Coloca-se cada um dos reagentes nos respetivos contentores da placa de análise (8) e, de seguida, o sangue do paciente que se quer analisar, ambos nas respetivas proporções, isto é 50 i de cada um dos reagentes e 1 gota pequena de sangue total, com ¼ das dimensões da gota de reagente; b) De seguida, coloca-se a placa de análise (8) no dispositivo, fixando-a na plataforma rotativa (6), para que não haja a possibilidade de se deslocar durante o processo dado as velocidades do motor (7) serem elevadas . c) Fecha-se o dispositivo, unindo a parte superior do dispositivo (1) com a parte inferior (5) e liga-se o dispositivo ; d) O dispositivo ativa a câmara (3), os LEDS (4) e o motor (7), segundo as seguintes etapas: i. O motor (7) movimenta rotativamente a plataforma

(6) por um período entre 60 a 130 segundos, período no qual decorre a reação; ii. O motor (7) pára e os LEDs (4) são ligados; iii. A câmara (3) capta a imagem somente após 2 minutos, para que não sejam ocultadas reações mais fracas; e) Os LEDs (4) são desligados; f) A imagem da câmara é enviada para dispositivo móvel, que por sua vez armazena essa imagem; g) A imagem é tratada através de técnicas de processamento de imagem; h) O algoritmo de classificação classifica a ocorrência ou não ocorrência de aglutinação conforme o valor de desvio padrão obtido em cada um dos contentores de teste .

Técnicas de processamento de imagem

As técnicas de processamento de imagem utilizadas no método de análise de sangue através do dispositivo acima descrito compreendem as seguintes etapas: a) Extraem-se os planos de cor verde da imagem captada, transformando a imagem original de 32 bits numa imagem de 8 bits para que possa ser utilizada; b) Separaram-se as misturas de sangue e reagente em duas regiões, designadas de região partícula e região fundo, através da atribuição do valor 1 (um) a todos os pixéis que pertencem a um intervalo de valores estabelecido e atribuindo o valor 0 (zero) a todos os outros pixéis na imagem que não pertencem a esse intervalo estabelecido c) Calcula-se o valor de limite para cada pixel com base em estatísticas do pixel adjacente, utilizando uma matriz (kernel) por defeito, de 32 de largura e 32 de altura, com um fator de desvio que por defeito é 0.20; d) Na imagem, atribui-se o valor 1 (um) aos buracos existentes nas partículas correspondentes às misturas de sangue e reagente; e) Em seguida eliminam-se as partículas com o valor de 1 (um) para retirar o ruído de fundo da imagem e garantir que no final só restam as partículas referentes aos contentores de testes; f) Removem-se as partículas que estão nas fronteiras da imagem, preenchendo a posição com o mesmo valor do pixel adjacente, de forma a garantir que apenas restam para analisar as partículas referentes aos contentores de testes; g) Calculam-se as métricas acerca da imagem CenterofMassX e CenterofMassY, que juntas dão as coordenadas do centro de massa de cada uma das partículas na imagem; h) Extraem-se os planos de luz da imagem original e transforma-se a imagem numa imagem de 8 bits, que passa a poder ser utilizada por outras funções; i) Referencia-se o objeto na imagem que constitui uma marca identificadora da ordem pela qual o teste foi realizado, guardando um perfil desse objeto e procurando por esse objeto em cada uma das imagens que o programa analisar, apresentando as suas coordenadas e calculando as distâncias aos outros objetos; j) Identificam-se em cada imagem seis contentores e apresentam-se as coordenadas de cada um deles de modo a calcular as distâncias anteriormente referidas; k) Quantifica-se uma determinada região da imagem definida pelo programador, utilizando cada uma das coordenadas dos contentores dada na função anterior para quantificar um conjunto de métricas como média dos pixéis, valor mínimo, valor máximo, desvio padrão e área analisada pois o valor do desvio padrão é que determina se ocorreu ou não aglutinação em cada um dos contentores de teste;

Algoritmo de classificação e resultados

Se o desvio padrão calculado pelo for inferior a 16, o algoritmo de classificação classifica como não aglutinado. Por outro lado, se o desvio padrão calculado pelo for superior a 16, o algoritmo de classificação classifica como aglutinado .

Vantagens do sistema

As grandes vantagens deste sistema baseiam-se nos seguintes aspetos : utiliza o teste em lâmina que é um teste rápido em obtenção de resultados e que se adequa perfeitamente a situações de emergência; a mistura é realizada de forma totalmente automática, não havendo intervenção do utilizador, nem erros humanos associados; atendendo à construção da placa de análise e dos contentores, não existem contaminações entre amostras; todo o processo de leitura e interpretação de resultados também é automático e otimizado, o que mais uma vez reduz os erros humanos associados ao procedimento de teste.

Assim, todo o procedimento demora aproximadamente 3 minutos e os resultados são fiáveis e precisos, não existindo erros humanos associados. Além disso, devido à sua construção, o dispositivo apresenta reduzidas dimensões, adequando-se perfeitamente a situações de emergência.

Breve descrição das figuras

Para uma mais fácil compreensão da invenção juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem limitar o objeto do presente pedido.

A figura 1 ilustra uma representação do dispositivo em que (5) corresponde à peça inferior, (1) à peça superior; (3) a câmara; (4) aos LEDS; (8) à placa de análise; (6) à plataforma rotativa; (7) ao motor e (2) à tampa.

A figura 2 ilustra uma representação de placa de análise (8) .

A figura 3 ilustra Representação da placa de análise (8) e a respetiva tampa (11) .

A figura 4 ilustra uma representação da placa de centrifugação (12), com os respetivos contentores (13) . A figura 5 ilustra uma representação da placa de centrifugação com tampa (11) .

Descrição de formas de realização

Dispositivo

O dispositivo da presente invenção consiste num dispositivo portátil composto por duas partes, a superior (1) e a inferior (5) . A parte superior (1) compreende uma câmara digital (3) que se encontra fixa no centro da parte superior, incidindo diretamente sobre a região da amostra a analisar, rodeada de iluminação, podendo ter entre 4 a 6 LEDS (4) para uma boa visualização da imagem e consequentemente da ocorrência ou não de aglutinação. Os LEDS irão iluminar a placa de análise (8) que se encontra na parte inferior do dispositivo (5), mais especificamente na plataforma rotativa (6) . A parte inferior do dispositivo (5) compreende um motor (7), que está ligado à plataforma rotativa (6), onde se encaixa, de forma segura, a respetiva placa que possui a amostra a analisar (8) . A placa poderá ser de testes (8) ou de centrifugação (12), isto é os contentores são mais profundos.

A câmara está ligada a um computador portátil ou a outro dispositivo móvel, como um telefone (smartphone) ou tablet através de USB, Wireless ou Bluetooth, que analisa as imagens captadas através de técnicas de processamento de imagem.

A incorporação de uma câmara ligada à internet com USB, Wireless ou Bluetooth permite o envio da imagem captada para os equipamentos mencionados no parágrafo anterior. Através de uma aplicação desenvolvida para diferentes sistemas operativos, a imagem vai poder ser utilizada em qualquer um desses equipamentos.

O dispositivo é fechado, devido à existência de uma tampa (2), não havendo entrada de luz ambiente, o que previne a existência nem interferências de artefactos na imagem, que poderiam comprometer toda a análise efetuada, fornecendo um resultado errado do tipo de sangue.

O facto de a câmara incidir diretamente sobre as amostras possibilita a captação de uma imagem completa e consequentemente, de uma análise completa de todas as reações .

A plataforma rotativa (6) encaixa, de forma segura, a respetiva placa de análise (8) fechada e com seis contentores separados, que possuem orifícios constituídos por um de material vedante e impermeável (10) . A parte superior (1) e a parte inferior (5) do dispositivo poderão estar ligadas por uma dobradiça de um dos lados e por um fecho no lado oposto.

0 motor pode atingir velocidades entre os 0 e as 13446 rpm.

A mistura e ativação do motor é realizada através de um botão e existe um potenciómetro, para regular a velocidade do motor, conforme se trate de uma análise ou de centrifugação e um temporizador, para controlar o tempo de execução de cada um dos testes.

A plataforma rotativa é a peça base do sistema que auxilia na promoção da mistura dos componentes que se encontram na placa, uma vez que está diretamente ligada ao motor. Esta peça base tem um sistema de encaixe simples para permitir a entrada e saída das placas de teste e centrifugação.

A câmara e os LEDs estão devidamente protegidos por um encaixe que permite o fácil acesso a ambos para posteriores reparações e substituições de LEDs, se necessário.

É importante salientar que tanto o sistema como a câmara requerem alimentação, o que facilmente se resolve com uma bateria .

As placas têm duas possibilidades de introdução dos líquidos : uma em que a placa é inteira com tampa fixa e possui em cada um dos contentores um pequeno orifício vedado por um material impermeável permitindo apenas a passagem de uma seringa para a introdução do sangue e reagente, não permitindo a saída de sangue mesmo durante o processo de mistura onde as velocidades são elevadas; outra em que a placa é desmontável e possui uma tampa que sai e permite a introdução do sangue e reagente, podendo ser novamente encaixada, através de uma rosca em que girando a tampa na peça fixa as peças, de forma a não existir fugas de sangue e reagente, nem misturas entre os contentores.

Nesta última placa o mecanismo de vedação consiste numa rosca que permite juntar ambas as peças (tampa e base com contentores) vedando completamente a saída de líquido.

Ambas as placas estão devidamente vedadas de forma a não haver contaminações nem mistura entre contentores de sangue e reagentes e são transparentes para que a imagem seja facilmente captada.

Os contentores são separados e estanques (isolados), o que possibilita que não existam contaminações entre amostras - no dispositivo reivindicado, apenas se introduzirá o sangue pelos pequenos orifícios que cada contentor possui, não sendo necessário abrir a placa de análise;

Dada a velocidade que o motor consegue atingir, caso seja necessário centrifugar o sangue, o mesmo pode ser realizado no dispositivo, de forma a se obter o plasma separado dos seus componentes e utilizá-lo para a realização de alguns testes. Para isso, utiliza-se uma placa de centrifugação

(12) , na qual os contentores terão de ser mais profundos

(13) dado que deverá conter uma quantidade de sangue (liquido total) superior à placa que é utilizada nos testes .

As paredes dos contentores são circulares, pelo que, no caso do sangue e reagentes se depositarem, estes terão sempre a tendência a escorrer/descer para o fundo do contentor e depositar-se/acumular-se nesse local. Assim, o liquido ficará sempre depositado na base do contentor e uma boa área com a reação para analisar.

A base dos contentores poderá não ser completamente redonda. A base do contentor é lisa ou plana para facilitar a visualização das reações entre o sangue e o reagente. Deste modo, apesar de neste momento a placa estar no formato em que se apresenta, com alguma concavidade, tendo a base do contentor lisa é possível utilizar a mesma placa totalmente reta.

De acordo com a metodologia do teste em lâmina, deverá ser introduzida uma gota de sangue com 1/4 das dimensões da gota de reagente, ou plasma, dependendo do teste em causa.

Método de análise

O método de análise da amostra sanguínea compreende os seguintes passos: a) Coloca-se cada um dos reagentes nos respetivos contentores (9) da placa de análise (8) e, de seguida, o sangue que se quer analisar, ambos nas respetivas proporções ; b) De seguida, coloca-se a placa de análise (8) no dispositivo, fixando-a na plataforma rotativa (6), para que não haja a possibilidade de se deslocar durante o processo dado as velocidades do motor (7) serem elevadas . c) Fecha-se o dispositivo, unindo a parte superior do dispositivo (1) com a parte inferior (5) e liga-se o dispositivo, regulando a velocidade de acordo com a recomendada para o teste; d) O dispositivo ativa a câmara (3), os LEDS (4) e o motor (7), segundo as seguintes etapas: i. O motor (7) movimenta rotativamente a plataforma

(6) por um período entre 60 a 130 segundos, período no qual decorre a reação; ii. O motor (7) pára e os LEDs (4) são ligados; iii. A câmara (3) capta a imagem somente após 2 minutos, para que não sejam ocultadas reações mais fracas; e) Os LEDs (4) são desligados; f) A imagem da câmara é enviada para dispositivo móvel, que por sua vez armazena essa imagem; g) A imagem é tratada através de técnicas de processamento de imagem; h) O algoritmo de classificação classifica a ocorrência ou não ocorrência de aglutinação conforme o valor de desvio padrão obtido em cada um dos contentores de teste .

No caso da realização de uma centrifugação, procede-se da seguinte forma:

Numa placa de centrifugação coloca-se a quantidade de sangue recomendada em cada um dos contentores necessários ;

Abre-se o sistema e coloca-se o placa de centrifugação (12) no mesmo, bem encaixada para que não sai do seu lugar;

Seguidamente fecha-se o sistema, regula-se a velocidade de acordo com a recomendada para o teste e carrega-se no botão para ligar o sistema e promover a agitação;

Terminada a centrifugação abre-se o sistema para remover a placa de centrifugação e extrair o plasma;

Por fim deita-se a placa de centrifugação fora em local apropriado .

No caso do teste para grupo ABO e RhD são utilizados 4 contentores e para o fenótipo RhD são utilizados 6 contentores .

Técnicas de processamento de imagem

As técnicas de processamento de imagem para detetar a ocorrência de aglutinação e, consequentemente, determinar o resultado do teste em análise compreendem as seguintes etapas : a) Extraem-se os planos de cor verde da imagem captada, transformando a imagem original de 32 bits numa imagem de 8 bits para que possa ser utilizada; b) Separaram-se as misturas de sangue e reagente em duas regiões, designadas de região partícula e região fundo, através da atribuição do valor 1 (um) a todos os pixéis que pertencem a um intervalo de valores estabelecido e atribuindo o valor 0 (zero) a todos os outros pixéis na imagem que não pertencem a esse intervalo estabelecido; c) Calcula-se o valor de limite para cada pixel com base em estatísticas do pixel adjacente, utilizando uma matriz (kernel) por defeito, de 32 de largura e 32 de altura, com um fator de desvio que por defeito é 0.20; d) Na imagem, atribui-se o valor 1 (um) aos buracos existentes nas partículas correspondentes às misturas de sangue e reagente; e) Em seguida eliminam-se as partículas com o valor de 1 (um) para retirar o ruído de fundo da imagem e garantir que no final só restam as partículas referentes aos contentores de testes; f) Removem-se as partículas que estão nas fronteiras da imagem, preenchendo a posição com o mesmo valor do pixel adjacente, de forma a garantir que apenas restam para analisar as partículas referentes aos contentores de testes; Calculam-se as métricas acerca da imagem CenterofMassX e CenterofMassY, que juntas dão as coordenadas do centro de massa de cada uma das partículas na imagem;

Extraem-se os planos de luz da imagem original transforma-se a imagem numa imagem de 8 bits, que pas a poder ser utilizada por outras funções;

Referencia-se o objeto na imagem que constitui uma marca identificadora da ordem pela qual o teste foi realizado, guardando um perfil desse objeto e procurando por esse objeto em cada uma das imagens que o programa analisar, apresentando as suas coordenadas e calculando as distâncias aos outros objetos;

Identificam-se em cada imagem seis contentores apresentam-se as coordenadas de cada um deles de modo calcular as distâncias anteriormente referidas;

Quantifica-se uma determinada região da imagem definida pelo programador, utilizando cada uma das coordenadas dos contentores dada na função anterior para quantificar um conjunto de métricas como média dos pixéis, valor mínimo, valor máximo, desvio padrão e área analisada pois o valor do desvio padrão é que determina se ocorreu ou não aglutinação em cada um dos contentores de teste.

As técnicas de processamento de imagem estão desenvolvidas com o software Labview e também com a linguagem de programação C# e C, para que possam ser utilizadas por diferentes dispositivos móveis. A possibilidade de ter a aplicação num dispositivo móvel possibilita que esta seja utilizada em qualquer parte do mundo. O software desenvolvido, tal como referido, utiliza técnicas de processamento de imagem para detetar a aglutinação e algoritmos de classificação para determinar os resultados dos testes realizados.

A aplicação tem como principais funções:

Image Buffer: Store a copy - que permite guardar a imagem original captada pela câmara, de forma a mantê- la intacta para se poder usá-la mais tarde;

Color Plane Extraction: RGB Green Plane - extrai os planos de cor verde da imagem captada, permitindo transformar a imagem original de 32 bits numa imagem de 8 bits para que possa ser utilizada por funções seguintes necessárias ao processamento;

Auto Threshold Clustering - esta função aplica um limite (limiar, do inglês threshold) com base em técnicas estatísticas denominadas de clustering e é usada para separar as misturas de sangue e reagente em duas regiões, designadas de "região partícula" e "região fundo". Este processo consiste em mudar todos os pixéis que pertencem a um determinado intervalo de valores estabelecido (designado intervalo de threshold) alterando todos os outros pixéis na imagem para zero (0) . É importante referir que a função é automática e que o utilizador não terá de especificar os valores do intervalo. Para definir o threshold, a função usa automaticamente os valores do histograma; Local Threshold: Niblack - nesta função o valor de limite pra cada pixel é calculada com base em estatísticas do pixel adjacente. É utilizado uma matriz (kernel) por defeito, de 32 de largura e 32 de altura, com um fator de desvio que por defeito é 0.20. Esta função é extremamente importante para isolar as partículas que serão analisadas. No final da aplicação desta função têm-se então as partículas correspondentes às misturas de sangue e reagente isoladas do resto da imagem;

Adv. Morphology: Fill holes - que permite preencher totalmente os buracos existentes nas partículas;

Adv. Morphology: Remove small objects - que tal como o nome indica remove as partículas de pequenas dimensões, retirando o lixo de fundo que está a estragar a imagem e garantindo que no final só restem as partículas referentes aos contentores de testes;

Adv. Morphology: Remove border objects - remove as partículas que estão nas fronteiras da imagem, mais uma vez de forma a garantir que apenas restam para analisar as partículas referentes aos contentores de testes;

Particle Analysis - esta função é de extrema utilidade já que permite obter uma série de métricas acerca da imagem, como CenterofMassX e CenterofMassY, que juntas dão as coordenadas do centro de massa de cada uma das partículas na imagem; o centro de Massa X é uma coordenada que juntamente com o centro de Massa Y dão uma posição na partícula (mistura sangue/reagente) que corresponde ao centro de massa dessa partícula - é feita uma média da massa dos pixéis da partícula e obtém-se o valor, de acordo com as seguintes fórmulas: r , * _v ^m i i ^{+ πι} 2 ^χ 2 + m ₃ x ₃ + - + m _n x _n

CenterofmassX =

mi + ^m 2 + ^m 3 +— l ^{~ m} n r , * _v ™ ₁ y ₁ + m ₂ y ₂ + m ₃ y ₃ + - + m _n y _n

CenterofmassY =

mi + ^m 2 + ^m 3 +— I ^{" m} n

Image Buffer: Retrieve Copy - para retornar a imagem original guardada na primeira função apresentada de forma que seja utilizada pelas funções seguintes;

Color Plane Extraction: HSL Luminance Plane - extrai os planos de luz da imagem original e permite mais uma vez transformar a imagem numa imagem de 8 bits que passa a poder ser utilizada por outras funções;

Pattern Matching - esta função é fulcral para a determinação do resultado do teste. Basicamente consiste em referenciar um objeto na imagem que na verdade constitui uma marca identificadora da ordem pela qual o teste foi realizado. A função guarda um perfil desse objeto e vai tentar procurar por esse objeto em cada uma das imagens que o programa analisar. Assim que encontra o objeto referência devolve as suas coordenadas e permite que a partir delas se calculem distâncias aos outros objetos (neste caso a cada uma das partículas correspondentes aos contentores de teste) . Sabendo as distâncias ordena-se as mesmas e tem-se a ordem correta de análise do teste e o resultado do teste realizado, que será dado de seguida pelo algoritmo de classificação; Geometric Matching - esta função associada à anterior ajudam na determinação do resultado do teste. Neste caso, dado o perfil de cada um dos contentores de teste, a função vai identificar em cada imagem seis contentores e vai devolver as coordenadas de cada um deles. Através das coordenadas de cada um deles, são calculadas as distâncias anteriormente referidas (do objeto referência a cada um dos contentores) . Assim sabe-se a ordem correta de análise do teste;

Quantify - quantifica uma determinada região da imagem definida pelo programador, utilizando cada uma das coordenadas dos contentores dada na função anterior. A quantificação permite obter um conjunto de métricas como média dos pixeis, valor mínimo, valor máximo, desvio padrão e área analisada. Neste caso, o valor do desvio padrão é a métrica importante para o trabalho dado ser com base neste valor que se determina se ocorreu ou não aglutinação em cada um dos contentores de teste.

Classification Algorithm - o algoritmo de classificação classifica a ocorrência ou não de aglutinação conforme o valor de desvio padrão obtido em cada um dos contentores de teste. Se o desvio padrão for superior a 16, classifica como aglutinado, se o desvio padrão for inferior a 16 classifica como não aglutinado. Para além disso, conforme a conjugação de resultados entre aglutinação e não aglutinação permite, para cada um dos testes realizados, identificar o resultado do teste, quer seja um grupo se sangue, um anticorpo, uma compatibilidade ou uma doença. A função que remove as partículas das fronteiras elimina as partículas que toquem nas fronteiras da imagem, isto é, os limites exteriores da imagem. Ou seja, se a partícula tocar nas fronteiras da imagem, nas laterais, é eliminada. Isto é utilizado para eliminar o círculo feito pela base do sistema que é captado pela câmara e que não conta para a análise da imagem. Não são usados valores, basta que toque nas referidas fronteiras da imagem.

As técnicas de Processamento de Imagem desenvolvidas e restantes algoritmos são passíveis de serem utilizados em dispositivos móveis como tablets e telefones portáteis com sistema operativo Windows Phone, Android e iOS . Estas aplicações baseiam-se essencialmente na captação de uma imagem por parte do dispositivo móvel e no processamento dessa imagem através das técnicas de processamento de imagem desenvolvidas; ou existe a possibilidade da captação da imagem ser realizada pela câmara do sistema e ser enviada por Bluetooth/Wireless para o dispositivo móvel, sendo aí realizado o Processamento de Imagem da imagem enviada com a aplicação desenvolvida.

O software acima descrito permite ainda o envio de mensagem eletrónica e mensagens (sms) para um telemóvel com os resultados dos testes realizados, permitindo que, no caso de os testes estarem a ser realizados fora do laboratório, se possa antecipar a preparação de uma unidade de sangue compatível .

Exemplos

No exemplo seguinte, são apresentados os resultados no caso da realização do teste de grupo ABO e RhD e no caso da determinação do fenótipo RhD. No caso do teste para o grupo ABO e RhD, tendo em conta que a ocorrência de aglutinação identifica o antigénio presente, tem-se um conjunto de resultados possíveis, em que alguns são apresentados na tabela 1. Analisando a tabela 1, tem-se que para o Exemplo 1, por exemplo, Aglutinou na presença do Reagente Anti-A, Anti-AB e Anti-D, indicando a presença de antigénios A e D. Como o D indica se é Rh positivo ou Rh negativo, a ocorrência de aglutinação indica a positividade, tem-se que o resultado deste teste é então A Positivo. A mesma lógica vai ser aplicada para os restantes exemplos. Por exemplo, o Exemplo 4, tem como resultado O Positivo, porque o único reagente com a qual o sangue aglutinou foi na presença do reagente Anti-D, indicando a positividade do Rh e indicando que os restantes antigénios não estão presentes, logo trata-se de um O ou zero Positivo.

Tabela 1 - Resultados esperados com o algoritmo de

classificação para o teste de Grupo ABO e RhD

No caso do teste de fenótipo RhD, o procedimento é semelhante. A aglutinação identifica a presença do antigénio e como tal, analisando um dos exemplos, por exemplo o Exemplo 2, tendo em conta que aglutinou na presença dos reagentes Anti-D, Anti-C, Anti-c e Anti-e, não aglutinando nos restantes, o fenótipo presente é o DcCe . Tabela 2 - Resultados para o teste de fenótipos com o algoritmo de classificação