用于诊断上皮源性癌症的血液标志物及其单克 隆抗体 技术领域

本发明涉及癌症的诊断， 更具体地说， 本发明涉及细胞角蛋白片 段作为诊断上皮源性癌症的标志物的用途。 背景技术

对于癌症患者的成功治疗而言最重要的因素之 一是早期检测。 随 着基因分析及蛋白质组学的发展， 在鉴定可用于诊断及预测特定癌症 的分子标记方面已取得了显著的进步。

上皮源性癌症是指起于上皮细胞的癌症， 包括但不限于乳腺癌、 胃癌、 口腔癌、 食管癌、 结肠癌、 肝癌、 膀胱癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌、 肺癌、 乳腺癌和皮肤癌、 前列腺癌、 肾癌等。

例如， 胃癌是世界上第二大癌症死因， 是威胁人类健康最常见的 恶性肿瘤之一。 胃癌患者预后的关键是作好二级预防， 即早期发现和 早期治疗。 胃癌的早期及时准确检出和治疗， 对于降低胃癌死亡率具 有十分重要的意义。

肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤， 近年来， 随着吸烟和各种环境 因素的影响，世界各国特别是工业发达国家， 肺癌的发病率和病死率均 迅速上升。 研发具有高度特异性和敏感性的血清肿瘤标记 物对肺癌早 期的发现及治疗具有很重要的意义。

分子诊断是诊断癌症最流行的方法。 不同类型的分子如 DNA、 蛋 白质和脂肪被用作诊断工具。 肿瘤标记物 （Tumor Markers,TM ) ， 是 指在肿瘤发生和增殖过程中， 由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、 细胞、 体液中， 反映肿瘤存在和生长的一类物质。 肿瘤标记物通常是 蛋白质， 已经广泛应用于多种类型癌症的检测和诊断。 肿瘤标记物浓 度水平上升， 可能表明了一种癌症在人体内的某种形式的存 在。 肿瘤 标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、 肿瘤高危人群的筛选、 良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、 肿瘤发展程度的判断、 肿瘤治疗效果的 观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。 肿瘤标记物常用免疫法测 定， 如间接法、 双抗体夹心法、 竟争法。 检测手段有胶体金法、 酶 免疫法、 化学发光法、 电化学发光法等。 血清学检测的目的在于测定 病人血清中与癌症相关的肿瘤标记物的含量。 此方法简单易行， 适用 于大量人群的普查。 例如， 目前国际上普遍应用的与胃癌相关的肿瘤 标记物包括 CEA， TPS以及 CA72-4等。

细胞角蛋白（Cytokeratins)包括 20多种不同蛋白， 是细胞骨架的重 要成分。 尽管所有上皮源的细胞均表达一定水平的细胞 角蛋白， 但是 某些角蛋白的组分例如角蛋白 8、 18以及 19与恶性肿瘤的发生与进展 密切相关 ( M. Nap, Th. Van Wei, C. Andres, et al. Immunohistochemical Profiles of 30 Monoclonal Antibodies against Cytokeratins 8, 18 and 19[J]. Tumor Biology 2001;22:4-10 ) 。

细胞角蛋白 18 (Cytokeratin 18)是一分子量为 55kD的酸性蛋白质， 由 430个氨基酸组成， 具有高度保守的 α螺旋结构中心区域， 呈丝状结 构。 广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上 皮， 以及单层上皮 细胞如腺泡、 气管、 乳腺导管、 汗腺、 子宫内膜、 结肠和肝细胞等。 在正常上皮细胞中细胞角蛋白 18表达相对稳定， 细胞角蛋白 18及其片 段在外周血、 骨髓、 淋巴结中无表达或低表达， 几乎没有片段产生释 放入血。 相反的是， 当上皮细胞恶性转化时， 细胞角蛋白 18表达急剧 增高。 同时， 细胞角蛋白 18生长进程发生异常。 在肿瘤细胞凋亡和坏 死过程中激活的蛋白酶加速了细胞的降解， 使得大量可溶性的细胞角 蛋白 18片段被释放， 造成组织液、 体液中可溶性的细胞角蛋白 18片^ 的浓度升高， 尤其在胃癌患者血循环中含量丰富（Stig L, Aleksandra M H ,Takayuki U， et al. Determining tumor apoptosis and necrosis in patient serum using cytokeratin 18 as a biomarker[J]. Cancer Letters 214(2004): 1-9; T. Stigbrand. The Versatility of Cytokeratins as Tumor Markers[J]. Tumor Biology 2001;22: 1-3 ) 。

细胞角蛋白 19是一分子量为 40kD的酸性蛋白质， 是角蛋白家族中 最小的成员， 由 400个氨基酸组成， 具有高度保守的 α螺旋结构中心区 域， 呈丝状结构。 广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上 皮， 以及单层上皮细胞如腺泡、 气管、 乳腺导管、 汗腺、 子宫内膜、 结肠 和肝细胞等。 在正常上皮细胞中细胞角蛋白 19表达相对稳定， 细胞角 蛋白 19及其片段在外周血、 骨髓、 淋巴结中无表达或低表达， 几乎没 有片段产生释放入血循环系统。 相反的是， 当上皮细胞恶性转化时， 细胞角蛋白 19表达急剧增高。 同时， 细胞角蛋白 19生长进程发生异常。； 在肿瘤细胞凋亡和坏死过程中激活的蛋白酶加 速了细胞的降解， 使得 大量可溶性的细胞角蛋白 19片段被释放， 造成组织液、 体液中可溶性 的细胞角蛋白 19片段的浓度升高， 尤其在肺癌患者血循环中含量丰富 ( J. Niklinski, T. Burzykowski, W. Niklinska，et al. Preoperative CYFRA 21-1 level as a prognostic indicator inresected nonsmall cell lung cancer [J]. Eur Respir J 1998; 12: 1424-1428 ) 。 发明内容

本发明一方面提供了与上皮源性癌症有关的细 胞角蛋白片段， 其 中该片段包含选自由 SEQ ID NOs: 2、 3、 5和 6构成的组的抗原表位。 在 一个具体实施方式中，该片段包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸残基 200-400。 在另一个具体实施方式中， 该片段包含 SEQ ID NO: 2的氨基酸残基 325-400。

本发明另一方面提供了与所述抗原表位特异性 结合的单克隆抗 体。 在一个具体实施方式中， 该单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No. 1957、 CGMCC No. 1956、 CGMCC No. 1955或 CGMCC No. 1952的杂交 瘤产生。

本发明还提供了所述单克隆抗体的抗原结合部 分， 其中该抗原结 合部分与所述单克隆抗体竟争结合所述抗原表 位。 在一个具体实施方 式中， 该抗原结合部分为人源化抗体。 在另一个具体实施方式中， 该 抗原结合部分为嵌合抗体。

本发明一方面提供了用于对受试者中的上皮源 性癌症进行早期筛 查、 诊断或预后评估的方法， 该方法包括： 获得来自受试者的生物样 品， 检测该生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的 含量， 和将该含量 与阈值水平进行比较。 如果该含量超过阈值水平则说明该患者可能患 有癌症。

在一个优选实施方式中， 该方法还涉及与其他上皮源性肿瘤标记 物联用。 具体而言， 该方法包括： 获得来自受试者的生物样品， 检测 该生物样品中本发明的细胞角蛋白片段的含量 ， 检测该生物样品中其 他上皮源性肿瘤标记物的含量， 和将所述细胞角蛋白片段以及所述其 他上皮源性肿瘤标记物的含量与阈值水平进行 比较。 优选地， 所述其 他上皮源性肿瘤标记物选自由 AFP、 CEA、 CA242、 CA19-9、 CA72-4、 CA125、 CA15-3、 NSE、 SCCA、 Cyfra21-1、 PSA, free PSA构成的组。 本发明另一方面提供了评估用于治疗上皮源性 癌症的药物或疗法 的治疗效果的方法， 包括： 向患有上皮源性癌症的受试者施用所述药 物或疗法， 在施用所述药物或疗法之前和之后采集所述受 试者的生物 样品， 和检测所述生物样品中本发明的细胞角蛋白片 段的含量， 其中 在施用所述药物或疗法之前和之后该细胞角蛋 白片段含量明显降低 的， 表明所述药物或疗法有明显疗效。

优选地， 所述上皮源性癌症选自由胃癌、 肝癌、 肺癌、 胆嚢癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 结肠癌、 前列腺癌、 肾癌、 食道癌、 肠癌、 膀胱癌构成的组。

优选地， 所述生物样品选自由血液、 血清、 组织液、 尿液、 大便、 痰液、 脑脊液、 唾液、 眼泪和乳头吸出液构成的组。

本发明另一方面提供了一种试剂盒， 包含： 固定于固相载体上的 能够特异结合本发明的细胞角蛋白片段的包被 抗体， 以及被可检测地 标记的能够特异结合该细胞角蛋白片段的检测 抗体。 该试剂盒可以用 于实施本发明的方法， 也可用于检测本发明的细胞角蛋白片段。

本发明还提供了所述细胞角蛋白片段的特异结 合剂， 例如本发明 的单克隆抗体或者抗原结合片段， 在制备用于诊断上皮源性癌症的试 剂中的用途。 附图说明

图 1是一幅流程图， 简要描述了细胞角蛋白 18片段制备和活性分析 的步骤。

图 2是一幅电泳图， 显示了细胞角蛋白 18片段 cDNA的电泳结果。 图 3显示了 TOPO质粒的结构。 其中， Ampicillin是指氨苄青霉素，

Neomycin是指新尊素。

图 4是一幅电泳图 ， 显示了重组表达质粒 TOPO-GY10、 TOPO-GY1 K TOPO-GY12的酶切鉴定结果。 其中， marker是指标志物。

图 5是一幅电泳图， 显示了重组细胞角蛋白 18片段 GY10、 GY11、 G Y 12的 SDS-PAGE结果。

图 6显示了最佳抗体配对实验的结果。

图 7是一幅示意图， 显示了单克隆抗体 3A9、 2A6的结合表位的位 置。

图 8显示了单克隆抗体 3A9及 2A6与其他人血清肿瘤标记物的免疫 检测结果。

图 9显示了胃癌与非胃癌诊断的 ROC曲线。 其中， specificity是指特 异性， sensitivity是指灵敏度。

图 10是一幅流程图， 简要描述了细胞角蛋白 19片段制备和活性分 析的步骤。

图 11是一幅电泳图， 显示了细胞角蛋白 19片段 cDNA的电泳结果。 图 12显示了 TOPO质粒的结构。 其中， Ampicillin是指氨苄青霉素， Neomycin是指新霉素。

图 13是一幅电泳图， 显示了重组表达质粒 TOPO-GY20、 TOPO-GY21 , TOPO-GY22的酶切鉴定结果。其中， marker是指标志物。

图 14是一幅电泳图， 显示了重组细胞角蛋白 19片段 GY20、 GY2K GY22的 SDS-PAGE结果。

图 15显示了最佳抗体配对实验的结果。

图 16是一幅示意图， 显示了单克隆抗体 2G2、 5H2的结合表位的位 置。

图 17显示了单克隆抗体 2G2、 5H2与其他人血清肿瘤标记物的免疫 检测结果。

图 18显示了肺癌与非肺癌鉴别诊断 ROC曲线。 其中， specificity是 指特异性， sensitivity是指灵敏度。 相关序列的描述

SEQ ID ΝΟ:1显示了细胞角蛋白 18 (简称 K18 )的全长氨基酸序列， 长度为 430个氨基酸残基。

SEQ ID NO:2显示了单克隆抗体 3A9识别的 K18抗原表位的氨基酸 序列，长度为 51个氨基酸残基，对应于 SEQ ID NO:l的氨基酸位置 200 ~ 250。

SEQ ID NO:3显示了单克隆抗体 2A6识别的 K18抗原表位的氨基酸 序列，长度为 51个氨基酸残基，对应于 SEQ ID NO:l的氨基酸位置 350 ~ 400。

SEQ ID NO:4显示了细胞角蛋白 19 (简称 K19 )的全长氨基酸序列， 长度为 400个氨基酸残基。

SEQ ID NO:5显示了单克隆抗体 2G2识别的 K19抗原表位的氨基酸 序列，长度为 26个氨基酸残基，对应于 SEQ ID NO:4的氨基酸位置 375 - 稱。

SEQ ID NO:6显示了单克隆抗体 5H2识别的 K19抗原表位的氨基酸 序列，长度为 26个氨基酸残基，对应于 SEQ ID NO:4的氨基酸位置 325 - 350。 具体实施方式

本发明提供了细胞角蛋白 18( K18 )的两个上皮源性癌症相关表位。 两个癌相关表位均位于细胞角蛋白 18氨基酸序列的 C端， 其序列如 SEQ ID NOs: 2、 3所示。 所述表位在恶性转化期间， 特别是在胃， 结肠， 乳 腺， 卵巢， 肾脏等组织的恶性转化期间变得暴露。 所述癌相关表位的 暴露， 是通过肿瘤细胞的不断增殖、 坏死、 凋亡而将细胞角蛋白 18片 段释放于血液中而暴露的。 而正常组织和健康人员血液中没有这两个 癌相关表位的表达。 本发明提供了分别识别这两个癌相关表位的两 抹 单克隆抗体 3A9和 2A6， 并应用这两林单抗发明了诊断癌症的方法。 用 于生产 K18单抗 3A9和 2A6的杂交瘤于 2007年 3月 8日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC, 北京市海淀区中关村 北一条 13号）， 保藏编号分别为 CGMCC NO. 1957和 1956。 保藏证明中 的信息通过援引并入本文， 作为本发明原始公开内容的一部分。 序列如 SEQ ID NOs: 5、 6所示。本发明提供了分别识别这两个癌相关� � 位的两株单克隆抗体 2G2和 5H2， 并应用这两株单抗发明了诊断癌症的 方法。 用于生产 K19单抗 2G2和 5H2的杂交瘤于 2007年 3月 8日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC, 北京市海淀 区中关村北一条 13号）， 保藏编号分别为 CGMCC NO. 1955和 1952。 保 藏证明中的信息通过援引并入本文， 作为本发明原始公开内容的一部 分。

本发明一方面提供了与上皮源性癌症有关的细 胞角蛋白片段， 其 中该片段包含选自由 SEQ ID NOs: 2、 3、 5和 6构成的组的抗原表位。

本文所用的术语 "上皮源性癌症" 是指起于上皮细胞的癌症， 包 括但不限于乳腺癌、 基底细胞癌、 腺癌、 胃肠癌、 唇癌、 口腔癌、 食 管癌、 小肠癌和胃癌、 结肠癌、 肝癌、 膀胱癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 宫 颈癌、 肺癌、 乳腺癌和皮肤癌例如鳞状细胞和基底细胞癌、 前列腺癌、 腎细胞癌及其它已知通过身体影响上皮细胞的 癌症。

本文所用的术语 "片段" 是指与天然的全长蛋白相比， 缺少一个 或多个氨基酸残基的氨基酸序列。 例如， 蛋白片段可以通过从全长蛋 白中删除部分残基而获得， 例如 N段截短片段可以通过将位于蛋白 N段 的部分氨基酸残基删除而获得。

蛋白片段中也可以含有外源序列， 从而形成嵌合蛋白片段。 例如， 将蛋白 A的 N端结构域删除后， 与蛋白 B的 N端结构域连接， 可以形成蛋 白 A和蛋白 B的嵌合片段。 本领域技术人员可以理解， 该嵌合片段的长 度有可能超过蛋白 A的长度。

为了便于纯化，可以在蛋白片段中添加常用的 纯化标签， 例如 GST (谷胱甘肽巯基转移酶）、 His-tag (六聚组氨酸） 等。

本发明的细胞角蛋白片段可以含有抗原表位附 近的一段连续的氨 基酸序列。

例如， 本发明的 K18片段可以包含 SEQ ID ΝΟ:1中涵盖 SEQ ID NO:2或 3所示抗原表位的至少 60、 70、 80、 90、 100、 120、 150、 180、 200、 210、 220、 250、 280、 300、 320、 350、 380、 400或 420个连续的 氨基酸残基。例如，在本发明一个实施方式中 ， K 18片段包含 SEQ ID NO： 1的氨基酸残基 1-250， 涵盖单抗 3A9识别的抗原表位； 在另一个实施方 式中， K18片段包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸残基 250-430， 涵盖单抗 2A6 识别的抗原表位； 在又一个实施方式中， K18片段包含 SEQ ID NO: 1的 氨基酸残基 150-430， 同时涵盖两个抗原表位。 可以将包含 K18的一个 或两个抗原表位的片段与 K19的抗原表位融合在一起， 形成嵌合片段。

本发明的 K19片段可以包含 SEQ ID NO:4中涵盖 SEQ ID NO:5或 6 所示抗原表位的至少 30、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 150、 180、 200、 210、 220、 250、 280、 300、 320、 350或 380个连续的氨基酸残基。 例如， 在本发明一个实施方式中， K19片段包含 SEQ ID NO: 4的氨基酸 残基 1-375， 涵盖单抗 5H2识别的抗原表位； 在另一个实施方式中， K19 片段包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸残基 150-400, 同时涵盖单抗 2G2和 5H2 识别的抗原表位。 通过本领域公知的分子克隆实验技术可以容易 地制备包含特定氨 基酸残基的蛋白片段。

本文所用的 "生物样品"是指从患者 (优选病人)获得的生物材料样 品， 包括組织样品、 细胞样品 (例如组织活检样品， 例如吸出活检样品、 刷拭活检样品、 表面活检样品、 针吸活检样品、 钻取活检样品、 切除 活检样品、 开胸腹活检样品、 切开式活检样品或内窥镜活检样品)和肿 瘤样品。 生物样品也可为生物流体样品。 在一个优选实施方案中， 生 物样品为血清。 然而， 也可使用血液、 尿液、 唾液、 脑脊液、 乳头吸 出液和细胞裂解物上清液等。

如本文所述， 可通过本领域技术人员所知的任何手段来测量 本发 明细胞角蛋白片段的水平。 在本发明中， 一般优选使用抗体或抗体的 抗原结合部分来检测生物样品中的细胞角蛋白 片段的水平。 然而， 其 它方法也可使用， 例如通过分析 mRNA转录物来测量细胞角蛋白片段 的表达。

mRNA 水平的评价方法为本领域技术人员所熟知。 举例而言， 通 过 RNA印迹法可完成 RNA转录物的检测，其中 RNA制备物在变性琼 脂糖凝胶上进行， 并转移至合适支持物上， 例如活性纤维素膜、 硝酸 纤维素膜或玻璃膜或尼龙膜。然后使标记 (例如放射性标记)的 cDNA或 RNA与该制备物杂交， 洗涤， 并通过例如放射自显影等方法来分析。 或者， 可在 DNA阵列、 芯片或微阵列上检测 mRNA表达。 举例而言， 为监测 mRNA水平， 从待测生物样品中提取 mRNA, 逆转录， 产生荧 光-标记的 cDNA探针。 然后用标记的 cDNA探针探测能够与细胞角蛋 白片段 cDNA杂交的微阵列， 扫描载玻片， 测量荧光强度。 该强度和 杂交强度与表达水平相关。

也可测量细胞角蛋白片段水平， 尤其是当该生物样品为流体样品 例如血液或尿液时。 在一个实施方案中， 通过让生物样品与特异性结 合细胞角蛋白片段的单克隆抗体接触， 来测量细胞角蛋白片段水平。

术语 "抗体的抗原结合部分" 包括与细胞角蛋白的抗原表位特异 性结合 (起免疫反应）的免疫球蛋白分子和免疫球蛋� �分子的免疫学活 性决定簇， 例如含有抗原结合位点的分子。 术语 "抗体的抗原结合部 分" 意指包括全抗体， 例如任何同种型（IgG、 IgA、 IgM IgE 等等）， 也包括抗体片段。 可使用常规技术使抗体片段化。 因此， 该术语包括 能够选择性地与某一蛋白反应的抗体分子的蛋 白水解片段或重组制备 的部分。此等蛋白水解和 /或重组片段的非限制性实例包括 Fab、F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs及含有由多肽接头连接的 VL区和 VH区的单链抗体 (scFv)。 所述 scFv可共价或非共价连接形成含两个以上结合� �点的抗 体。 因此， "抗体的抗原结合部分" 包括多克隆抗体、 单克隆抗体或 抗体的其它纯化制备物和重组抗体。 术语 "抗体的抗原结合部分" 还 指包括人源化抗体、 双特异性抗体及含至少一个源自抗体分子的抗 原 结合决定簇的嵌合分子。 术语 "人源化抗体" 指源自非人抗体 （例如 鼠） 的保持或基本上保持亲本抗体抗原结合特性， 但在人中具有较低 免疫原性的抗体。 人源化抗体的优点是减少或消除了抗体在宿主 中的 免疫原性， 从而增加生物利用度和减少可能的不利免疫反 应。 可使用 CDR移植的方法制备人源化抗体。

本文所用的 "标记抗体" 包括以可检测的方式标记的抗体， 包括 但不限于酶标记抗体、 放射性标记抗体、 荧光标记抗体和化学发光标 记抗体。 也可用可检测标签例如 HA、 HSV、 FLAG或 HIS标记抗体。 细胞角蛋白片段的水平 Γ生物样品中存在 细胞角蛋白、片段^平与可 检测的标记抗体发射的信号强度相关。

在一个优选实施方案中， 可通过将抗体与酶连接， 来可检测地标 记抗体或抗体的抗原结合部分。 当该酶与其底物接触时， 将与该底物 反应， 其反应方式能产生可检测化学部分， 举例而言， 通过分光光度 法、 荧光测定法或通过视觉手段来检测。 可用于可检测地标记本发明 抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 天冬酰胺酶、 葡萄糖氧化酶、 尿素酶、 过氧化氢酶、 葡萄糖淀粉酶和 乙酰胆碱酯酶。 化学发光是另一种可用于检测基于抗体或其抗 原结合 部分的方法。

使用多种其它免疫测定中的任一种也可完成检 测。 举例而言， 通 过放射性标记抗体， 通过使用放射免疫测定可以检测该抗体。 通过使 用例如 γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影等手� ��可检测放射性 同位素。

用荧光化合物标记抗体也是可行的。 当荧光标记的抗体暴露于合 适波长的光时， 由于荧光于是可检测其存在。 在最常用荧光标记化合 物中有异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 藻红蛋白和荧光胺。

本发明一方面提供了用于对受试者中的上皮源 性癌症进行早期筛 查、 诊断或预后评估的方法， 包括： 获得来自受试者的生物样品， 检 测该生物样品中细胞角蛋白片段的含量， 和将该含量与阔值水平进行 比较。 如果该含量超过阈值水平则说明该患者可能患 有癌症或者预后 不佳。

在一个优选实施方式中， 采用本发明提供的单克隆抗体进行检测。 例如，可以仅使用一种单抗来检测 K18或 K19片段；可以组合使用 3A9 和 2A6来检测 K18片段； 可以组合使用 2G2和 5H2来检测 K19片段； 也可以组合使用 3A9和 2G2来同时检测 K18片段和 K19片段；或者同 时组合使用上述四种单克隆抗体进行检测。 可以理解， 组合使用几种 抗体可能提高诊断的准确性。

本文所用的术语 "3A9" 是指由保藏编号为 CGMCC NO. 1957的杂 交瘤生产的单克隆抗体 , 可以特异识别 K18上的抗原表位。

本文所用的术语 "2A6" 是指由保藏编号为 CGMCC NO. 1956的杂 交瘤生产的单克隆抗体， 可以特异识别 K18上的抗原表位。

本文所用的术语 "2G2" 是指由保藏编号为 CGMCC NO. 1955的杂 交瘤生产的单克隆抗体， 可以特异识别 K19上的抗原表位。

本文所用的术语 "5H2" 是指由保藏编号为 CGMCC NO. 1952的杂 交瘤生产的单克隆抗体， 可以特异识别 K19上的抗原表位。

在一个优选实施方式中， 该方法还涉及与其他上皮源性肿瘤标记 物联用， 例如 AFP、 CEA、 CA242、 CA19-9、 CA72-4、 CA125、 CA15-3、 NSE、 SCCA、 Cyfra21- PSA、 free PSA等常用肿瘤标记物。 对多个 肿瘤标记物进行组合检测对于提高诊断的准确 性有帮助。

本发明另一方面提供了评估用于治疗上皮源性 癌症的药物或疗法 的治疗效果的方法， 包括： 向患有上皮源性癌症的受试者施用所述药 物或疗法， 在施用所述药物或疗法之前和之后采集所述受 试者的生物 样品， 和检测所述生物样品中本发明的细胞角蛋白片 段的含量， 其中 在施用所述药物或疗法之前和之后该细胞角蛋 白片段含量明显降低 的， 表明所述药物或疗法有明显疗效。 盒。 该试剂盒可以是本领 普道°技术 员所熟知的 何配置 " 用于实 施一种或多种本文所述的方法。 另外， 优选用包括于试剂盒中的一种 或多种标准品同时实施测试， 以便该测试结果可定量或确证。 例如， 标准品可以是纯化的 K18或 K19蛋白。

试剂盒包括检测细胞角蛋白片段水平的手段， 例如选择性结合细 胞角蛋白片段的抗体或抗体片段。 诊断检测试剂盒优选以标准双抗体 结合形式配制， 其中一种特异性抗体捕获患者样品中的细胞角 蛋白片 段， 另一种特异性抗体用于检测捕获的细胞角蛋白 片段。 举例而言， 将该捕获抗体 （包被抗体） 固定于例如测试板或硝酸纤维素膜等固相 上。 通常用可检测标记例如辣根过氧化物酶或放射 性同位素来给第二 抗体即检测抗体作标签。

在一个优选实施方式中，试剂盒中组合使用 3A9和 2A6来检测 K18 片段。 在另一个优选实施方式中， 试剂盒中组合使用 2G2和 5H2来检 测 K19片段。也可以组合使用 3A9和 2G2来同时检测 K18片段和 K19 片段； 或者同时组合使用上述四种单克隆抗体进行检 测。 可以理解， 组合使用几种抗体可能提高诊断的准确性。

在其它的实施方案中， 检测试剂盒可采用（但不限于)下列技术： 竟 争性和非竟争性测定、放射免疫测定 (RIA)、生物发光和化学发光测定、 荧光测定、夹层试验、免疫放射测定、斑点印 迹、酶联测定（包括 ELIS A)、 微量滴定板和免疫细胞化学法。 对每一试剂盒， 测试的范围、 灵敏度、 准确度、 可靠性、 特异性和再现性均通过本领域技术人员所熟知 的方 法来确立。

上述检测试剂盒将还提供使用说明书。

本发明由下列实施例作进一步说明。 提供这些实施例是为了帮助 理解本发明， 不得解释为对本发明的限制。 实施例 1

1. 抗角蛋白 18及片段的单克隆抗体的制备

1.1 免疫原——重组细胞角蛋白 18片段的制备

重组细胞角蛋白 18片段 GY10为 E.coli系 BL21(DE3)大肠扞菌表 达。 ·

1.1.1 研制方案

见图 1。 1.1.2 细胞角蛋白 18片段的 cDNA合成

通过 RT-PCR方法制备编码各种细胞角蛋白 18片段的 cDNA: a) 模板及引物

先从一种 HELA人癌细胞系中分离得到总 RNA。 然后根据说明书 用反转录试剂盒（ Promega )合成 cDNA。 所获得的 cDNA即是 PCR的 模板。 设计三种片段的引物， 对各 cDNA进行 PCR扩增。 片段编号及 氨基酸序列见表 1-1。 重组细胞角蛋白 18片段的编号及序列

b) PCR反应

PCR反应溶液组分：

cDNA模板： 5 μ 1;

引物： 5'和 3'引物各 lOpmol

10 X PCR緩冲液： ΙΟ μ Ι;

dNTP: 各 2.5mM， 共 4 μ 1;

Taq聚合酶（ Promega ) ： 5U;

加入无菌双蒸水至 100 μ 1。

程序如下：

溶液加热至 94°C恒温 2min， 然后循环 40次， 每个循环设置为： 加 热 94。C 30s , 52 °C lmin, 72 °C 3min。 程序完成后， 反应溶液加热 72 °C 10min。 然后获取扩增的 DNA片段， 用含 0.25 g/ml溴化乙锭的 1%琼脂 糖凝胶分离， 见图 2。 结果显示条带中包含所需的细胞角蛋白 18片段 cDNA片段， 然后用 Gene Clean kit ( BIOIOI , Irvine，CA ) 回收 DNA片 段。

1.1.3 构建质粒并筛选

用 TOPO100 expression Cloning Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)克隆 cDNA片段。 (1)将从 PCR反应溶液回收的细胞角蛋白 18的 cDNA与克隆试剂 盒提供的 TOPO质粒 （图 3 ) 50ng混合；

(2)溶液中加入 10 X连接酶反应緩沖液（6mM Tris-HCl(pH7.5), 6mM MgCl, 5mM NaCl, 7mM β -巯基乙醇， 0.1 mM ATP， 2mM DTT, ImM 亚精胺， O.lmg/ml BSA ) ；

(3)再加入 4U T4 DNA连接酶（1 μ 1);

(4)用灭菌去离子水调整溶液体积至 10 μ ΐ;

(5)将其在 14°C温育 15h;

(6)取 2 μ 1加入到 50 μ 1感受态 E.coli 细菌株 TOP10F (由 TA克 隆试剂盒提供， 并按照说明书制成感受态， 混合物冰浴 30min, 然后孵 育 42°C 30s, 再冰浴 5min )

(7)配制 500 μ ΐ培养基， 含 2%(ν/ν)蛋白胨, 0.5%(w/v)酵母膏， 0.05%(w/v)NaCl, 2.5mM KC1, ImM MgCl和 20mM葡萄糖， 将 (6)加 入其中， 37°C温育 lh， 并振摇。

(8)在 L-肉汤琼脂平板 （ 1%(ν/ν)蛋白胨， 0.5%(w/v)酵母膏，

0.5%(w/v)NaCl， 0.1 %葡萄糖， 0.6%(w/v)bacto-agar(Difo, Detroit, MI) ) 涂铺 (7)， 10(^g/ml。

(9)培养基表面可筛选出抗氨苄的克隆子， 用铂丝涂布圈挑出单菌 落放入 L-肉汤培养基（含氨苄 10(^g/ml ) 中 37°C培养， 过夜， 振摇 (200rpm)。

(10) 温育过后， 离心收集细菌， 用碱法提取 DNA质粒。

经酶切鉴定，已经得到重组的表达质粒 TOPO-GY10、TOPO-GY11、

TOPO-GY12, 如图 4。

1.1.4 重组蛋白的诱导表达和鉴定

编码各种细胞角蛋白 18的 cDNA已经插入 TOPO质粒中，

(1)所获质粒转化至 E.coli系 BL21(DE3)， 然后在 LB培养基中培 养至指数增长期， 用异丙醇 β-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 3h。

(2)沉淀细胞， 用裂解液 (8M urea, 20mM Tris-HCl)重悬， 并用超 声破碎。

(3)后 14,000 x g离心 15min,在 Ni柱纯化上清。用 PBS溶液透析 纯化蛋白， 4°C过夜。

(4)用 BCA试剂（Pierece, Woburn, MA)检测蛋白浓度。 1.1.5 重组细胞角蛋白 18的纯化

活化 Sephadex G-50, 利用分子筛层析纯化重组细胞角蛋白 18片 段。 将 Sephadex G-50溶于 100 mM Tris-HCl緩冲液 （pH 7.4), 在 100 °C煮沸 10分钟， 然后用 100 mM Tris-HCl緩冲液 （pH 7.4)封闭， 并在 4°C保存。 将细菌破碎浓缩液流经 2ml凝胶珠， 流速为 2 ml /min。 样品 通过后， 50毫升 PBS冲洗，洗脱緩冲液 0.1 M甘氨酸 （pH 2.4)， 0.15 M NaCI 。 洗脱液于紫外 OD280nm测值判断洗脱是否完毕。 收集有效洗 脱液（OD>0.01 ) 置于透析袋用 1L的磷酸盐緩冲液（ pH7.5 ) 4°C透 析， 期间更换 2次透析緩冲液。 将纯化的蛋白质浓缩到约 lmg/ml, 加 入 l %。NaN ₃ , 4°C保存。 用 10 %的 SDS— PAGE检测， 并用 GDS8000 凝胶成像系统扫描分析蛋白纯度。

结果如图 5 , 结果显示获得了高纯度的重组细胞角蛋白 18 片段 GY10、 GY11、 GY12, 电泳测定纯度大于 95 %。

用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组全长 人细胞角蛋白 18， 此蛋白由美国 UAB大学周铜教授馈赠。

1.2 免疫流程

动物： 6 ~ 8周龄雌性 Balb/c小鼠。

初次免疫（第 1天） ： 采用 1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏 完全佐剂混勾形成乳化颗粒， 每只足底注射 100 μ 1。

二次免疫（第 7天） ： 采用 1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏 不完全佐剂混勾形成乳化颗粒， 每只足底注射 100 μ 1。

强化免疫（第 14、 21、 28天）： 采用不含佐剂的抗原（lmg/ml ) ， 每只足底注射 100 μ 1。

融合（第 31天） 。

1.3 杂交瘤的建立

取免疫小鼠的胭窝及腹股沟分离淋巴细胞， 将其与 NS1骨髓瘤细 胞按 2:1比例混合， 用无血清 RPMI 1640洗涤 2次， 加入 lml37。C预热 的 PEG1500, 在 37°C轻微混合细胞 1分钟， 然后在 3分钟内緩慢滴加 20ml预热至 37°C的无血清 RPMI 1640培养基。 离心， 将融合细胞悬浮 于 12% FBS RPMI 1640 HAT 选择培养基。 将细胞加入 5块 96孔细胞 培养板中， ΙΟΟμΙ/孔。

1.4 ELISA检测筛选阳性克隆 在细胞融合后 7天， 用间接 ELISA法进行初次筛选， 所有杂交瘤 均用三种重组人细胞角蛋白 18抗原筛选： （1 )全长细胞角蛋白 18; ( 2 ) N端细胞角蛋白 18片段； （3 ) C端细胞角蛋白 18片段。

用上述角蛋白 18抗原 （ l g/ml ) 包被 ELISA板 4°C过夜； 用 PBS 洗涤 3次， 用含 3% (w/v) BSA的 PBS室温封闭 lh。 检测时每孔加入 ΙΟΟμΙ细胞培养液上清； 37°C温浴 30分钟， 用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋 白 （HRP-GAM Ig , DAKO公司） ， 37°C温浴 30分钟， 取出后用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍 干后先后加入底物液 A、 B 各 50μ1 (底物液 Α 成分为： 13.42g Na ₂ HP0 ₄ *12H ₂ 0、 4.2g柠檬酸 ·Η ₂ 0和 0.3g过氧化氢， 用去离子水中调 节体积为 700ml; 显色液 B成分为： 0.2g四甲基联苯胺、 20ml二甲基 甲酰胺用去离子水中调节体积为 700ml ) , 37°C显色 10分钟，加入 50μ1 终止液（2Μ H ₂ S0 ₄ )终止反应， 并于酶标仪上检测各孔的 OD _45Q 值， 以 OD ₄₅₀ 值高于 2.0以上者视为阳性。

单克隆抗体的初筛结果概括为表 1-2。所有 480孔杂交瘤培养上清 经四种抗原检测后， 我们鉴定出 48个克隆与全长细胞角蛋白 18抗原 反应很强。 其中 5个克隆与角蛋白 18的 N端、 C端片段以及无关对照 抗原呈阳性反应， 这些克隆被视为非特异性克隆； 其中 18个克隆与 N 端细胞角蛋白 18片段呈阳性反应， 定义为 N端特异性克隆； 其中 24 个与 C端细胞角蛋白 18片段呈阳性反应， 定义为 C端特异性克隆。 另 外， 还有 1株克隆与 N端及 C端抗原反应， 其反应特异性未知。 这些 N端和 C端特异性克隆作为候选克隆进行进一步研究� �

这些克隆通过有限稀释法进行三次亚克隆。 表 1-2 初次筛选鼠抗人角蛋白 18单抗结果

反应结果 总共 480个克隆 备注 全长角 N-端片段 C-端片段 阴性对照 阳性克隆数

蛋白 18 (aal ~ 250) (aa200 - 430) 抗原

+ + + + 5 非特异性

+ + - - 18 N-端特异

+ ■一 + - 24 C-端特异

+ + + - 1 未知 1.5 单克隆抗体的产生及纯化

取 16周龄的健康 Balb/c小鼠，腹腔注射 0.5ml pristane„ 5 ~ 7天后， 收集克隆化的杂交瘤细胞， 离心去上清， 加入不含血清的培养基， 调 节细胞密度至 2x l0 ⁵ ~ 2χ 10 ⁶ 个 /ml， 每只小鼠注射 0.5ml。 7 ~ 10天后 小鼠腹部增大， 开始收集腹水。 3000rpm离心 15分钟， 吸取中间澄清 部分的液体， 0.45μπι的微孔滤膜过滤除菌， 分装后 -20°C保存。

将处理好的腹水用 0.02mol/L、 pH7.4 的 PBS ( 81ml 0.2mol/L Na ₂ HP0 ₄ ， 19ml 0.2mol/L NaH ₂ P0 ₄ , 加生理盐水至 100ml ) 5倍稀释， 取 50 ml上样至 2 ml protein-A/G 层析柱， 流速为 1 ml/min. 然后用 PBS 洗涤亲和层析柱至流出液 OD _28Q 测值小于 0.01。 然后使用 0.1M Glycine-HCL pH2.4 緩冲液洗脱结合在层析柱上的抗体，收集洗脱 组分 2ml/管， 最后将所有 OD _28Q 大于 0.1的洗脱组分混合， 再用 1/10体积的 1M Tris-HCL pH 8.5溶液中和。 最后在 PBS溶液中透析过夜， 期间更 换 2次透析液。

1.6 酶标抗体的制备

辣根过氧化物酶（HRP ) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过 碘酸钠法。其原理是 HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体 IgG 后该醛基与 IgG氨基结合， 形成 Schiff氏碱。 为了防止 HRP中糖的醛 基与其自身蛋白氨基发生偶合， 在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯 阻断氨基。 氧化反应末了， 用硼氢化钠稳定 Schiff氏碱。

(1) 将 5mg HRP溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHC0 ₃ 溶液中； 加 0.5ml 10mmol/L NaIO ₄ 溶液， 混匀， 盖紧瓶塞， 室温避光作用 2小时。

(2) 加 0.75ml 0.1mol/L Na ₂ C0 ₃ 混匀。

(3) 加入 0.75ml纯化单抗（ 15mg/ml ) ， 混匀。

(4) 称取 Sephadex G25干粉 0.3g， 加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内； 随后将上述交联物移入注射器外套； 盖紧， 室温作用

(避光） 3小时或 4°C过夜。

(5) 用少许 PBS将交联物全部洗出， 收集洗出液， 加 1/20V体积 新鲜配制的 5mg/ml NaBH ₄ 溶液，混匀，室温作用 30分钟；再加入 3/20V

NaBH ₄ 溶液， 混匀， 室温作用 1小时 （或 4°C过夜） 。

(6)将交联物过 Sephadex G200或 Sepharose 6B ( 2.6x50cm )层析纯 化， 分管收集第一峰。

(7) 酶结合物质量鉴定：

克分子比值测定

酶量 （mg/ml ) =OD ₄ o3 ^x 0.4

IgG量 （ mg/ml ) = ( OD ₂₈₀ -OD ₄₀₃ x 0.3 ) χθ.62

克分子比值（E/P ) =酶量 x4/IgG量， 一般在 1-2之间。 酶结合率= 酶量 X体积 /抗体， 标记率一般为 0.3-0.6， 即 1-2个 HRP分子结合在一 个抗体分子上， 标记率可大于 0.6， 0.8， 0.9; OD ₄₀₃ /OD ₂₈₀ 等于 0.4时， E/P约为 1。

标"己率 =OD ₄₀₃ /OD ₂₈₀

酶活性和抗体活性的测定 可应用 ELISA法、免疫扩散、 DAB-H ₂ 0 ₂ 显色反应测定酶结合物的酶活性， 抗体活性及效价、 特异性。

(8) HRP抗体结合物的保存： 加入等量甘油后， 小量分装 -20°C存 放， 防止反复冻融； 或加入等量 60%甘油 4°C保存； 不宜加 NaN ₃ 或酚 防腐， 否则会影响酶活性。 必要时冻干保存， 以 BSA或脱脂牛奶作保 护剂。

1.7 肿瘤相关角蛋白 18 片段单克隆抗体配对筛选和临床初步验 证

纯化及酶标抗体经 ELISA法确认其抗原反应性后，选取 10株具有 高度亲和力的进行配对实验， 以筛选出与胃癌高度相关的角蛋白 18抗 体配对。

1.7.1 交叉配对试验

为了获取与胃癌血清角蛋白 18具有选择性的单克隆抗体配对， 我 们选取 10份胃癌血清样本及 10份正常人血清样本作为测试样本。 将 10份胃癌血清等量体积混合作为阳性样本，将 10份正常人血清等量体 积混合作为阴性样本。 用 l g/ml的纯化抗体包被 96孔板， 4°C过夜， 然后以含 3%BSA的 PBS封闭， 室温下 lh。 然后在一套 ELISA板中各 孔加入 50μ1的胃癌阳性血清，在另外一套 ELISA板中加入正常人阴性 对照血清， 再各加入 50μ1的 1:1000酶标抗体。 37°C温育后洗涤， 加入 显色底物， 避光 10分钟， 加入终止液， 在 450nm测量 OD值。

表 1-3 概括了 5 对单克隆抗体的交叉配对实验结果。 其中以 3A9/2A6-HRP, 2A6/3A9-HRP, 3H7/3A9-HRP 的抗体配对显示出对胃 癌血清的强阳性反应， 而对正常人血清呈阴性反应。 因此， 我们确定 这些抗体配对所检测的血清角蛋白 18与胃癌高度相关。 筛选胃癌相关角蛋白 18抗体的交叉实验

1.7.2 最佳抗体配对临床验证实验

从上述交叉抗体配对实验中初选出 3对与胃癌角蛋白 18高度相关 的抗体配对 3A9/2A6-HRP, 2A6/3A9-HRP, 3H7/3A9-HRP，使用 ELISA 法进行临床验证。 用 l g/ml的纯化抗体包被 96孔板， 4°C过夜， 然后 以含 3%BSA的 PBS室温下封闭 lh。 分别入 10份胃癌血清和 10份正 常人血清各 50μ1作为检测样本进行检测， 然后加入 50μ1的 1:1000酶 标抗体。 37°C温育后洗涤， 加入显色底物， 避光 10分钟， 加入终止液， 在 450nm测量 OD值。 将检测数据作散点分布图， 初步观察比较诊断 灵敏度及特异性， 见图 6。

结果显示， 3A9/2A6-HRP检测中， 胃癌血清检测值均高于正常人 血清检测值， 灵敏度及特异性均为 100%; 2A6/3A9-HRP检测中， 1例 胃癌血清检测值在正常人血清检测值范围内， 灵敏度及特异性较前者 低； 3H7/3A9-HRP检测中， 4例胃癌血清检测值在正常人血清检测值 范围内， 灵敏度及特异性较前两者低； 所以， 3A9/2A6-HRP配对对血 清的诊断性能最佳。 1.8 肿瘤相关角蛋白 18单克隆抗体的特征性研究

1.8.1 抗体识别肿瘤相关角蛋白 18片段抗原决定簇的确定 为了进一步确定 3A9及 2A6的抗原结合表位， 我们制备了一组重 组角蛋白 18片段， 这些片段带有每 50个氨基酸片段的缺失， 如表 1-4 所示。 采用间接 ELISA法测定抗体与这些抗原的结合活性。

(1) ELISA微孔板包被 l g/ml各种细胞角蛋白 18片段， 4°C过夜；

(2) 用 PBS洗涤 3次， 用含 3% (w/v) BSA的 PBS封闭， 室温， lh;

(3) 微孔中加入检测抗体（终浓度 l g/ml ) ， 温育 lh， 37°C ;

(4) 用 PBS洗涤 3次， 未结合抗体即被洗去。 然后加入连接 HRP 的抗 mouse IgG抗体（ g/ml)， 温育 30min， 37 °C；

(5) 用 PBS洗涤 3次， 加入 TMB底物， 静置 10min， 然后加入 终止液 2N H ₂ S0 ₄ ; 在 ELISA酶标仪上检测样本孔 450 nm/650 nm光密

表 1 -4 抗原识别表位的确定

序号 抗原 3A9 2A6

C1 aal ~ 430 + +

C2 aa50 - - 430 + +

C3 aalOO - 430 + +

C4 aal 50 ~ 430 + +

C5 aa200 - 430 + +

C6 aa250 ~ 430 - +

N7 aal 〜 400 + +

N8 aal ~ 350 +

N9 aal ~ 300 +

N10 aal ~ 250 +

aa 200 ~ 250 aa350 ~ 400 结果显示，单抗 3A9结合抗原 1 ~ 5，但是不能结合抗原 6( aa250 ~ 430 ) , 同时与所有 C端缺失片段呈阳性反应。 因此， 单抗 3A9的抗原 结合表位位于细胞角蛋白 18 aa 200 ~ 250的片段内。 单抗 2A6与所有 的 N端缺失片段均呈阳性反应， 并且与 1个 N端片段（aal - 400 ) 呈 阳性反应， 其它 3个 N端片段均呈阴性反应。 因此， 单抗 2A6结合表 位为细胞角蛋白 18 aa 350 ~ 400的片段内。 单抗 3A9和单抗 2A6的结 合表位如图 7所示。

1.8.2 杂交瘤分泌抗体的类型及亚类鉴定

以纯化角蛋白 18抗原包被 ELISA板。每孔加入各单克隆抗体的细 胞上清 lOO L, 37°C温育 30min; 在 TEC AN全自动洗板机上用 PBST 洗涤 5次， 每次间隔 20秒， 扣干， 加入合适稀释度的 HRP-山羊抗小 鼠 IgM、 IgG IgG2a、 IgG2b、 IgG3抗体（Serotec公司） 酶标二抗， 于 37°C温育 30min; 在 TECAN全自动洗板机上用 PBST洗涤 5次， 每 次间隔 20sec, 扣干 , 加入显色液 A ( H ₂ 0 ₂ )和 B ( TMB )各 1滴， 于 37°C显色 10min， 加入 1滴终止液（ 2M H ₂ S0 ₄ )； 在 TECAN酶标仪上 测量 OD _45Q nm (参比波长为 620nm ) , cutoff值为 2倍的阴性均值， OD 值大于 cutoff值为阳性， OD值小于 cutoff值为阴性。 结果表明， 3A9 为 IgG2a， 2A6为 IgGl。

1.8.3 特异性

为了检测单抗 3A9及 2A6的反应特异性， 我们检测其与其它人血 清肿瘤标记物的免疫结合强度。 首先将 K18、 K8、 K19、 CEA、 CA724 其他人血清肿瘤标记物按 1μ _β /πι1 包被 96 孔板， 4°C过夜， 然后以含 3%BSA的 PBS室温下封闭 lh。 检测时每孔加入 50μ1 1 :1000稀释的单 抗 3Α9或 2Α6; 37°C温浴 30分钟， 用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后 加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白 （HRP-GAM Ig， DAKO公 司） ， 37°C温浴 30分钟， 取出后用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后先后 加入底物液 A、 B各 50μ1 (底物液 A成分为： 13.42g Na ₂ HP0 ₄ ' 12H ₂ 0、 4.2g柠檬酸 ·Η ₂ 0和 0.3g过氧化氢， 用去离子水中调节体积为 700ml; 显色液 B成分为： 0.2g四曱基联苯胺、 20ml二曱基甲酰胺用去离子水 中调节体积为 700ml )，37°C显色 10分钟，加入 50μ1终止液（ 2M H ₂ S0 ₄ ) 终止反应， 并于酶标仪上检测各孔的 OD _45Q 值。 结果见图 8。

结果显示， 单克隆抗体 3A9、 2A6与 K18呈强阳性反应， 与其它 肿瘤标记物均呈阴性反应。 表明单克隆抗体 3A9、 2A6为角蛋白 18高 度特异的单克隆抗体。

2 角蛋白 18-3A9试剂盒的制备 细胞角蛋白 18-3A9测定试剂盒（化学法发光法） 采用固相 96孔发 光板作为反应载体， 通过与胃癌相关的抗角蛋白 18的一对单克隆抗体 构成双抗体夹心法， 使用高敏感的化学发光检测技术对胃癌病人血 清 中.角蛋白 18片段进行定量检测。

以 K18单抗 3A9作为包被抗体， 以 K18单抗 2A6作为标记抗体， 制备 K18试剂盒。

试剂盒主要组分为： 校准品、 包被板、 酶结合物、 发光液、 浓缩 洗涤液。

标准品为纯化的角蛋白 18。 包被抗体为 K18单抗 3A9。 标记抗体 为 K18单抗 2A6, 以 HRP辣根过氧化物酶进行标记， 形成抗体 -HRP 复合物 （酶结合物） 。

包被板是包被单抗 3A9经洗涤、 封闭、 干燥， 真空封装而成。 K18 单抗 3A9 以拧檬酸緩沖液 PH4.8为包被緩冲液， 以 5 g/mL的包被浓 度进行包被。 封闭液为 0.02M PBS+0.4%酪蛋白 +1%BSA+0.5M NaCl+0.2%明胶 +10%牛血清 +0.05%Tween-20+l %。防腐剂 +2.5%蔗糖。

标记抗体为 2A6-HRP。稀释液为 0.02M PBS+1%酪蛋白 +1%BSA +1 %。氨基比啉 +0.05%Tween-20。

发光液由将 KPL生产的发光液 A和发光液 B分装而成。 浓缩洗涤液 为 20 X PBS洗涤液。

3 临床验证和应用

在临床实验的统计分析过程中， 考虑到对治疗（化疗和手术）后处 于恢复期的患者血清中 K18的含量较治疗前会明显减少， 为了排除治 疗对试验结果的干扰， 在临床 1000例样本中选取 24例胃癌初诊患者 (未经治疗）血清标本检测结果进行分析， 结果表明 K18试剂盒的灵 敏度为 62.5 %， CA72-4试剂盒的灵敏度为 37.50%， 详见表 1-5。 表 1-5 K18试剂盒与 CA72-4试剂盒对初诊胃癌患者诊断评价指 标比较

阳性预测值 阴性预测值 诊断试剂 灵敏度％ 特异度％ 符合率％

% %

K18 62.50 96.00 92.41 65.22 95.52

CA72-4 37.50 95.00 88.84 47.37 84.82 在临床实验的统计分析过程中， 考虑到试剂盒对炎症等患者诊断 的假阳性率是影响诊断结果的重要因素， 本试验对 150例胃炎患者血清 样本进行对比试验， 以比较 K18试剂盒和 CA72-4试剂盒鉴别诊断能力。 结果显示， K18试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为 5.3%， CA72-4试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率 为 16.7%， K18试剂盒 假阳性率低于 CA72-4。 见表 1-6。 检测结果表明本试剂盒能将炎症患者 血清与胃癌患者血清很好的区分， 具有很好的特异性。 表 1-6 炎症患者血清检测结果统计

、1、，^ 检测结果

试剂盒

阳性 阴性

K18试剂盒 8 142

CA72-4试剂盒 25 125 如图 9所示， 由 ROC曲线分析结果可知， 角蛋白 18-3A9试剂盒对应 的 ROC曲线下面积（ 0.743 ) 大于罗氏公司的 CA72-4试剂盒对应 ROC曲 线下所围面积（ 0.612 )，角蛋白 18-3 A9试剂盒诊断胃癌的效果较 CA72-4 试剂盒好。

在中国医学科学院肿瘤医院进行的预实验中， 选择癌症患者血清 241例， 其中肺癌 84例， 胃癌 76例， 肠癌 81例， 阴性对照 61例， 正常人 体检血清 61例进行临床验证预实验。 结果如表 1-7, 表明角蛋白 18-3A9 测定试剂盒（化学发光法）对其它上皮源肿瘤 也具有较高的检出率。

K18对各种癌症鉴别诊断结果

灵敏度(％) 特异度(％)

肺癌 43 90

胃癌 45 90

肠癌 53 90 实施例 2 1 抗角蛋白 19及片段的单克隆抗体的制备

1.1 免疫原

重组细胞角蛋白 19片段 GY20为 E.coli系 BL21(DE3)大肠杆菌表 达。

通过以下方法研制得到：

1.1.1 研发方案

见图 10

1.1.2 细胞角蛋白 19片段的 cDNA合成

通过 RT-PCR方法制备编码各种细胞角蛋白 19片段的 cDNA: a) 模板及引物

先从一种 HELA人癌细胞系中分离得到总 RNA。 然后根据说明书 用反转录试剂盒（ Promega )合成 cDNA。 所获得的 cDNA即是 PCR的 模板。 设计三种片段的引物， 对各 cDNA进行 PCR扩增。 片段编号及 氨基酸序列见表 2-1。 重组细胞角蛋白 19片段的编号及序列

b) PCR反应

PCR反应溶液组分：

cDNA模板： 5 μ ί;

引物： 5，和 3，引物各 lOpmol

10 X PCR緩冲液： 10 μ ΐ;

dNTP: 各 2.5mM, 共 4 μ 1;

Taq聚合酶（Promega ) ： 5U;

加入无菌双蒸水至 100 μ 1。

程序如下：

溶液加热至 94°C恒温 2min, 然后循环 40次， 每个循环设置为： 加 热 94 °C 30s , 52 °C lmin, 72 °C 3min。 程序完成后， 反应溶液加热 72 °C 10min。 然后获取扩增的 DNA片段， 用含 0.25 g/ml溴化乙锭的 1%琼脂 糖凝胶分离， 见图 11。 结果显示条带中包含所需的细胞角蛋白 19片段 cDNA片段， 然后用 Gene Clean kit ( BIO101 , Irvine,CA ) 回收 DNA片 段。

1.1.3 构建质粒并筛选

用 TOPO100 expression Cloning Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)克隆 cDNA片段。

(11) 将从 PCR反应溶液回收的细胞角蛋白 19的 cDNA与克隆试 剂盒提供的 TOPO质粒 （图 12 ) 50ng混合；

(12) 溶液中加入 10 X连接酶反应緩沖液（ 6mM Tris-HCl(pH7.5),

6mM MgCl, 5mM NaCl, 7mM β -巯基乙醇， 0.1 mM ATP, 2mM DTT, ImM 亚精胺， O.lmg/ml BSA ) ；

(13) 再加入 4U T4 DNA连接酶（1 μ 1);

(14) 用灭菌去离子水调整溶液体积至 10 μ ΐ;

(15) 将其在 14°C温育 15h;

(16) 取 2 μ 1加入到 50 μ 1感受态 E.coli 细菌株 TOP10F (由 TA 克隆试剂盒提供， 并按照说明书制成感受态， 混合物冰浴 30min， 然后 孵育 42°C 30s， 再冰浴 5min )

(17) 配制 500 μ ΐ培养基， 含 2%(ν/ν)蛋白胨， 0.5%(w/v)酵母膏， 0.05%(w/v)NaCl, 2.5mM KC1, ImM MgCl和 20mM葡萄糖， 将 (6)加 入其中， 37°C温育 lh， 并振摇。

(18) 在 L-肉汤琼脂平板 （ 1%(ν/ν)蛋白胨， 0.5%(w/v)酵母膏， 0.5%(w/v)NaCl, 0.1%葡萄糖， 0.6%(w/v)bacto-agar(Difo, Detroit, MI) ) 涂铺 (7), lOO g/mh

(19) 培养基表面可筛选出抗氨苄的克隆子， 用铂丝涂布圈挑出单 菌落放入 L-肉汤培养基（含氨苄 lOO g/ml ) 中 37°C培养， 过夜， 振 摇 (200rpm)。

(20) 温育过后， 离心收集细菌， 用碱法提取 DNA质粒。

经酶切鉴定，已经得到重组的表达质粒 TOPO-GY20、TOPO-GY21、 TOPO-GY22, 如图 13。

1.1.4 重组蛋白的诱导表达和鉴定

编码各种细胞角蛋白 19的 cDNA已经插入 TOPO质粒中， (5)所获质粒转化至 E.coli系 BL21(DE3), 然后在 LB培养基中培 养至指数增长期， 用异丙醇 β-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 3h。

(6)沉淀细胞， 用裂解液 (8M urea, 20mM Tris-HCl)重悬， 并用超 声破碎。

(7)后 14,000 X g离心 15min,在 Ni柱纯化上清。用 PBS溶液透析 纯化蛋白， 4°C过夜。

(8)用 BCA试剂（Pierece, Woburn, MA)检测蛋白浓度。

1.1.5 重组细月包角蛋白 19的纯化

活化 Sephadex G-50, 利用分子筛层析纯化重组细胞角蛋白 19片 段。 将 Sephadex G-50溶于 100 mM Tris-HCl緩冲液 （pH 7.4)， 在 100 °C煮沸 10分钟， 然后用 100 mM Tris-HCl緩沖液 （pH 7.4)封闭， 并在 4°C保存。 将细菌破碎浓缩液流经 2ml凝胶珠， 流速为 2 ml /min。 样品 通过后， 50毫升 PBS冲洗，洗脱緩冲液 0.1 M甘氨酸 （pH 2.4)， 0.15 M NaCl 。 洗脱液于紫外 OD280nm测值判断洗脱是否完毕。 收集有效洗 脱液（OD>0.01 ) 置于透析袋用 1L的磷酸盐緩沖液（ pH7.5 ) 4°C透 析， 期间更换 2次透析緩沖液。 将纯化的蛋白盾浓缩到约 lmg/ml, 加 入 l%。NaN ₃ ， 4°C保存。 用 10 %的 SDS— PAGE检测， 并用 GDS8000 凝胶成像系统扫描分析蛋白纯度。

结果如图 14， 结果显示获得了高纯度的重组细胞角蛋白 19 片段 GY20、 GY21、 GY22, 电泳测定纯度大于 95 %。

用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组全长 人细胞角蛋白 19， 此蛋白由美国 UAB大学周铜教授馈赠。

1.2 免疫程序

动物： 6 ~ 8周龄雌性 Balb/c小鼠。

初次免疫（第 1天） ： 采用 1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏 完全佐剂混勾形成乳化颗粒， 每只足底注射 100 μ 1。

二次免疫（第 7天） ： 采用 1ml抗原蛋白溶液与相同体积的弗氏 不完全佐剂混勾形成乳化颗粒， 每只足底注射 100 μ 1。

强化免疫（第 14、 21、 28天）： 采用不含佐剂的抗原（lmg/ml ) ， 每只足底注射 100 μ 1。

融合（第 31天） 。

杂交瘤的建立 取免疫小鼠的胭窝及腹股沟分离淋巴细胞， 将其与 NS1骨髓瘤细 胞按 2: 1比例混合， 用无血清 RPMI 1640洗涤 2次， 加入 lml37°C预热 的 PEG1500, 在 37°C轻微混合细胞 1分钟， 然后在 3分钟内緩慢滴加 20ml预热至 37Ό的无血清 RPMI 1640培养基。 离心， 将融合细胞悬浮 于 12% FBS RPMI 1640 HAT 选择培养基。 将细胞加入 5块 96孔细胞 培养板中， ΙΟΟμΙ/孔。

1.4 ELISA检测筛选阳性克隆

在细胞融合后 7天， 用间接 ELISA法进行初次筛选， 所有杂交瘤 均用三种重组人细胞角蛋白 19抗原筛选： （ 1 )全长细胞角蛋白 19; ( 2 ) Ν端细胞角蛋白 19片段； （3 ) C端细胞角蛋白 19片段。

用上述角蛋白 19抗原（ 1 y g/ml )包被 ELISA板 4 °C过夜； 用 PBS 洗涤 3次， 用含 3% (w/v) BSA的 PBS室温封闭 lh。 检测时每孔中加 入 ΙΟΟμΙ细胞培养液上清； 37°C温浴 30分钟，用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋 白 （HRP-GAM Ig， DAKO公司） ， 37°C温浴 30分钟， 取出后用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍 干后先后加入底物液 A、 B 各 50μ1 (底物液 Α 成分为： 13.42g Na ₂ HP0 ₄ .12H ₂ 0、 4.2g拧檬酸 ·Η ₂ 0和 0.3g过氧化氢， 用去离子水中调 节体积为 700ml; 显色液 B成分为： 0.2g四曱基联苯胺、 20ml二曱基 曱酰胺用去离子水中调节体积为 700ml )， 37°C显色 10分钟，加入 50μ1 终止液（2Μ H ₂ S0 ₄ )终止反应， 并于酶标仪上检测各孔的 OD ₄₅ o值， 以 OD ₄₅ o值高于 2.0以上者视为阳性。

单克隆抗体的初 结果概括与表 2-2。所有 480孔杂交瘤培养上清 经四种抗原检测后， 我们鉴定出 39个克隆与全长细胞角蛋白 19抗原 反应很强。 其中， 3个克隆与角蛋白 19的 N端、 C端片段以及无关对 照抗原呈阳性反应， 这些克隆被视为非特异性克隆； 其中 15个克隆与 N端细胞角蛋白 19 片段呈阳性反应， 定义为 N端特异性克隆； 其中 18个与 C端细胞角蛋白 19片段呈阳性反应， 定义为 C端特异性克隆。 另外， 还有 3株克隆与 N端及 C端抗原反应， 其反应特异性未知。 这 些 N端和 C端特异性克隆作为候选克隆进行进一步研究� �

这些克隆通过有限稀释法进行三次亚克隆。 初次筛选角蛋白 19鼠抗人单抗结果

1.5 单克隆抗体的产生及純化

取 16周龄的健康 Balb/c小鼠 ,腹腔注射 0.5ml pristane„ 5 ~ 7天后， 收集克隆化的杂交瘤细胞， 离心去上清， 加入不含血清的培养基， 调 节细胞密度至 2χ 10 ⁵ ~ 2χ 10 ⁶ 个 /ml, 每只小鼠注射 0.5ml。 7 ~ 10天后 小鼠腹部增大， 开始收集腹水。 3000rpm离心 15分钟， 吸取中间澄清 部分的液体， 0.45μπι的微孔滤膜过滤除菌， 分装后 -20°C保存。

将处理好的腹水用 0.02mol/L、 pH7.4 的 PBS ( 81ml 0.2mol/L Na ₂ HP0 ₄ , 19ml 0.2mol/L NaH ₂ PO ₄ , 加生理盐水至 100ml ) 5倍稀释， 取 50 ml上样至 2 ml protein-A/G 层析柱， 流速为 1 ml/min. 然后用 PBS 洗涤亲和层析柱至流出液 OD ₂₈₍₎ 测值小于 0.01。 使用 0.1M Glycine-HCL pH2.4緩沖液洗脱结合在层析柱上的抗体，收集� ��脱组分 2ml/管， 最后将所有 OD ₂₈ 。大于 0.1的洗脱组分混合， 然后用 1/10体积 的 lM Tris-HCL pH 8.5溶液中和。 然后在 PBS溶液中透析过夜， 期间 更换 2次透析液。

1.6 酶标抗体的制备

辣根过氧化物酶（HRP ) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过 碘酸钠法。其原理是 HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体 IgG 后该醛基与 IgG氨基结合， 形成 Schiff氏碱。 为了防止 HRP中糖的醛 基与其自身蛋白氨基发生偶合， 在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯 阻断氨基。 氧化反应末了， 用硼氢化钠稳定 Schiff氏碱。

(1) 将 5mg HRP溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHC0 ₃ 溶液中； 加 0.5ml

10mmol/L NaIO ₄ 溶液， 混匀， 盖紧瓶塞， 室温避光作用 2小时。

(2) 加 0,75ml 0.1mol/L Na ₂ C0 ₃ 混匀。 (3) 加入 0.75ml纯化单抗（ 15mg/ml ) , 混匀。

(4) 称取 Sephadex G25干粉 0.3g， 加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内； 随后将上述交联物移入注射器外套； 盖紧， 室温作用

(避光） 3小时或 4°C过夜。

(5) 用少许 PBS将交联物全部洗出， 收集洗出液， 加 1/20V体积 新鲜配制的 5mg/ml NaBH ₄ 溶液，混匀，室温作用 30分钟；再加入 3/20V NaBH ₄ 溶液， 混匀， 室温作用 1小时 （或 4°C过夜） 。

(6)将交联物过 Sephadex G200或 Sepharose 6B ( 2.6x50cm )层析纯 化， 分管收集第一峰。

(7) 酶结合物质量鉴定：

克分子比值测定

酶量（ mg/ml ) =OD ₄₀ 3 ^X 0.4

IgG量 （ mg/ml ) = ( OD ₂₈₀ -OD ₄₀₃ x 0.3 ) χθ.62

克分子比值（E/P ) =酶量 x4/IgG量， 一般在 1-2之间。 酶结合率= 酶量 X体积 /抗体， 标记率一般为 0.3-0.6, 即 1-2个 HRP分子结合在一 个抗体分子上， 标记率可大于 0.6, 0.8, 0.9; OD ₄ 。 ₃ /OD ₂₈ 。等于 0.4时， E/P约为 1。

标记率 =OD ₄₀₃ /OD ₂₈₀

酶活性和抗体活性的测定 可应用 ELISA法、免疫扩散、 DAB-H ₂ 0 ₂ 显色反应测定酶结合物的酶活性， 抗体活性及效价、 特异性。

(8) HRP抗体结合物的保存： 加入等量甘油后， 小量分装 -20°C存 放， 防止反复冻融； 或加入等量 60%甘油 4°C保存； 不宜加 NaN ₃ 或酚 防腐， 否则会影响酶活性。 必要时冻干保存， 以 BSA或脱脂牛奶作保 护剂。

1.7 肿瘤相关角蛋白 19片段单克隆抗体配对的筛选

纯化及酶标抗体经 ELISA法确认其抗原反应性后，选取 10株具有 高度亲和力的进行配对实验， 以筛选出与肺癌高度相关的角蛋白 19抗 体配对。

1.7.1 交叉配对试验选择

为了获取与肺癌血清角蛋白 19具有选择性的单克隆抗体配对， 我 们选取 10份肺癌血清样本及 10份正常人血清样本作为测试样本。 将 10份肺癌血清等量体积混合作为阳性样本，将 10份正常人血清等量体 积混合作为阴性样本。 用 l g/ml的纯化抗体包被 96孔板， 4°C过夜， 然后以含 3%BSA的 PBS室温下封闭 lh。 然后一套 ELISA板中各孔加 入 50μ1的肺癌阳性血清，在另外一套 ELISA板中加入正常人阴性对照 血清， 再各加入 50μ1的 1 :1000酶标抗体。 37°C温育后洗涤， 加入显色 底物， 避光 10分钟， 加入终止液， 在 450nm测量 OD值。

表 2-3 概括了 5 对单克隆抗体的交叉配对实验结果。 其中以 2G2/5H2-HRP, 5H2/2G2-HRP, 5H2/1D11-HRP的抗体配对显示出对肺 癌血清的强阳性反应， 而对正常人血清呈阴性反应。 因此， 我们确定 这些抗体配对所检测的血清角蛋白 19与肺癌高度相关。

1.7.2 初步确认最佳抗体配对实验

从上述交叉抗体配对实验中初选出 3对与肺癌角蛋白 19高度相关 的抗体配对 2G2/5H2-HRP, 5H2/2G2-HRP, 5H2/1D11-HRP，使用 ELISA 法进行临床 r证。 用 l g/ml的纯化抗体包被 96孔板， 4°C过夜， 然后 以含 3%BSA的 PBS室温下封闭 lh。 分别入 10份肺癌血清和 10份正 常人血清各 50μ1作为检测样本进行检测， 然后加入 50μ1的 1 :1000酶 标抗体。 37°C温育后洗涤， 加入显色底物， 避光 10分钟， 加入终止液， 在 450nm测量 OD值。 将检测数据作散点分布图 , 初步观察比较诊断 灵敏度及特异性， 见图 15。

结果显示， 2G2/5H ² _HRP检测中， 1 例肺癌血清检测值在正常人 血清检测值范围内，且其它肺癌血清检测值均 较高，以特异性 100%计， 灵敏度为 90%; 5H2/2G2-HRP检测中， 2例肺癌血清检测值在正常人 血清检测值范围内， 4例肺癌血清检测值偏低， 以特异性 100%计， 灵 敏度为 80%; 5H2/1D1 1 -HRP检测中， 4例肺癌血清检测值在正常人血 清检测值范围内， 且所有肺癌血清检测值较前两种检测均偏低， 以特 异性 100%计， 灵敏度为 60%; ； 所以， 2G2/5H2-HRP配对对血清的诊 断性能最佳。

1 .8 肿瘤相关角蛋白 19单克隆抗体的特征性研究

1.8.1 肿瘤相关角蛋白 19片段抗原决定簇的确定

为了进一步确定 2G2、 5H2 的抗原结合表位， 我们制备了一组重 组角蛋白 19片段, 这些片段带有每 50个氨基酸片段的缺失， 如表 2.4 所示。 采用间接 ELISA法测定抗体与这些抗原的结合活性。

(1) ELISA微孔板包被 l g/ml各种细胞角蛋白 19片段， 4°C过 夜；

(2) 用 PBS洗涤 3次， 用含 3% (w/v) BSA的 PBS封闭， 室温， lh;

(3) 微孔中加入检测抗体（终浓度 l g/ml ) ， 温育 lh， 37 °C ;

(4) 用 PBS洗涤 3次， 未结合抗体即被洗去。 然后加入连接 HRP 的抗 mouse IgG抗体（ g/ml) , 温育 30min, 37 °C ;

(5) 用 PBS洗涤 3次， 加入 TMB底物， 静置 10min， 然后加入 终止液 2N H ₂ S0 ₄ ; 在 ELISA酶标仪上检测样本孔 450 nm/650 nm光密 度。

表 2-4 抗原识别表位的确定

序号 抗原 2G2 5H2

CI aal ~ 400 + +

C2 aa50 ~ 400 + +

C3 aal00 ~ 400 + +

C4 aal50 ~ 400 + +

N5 aal ~ 375 - +

N6 aal - 350 - -

N7 aal ~ 300 - -

N8 aal ~ 250 _ _

aa 375 - 400 aa325 - 350 结果显示， 单抗 2G2结合抗原 1 ~ 4, 同时与所有 C端缺失片段呈 阳性反应。因此，单抗 2G2的抗原结合表位位于细胞角蛋白 19 aa 375 ~ 400的片段内。 单抗 5H2与所有的 N端缺失片段均呈阳性反应， 并且 与 1个 N端片段（aal ~ 375 )呈阳性反应， 与其它 3个 N端片段均呈 阴性反应。单抗 5H2结合表位为细胞角蛋白 19 aa 325 ~ 350的片段内。 单抗 2G2和单抗 5H2的结合表位如图 16所示：

1.8.2 杂交瘤分泌抗体的类型及亚类鉴定

以纯化角蛋白 19抗原包被 ELISA板。每孔加入各单克隆抗体的细 胞上清 ΙΟΟμ , 37°C温育 30min; 在 TEC AN全自动洗板机上用 PBST 洗涤 5次， 每次间隔 20秒， 扣干， 加入合适稀释度的 HRP-山羊抗小 鼠 IgM、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3抗体（Serotec公司）酶标二抗， 于 37°C温育 30min; 在 TECAN全自动洗板机上用 PBST洗涤 5次， 每 次间隔 20sec, 扣干， 加入显色液 A ( H ₂ 0 ₂ )和 B ( TMB )各 1滴， 于 37°C显色 10min， 加入 1滴终止液（ 2M H ₂ S0 ₄ )； 在 TECAN酶标仪上 测量 OD ₄₅₍₎ nm (参比波长为 620nm ) ， cutoff值为 2倍的阴性均值， OD 值大于 cutoff值为阳性， OD值小于 cutoff值为阴性。 结果表明 2G2为 IgG2a, 5H2为 IgGl。

1.8.3 特异性

为了检测单抗 2G2及 5H2的反应特异性， 我们检测其与其它人血 清肿瘤标记物的免疫结合强度。 首先将 K18、 K8、 K19、 CEA、 CA724 其他人血清肿瘤标记物按 l g/ml 包被 96 孔板， 4°C过夜， 然后以含 3%BSA的 PBS室温下封闭 lh。 检测时每孔加入 50μ1 1 :1000稀释的单 抗 2G2或 5Η2; 37°C温浴 30分钟， 用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后加 入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白（ HRP-GAM Ig， DAKO公司）， 37°C温浴 30分钟， 取出后用 PBST洗涤液洗 5遍， 拍干后先后加入底 物液 A、 B各 50μ1 (底物液 Α成分为： 13.42g Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 0 4.2g 柠檬酸 ·Η ₂ 0和 0.3g过氧化氢， 用去离子水中调节体积为 700ml; 显色 液 B成分为： 0.2g四曱基联苯胺、 20ml二曱基曱酰胺用去离子水中调 节体积为 700ml ) , 37°C显色 10分钟， 加入 50μ1终止液（ 2M H ₂ S0 ₄ ) 终止反应， 并于酶标仪上检测各孔的 OD ₄₅ 。值。 结果见图 17。

结果显示， 单克隆抗体 2G2、 5H2与 K19呈强阳性反应， 与其它 肿瘤标记物均呈阴性反应。 表明单克隆抗体 2G2、 5H2为角蛋白 19高 度特异的单克隆抗体。

2 角蛋白 19-2G2试剂盒的制备

角蛋白 19-2G2测定试剂盒（化学法发光法） 采用固相 96孔发光板 作为反应载体， 通过与肺癌相关的抗角蛋白 19的一对单克隆抗体构成 双抗体夹心法， 使用高敏感的化学发光检测技术对肺癌病人血 清中角 蛋白 19片段进行定量检测。

以 K19单抗 2G2作为包被抗体， 以 K19单抗 5H2作为标记抗体， 制备 K19试剂盒。

试剂盒主要组分为： 校准品、 包被板、 酶结合物、 发光液、 浓缩 洗涤液。

标准品为纯化的角蛋白 19。 包被抗体为 K19单抗 2G2。 标记抗体为 K19单抗 5H2， 以 HRP辣根过氧化物酶进行标记， 形成抗体 -HRP复合物 (酶结合物） 。

包被板是包被单抗 2G2, 经洗涤、 封闭、 干燥， 真空封装而成。 K19单抗 2G2以柠檬酸緩冲液 PH4.8为包被緩沖液， 以 5 g/mL的包 被浓度进行包被。 封闭液为 0.02M PBS+0.4%酪蛋白 +1%BSA+0.5M NaCl+0.2%明胶 +10%牛血清 +0.05%Tween-20+l %。防腐剂 +2.5%蔗糖。

标记抗体为 5H2-HRP。 稀释液为 0.02M PBS+0.4%酪蛋白

+ 1%BSA+0.5M NaCl+1 %。氨基比啉 +0.2%明 胶 +10%牛血清 +0.05%Tween-20。 发光液由将 KPL生产的发光液 A和发光液 B分装而成。 浓缩洗涤液 为 20 x PBS洗涤液。

3 临床验证和应用

在临床实验的统计分析过程中， 考虑到对治疗（化疗和手术）后处 于恢复期的患者， 血清中 K19的含量较治疗前会明显减少。 为了排除 治疗对试验结果的干扰， 在临床 1000例样本中选取 69例肺癌初诊患 者 （未经治疗）血清标本检测结果进行分析， 结果表明 K19试剂盒的 灵敏度为 88.4%， CYFRA21-1试剂盒的灵敏度为 52.17%， 见表 2-5。 表 2-5 K19试剂盒与 CYFRA21-1试剂盒对初诊肺癌患者诊断评 价指标比较

阳性预测值

诊断试剂 灵敏度％ 特异度％ 符合率％ 阴性预测值％

%

K19 88.41 97.50 95.17 92.42 96.06

CYFRA21 -1 52.17 95.50 84.39 80.00 85.27 在临床实验的统计分析过程中， 考虑到试剂盒对炎症等患者诊断 的假阳性率是影响诊断结果的重要因素。 本试验对 150例肺炎患者血 清样本进行对比试验，以比较 K19试剂盒和 CYFRA21-1试剂盒鉴别诊 断能力。 结果显示 K19 试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性率为 5.3%, CYFRA21-1试剂盒对炎症患者血清样本诊断假阳性 率为 12.0%。

K19试剂盒假阳性率低于 CYFRA21-1试剂盒， 见表 2-6。 检测结果表 明本试剂盒能将炎症患者血清与肺癌患者血清 很好的区分， 具有很好 的特异性。 表 2-6 炎症患者血清检测结果统计

检测结果

试剂盒 阳性 阴性 K19试剂盒 8 142

CYFRA21-1试剂盒 18 132 由图 18的 ROC曲线分析结果可知， 角蛋白 19-2G2试剂盒对应的 ROC曲线下面积（ 0.817 )大于罗氏公司的 CYFRA21-1试剂盒对应 ROC 曲线下所围面积 （ 0.766 ) ， 角蛋白 19-2G2 试剂盒诊断肺癌效果优于 CYFRA21-1试剂盒。

在中国医学科学院肿瘤医院进行的预实验中， 选择癌症患者血清 241例， 其中肺癌 84例， 胃癌 76例， 肠癌 81例， 阴性对照 61例， 正 常人体检血清 61 例进行临床验证预实验。 结果如表 2-7，表明角蛋白 19-2G2测定试剂盒（化学发光法）对其它上皮源 肿瘤也具有较高的检 出率。

K19对各种癌症鉴别诊断结果

癌种 灵敏度 (％) 特异度(％) 肺癌 75 90

胃癌 63 90

肠癌 62 90