발명의명칭:바이러스중화항원단백질발현을� �한보르데텔라 백일해균주및이를이용한면역원성조성물 기술분야

[1] 본발명은바이러스중화항원단백질발현을위한 보르데텔라백일해균주및 이를이용한면역원성조성물에관한것으로,상� �하게는 Fim2유전자에서 인플루엔자해마글루티닌을발현하는보르데텔 라백일해균주，이를포함하는 면역원성조성물과상기보르데텔라백일해균주 를제조하는방법에관한 것이다.

배경기술

[2] 인플루엔자바이러스 A(Influenzavirus A)형은돌연변이 (drift)나

유전체분절교환 (shift)에의해새로운항원변이주가출현하기쉽� �인간집단에 변이항원에대한항체보유율이낮은경우바이러 스대유행을일으킨다.상기 바이러스는상기도점막에침입하여호흡기질환 을일으키는단일가닥 (single strand) RNA바이러스로오르소믹소비리데 (Ortftomyjcovi dije)에속한다.

유전체는 8분절로구성되어있으며，이중표면당단백질� �하나인

헤마글루티닌 (hemagglutinin or haemagglutinin, HA)은인플루엔자의구형표면에 부착되어뉴라미니다제 (neuraminidase, NA)와함께아형 (subtype)을결정하는 단백질이다.국내에서는돼지유래의아형에의� �돌연변이발생으로인해 신종인플루엔자바이러스가발병하였으며，현 재까지해마다유행되는바이러스 백신주를선정하여흔합된예방백신을접종하고 있는실정이다.현재판매되는 독감백신은유정란을이용하여바이러스배양및 불활화를통한제 1세대백신 생산법을사용하고있어생산에수개월이소요되 며새로운형태의바이러스가 발생할경우예방의의미가없다.또한가격이고� �이다보니다수의인원이백신 접종을하는데있어경제적인어려움이있을수있 다.

[3] 백일해는그람음성간구균인보르데텔라백일해 (BordeteHa pertussis, BPS)에 의해전염되며，주로유아나어린이에게전염성 이높은호흡기감염질환이다. 백일해는심한경련성기침이오래지속되는특징 이있고,모체로부터 수동적으로받는면역을기대할수없어영아에서 의발병은중증을나타내며, 치사율도높아전체사망자의약 80%가생후 1년이내의영유아이자 90%이상의 치사율을나타낸다.국내에서는 1954년전염병예방법에의하여정기적으로 예방접종을해야하는질환으로지정되었으며， 1958년부터국내에서는

디프테리아,파상풍,백일해흔합백신 (DTP)의사용이시작되어현재까지 추가접종을포함한 3회의기본접종이이루어지고있다.기존상용화� ��신의 경우, 1960년대증반부터접종후발열，식욕감퇴,심한� ��챔，경련등과같은 전신적부작용및뇌중에의한중증의부작용이점 차문제화되기시작하였으며, 이를극복하기위한여러연구가진행되어 1979년성분백신이포함된 디프테리아-무세포성백일해 (acellular Pertussis)-파상풍 (DaPT)백신이일본에서 개발되어국내에도입된후현재까지전국적으로 사용되고있다.현재

국내에서는보르데텔라백일해백신에인플루엔 자를접목하여백신을구성한 경우는없는실정이다.

발명의상세한설명

기술적과제

[4] 본발명에서는상기문제점의해결을위해보르데 텔라백일해의표면구조

단백질인 Fimbriae를이용하여상기단백질의유전자좌에다� ��바이러스

병원체의항원성단백질을코딩하는유전자를도 입하여발현시킴으로써 보르데텔라백일해뿐만아니라상기항원성단백 질로발현되는해당바이러스 병원체의감염에대해서도방어효과가있는다가 (multivalent)생백신을

개발하고자하였다.

과제해결수단

[5] 본발명은서열번호 1의염기서열을갖는보르데텔라백일해의 Fim2유전자의

N-말단 100내지 140 mer와 C-말단 100내지 140 mer,바람직하게는각각 120 mer, 사이에이종항원단백질유전자를삼입한구조를 갖는재조합유전자를 포함하는약독화또는사독화된보르데텔라백일 해 pertussis)균주에 관한것이다.

[6] 본발명에서상기이종항원단백질유전자는제한 되지는않으나인플루엔자 바이러스유래헤마글루티닌 (HA)일수있다.본발명에서상기해마글루티닌은 제한되지는않으나서열번호 2의염기서열을갖을수있다.

[7] 인플루엔자바이러스는단편화된음성가닥의 RNA바이러스이고

Orthomyxoviridae족에속한다.인플루엔자 A바이러스는 9개의단백질로

구성되고조절기능을갖는하나의비구조적인 NS 1단백질을추가로

암호화한다.상기비구조적인 NS1단백질은재생주기동안에다량으로 합성되고감염세포의세포질 (cytosol)및핵에집중된다.이바이러스게놈의 단편화된특성으로인해，여러가지바이러스균 주들에의한세포의혼합감염 동안에유전자재배열 (게놈단편들의교환)의기작이일어날수있다.

인플루엔자 A바이러스는그표면상에나타난여러가지해마� �루티닌 (HA)및 뉴로아미니다제 (NA)바이러스단백질에따라여러가지아형들로� �욱

분류된다.인플루엔자 A바이러스아형은두개의바이러스당단백질，� � 해마글루티닌 (HA또는 H)및뉴로아미니다제 (NA또는 N)에의해확인된다. 각각의인플루엔자바이러스아형은 H및 N단백질의조합에의해확인된다. 18종의 HA아형및 11종의 NA아형이알려져있다.인플루엔자 A형바이러스는 사람,조류,돼지,말및기타동물들을감염시킬수 있으나,야생조류는이러한 바이러스에대한천연숙주이다.단지일부종의� �플루엔자 A아형 (즉， H1N1, H1N2,및 H3N2)이오늘날사람들사이에전파되고있지만, 18 HA및 11 NA 아형들의모든조합은조류，특히야생물새및도 요새에서확인되어왔다.

게다가, H5및 H7인플루엔자바이러스가인간질병을유발할수� ��있다는 증거가계속확인되고있다.인플루엔자 A바이러스의 HA는두개의구조적으로 특이한영역,즉，구형머리영역및줄기영역을� �함한다.구형머리영역은 표적세포에의바이러스부착을초래하고 HA의헤마글루틴화활성에관여하는 수용체결합부위를포함한다.줄기영역은바이� �스외피 (envelope)와세포의 엔도솜막 (endosomal membrane)사이의막융합에필수적이어서융합활성 에 관여하는융합단백질을포함한다. 또한본발명은상기보르데텔라백일해균주를포 함하는감염증치료또는 예방용면역원성조성물에관한것이다.

본발명에서상기감염증은제한되지는않으나인 체로의이종항원병원체 감염증또는보르데텔라백일해감염증일수있다 . 또한본발명은서열번호 1의염기서열을갖는보르데텔라백일해의 Hm2 (fimbriae 2)유전자의 N-말단 100내지 140 mer와 C-말단 100내지 140 mer, 바람직하게는각각 120 mer,사이에이종항원단백질유전자를삽입하여 상동재조합용인서트를제조하는단계;및상기� �서트를보르데텔라백일해에 형질전환하는단계;를포함하는보르데텔라백� �해 (Bor^½Zto pertussis)균주의 제조방법에관한것이다.

본발명에서상기이종항원단백질유전자는제한 되지는않으나인플루엔자 바이러스유래헤마글루티닌 (HA)일수있다.

본발명에서상기헤마글루티닌은제한되지는않 으나서열변호 2의

염기서열을갖을수있다.

본발명에서상기인서트는제한되지는않으나도 2에나타난 2개의제한효소 ( BgHl+Kpnl)로자른 linearized DNA를이용할수있다.

본발명의실시예를통해제작한인플루엔자바이 러스유래해마글루티닌을 포함하는재조합단백질은형질전환된보르데텔 라백일해균주를 2x시료 완층액을첨가하여변성한후 10% SDS-PAGE에서전기영동을실시하고상기 전기영동결과물을 PVDF막에단백질을옮긴후，별도로대장균에서� �현시킨 재조합 Fim2및재조합헤마글루티닌을토끼에접종하여� �산한토끼-항 -Fim2와 토끼항 -해마글루티닌다클론항체를 1차항체로사용한후염소항 -토끼 IgG HRP접합된항체를 2차항체로사용하여순수분리함으로써약 37 kDa의크기를 갖는재조합단백질이형성되어분리되었음을확 인할수있었다. 또한본발명은서열번호 1의염기서열을갖는보르데텔라백일해의 Fim2 유전자의 N-말단 100내지 140 mer와 C-말단 100내지 140 mer,바람직하게는 각각 120 mer，사이에이종항원단백질유전자를삽입하여 상동재조합용 인서트를제조하는단계；상기인서트를보르데 텔라백일해에형질전환하는 ' 단계;상기형질전환된보르데텔라백일해를배� �하여상기이종항원단백질을 발현하는단계;및상기변이주를이용하여사균� �신을만드는단계;및상기 사균백신을동물내로면역후면역여부를판단하 는단계;를포함하는

면역확인방법에관한것이다.

[19] 상기면역여부를판단하는단계에서면역효과가 있음을검증하기위해서는 본원발명의일실시예와같이상기형질전환된변 이주를이용하여사균백신을 제조하고이를실험동물에투여한후，혈액을채 취하여혈청을분리하고 ELISA 방법으로 Fim2나헤마글루티닌에대한혈증의 IgG를음성대조군과비교하여 항체의생성여부를확인하였으며，항체가성공 적으로형성되었음을확인할수 있었다.

[20]

[21] 또한본발명은서열번호 1의염기서열을갖는보르데텔라백일해의 Fim2

유전자의 N-말단 100내지 140 mer와 C-말단 100내지 140 mer,바람직하게는 각각 120 mer，사이에이종항원단백질유전자를삽입하여 상동재조합용 인서트를제조하는단계;상기인서트를보르데� �라백일해에형질전환하는 단계;상기형질전환된보르데텔라백일해를배� �하여사균백신을제조하는 단계;상기제조된사균백신을인간을제외한동� �내로면역후면역여부를 판단하는단계;및살아있는인플루엔자바이러� �를상기면역된동물내로 투여한후방어여부를판단하는단계;를포함하� �방어확인방법에관한것이다.

[22] 상기방어여부를판단하는단계에서인플루엔자 바이러스에대한방어효과가 있음을검증하기위해서는본원발명의일실시예 와같이면역이확인된 동물에게살아있는인플루엔자바이러스를감염 시키고그동물조직으로부터 RNA를추출하고 cDNA를합성하여정량적실시간증합효소연쇄반� �을 시행하고이를음성대조군과비교하여상기순수 분리된단백질을투여한 실험군이블활화한인플루엔자바이러스를투여 한양성대조군과비교하여 바이러스 RNA의양이유사하게감소하고음성대조군에비해 서는월등히 감소함을측정함으로써효과적인방어효과가있 음을확인할수있었다.

발명의효과

[23] 본발명의보르데텔라백일해균주를통한형질전 환결과이종항원단백질을 발현하는사균백신 (killed whole cell vaccine)으로활용효과가높을것으로 기대되며,보르데텔라백일해균주의화학약품� �처리및층분리를이용한 성분백신 (acellular vccine)으로써활용가능할것으로기대된다.

[24] 상기균주를포함하는면역원성조성물은인체내 투여시보르데텔라백일해에 대한감염증은나타나지않으며，중화항체를유 발하는바이러스유래이종항원 단백질발현을통해예방백신또는치료용균주로 사용이가능할것으로 기대된다.

도면의간단한설명

[25] 도 1은 PCR증폭결과로레인 1은해마글루티닌의증폭결과，레인 2는 Fim2 유전자의 N-말단및 C-말단부위의증폭결과 , Μ은 100 bp마커이다.

[26] 도 2는 Fim2유전자의 N-말단 120 mer와 C-말단 120 mer,인플루엔자

바이러스의해마글루티닌단백질을코딩하는유 전자를클로닝한후이를 연결하여하나의상동재조합용인서트로사용하 는것을나타내는모식도이다.

[27] 도 3은 3개의유전자좌의치환여부검증을위한 PCR모식도이다.

[28] 도 4는 PCR결과로,레인 1은 Fim2유전자의 N-말단 -헤마글루티닌의증폭결과

(0.95 kb),꿰인 2는헤마글루티닌의증폭결과 (0.83 kb),레인 3은

헤마글루티닌 -Fim2유전자의 C-말단의증폭결과 (0.95 kb)이며， M은 100 bp 마커이다.

[29] 도 5는헤마글투티닌단백질의발현여부를 Fim2에대한다클론항체를

이용하여측정한웨스턴블롯결과이다.레인 1은야생형보르데텔라백일해 (23 kDa),레인 2는본발명의해마글루티닌을발현하는변이주� �르데텔라백일해 (37 kDa),레인 3은양성대조군으로대장균내에서발현된 Fim2의재조합항원 (30 kDa)이다.

[30] 도 6은헤마글루티닌단백질의발현여부를헤마글� �티닌에대한다클론

항체를이용하여측정한웨스턴블롯결과이다.� �인 1은야생형보르데텔라 백일해 (밴드가없어야함)，레인 2는본발명의헤마글루티닌을발현하는변이주 보르데텔라백일해 (37 kDa),레인 3은양성대조군으로대장균내에서발현된 헤마글루티닌의재조합항원 (35 kDa)이다.

[31] 도 7은보르데텔라백일해변이주에서 Fim3의구조에영향이있는지를 Fim3에 대한다클론항체를이용하여측정한웨스턴블롯 결과이다.레인 1은야생형 보르데텔라백일해 (23 kDa),레인 2는본발명의헤마글루티닌을발현하는 변이주보르데텔라백일해 (23 kDa),레인 3은양성대조군으로대장균내에서 발현된 Fim3의재조합항원 (35 kDa)이다.

[32] 도 8은본발명의변이주보르데텔라백일해균주를� �르말린처리및부형제와 흔합된백신으로면역한그룹 (중간)의혈중면역글로블린 G(IgG)의항체가와 양성대조군으로불활화시킨 H1N1바이러스를접종한그룹 (회색)의혈중 IgG 농도를나타낸그림이다.음성대조군으로 PBS (검정색)만접종한그룹를 사용하였다.

[33] 도 9는면역후인플루엔자바이러스에감염되었을� �의방어효과를나타내는 실시간증합효소연쇄반응 (real-time PCR)의 threshold cycle (Q)의변화를 나타내는결과이다.

[34] 도 10은도 9의결과로부터계산한상대적인바이러스의양� �정량적으로

나타낸것이다. 발명의실시를위한최선의형태

[35] 이하본발명을실시예를참조하여상세히설명한 다.그러나이들은본발명을 보다상세하게설명하기위한것으로,본발명의� �리범위가하기의실시예에 의해한정되는것은아니다.

[36]

[37] [실시예 1]인플루엔자바이러스의헤마글루티닌 (HA)을발현하는약독화된 보르데텔라백일해균주제조

[38] 공시규주 폴라스미드

[39] 대장균 (Escherichia coli) JM 109 (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)

[40] pGEM-T easy백터 (Promega; Madison, WI, USA)

[41] Red헬퍼플라스미드 pKD46 (Datsenko and Wanner, 2000): pBAD프로모터를 이용하여 Red, Gam단백질을생산하는백터

[42] 보르데텔라백일해 (Bordetella pertussis)표준균주 Tohama I ATCC#B AA-589) [43] 인플루엔자바이러스 A/PR/8/34(HlNl) (VR1469): American Type Culture

Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).

[44]

[45] 오펴래핑 ^overlapping) PCR

[46] 1) Fim2및헤마글루티닌의 PCR을위한프라이머

[47] Fim2 (GenBank #BX640414)의 N-말단,인플루엔자바이러스의

해마글루티닌 (GenBank #EF467821)및 Fim2 C-말단의증폭을위해하기표 1과 같이정방향및역방향프라이머를제작하여사용 하였다.인플루엔자 헤마글루티닌의클로닝을위한주형을만들기위 해바이러스로부터 TRIzol ^® reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를이용하여 total RNA를추출하고 Superscript ΠΙ One-step RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 cDNA 합성용프라이머 Uni- 12-F (표 1)를이용하여 cDNA를합성하였고이를 PCR 클로닝용주형으로사용하였다.

[48] [Table 1]

[50] 각프라이머세트에대해 PCR은 94 °C에서 5분간예비변성， 94 °C에서 30초 -57 0C에서 30초 -72 °C에서 1분간 30사이클을실시하고,최종연장을 72 °C에서 5분간실시하였다.각 PCR산물을 1.2%아가로스겔에로딩하여전기영동을 실시하였다 (도 1).

[51] 상기증폭된각각유전자에대한 PCR산물에서， Fim2 N-말단과해마글루티닌 PCR산물을이용하여오버래핑 PCR산물 1을제작하였다. PCR은 94 °C에서 30초 -57 °C에서 30초 -72 °C에서 1분간 15사이클을실시한후， Fim2-N-F 프라이머와 HA-R프라이머를넣고 94 °C에서 5분간예비변성， 94 °C에서 30초 -57 °C에서 30초 -72 °C에서 1분간 30사이클을실시하였다.

[52] 상기와같이제작된오버래핑 PCR산물 1과 Fim2 C-말단 PCR산물을이용하여 오버래핑 PCR산물 1제작과동일한조건으로 PCR을실시하여오버래핑 PCR 산물 2를제작하였다.

[53] 상기 PCR산물을 pGEM-T Easy클로닝백터내로클로닝하고,도 2에서와같이 제한효소 g II와 wl을이용하여절단후,준비된 1.07 kb의 DNA를

상동재조합용선형 DNA인서트로사용하였다.

[54]

[55] 상동지ᅵ조합을통하 Fhn2유저자좌로의산

[56] 보르데텔라백일해균주를 Bordet-Gengou blood agar (BBL™, 297876, BD, USA)에 37°C에서배양하고，상기균주콜로니를 Stainer-Scholte(SS) 브로스 (broth) 5 mL에접종하여 OD ₆₀₀ 값이 0.5가될때까지 37°C에서배양하고， 얼음위에서 20분간냉각한후 , 4000 x g에서 15분간원심분리하여균의 펠릿 (pellet)을회수하였다.이를냉각된 10%글리세롤 (Sigma, USA) 100 로 농축하여전기천공용컴피턴트세포 (competent cell)를제조하였다.상기 균체에서 Red리콤비나제 (recombinase)를발현하기위해 pKD46플라스미드를 Gene Pulser Xcell전기천공시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을이용하여

형질전환한후，최종농도 10 mM의암피실린 (ampicillin; Sigma, USA)과

L-아라비노스 (L-arabinose; Sigma, USA)가첨가된 Stainer-Scholte(SS)브로스에서 선택후， 30 °C에서 OD _6∞ 값이 0.5가될때까지배양하였다.이후다시넁각된 10%글리세롤 (Sigma, USA) 100 로농축하여，먼저제조된상동재조합용선형 DNA를형질전환하기위한일렉트로컴피턴트세포 를제조하였다.

[57] 50 μί의일렉트로컴피턴트세포에 l iL의인서트 DNA를전기천공법으로 형질전환한후， Bordet-Gengou blood agar에서배양하여이종항원으로 헤마글루티닌을발현하는변이주 "BPS-Fim2-HA"를선별하였다.

[58]

[59] [실시예 2]헤마글루티닌치환확인

[60] 상기실시예 1을통한형질전환후선택배지에서생존한 BPS-Fim2-HA의

검증을위해 PCR검증을실시하였다.도 3과같이 3종류의프라이머세트를 이용하여 , PCR검증 1번은 Fim2-N-F및 HA-R프라이머， PCR검증 2번은 HA-F 및 HA-R프라이머， PCR검증 3번은 HA-F및 Fim2-C-R프러이머를이용하여 각각 0.95 kb, 0.83 kb및 0.95 kb의 PCR산물의증폭을얻었는지검증하였다.

[61] 그결과도 4의결과로부터각 PCR검증에기대되는크기의 PCR산물이

생성되었음을확인하였다.

[62]

[63] [실시예 3]이종항원단백질인헤마글루티닌 (HA)이포함된단백질의발현 확인

[64] 변이균주인 BPS-Fim2-HA배양액 1 mL을 4000 x g에서 15분간원심분리하여 균펠릿을준비하고 2x시료완충액 (0.125M Tris (pH 6.8), 4% SDS, 20%글리세롤 10% 2-mercaptoethanol, 0.2% bromo-phenol-blue; Sigma, US A)을첨가하여변성한 후 10% SDS-PAGE에서전기영동을실시하였다.상기전기영 동결과물을 PVDF막 (Westeran ^® , Whatman™, GE Healthcare, UK)에단백질을옮긴후 대장균에서발현된재조합 Fim2및대장균에서발현한재조합헤마글루틴을 토끼에접종하여생산한토끼-항 -Fim2와토끼 -항-헤마글루티닌다클론항체를 1차항체로,염소항 -토끼 IgG HRP접합된항체 (Pierce, USA)를 2차항체로 사용하여헤마글루티닌단백질의발현여부를확 인하였다.

[65] 그결과，도 5및도 6 (각각 lane 2)으로부터 37 kDa의단백질에대한밴드가 형성됨을확인함으로써헤마글루티닌이포함된 단백질의발현을확인하였다. [67] Fim3 (fimbriae 3)에 대하구조적 변이유발여부확이

[68] 상기실험과동일한조건에서대장균에서발현된 재조합 Fim3를토끼에

접종하여생산한토끼-항 -Hm3다클론항체를 1차항체로사용한후,염소 항 -토끼 IgG HRP접합된항체 (Pierce, USA)를 2차항체로사용하여 Fim2 유전자좌의변화로인해정상적인 Fim3의발현이영향을받는지알아보기위해 Fim3의정상적인발현여부를확인한결과도 7과같이 Fim3의발현에는영향을 주지않았음을알수있었다.

[69]

[70] [실시예 4] BPS-Fim2-HA사균백신제조

[71] 실험동물인마우스내에서의면역효과검증을위 해상기실시예를통해

제조한변이주 BPS-Fim2-HA를이용하여사균백신을제조하였다.

[72] 상기실시예를통해제작한균주를 Stainer-Scholte(SS)브로스 (broth)에서

배양하고， 4000 X g에서 15분간원심분리한후, PBS로재부유후 formalin을 최종농도 0.2%가되도록포함하여 37°C, 48시간이상반웅한후 killed-bacterial cell을준비하였다.항원인식을위한아쥬반트로� �� Alum ^® (Imject Alum, Pierce, Rockford, IL, USA)과 1:1-1:3의비율로혼합준비하였다. 1회접종되는전체 균수는재조합헤마글루티닌을마우스당 50ug이접종될수있도록정량하여 상웅하는 cell수인 lxlO ⁹ cells/마우스로접종하였다.

[73]

[74] [실시예 5]제조된사균백신을이용한마우스에서의면역� ��과검증

[75] 5주령 ICR마우스 (DBL,대한민국)피하내로상기실시예를통해준비 한

사균백신을주사하였다.이를위하여실험군을 3그룹으로나누어상기준비된 사균백신접종군，음성대조군으로 PBS접종군및양성대조군으로불활화한 인플루엔자바이러스접종군을구성하였다.

[76] 항원면역은 2주간격으로총 3회실시하였고，각마우스군의동일위치의

미정맥에서혈액을채취하여혈청을분리하였다 .혈액채취는실험전，면역후

7일간격으로총 3회실시하였고,증류수로 1:100으로희석한후

효소면역측정법 (ELISA)으로혈중의면역글로불린 G(IgG)를비교하였다.

[77] 상기 IgG의비교결과음성대조군과비교하여 21일과 35일에항체가가

유도됨을확인하였다 (도 8).

[78]

[79] [실시예 6]사균백신을이용한마우스에서의방어효과검� ��

[80] 상기실시예 5의면역효과확인후인플투엔자바이러스감염� �방어효과를 확인하기위해실시예 5에서면역측정이완료된마우스에준치사량 (sublethal dose; 500 pfu/mouse, 40 LD ₅₀ , 10 ^{4 1} EID ₅₀ )의인플루엔자바이러스

A/PR/8/34(HlNl)를비강내로투여하여감염시켰다.� �염후 5일뒤，

마우스로부터폐조직을분리하고，이로부터 TRIzol ^® reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, US A)를이용하여 total RNA를추출하고 Superscript III One-step RT-PCR system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과프라이머 Uni-1 ² -F (표 ¾를이용하여 cDNA를합성하였다.상기 cDNA를주형으로하고표 2에나오는프라이머를 사용하여정량적실시간증합효소연쇄반웅 (real-time quantitative PCR;

Exicycler™ 96, Bioneer,대한민국)을실시하였다.바이러스의 RNA는그에 준하는 cDNA양으로해석되고 cDNA의양은바이러스의실제농도와비례할 것이므로정량 PCR에서의검출농도는바이러스의양으로해석될 수있다. 바이러스유래 RNA,즉 cDNA의검출에는해마글루티닌유전자부위와 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), M protein유전자부위를 target으로하여 실시하였다.시료에쓰인조직의양에따라 total RNA의양이영향을받기때문에 상대적인정량의확인을위한베타 -액틴유전자의 RNA를비교군으로하여 검출되는바이러스 RNA양을간접해석하였다.

[81]

[82] [Table 2]

[83]

[84] 그결과도 9에서확인할수있는바와같이 threshold cycle을통한 delta(Ct)값 o 10-13사이클의차이를나타내는것을확인하였다. PCR에서의 1 cycle의차이는 2배의농도차가나므로 10-13사이클의차이는 2 ^t0 -2 ¹³ (1024배 -8192배)의 농도차가나는것으로해석된다.이를바이러스 RNA양에대한상대적인정량 비교를실시한결과，도 10에서확인할수있는바와같이，음성대조군에� ��해 유의하게감소하였음올확인하였고,양성대조� �인불활화한인플루엔자 바이러스를면역한그룹과유사한값을나타냄을 확인하였다.

[85]

[86] 상기결과로부터，본원발명의변이된보르데텔 라백일해균주는본래가지고 있던병원체의원형은유지하면서이종항원인인 플루엔자바이러스의 헤마글루티닌 (HA)단백질을발현할수있는균주임을확인하였� �.

[87] 또한상기균주에서발현되는이종항원단백질을 포함하는사균백신을통해 확인한면역및방어효과결과로부터，인플루엔 자바이러스감염에대한예방 또는치료효과를가지며，발명된균주는이러한 이종항원단백질운반체로 사용될수있음을확인하여본발명을완성하였다 .

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[89] 서열목록은서열목록파일로첨부하였다.