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Patent Searching and Data


Title:
BRANCHED POLYALKYLENE GLYCOL DERIVATIVE, PHOTOSENSITIVE COMPOSITION, CROSSLINKED MATERIAL, AND SUBSTRATE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2009/072590
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed is a substrate comprising a base material and a crosslinked material arranged on the base material, wherein the crosslinked material comprises a branched polyalkylene glycol derivative having: three or more polyalkylene glycol groups each having a polymerizable substituent at the terminal; and a linkage group having a valency of 3 or more and capable of binding to the polyalkylene groups. The substrate can be patterned with a high degree of accuracy and can keep the unadhered state of a cell thereon stably for a long term.

Inventors:
OTSUKA, Hidenori (1-3 KagurazakaShinjuku-k, Tokyo 01, 1628601, JP)
大塚 英典 (〒01 東京都新宿区神楽坂一丁目3番地 学校法人東京理科大学内 Tokyo, 1628601, JP)
SATOMI, Tomomi (ATRIUM-T ANNEX 204, 6-21-5 Kitamachi, Nerima-k, Tokyo 81, 1790081, JP)
Application Number:
JP2008/072123
Publication Date:
June 11, 2009
Filing Date:
December 05, 2008
Export Citation:
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Assignee:
TOKYO UNIVERSITY OF SCIENCE EDUCATIONAL FOUNDATION ADMINISTRATIVE ORGANIZATION (1-3 Kagurazaka, Shinjuku-ku Tokyo, 01, 1628601, JP)
学校法人東京理科大学 (〒01 東京都新宿区神楽坂一丁目3番地 Tokyo, 1628601, JP)
OTSUKA, Hidenori (1-3 KagurazakaShinjuku-k, Tokyo 01, 1628601, JP)
大塚 英典 (〒01 東京都新宿区神楽坂一丁目3番地 学校法人東京理科大学内 Tokyo, 1628601, JP)
International Classes:
C08G65/329; C08F299/02; C12M3/00; G03F7/008; G03F7/027
Domestic Patent References:
WO2003010302A1
Foreign References:
JP2004054085A
JP2003249266A
Other References:
SATO Y ET AL.: 'Synthesis and evaluation of PEG hydrogel incorporating two dimensionally dispersed cell spheroid' TRANSACTIONS OF THE MATERIALS RESEARCH SOCIETY OF JAPAN vol. 32, no. 3, 24 October 2007, pages 773 - 776
KATRITZKY A R ET AL.: 'Ciaramitaro D A, Preparation and characterization of 1,2,3- triazole-cured polymers from endcapped azides and alkynes' JOURNAL OF POLYMER SCIENCE, PART A: POLYMER CHEMISTRY vol. 46, no. 1, 21 November 2007, pages 238 - 256
FERNANDEZ-MEGIA E ET AL.: '''Clickable'' PEG-Dendritic Block Copolymers' BIOMACROMOLECULES vol. 7, no. 11, 2006, pages 3104 - 3111
HIDENORI OTSUKA ET AL.: 'Kobunshi Hyomen no Patterning Gijutsu to Spheroid Alloy' FUNCTION & MATERIALS vol. 27, no. 11, 05 October 2007, pages 61 - 69
Attorney, Agent or Firm:
NAKAJIMA, Jun et al. (TAIYO, NAKAJIMA & KATO Seventh Floor,HK-Shinjuku Bldg.,3-17, Shinjuku 4-chom, Shinjuku-ku Tokyo 22, 1600022, JP)
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Claims:
 末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の3以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する3価以上の連結基と、を有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 前記ポリアルキレングリコール基の4以上を有する請求項1に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 前記ポリアルキレングリコール基は、下記一般式(1)で表される請求項1又は請求項2に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 
[式中、X 1 は重合性置換基を表し、mは2~4の整数を、nは5~1000の整数をそれぞれ表す]
 下記一般式(2)で表される請求項1~請求項3のいずれか1項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 
[式中、L 2 は単結合又はメチレン基を表し、pは1又は2を表し、qは1~70の整数を表す。R 2 は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す]
 前記重合性置換基は、下記一般式(3)及び一般式(4)の少なくとも1種で表される置換基である請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 
[式中、L 3 は単結合又は2価の連結基を表し、L 4 は2価の連結基を表し、R 3 は水素原子又は炭素数1~3のアルキル基を表す]
 前記重合性置換基の少なくとも1つは、下記一般式(5)で表される置換基である請求項1~請求項5のいずれか1項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
 
[式中、L 5 は単結合又は2価の連結基を表し、R 5 は置換基を表し、iは1又は2を表す]
 請求項1~請求項6のいずれか1項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物。
 請求項7に記載の感光性組成物を硬化させて形成された架橋体。
 基材と、前記基材上に配置された請求項8に記載の架橋体とを含む基板。
 前記基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも1種で表面処理された基材である請求項9に記載の基板。
 前記基材は、細胞接着性タンパク質で表面処理された基材である請求項9または請求項10に記載の基板。
Description:
分岐ポリアルキレングリコール 導体、感光性組成物、架橋体及び基板

Technical Field
 本発明は、分岐ポリアルキレングリコール 導体、感光性組成物、架橋体及び基板に関 る。

Background Art
 近年の細胞工学の発展および再生医療への 目と相まって、生体外にて細胞を適切な形 培養し、治療への応用および生体反応のシ ミレーターとして使用する試みが現在活発 行われている。このような目的において、 養される細胞は各種臓器機能の担い手であ 実質細胞が中心であるが、一般に生体外に 実質細胞の機能を維持した状態で長期の培 を行うことは困難であり、この点を解決す ための様々な試みがなされている。

 例えば、多数の細胞の三次元的凝集状態 作って培養を行うスフェロイド(細胞凝集塊 )培養系は、細胞極性および細胞間相互作用 維持という観点から、生体外における優れ 実質細胞培養系として、様々な報告がなさ ており、膵細胞、骨芽細胞、肝細胞、など 種の細胞に適用された例が存在する。いず も単層培養系とは異なった生物学的応答を し、分化マーカーが高レベルで維持されて る例も報告されている。

 スフェロイド形成の手法としては、細胞接 性U字底を有する96穴プレートに細胞数を定 て細胞を播種することによってサイズをコ トロールしたスフェロイドを形成する手法( 例えば、非特許文献1参照)や、温度感応性高 子と細胞接着性物質からなる培養基材を用 る手法(例えば、特許文献1参照)などが報告 れている。また、プラズマエッチングによ フォトリソグラフィーを用いて、細胞非接 性表面上、数十~数百マイクロのサイズを有 する細胞接着性マイクロドメインを有する培 養基材を作製し、その基板上にスフェロイド を形成する手法(例えば、特許文献2参照)が知 られており、高い効率でスフェロイドを形成 可能とされている。
 一方、光架橋により親水性で生体適合性の い表面コーティングを形成可能な感光性樹 が知られている(例えば、特許文献3及び4参 )。

特開平7-31464号公報

特開2006-67987号公報

特開2006-307184号公報

特開2007-269973号公報 Yamauchi et al.J.Reprod.Dev.47(2001)165-171

Disclosure of Invention
 しかしながら、特許文献1や非特許文献1に 載の方法ではスフェロイド形成の培養面積 たりの効率が極めて低いという問題点があ た。また特許文献2に記載の方法では、基板 作製する工程が複雑であり、細胞非接着性 面の環境安定性が不十分であるという問題 があった。更に特許文献3又は4に記載の感 性樹脂では、細胞非接着性表面の経時安定 が不十分であるという問題点があった。
 本発明は、高精度にパターニング可能で、 胞の非接着状態を経時安定的に維持可能な 水性領域を有する基板、該親水性領域を形 する架橋体、並びに該架橋体を形成可能な 光性組成物及びそれに含まれる分岐ポリア キレングリコール誘導体を提供することを 題とする。

 本発明の第1の態様は、末端に重合性置換 基を有するポリアルキレングリコール基の3 上と、前記ポリアルキレングリコール基と 合する3価以上の連結基と、を有する分岐ポ アルキレングリコール誘導体である。前記 リアルキレングリコール基は4以上であるこ とが好ましく、前記ポリアルキレングリコー ル基は、下記一般式(1)で表されることがより 好ましい。

 

[式中、X 1 は重合性置換基を表し、mは2~4の整数を、nは5 ~1000の整数をそれぞれ表す]

 また、本発明の分岐ポリアルキレングリ ール誘導体は下記一般式(2)で表されること 好ましい。

 

[式中、L 2 は単結合又はメチレン基を表し、pは1又は2を 表し、qは1~70の整数を表す。R 2 は末端に重合性置換基を有するポリアルキレ ングリコール基又は末端に水酸基を有するポ リアルキレングリコール基を表す]

 前記重合性置換基は、下記一般式(3)及び 般式(4)の少なくとも1種で表される置換基で あることが好ましく、前記重合性置換基の少 なくとも1つは、下記一般式(5)で表されるこ がより好ましい。

 

[式中、L 3 は単結合又は2価の連結基を表し、L 4 は2価の連結基を表し、R 3 は水素原子又は炭素数1~3のアルキル基を表す ]

 

[式中、L 5 は単結合又は2価の連結基を表し、R 5 は置換基を表し、iは1又は2を表す]

 また本発明の第2の態様は、前記分岐ポリア ルキレングリコール誘導体を含有する感光性 組成物である。
 また本発明の第3の態様は、前記感光性組成 物を硬化させて形成された架橋体である。

 更に本発明の第4の態様は、基材と、前記 基材上に配置された前記架橋体とを含む基板 である。前記基材は、アミノ基を有するシラ ンカップリング剤、エチレン性不飽和基を有 するシランカップリング剤、及びポリリジン から選ばれる少なくとも1種で表面処理され 基材であることが好ましく、前記基材は、 胞接着性タンパク質で表面処理された基材 あることがより好ましい。

 本発明によれば、高精度にパターニング 能で、細胞の非接着状態を経時安定的に維 可能な親水性領域を有する基板、該親水性 域を形成する架橋体、並びに該架橋体を形 可能な感光性組成物及びそれに含まれる分 ポリアルキレングリコール誘導体を提供す ことができる。

Brief Description of Drawings
重合性置換基の吸収スペクトルを示す ラフである。 実施例10で作製した基板表面の拡大写 である。 基板上に形成されたスフェロイドの拡 写真である。 基板上に形成された内皮細胞集合体の 大写真である。 基板上の内皮細胞集合体上に形成され スフェロイドの拡大写真である。 培養1日後のスフェロイドの拡大写真で ある。 培養3日後のスフェロイドの拡大写真で ある。 培養4週間後のスフェロイドの拡大写真 である。 培養1日後のスフェロイドの拡大写真で ある。 培養3日後のスフェロイドの拡大写真 ある。 培養4週間後のスフェロイドの拡大写 である。

Best Mode of Carrying Out the Invention
 本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘 体は、末端に重合性置換基を有するポリア キレングリコール基の3以上と、前記ポリア ルキレングリコール基と結合する3価以上の 結基とを有することを特徴とする。
 かかる構成の分岐ポリアルキレングリコー 誘導体は、親水性の架橋体を形成すること できる。かかる親水性の架橋体は、細胞非 着性の経時安定性が良好であり、例えば、 発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導 を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域 が高精度に形成された基板は、該基板上で 胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特 的に細胞が接着するため、高精度に区画化 れた細胞集合体を形成することができる。 た、前記親水性領域は細胞非接着性の経時 定性が良好であり、長期に渡って区画化さ た細胞集合体を維持することができる。更 前記細胞集合体は、例えば、単層の細胞集 体とすることもできるし、細胞が3次元的凝 集状態を形成した細胞凝集塊(スフェロイド) することもできる。

 本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘 体において、末端に重合性置換基を有する リアルキレングリコール基の含有数は3以上 である。前記ポリアルキレングリコール基の 含有数が2以下では、これによって形成され 親水性領域の細胞非接着性の経時安定性が 十分であり、区画化された細胞集合体を長 間維持することができない。
 また前記ポリアルキレングリコール基の含 数は、経時安定性と良好なスフェロイド形 性の点から、4以上であることが好ましく、 4以上64以下であることがより好ましく、4以 16以下であることが更に好ましい。

 本発明における前記ポリアルキレングリコ ル基は、末端に重合性置換基を有するポリ ルキレングリコール基であれば特に制限は い。
 また前記重合性置換基としては重合性の官 基を有する置換基であってポリアルキレン リコールの末端に結合可能なものであれば に制限はない。重合性置換基のポリアルキ ングリコールの末端への結合態様としては ポリアルキレングリコールに由来する酸素 子を介した結合態様であっても、ポリアル レングリコールの末端水酸基が他の元素に 換された結合態様であってもよい。

 前記重合性置換基は、重合性の官能基その のであっても、重合性の官能基と連結基と 含んで構成された置換基であってもよい。
 本発明における重合性の官能基としては、 常用いられる重合性官能基を特に制限なく いることができ、例えば、エチレン性不飽 結合を有する基、アジド基等を挙げること できる。本発明においては、親水性領域の ターン形成性の観点から、エチレン性不飽 結合を有する基及びアジド基から選ばれる なくとも1種であることが好ましく、アジド 基であることがより好ましい。

 また前記重合性置換基における連結基とし は重合性の官能基とポリアルキレングリコ ル基とを連結可能な基であれば特に制限は く、例えば、アルキレン基、アリーレン基 ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素 子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及 水素原子から選ばれる少なくとも1種を含ん で構成することができる。
 具体的には例えば、カルボニル基、アリー ン基、アルキレンカルボニル基、カルボニ アリーレン基、カルバモイルアリーレン基 を挙げることができる。
 更に連結基の価数としては少なくとも2価で あればよく、3価以上の連結基であってポリ ルキレングリコールと2以上の重合性官能基 を連結する連結基であってもよい。

 末端に重合性置換基を有するポリアルキ ングリコール基を構成するポリアルキレン リコール基は、本発明の分岐ポリアルキレ グリコール誘導体に親水性を付与可能なポ アルキレングリコール基であれば特に制限 ない。例えば、炭素数2~4のアルキレングリ ール構造単位(例えば、エチレンオキシ、n- ロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、 チレンオキシ、イソブチレンオキシ等)を含 むポリアルキレングリコール基を好ましく用 いることができる。

 前記ポリアルキレングリコール基における ルキレングリコール構造単位は、1種のアル キレングリコール構造単位からなるものであ っても、2種以上アルキレングリコール構造 位の組合せからなるものであってもよい。 リアルキレングリコール基が2種以上のアル レングリコール構造単位の組合せからなる 合、ブロックポリマーであってもランダム リマーであってもよい。
 また、ポリアルキレングリコール基の重合 としては、親水性の観点から5以上であれば よく、5~1000の重合度を有するポリアルキレン グリコール基を好ましく用いることができ、 より好ましくは10~500である。

 本発明における、末端に重合性置換基を有 るポリアルキレングリコール基と結合する3 価以上の連結基は、少なくとも3つの前記ポ アルキレングリコール基における重合性置 基が結合していない方の末端と結合し、前 ポリアルキレングリコール基を互いに連結 能なものであれば特に制限はない。結合様 としては共有結合、配位結合、イオン結合 いずれであってもよい。
 具体的には例えば、糖類に由来する連結基 多価アルコールに由来する連結基、多価カ ボン酸に由来する連結基、配位結合を介し 前記ポリアルキレングリコール基を含む基 結合可能な金属原子等を挙げることができ 。

 前記糖類としては、例えば、グリセルア デヒド、エリトロース、リボース、グルコ ス等を挙げることができる。また、多価ア コールとしては、グリセリン、ペンタエリ リトール、キシリトール、ソルビトール等 挙げることができる。更に、多価カルボン としては、プロパントリカルボン酸、クエ 酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げるこ ができる。また、前記金属原子としては、 、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げること できる。

 本発明においては、親水性と経時安定性 観点から、多価アルコールに由来する連結 であることが好ましく、グリセリンに由来 る連結基又はペンタエリスリトールに由来 る連結基がより好ましく、グリセリン、ポ グリセリン、ペンタエリスリトール、及び リペンタエリスリトールから選ばれる化合 に由来する連結基であることが特に好まし 。

 本発明における末端に重合性置換基を有 るポリアルキレングリコール基は、経時安 性と良好なスフェロイド形成性の観点から 下記一般式(1)で表される置換ポリアルキレ グリコール基であることが好ましい。

 一般式(1)中、mは2~4の整数を表すが、2又 3であることが好ましく、2であることがより 好ましい。またnは5~1000の整数を表すが、10~50 0であることが好ましく、10~300であることが り好ましい。

 一般式(1)中、X 1 は重合性置換基を表す。本発明において前記 重合性置換基は、本発明の分岐ポリアルキレ ングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から 、下記一般式(3)及び一般式(4)の少なくとも1 で表される重合性置換基であることが好ま い。

 一般式(3)中、L 3 は単結合又は2価の連結基を表す。前記2価の 結基としてはエチレン性不飽和基とポリア キレングリコール基とを連結可能であれば に制限はない。例えば、アルキレン基、ア ーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニ 基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び 素原子の少なくとも1種を含んで構成される 2価の連結基を挙げることができ、カルボニ 基、エステル基、アミド基、フェニレン基 炭素数2~4のアルキレン基、から選ばれる2価 連結基又はこれらの組合せからなる2価の連 結基であることが好ましい。
 本発明においてL 3 は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニ ルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基 から選ばれる2価の連結基であることがより ましい。

 また、R 3 は水素原子又は炭素数1~3のアルキル基を表す 。炭素数1~3のアルキル基としては、具体的に はメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソ ロピル基を挙げることができる。本発明に いては、分岐ポリアルキレングリコール誘 体の架橋反応性の観点から、R 3 は水素原子又はメチル基であることが好まし く、水素原子であることがより好ましい。

 一般式(4)におけるL 4 は2価の連結基を表すが、その定義及びその ましい範囲は前記L 3 における2価の連結基と同様である。

 また本発明においては、前記重合性置換 の少なくとも1つは下記一般式(5)で表される 置換基であることが好ましい。これにより、 重合性置換基の反応開始がより長波長の光照 射によって可能となる。

 

 一般式(5)中、L 5 は単結合又は2価の連結基を表す。L 5 で表される2価の連結基は、前記L 3 における2価の連結基と同様である。
 また、iは1又は2を表す。

 一般式(5)中、R 5 は置換基を表すが、一般式(5)で表される重合 性置換基の極大吸収波長を変化させることが できる置換基であれば特に制限はない。中で も一般式(5)で表される重合性置換基の極大吸 収波長を長波長側にシフト可能な置換基であ ることが好ましい。具体的には例えば、ニト ロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキ ルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適 に挙げることができる。
 iが2の場合、2つのR 5 は同一でも異なっていてもよい。

 また、本発明の分岐ポリアルキレングリ ール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点 ら、下記一般式(2)で表される化合物である とが好ましい。

 

 一般式(2)中、L 2 は単結合又はメチレン基を表し、pは1又は2を 表す。pが1のときL 2 は単結合であることが好ましく、pが2のときL 2 はメチレン基であることが好ましい。
 qは1~70の整数を表す。本発明においては、 水性と架橋反応性の観点から、pが1のとき、 qは1~64であることが好ましく、2~10であること がより好ましい。またpが2のとき、qは1~32で ることが好ましく、1~5であることがより好 しい。

 一般式(2)中、R 2 は末端に重合性置換基を有するポリアルキレ ングリコール基又は末端に水酸基を有するポ リアルキレングリコール基を表す。中でも架 橋反応性の観点から、R 2 は末端に重合性置換基を有するポリアルキレ ングリコール基であることが好ましく、前記 一般式(1)で表される置換ポリアルキレングリ コール基であることがより好ましい。

 本発明の分岐ポリアルキレングリコール 導体は、経時安定性とスフェロイド形成性 観点から、末端に重合性置換基を有するポ アルキレングリコール基を4以上16以下有し 前記ポリアルキレングリコール基が前記一 式(1)で表されるものであって、前記重合性 換基が前記一般式(3)、一般式(4)及び一般式( 5)の少なくとも1種で表されるものであること が好ましい。

 本発明の分岐ポリアルキレングリコール 導体の具体例を以下に例示するが、本発明 これらに限定されるものではない。尚、下 具体例中のポリアルキレングリコールの重 度(n)は分岐ポリアルキレングリコール誘導 の重量平均分子量から算出される平均重合 を意味する。また、分岐ポリアルキレング コール誘導体の重量平均分子量は、例えば ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって 定することができる。

 

 

 

 本発明の分岐ポリアルキレングリコール 導体は、例えば、3以上のポリエチレングリ コール基を有する化合物(以下、「マルチア ムPEG」ということがある。例えば、日油(株) 製、SUNBRIGHT(登録商標)PTEシリーズ、HGEOシリー ズ等)の末端水酸基に対して、重合性置換基 、通常用いられる方法を用いてエステル結 、エーテル結合等で結合することによって 成することができる。例えば、エステル結 の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で うことができる。

 本発明の分岐ポリアルキレングリコール 導体は、例えば、後述の感光性組成物の成 とすることができる。また、架橋反応によ 親水性の架橋体を形成することができる。

 本発明の感光性組成物は、前記分岐ポリア キレングリコール誘導体の少なくとも1種を 含有することを特徴とする。本発明の感光性 組成物を用いることで、例えば、基材上に高 精度に区画化された親水性領域と疎水性領域 とを形成することができる。
 本発明の感光性組成物においては、前記分 ポリアルキレングリコール誘導体を1種単独 で含有することもできるし、2種以上を含有 ることもできる。
 また本発明の感光性組成物は、前記分岐ポ アルキレングリコール誘導体に加えて、光 合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤 緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤 を含んで構成することができる。

 前記光重合開始剤としては、光照射によ て重合反応を開始可能なものであれば特に 限はないが、生細胞に対する障害性が低い のであることが好ましい。具体的には、例 ば、IRGACURE 2959、IRGACURE 184(いずれもチバ・ スペシャリティー・ケミカルズ社製)等を挙 ることができ、細胞毒性と水溶性の点からIR GACURE 2959が好ましい。

 前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレ グリコール誘導体を溶解可能であれば特に 限はない。ここでいう溶解可能とは前記分 ポリアルキレングリコール誘導体を質量基 で0.1%以上溶解できることをいう。
 前記溶剤として具体的には、ベンゼン、ト エン、THF、DMF、クロロホルム等の有機溶媒 及び水を好ましく用いることができる。ま 、溶剤は1種単独でも2種以上を混合して用 てもよい。

 本発明の感光性組成物における前記分岐 リアルキレングリコール誘導体の含有率と ては、例えば0.1~50質量%とすることができ、 0.1~20質量%であることが好ましい。

 本発明の架橋体は、前記感光性組成物を 橋硬化させて形成されたものである。前記 橋硬化は光照射による重合反応に起因する のであれば特に制限はなく、感光性組成物 応じて適宜架橋硬化条件を選択することが きる。

 本発明の架橋体は、例えば、基材上に形 された前記感光性組成物からなる観光性組 物層を硬化させたものであっても、媒体中 分散状態とした前記感光性組成物を硬化さ たものであってもよい。基材上に形成され 前記感光性組成物層を硬化させることで、 材上に架橋体からなる親水性領域を形成す ことができる。また、媒体中で分散状態と た前記感光性組成物を硬化させることで、 水性表面を有する粒子状の架橋体を形成す ことができる。

 本発明の基板は、基材と、前記基材上に 置された前記架橋体とを含むことを特徴と る。本発明における基材としては、通常用 られる基材を特に制限なく用いることがで る。基材の材質としては、例えば、ガラス 熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等 挙げることができる。本発明においては、 材と架橋体との接着性の観点から、ガラス は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガ スであることがより好ましい。

 また本発明における基材は、アミノ基を有 るシランカップリング剤、エチレン性不飽 基を有するシランカップリング剤、及びポ リジンから選ばれる少なくとも1種で表面処 理された基材であることが好ましい。これに より、基材とその上に形成された架橋体との 結合安定性を向上させることができる。
 また、前記基材は、細胞接着性タンパク質 少なくとも1種で表面処理された基材である こともまた好ましく、アミノ基を有するシラ ンカップリング剤、エチレン性不飽和基を有 するシランカップリング剤、及びポリリジン から選ばれる少なくとも1種で表面処理され 基材を、細胞接着性タンパク質の少なくと 1種で更に表面処理した基材であることがよ 好ましい。
 表面処理された基材を用いて、基板を構成 ることにより、例えば、基板上で細胞を培 する場合に、より効率的に細胞集合体を形 することができる。
 ここで、細胞接着性タンパク質としては、 えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネ チン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネ ン及びエラスチン等を挙げることができ、 でも、細胞集合体の形成性の観点から、コ ーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビ ロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラ ンがより好ましい。

 本発明の基板を作製する方法は、例えば、 材上に前記分岐ポリアルキレングリコール 導体を含む感光性組成物を付与して感光性 成物層を形成する工程と、前記感光性組成 層を、露光処理する硬化工程とを含むこと できる。これにより、基材上に、前記架橋 が形成された基板を作製することができる
 本発明の基板を作製する方法は、必要に応 て、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程 乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことがで る。

 本発明において、基材上に感光性組成物層 形成する工程には、特に制限なく通常の薄 形成方法を適用することができ、例えば、 布法、ディップコート法、スピンコート法 を好適に適用することができる。
 基材上に形成された感光性組成物層の層厚 しては、特に制限はなく基板の使用目的に じて適宜選択することができ、例えば、5nm~ 1000μmとすることができる。特に、本発明の 板を後述の細胞培養基板として使用する場 には、10nm~1000nmとすることが好ましく、10nm~5 00nmであることがより好ましい。

 前記基材上に感光性組成物層を形成する 程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶 を除去する工程を含むことができる。前記 剤を除去する工程としては、前記溶剤に応 て適宜その条件を選択することができ、常 乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい 例えば、30℃~150℃で1分~10時間とすることが でき、好ましくは35℃~120℃で3分~1時間である 。

 前記硬化工程における露光処理は、前記 光性組成物層を全面露光する工程であって 、所望のパターン様に部分露光する工程で ってもよい。本発明においては、所望のパ ーン様に部分露光する工程であることが好 しく、前記部分露光する工程後に更に現像 程を含むことがより好ましい。これにより 前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が 成されていない疎水性領域とが、パターン に基材上に形成された基板を作製すること できる。

 前記所望のパターン様に部分露光する工 は、所望のパターン様に光透過性を有する スク(フォトマスク)を介して、部分露光す 工程であることが好ましい。また、前記マ クを感光性組成物層に密着させて部分露光 行うことにより、より高精度でパターン様 露光することができる。

 露光に用いる光源としては、前記感光性組 物層を硬化可能な光源であれば特に制限は い。光源として例えば、X線、電子線、エキ シマレーザー、キセノンランプ、メタルハラ イドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ラ ンプ等を挙げることができる。中でも低圧又 は高圧水銀ランプを好適に用いることができ 、10W~2000Wの高圧水銀ランプであることが好ま しい。
 また露光波長及び露光量についても特に制 はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選 することができる。露光波長としては、例 ば200nm~400nmとすることができ、280nm~400nmであ ることが好ましい。露光量としては、例えば 、0.1mJ/cm 2 ~1000mJ/cm 2 とすることができ、1mJ/cm 2 ~200mJ/cm 2 であることが好ましく、10mJ/cm 2 ~20mJ/cm 2 であることがより好ましい。

 前記現像工程は、前記感光性組成物層に ける未露光領域を基材上から除去できる方 であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げるこ ができ、本発明においては、溶剤として水 用いる洗浄及び水への浸漬であることが好 しい。

 本発明の基板は、例えば、架橋体からな 親水性領域と、基材が露出した疎水性領域 が区画化(パターニング)されて基材上に形 された基板として作製することにより、細 培養基板として好適に用いることができる すなわち、前記疎水性領域にのみ細胞が配 され、前記親水性領域には細胞が接着しな ことにより、所望のパターン様に細胞が配 可能な細胞培養基板とすることができる。

 本発明の基板を細胞培養用基板として用 る方法としては、通常の細胞培養方法を制 なく適用することができる。例えば、本発 の基板上に細胞培養培地を配置し、前記細 培養培地へ所望の細胞を播種した後、所望 細胞に応じて選択される培養条件を適用す ことで、基板上の疎水性領域に所望の細胞 選択的に配置することができる。

 本発明における前記細胞は、接着性細胞で れば、種および由来組織は特に限定されな 。例えば、生体より採取した直後の細胞お び癌化した樹立細胞系等を挙げることがで 、好ましくは特定の臓器の機能発現および 態に関連する細胞である。より具体的には 薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制 に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する 芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神 幹細胞、発毛に関連する毛母細胞、がん細 、繊維芽細胞、および様々な細胞へ分化誘 できる胚性幹細胞、及び間葉系幹細胞等を げることができる。またこれら細胞と相互 用する非実質細胞も用いることができる。
 また本発明においては、前記疎水性領域に 置された細胞は、単層を形成していてもよ 、また、細胞凝集塊(スフェロイド)を形成 ていてもよい。

 各種細胞の通常の細胞培養培地としては、 えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、M em-α、RPMI1640等を挙げることができ、培養対 となる細胞種に応じて適宜選択される。ま これらの培地に対しては、必要に応じて、 清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常 細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加し もよい。これらの添加剤の濃度は通常用い れる濃度であればよく、例えば、血清は培 量の5~10容量%とすることができる。
 また各種細胞の培養条件は、細胞に応じて 宜選択できるが、例えば、5%CO 2 、37℃とすることができる。

 本発明における親水性領域及び疎水性領 の形状には特に制限はなく、目的に応じて 宜選択することができる。例えば、疎水性 域を円状、三角形をはじめとする多角形状 楕円状、ストライプ状等に形成することが きる。また親水性領域及び疎水性領域の大 さについても特に制限はなく、目的に応じ 適宜選択することができる。

 例えば、本発明の基板を前記細胞培養基板 して使用する場合、疎水性領域を円状に形 した場合の大きさとしては、直径として5μm ~1000μmとすることが好ましく、50μm~500μmとす ことがより好ましい。また、隣接する疎水 領域を隔てる親水性領域の幅としては、50μ m~500μmであることが好ましく、100μm~200μmであ ることがより好ましい。更に前記親水性領域 における層の厚みとしては、10nm~1000nmである とが好ましく10nm~500nmであることがより好ま しい。
 本発明における親水性領域及び疎水性領域 形状及び大きさは、上述の硬化工程におけ 露光処理を、マスクを介した露光処理とす ことで、容易にかつ高い精度で制御するこ ができる。

 本発明の基板は、特にスフェロイド形成用 細胞培養用基板として好適に用いることが きる。本発明の基板は、前記分岐ポリアル レングリコール誘導体からなる親水性領域 有するため、高精度にパターニングされた 水性領域を形成することができる。また、 記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性 極めて良好であり、長期間にわたって良好 機能性を示すスフェロイドを維持すること 可能となる。すなわち、スフェロイドを形 する各実質細胞に特異的な機能が維持され る。例えば、肝細胞にあっては高レベルの 細胞機能(例えば、高レベルのアルブミン産 生能、薬物代謝活性)、膵β細胞にあってはイ ンスリン分泌機能、心筋細胞にあっては拍動 運動機能等が長期間にわたって維持される。
 このようなスフェロイドが形成された基板 、例えば、各種細胞に影響を及ぼし得る環 又は物質のスクリーニングに用いることが きる。各種細胞に対する影響は、スフェロ ドの形態の変化や産生物(例えば、肝細胞に おけるアルブミン、モデル薬物の代謝生成物 等)の産生能の変化をモニターすることで評 することができる。

 本発明の基板においては、前記親水性領 を、分岐ポリアルキレングリコール誘導体 して、末端に重合性置換基を有するポリア キレングリコール基を4以上有する化合物を 用いて形成することで、形成されたスフェロ イドの経時安定性が顕著に向上する。

 本発明の基板をスフェロイド形成用基板と て使用する場合、疎水性領域を例えば、円 に形成した場合の大きさとしては、直径と て5μm~1000μmとすることが好ましく、50μm~500 mとすることがより好ましい。また、隣接す 疎水性領域を隔てる親水性領域の幅として 、50μm~500μmであることが好ましく、100μm~200 μmであることがより好ましい。また親水性領 域における層の厚みとしては10nm~1000nmである とが好ましく10nm~500nmがより好ましい。
 親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで 成することにより、機能性の高いスフェロ ドをより効率的に作成することができ、更 より長期に渡って維持することが可能とな 。

 本発明の基板をスフェロイド形成用基板と て用いる場合、前記疎水性領域に予めフィ ダー細胞を配置することが好ましい。すな ち本発明においては、本発明の基板上の疎 性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成 れたフィーダー細胞層上で、該細胞層を形 する細胞とは異なる細胞、好ましくは実質 胞を培養することが好ましい。
 予めフィーダー細胞層を形成することで、 質細胞のスフェロイド形成がより効率的に 行する。前記フィーダー細胞は、スフェロ ドを形成させる細胞に応じて適宜選択する とができる。例えば、肝細胞や軟骨細胞の フェロイドを形成する場合には、フィーダ 細胞としてCOS-1細胞、血管内皮細胞(例えば 大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞 )、繊維芽細胞等を好適に用いることができ る。

 また、本発明の基板上でスフェロイドを形 する場合、通常の培養条件で数十分~48時間 度培養を行うことでスフェロイドを形成す ことができる。更に培地中の細胞の播種濃 としては例えば、1×10 4 ~1×10 8 cells/mLとすることができ、1×10 4 ~1×10 6 cells/mLであることが好ましい。

 以下、本発明を実施例により具体的に説 するが、本発明はこれらの実施例に限定さ るものではない。尚、特に断りのない限り %」は質量基準であり、平均分子量は重量平 均分子量である。

(実施例1)
~分岐ポリアルキレングリコール誘導体(4PA20K) の合成~
 4-アジド-安息香酸12g(93.6mmol)を40mLの塩化チ ニルに溶解し、1.5時間、加熱還流した。反 混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加 て再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し 白色固体として目的物の4-アジド-安息香酸 ロリド9.3g(51.2mmol、収率70%)を得た。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.11-8.15 (2H, m), 7.11-7.16 (2H, m).

 次に、3mLのジクロロメタン(脱水)に、トリ チルアミン81mg(0.8mmol)、4-ジメチルアミノピ ジン147mg(1.2mol)を加え、氷浴で冷却しながら 拌した。この溶液に、上記で得られた4-ア ド-安息香酸クロリド363mg(2.0mmol、マルチアー ムPEGの末端OH基に対して5モル当量)のジクロ メタン(脱水)溶液(5mL)を滴下し、そのまま5分 攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチ アームPEG(日油(株)製SUNBRIGHT(登録商標) PTE-2000 0、4つのポリエチレングリコール基を有する ンタエリスリトール誘導体)2g(0.1mmol)のジク ロメタン(脱水)溶液(20mL)をゆっくり滴下し 。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室 で18時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮 し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過 して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗 生成物を少量のベンゼンに溶解し、0℃に冷 したイソプロピルエーテルに滴下して得ら た沈殿を濾取する工程を3回繰り返して、得 れた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物と る分岐ポリアルキレングリコール誘導体(4PA 20K)1.74g(収率85%)を得た。
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例2)
 実施例1において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりに下記表1に示したマルチアー PEGを用いた以外は、実施例1と同様にして分 ポリアルキレングリコール誘導体を合成し 。収率、性状等を表1に示した。

 

(実施例3)
 実施例1において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりに下記表2に示したマルチアー PEGを用いた以外は、実施例1と同様にして分 ポリアルキレングリコール誘導体を合成し 。収率、性状等を表2に示した。

 

(比較例1)
 実施例1において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりに下記表3に示したマルチアー PEGを用いた以外は、実施例1と同様にして分 ポリアルキレングリコール誘導体を合成し 。収率、性状等を表3に示した。

 

(実施例4)
 5-アミノ-サリチル酸15.3g(0.1mol)を蒸留水80mL 濃塩酸20mLの混合溶液に懸濁させ、室温で30 攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後 亜硝酸ナトリウム6.9g(0.1mol)の水溶液10mLを溶 の反応液の液温が5℃を超えないような速度 で滴下し、そのまま1時間攪拌した。続いて アジ化ナトリウム7.15 g(0.11mol)の水溶液30mLを 反応液の液温が10℃を超えない速度で滴下し 。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発 しなくなるまで激しく攪拌した。生成した 殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄し 。得られた固体は、暗所で風乾した後、減 下で完全に乾燥し、5-アジド-サリチル酸を 色固体として12.0g(67.0mmol、収率=67%)得た。
 5-アジド-サリチル酸及び4-アジド安息香酸 紫外吸収スペクトルを図1に示した。溶媒と て光学分析用メタノールを用いて、濃度は1 μmol/Lとして測定した。また併せて365nmにおけ る吸光度を表4に示した。
  1 H-NMR(DMSO-d 6 ) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6. 88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J =  8.4 Hz).

 得られた5-アジド-サリチル酸5g(27.9mmol)を塩 チオニル50mLに懸濁し、70℃で1時間攪拌した 。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化 チオニルを減圧で除き、5-アジド-サリチル酸 クロリドの赤色固体を定量的に得た。
  1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).

 

 次に、3mLのジクロロメタン(脱水)に、トリ チルアミン81mg(0.8mmol)、ジメチルアミノピリ ン147mg(1.2mol)を加え、氷浴で冷却しながら攪 拌した。この溶液に、上記で得られた5-アジ -サリチル酸クロリド358mg(2mmol、マルチアー PEGの末端OH基に対して5モル当量)のジクロロ メタン(脱水)溶液(5mL)を滴下し、そのまま5分 拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチ ームPEG(日油(株)製SUNBRIGHT(登録商標) PTE-20000 、4つのポリエチレングリコール基を有する 合物)2g(0.1mmol)のジクロロメタン(脱水)溶液(20 mL)をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴から はずし、そのまま室温で18時間攪拌した。反 混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて 濁させたものをろ過して塩を除いた後、再 減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼ に溶解し、0℃に冷却したイソプロピルエー テルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程 を3回繰り返して、得られた白色固体を減圧 で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレ グリコール誘導体(4PB20K)1.77g(収率85%)を得た
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例5)
 実施例4において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりにHGEO-20000(日油(株)製、8つのポ エチレングリコール基を有するヘキサグリ リン誘導体)を用いた以外は実施例4と同様 して、目的物とする分岐ポリアルキレング コール誘導体(8PB20K)1.72g(収率85%)を得た。
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例6)
 5-アミノ-2-ニトロ安息香酸18.1g(0.1mol)を蒸留 80mLと濃塩酸20mLの混合溶液に懸濁させ、室 で30分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却し た後、亜硝酸ナトリウム6.9g(0.1mol)の水溶液10m Lを溶液の反応液の液温が5℃を超えないよう 速度で滴下し、そのまま1時間攪拌した。続 いて、アジ化ナトリウム7.15 g(0.11mol)の水溶 30mLを反応液の液温が10℃を超えない速度で 下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気 が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生 した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で 浄した。得られた固体は、暗所で風乾した 、減圧下で完全に乾燥し、5-アジド-2-ニトロ 安息香酸を白色固体として19.2g(92.4mmol、収率= 92%)を得た。
 5-アジド-2-ニトロ安息香酸の紫外吸収スペ トルを図1に示した。溶媒として光学分析用 タノールを用いて、濃度は1μmol/Lとして測 した。また併せて365nmにおける吸光度を表4 示した
  1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2 H, m).

 得られた5-アジド-2-ニトロ安息香酸1.0g(4.8mmo l)を塩化チオニル10mLに懸濁し、70℃で1時間攪 拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰 の塩化チオニルを減圧で除き、5-アジド-サリ チル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
  1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).

 次に、3mLのジクロロメタン(脱水)に、トリ チルアミン81mg(0.8mmol)、ジメチルアミノピリ ン147mg(1.2mol)を加え、氷浴で冷却しながら攪 拌した。この溶液に、上記で得られた5-アジ -2-ニトロ安息香酸クロリド417mg(2mmol、マル アームPEGの末端OH基に対して5モル当量)のジ ロロメタン(脱水)溶液(5mL)を滴下し、そのま ま5分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、 ルチアームPEG(日油(株)製SUNBRIGHT(登録商標) P TE-20000、4つのポリエチレングリコール基を有 する化合物)2g(0.1mmol)のジクロロメタン(脱水) 液(20mL)をゆっくり滴下した。反応溶液を氷 からはずし、そのまま室温で18時間攪拌し 。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた 、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量の ンゼンに溶解し、0℃に冷却したイソプロピ エーテルに滴下して得られた沈殿を濾取す 工程を3回繰り返して、得られた白色固体を 減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアル キレングリコール誘導体(4PC20K)1.81(収率85%)を た。
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m). 

(実施例7)
 実施例6において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりにHGEO-20000(日油(株)製、8つのポ エチレングリコール基を有するヘキサグリ リン誘導体)を用いた以外は実施例6と同様 して、目的物とする分岐ポリアルキレング コール誘導体(8PC20K)1.71g(収率85%)を得た。
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例8)
 アクリロイルクロリド181mg(2.0mmol、マルチア ームPEGの末端OH基に対して5モル当量)のベン ン(脱水)溶液(5mL)を滴下し、そのまま5分攪拌 を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアー ムPEG(日油(株)製SUNBRIGHT(登録商標) PTE-20000、4 のポリエチレングリコール基を有するペン エリスリトール誘導体)2g(0.1mmol)のベンゼン( 脱水)溶液(20mL)をゆっくり滴下した。反応溶 を氷浴からはずし、そのまま室温で18時間攪 拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼ ンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除 いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少 量のベンゼンに溶解し、0℃に冷却したイソ ロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を 取する工程を3回繰り返して、得られた白色 体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポ アルキレングリコール誘導体(4PD20K)1.74g(収 85%)を得た。
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例9)
 実施例8において、マルチアームPEGとしてPTE -20000の代わりに、HGEO-20000(日油(株)製、8つの リエチレングリコール基を有するヘキサグ セリン誘導体)を用いた以外は、実施例8と 様にして、目的物とする分岐ポリアルキレ グリコール誘導体(8PD20K)1.74g(収率85%)を得た
  1 H-NMRの積分比より算出した末端水酸基の重合 置換基への置換率は、85%であった。
  1 H-NMR (CDCl 3 ) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J  = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2 145H, m).

(実施例10)
 以下の作業は、すべてイエロールーム内で った。
 実施例1で作製した分岐ポリアルキレングリ コール誘導体(マルチアームPEG-アジド:4PA20K) トルエンに溶解し、感光性組成物Aとして4PA2 0Kのトルエン溶液(1%)を調製した。基材として ポリ-L-リジンコートスライドガラス(松浪硝 工業(株)製。白切放NO.1スライドガラス丸型21 mmφ。以下「PLLコートガラス」と略す)を使用 、PLLコートガラス上に、感光性組成物Aを110 μL滴下後、スピンコート法(500rpm×5秒+3000rpm×2 0秒+6000rpm×1秒)により成膜し、常温で放置し 乾燥させた。これに、石英ガラス製フォト スク(直径100μmの円形パターンが多数配置さ たもの)を密着させ、高圧水銀灯(200W)を用い て40秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄( 現像工程:流水15秒間+浸漬20分間)した。常温 乾燥し、表面に微細加工された親水性の架 体を有する基板を得た。当該基板の表面を 位相差光学顕微鏡(倍率×100)により観察した ころ、良好なマイクロパターンが高精度に 成されていることが確認できた(図2)。

(実施例11)
 実施例10において、基材としてPLLコートガ スに代えて、アミノプロピルシランコート ラス(松浪硝子工業(株)製。APSコートNO.1カバ ガラス丸型21mmφ。以下「APSコートガラス」 略す)を用いた以外は、実施例10と同様にし 基板を作製し、表面に微細加工された親水 の架橋体を有する基板を得た。当該基板の 面を、位相差光学顕微鏡により観察したと ろ、良好なマイクロパターンが高精度に形 されていることが確認できた。

(実施例12)
 実施例10において、基材としてPLLコートガ スに代えて、MASコートガラス(松浪硝子工業( 株)製)を用いた以外は、実施例10と同様にし 基板を作製し、表面に微細加工された親水 の架橋体を有する基板を得た。当該基板の 面を、位相差光学顕微鏡により観察したと ろ、良好なマイクロパターンが高精度に形 されていることが確認できた。

(実施例13)
 実施例10において、基材としてPLLコートガ スに代えて、PLLコート上にコラーゲンをさ にコーティングした「コラーゲンコートガ ス」を用いた以外は、実施例10と同様にして 基板を作製し、表面に微細加工された親水性 の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表 面を、位相差光学顕微鏡(倍率×100)により観 したところ、良好なマイクロパターンが高 度に形成されていることが確認できた。
 尚、コラーゲンコートガラスは、PLLコート ラス上にブタI型コラーゲン(日本ハム(株)製 )の0.1%水溶液を400μL滴下し、スピンコート法( 350rpm×5秒+500rpm×5秒+1000rpm×10秒+1500rpm×10秒+6000 rpm×1秒)にて成膜した後、室温で乾燥する工 を2回繰り返して作製した。

(実施例14)
 実施例10において、基材としてPLLコートガ スに代えて、PLLコート上にゼラチンをさら コーティングした「ゼラチンコートガラス を用いた以外は、実施例10と同様にして基板 を作製し、表面に微細加工された親水性の架 橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を 、位相差光学顕微鏡により観察したところ、 良好なマイクロパターンが高精度に形成され ていることが確認できた。
 尚、ゼラチンコートガラスは、PLLコートガ スを用い、ゼラチン(新田ゼラチン社製)の0. 1%溶液を400μL滴下し、スピンコート法(350rpm×5 秒+500rpm×5秒+1000rpm×10秒+1500rpm×10秒+6000rpm×1秒 )にて成膜した後、室温で乾燥して作製した

(実施例15)
 実施例13において、コラーゲンコートガラ の作製方法を、PLLコートガラスをブタI型コ ーゲン(日本ハム(株)製)の0.02%水溶液に3時間 浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させ る方法に変更した以外は、実施例13と同様の 法で基板を作製した。当該基板の表面を、 相差光学顕微鏡により観察したところ、良 なマイクロパターンが高精度に形成されて ることが確認できた。

(実施例16)
 実施例13、実施例14、実施例15において、基 としてPLLコートガラスに代えて、APSコート ラスを用いた以外は、実施例13、実施例14、 実施例15とそれぞれ同様の方法で基板を作製 た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡 より観察したところ、いずれの基板におい も良好なマイクロパターンが高精度に形成 れていることが確認できた。

(実施例17)
 実施例13、実施例14、実施例15において、基 としてPLLコートガラスに代えて、MASコート ラスを用いた以外は、実施例13、実施例14、 実施例15とそれぞれ同様の方法で基板を作製 た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡 より観察したところ、いずれの基板におい も良好なマイクロパターンが高精度に形成 れていることが確認できた。

(実施例18)
 実施例10において、露光時間を10秒に変更し た以外は、実施例10と同様の方法で基板を作 した。当該基板の表面を、位相差光学顕微 により観察したところ、良好なマイクロパ ーンが高精度に形成されていることが確認 きた。

(実施例19)
 実施例10において、感光性組成物Aに代えて マルチアームPEG-アジド(4PA20K)の濃度を0.5%と した感光性組成物Bを用いた以外は、実施例7 同様の方法で基板を作製した。当該基板の 面を、位相差光学顕微鏡により観察したと ろ、良好なマイクロパターンが高精度に形 されていることが確認できた。

(実施例20)
 実施例10において、分岐ポリアルキレング コール誘導体として4PA20Kに代えて、実施例2 実施例3、及び実施例4~7で合成した各種の分 岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた 以外は実施例10と同様の方法で基板を作製し 。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡に り観察したところ、良好なマイクロパター が高精度に形成されていることが確認でき 。

(実施例21)
 実施例10において、分岐ポリアルキレング コール誘導体(4PA20K)に代えて、実施例6で合 した分岐ポリアルキレングリコール誘導体(4 PC20K)を用い、露光条件として高圧水銀灯(200W) で3秒間とした以外は、実施例10と同様の方法 で基板を作製した。当該基板の表面を、位相 差光学顕微鏡(倍率×100)により観察したとこ 、良好なマイクロパターンが高精度に形成 れていることが確認できた。

(実施例22)
 実施例10において、分岐ポリアルキレング コール誘導体(4PA20K)に代えて、実施例6で合 した分岐ポリアルキレングリコール誘導体(4 PC20K)を用い、露光条件をフォトマスク上にフ ィルター(シグマ光機(株)製、UTVAF36U)を配置し て、高圧水銀灯(200W)で10秒間の露光とした以 は、実施例10と同様の方法で基板を作製し 。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡(倍 ×100)により観察したところ、良好なマイク パターンが高精度に形成されていることが 認できた。

(実施例23)
 実施例11~17において、分岐ポリアルキレン リコール誘導体(4PA20K)に代えて、実施例4で 成した分岐ポリアルキレングリコール誘導 (4PB20K)又は実施例6で合成した分岐ポリアル レングリコール誘導体(4PC20K)を用い、露光条 件をフォトマスク上にフィルター(シグマ光 (株)製、UTVAF36U)を配置して、高圧水銀灯(200W) で10秒間の露光とした以外は、実施例11~17と れぞれ同様の方法で基板を作製した。当該 板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察 たところ、良好なマイクロパターンが高精 に形成されていることが確認できた。

(実施例24)
 実施例8及び実施例9で作製した分岐ポリア キレングリコール誘導体(4PD20K、8PD20K)の濃度 が1%であって、光重合開始剤としてIRGACURE2959 濃度が0.05%となるようにトルエンに溶解し 、感光性組成物Dを調製した。基材としてポ -L-リジンコートスライドガラス(松浪硝子工 業(株)製。白切放NO.1スライドガラス丸型21mmφ 。以下「PLLコートガラス」と略す)を使用し PLLコートガラス上に、感光性組成物Dを110μL 下後、スピンコート法(500rpm×5秒+3000rpm×20秒 +6000rpm×1秒)により成膜し、常温で放置して乾 燥させた。これに、石英ガラス製フォトマス ク(直径100μmの円形パターンが多数配置され もの)を密着させ、高圧水銀灯(200W)を用いて4 0秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄(現 工程:流水15秒間+浸漬20分間)した。常温で乾 燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体 を有する基板を得た。当該基板の表面を、位 相差光学顕微鏡(倍率×100)により観察したと ろ、いずれの分岐ポリアルキレングリコー 誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロ ターンが高精度に形成されていることが確 できた。

(実施例25)
~基板の滅菌作業~
 実施例10~12、18~24で作製した基板(表面にコ ーゲンコート又はゼラチンコートを施さな った基板)については、オートクレーブ(121℃ 、20分)による滅菌作業を行った。
 また実施例13~17で作製した基板(表面にコラ ゲンコート又はゼラチンコートを施してい もの)に関しては、クリーンベンチに設置さ れているUVランプを15分間照射し、滅菌作業 行った。

~スフェロイド形成~
 実施例10~24において作製した後、滅菌作業 行った基板を、FALCON社製12ウェルプレート底 面にセットし、培地としてDMEMを添加し、ウ 関節軟骨細胞(コンドロサイト)を細胞濃度5× 10 5 cells/mL(2mL/well)にて播種した。培養条件5%CO 2 、37℃で培養したところ、いずれの実施例で 製した基板を用いた場合においても、24時 以内に基材上に形成した疎水性領域に対応 るパターン状に並んだ軟骨細胞の細胞塊(ス ェロイド)が得られた。代表的な顕微鏡写真 (倍率×40)を図3に示した。

(実施例26)
 実施例25と同様にして滅菌作業を行った実 例10~24で作製した基板を、FALCON社製12ウェル レート底面にセットし、培地としてDMEMを添 加し、ウシ動脈血管内皮細胞(株名:HH)を細胞 度5×10 4 cells/mL(2mL/well)にて播種した。培養条件5%CO 2 、37℃で24時間培養したところ、基材上に形 した疎水性領域に対応するパターン状に接 した血管内皮細胞集合体が確認できた(図4)
 続けて、初代肝実質細胞をラットから常法 より採取し、細胞濃度5×10 5 cells/mL(2mL/well)で播種した。5時間後に培地交 を行い、培養条件5%CO 2 、37℃で24時間培養したところ、基材上に形 した疎水性領域に対応するパターン状に並 だ肝細胞の細胞塊(スフェロイド)が得られた 。代表的な顕微鏡写真(倍率×40)を図5に示し 。

(実施例27)
~軟骨細胞スフェロイドアレイの染色~
 通常のカルチャーディッシュで培養したウ 関節軟骨細胞(コンドロサイト)を2%トリプシ ン処理し、細胞懸濁液の状態でSIGMA社製PKH-26 ットにて染色した。細胞懸濁液はPBS(-)また タンパク質不含の培地で洗浄後、細胞数を ウントし、2×10 7 cellsに調製した。これを遠心分離(400G、5分)し 、上澄みを除去し、キット中のDiluentC 1mLに 分散させた。ここに4×10 -6 MのPKH-26染色液を調製して、細胞懸濁液に1mL えた。これを室温で2~5分間静置することで 応させ、タンパク質含有の培地にて反応を めた。この後、タンパク質含有の培地で3回 洗浄をし、実施例25と同様にして播種を行 た。培養後24時間以内に基材上に形成した疎 水性領域に対応するパターン状に並んだ軟骨 細胞の細胞塊(スフェロイド)が得られた。こ を蛍光顕微鏡(倍率×40)で観察したところ、 フェロイドが染色された状態で観察された すなわち、スフェロイドは軟骨細胞によっ 形成されていた。

(実施例28)
 実施例10で作製した基板、実施例20において 、分岐アルキレングリコール誘導体として4PA 20K、4PB20K、4PC20K、8PA20K、8PB20K、及び8PC20Kを用 いてそれぞれ作製した基板、並びに実施例24 作製した基板を用いて、実施例25と同様に てスフェロイドを形成した。
 得られたスフェロイドを、培養条件5%CO 2 、37℃で培養を更に継続し、スフェロイドの 態を顕微鏡で観察した。
 いずれの基板を用いた場合も、1日後~4週間 のいずれにおいても、区画化されたスフェ イドが維持されていた。また、スフェロイ を形成していない細胞は浮遊状態のままで スフェロイド間の親水性領域への付着は観 されなかった。
 代表的例として分岐アルキレングリコール 導体として8PA20Kを用いた場合の顕微鏡写真 して、1日後(図6、100倍)、3日後(図7、40倍)、 4週間後(図8、40倍)をそれぞれ示した。

(実施例29)
 実施例20において、分岐アルキレングリコ ル誘導体として3PA5K、及び3PA20Kを用いてそれ ぞれ作製した基板を用いて、実施例25と同様 してスフェロイドを形成した。
 得られたスフェロイドを、培養条件5%CO 2 、37℃で培養を更に継続し、スフェロイドの 態を顕微鏡で観察した。
 3日後までは良好に区画化されたスフェロイ ドが維持されたが、4週間後にはスフェロイ 間の親水性領域に付着した軟骨細胞が観察 れた。

(比較例2)
 実施例10において、分岐ポリアルキレング コール誘導体(4PA20K)の代わりに、比較例1で 成したポリアルキレングリコール誘導体(2PA2 K、及び2PA3K)を用いて、実施例10と同様にして 基板を作製した。
 次いで得られた基板を用いて実施例25と同 にして、スフェロイドを形成した。得られ スフェロイドを、培養条件5%CO 2 、37℃で培養を更に継続し、スフェロイドの 態を顕微鏡で観察した。
 1日後にはスフェロイド間の親水性領域に付 着した軟骨細胞が観察され、区画化されたス フェロイドを維持することができなかった。
 代表的例として分岐アルキレングリコール 導体として2PA3Kを用いた場合の顕微鏡写真 して、1日後(図9、100倍)、3日後(図10、40倍)、 4週間後(図11、40倍)をそれぞれ示した。

(実施例30)
 実施例25において、コンドロサイトの代わ に下記表5に示した細胞種を用いて、実施例2 5と同様にしてスフェロイドを形成した。形 されたスフェロイドを下記評価基準に従っ 評価した。結果を表5に示した。
<評価基準>
+++ : 極良好
++  : 良好
+   : 普通

 

 上記の結果から、本発明の分岐ポリアルキ ングリコール誘導体を含む感光性組成物を いることで、高精度にパターニングされた 水性領域と親水性領域とを基材上に有する 板を形成できることがわかる。
 また、本発明の基板を用いることで、高精 にパターニングされたスフェロイドを効率 く形成することができることが分かる。
 更に、本発明の基板を用いることで、形成 れたスフェロイドを長期に渡って経時安定 に維持することができることがわかる。特 、末端に重合性置換基を有するポリアルキ ングリコール基を4以上有する分岐ポリアル キレングリコール誘導体を用いることで、形 成されたスフェロイドの経時安定性が飛躍的 に向上することが分かる。