La presente invención está relacionada con una línea celular de cáncer de mama doble resistente y a sus aplicaciones en el cribado de nuevos agentes activos para el tratamiento de dicha enfermedad. La presente invención también está relacionada con una combinación de un inhibidor de FASN y un inhibidor de mTOR para el tratamiento del cáncer de mama de tipo HER2 positivo en un paciente que muestra doble resistencia a trastuzumab y lapatinib.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer de mama es una de las causas más importantes de mortalidad en el primer mundo. Se estima que aproximadamente medio millón de personas mueren de esta enfermedad al año. La enfermedad se puede tratar con éxito mediante cirugía, terapia hormonal y quimioterapia. Prueba de ello es que el 85% de los pacientes diagnosticados sobreviven en los primeros 5 años. Alrededor de un 30% de los cánceres de mama muestran una amplificación del gen Her2, cuya sobreexpresión está asociada a una recurrencia de la enfermedad, y a una peor prognosis. Her2 es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Es un receptor de membrana que transduce señales pro-mitóticas mediante la dimerización consigo mismo, o con otros receptores (al contrario que otros miembros de la familia, no tiene un ligando endógeno que lo active).

Recientemente, ha habido numerosos avances terapéuticos en el tratamiento del cáncer de mama Her2 positivo (HER2+). Entre ellos, el anticuerpo monoclonal trastuzumab (T) es el más notorio. Este anticuerpo se une al dominio extracelular del receptor HER2 inhibiendo así su dimerización y consiguiente activación, llevando, en última instancia a una parada en la cascada de transducción de señal. Se han comprobado los efectos beneficiosos del tratamiento con trastuzumab en múltiples ensayos clínicos, y hoy en día es un tratamiento estándar en cáncer de mama de tipo HER2+.

Se ha desarrollado un tratamiento alternativo para este tipo de cáncer, conocido como lapatinib (L) que se basa en la inhibición de la actividad proteína quinasa del receptor HER2. El lapatinib es un inhibidor competitivo del ATP que se une al dominio quinasa de HER2 y de EGFR,

interrumpiendo la transducción de señal mediada por estos receptores. El lapatinib es utilizado hoy en día como terapia de combinación en el tratamiento de cáncer de mama HER2+.

Aunque el trastuzumab y el lapatinib representan grandes avances en el tratamiento del cáncer, su efecto terapéutico puede verse disminuido por el desarrollo de resistencia. Esta resistencia puede suponer una potenciación de la capacidad de proliferación del cáncer de mama, además de una inhabilitación de los efectos terapéuticos asociados con T y L.

Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos alternativos a los ya existentes que permitan el tratamiento efectivo del cáncer de mama en pacientes que hayan desarrollado resistencia a trastuzumab y lapatinib.

La resistencia a lapatinib y/o trastuzumab en la célula de cáncer de mama puede desarrollarse por vahos mecanismos. Uno de estos mecanismos es el mediado por las enzimas con actividad quinasa PI3K y AKT (O'Brien N. et.al. "Activated phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling confers resistance to trastuzumab but not lapatinib" Mol. Cáncer Therap. 2010, vol. 9, pp. 1489- 1502). Un segundo mecanismo es el mediado por el receptor de estrógeno (ER) (Rexer B., et.al., "Overcoming resistance to tyrosine kinase inhibitors" Cell Cycle 2009, vol 8, pp. 18-22). A pesar de los avances realizados, la elucidación de los mecanismos involucrados en la aparición de resistencia, así como las condiciones bajo las cuales se desarrolla, son aún objeto de intensa investigación. Múltiples líneas celulares han sido utilizadas para estudiar los mecanismos moleculares de resistencia mediante los cuales estas terapias son

circunvaladas por la célula cancerígena. Algunas de las líneas celulares exhiben un fenotipo de resistencia primaria, según el cual la célula ya es resistente, incluso antes de ser expuesta a los dos fármacos. Entre estas se encuentran las líneas UACC-893, MDA-453 o JIMT-1 (Barok, M., et. al.

"Trastuzumab-DM1 causes tumour growth inhibition by mitotic catastrophe in trastuzumab-resistant breast cáncer cells in vivo" Breast Cáncer Res. 201 1 , vol. 13, pp. 1 -1 1 ).

Sin embargo, otras líneas celulares susceptibles (no resistentes) han sido inducidas a desarrollar resistencia mediante la exposición continua y prolongada al trastuzumab y/o lapatinib. En un estudio recientemente divulgado, una línea celular no resistente ni a T ni a L, la BT474, fue expuesta a trastuzumab, a lapatinib, o a trastuzumab+lapatinib

simultáneamente durante un período de tiempo suficiente como para inducir la resistencia (Huang C, et. al. "β1 integrin medíate an alternative survival pathway in breast cáncer cells resistant to lapatinib". Breast Cáncer Res. 201 1 , vol. 13, pp. 1 -15). El desarrollo de estas 3 líneas celulares estables y resistentes a T, a L, o doble resistentes a T+L, permitió descubrir el papel que puede jugar la integrina β1 en el desarrollo de una ruta alternativa de supervivencia. Se comprobó que las células resistentes a L, y las doble resistentes a T+L desarrollaron mecanismos basados en la ruta mediada por la integrina β1 , mientras que las T-resistentes no lo hacían. Esto indicaría que un nuevo tratamiento centrado en anular la transducción de señal mediada por β1 podría tener un efecto terapéutico en aquellos pacientes que hayan desarrollado resistencia a lapatinib o doble resistencia a

lapatinib+trastuzumab.

Estudios como los citados anteriormente apuntan a la variabilidad y heterogeneidad de mecanismos de resistencia y proliferación que puede desarrollar la célula cancerígena. A pesar de la existencia de las líneas celulares mencionadas más arriba, continúan siendo necesarias

herramientas adicionales con las que estudiar la complejidad del cáncer de mama y que permitan descubrir compuestos alternativos, útiles y efectivos en el tratamiento para combatir el cáncer de mama resistente.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han desarrollado una línea celular de cáncer de mama de tipo HER2+ con doble resistencia inducida a lapatinib y trastuzumab.

Así, en un primer aspecto, la invención proporciona una línea celular de cáncer de mama HER2+ estable con doble resistencia inducida a lapatinib y trastuzumab caracterizada por que los receptores EGFR, HER2, y HER4 se encuentran hiperfosforilados. Al contrario de la línea celular reportada por Huang et.al (supra), la línea celular del primer aspecto de la invención no muestra una sobreactivación de la ruta mediada por la integrina β1 , sino que muestra una sobreactivación por fosforilación de los receptores EGFR (p-EGFR), HER2 (p-HER2), HER4 (p- HER4). Así, la línea celular de la presente invención es una herramienta muy útil para identificar nuevos tratamientos que interfieran con las rutas mediadas por estos receptores hiperfosforilados (sobreactivados) en un contexto de doble resistencia a trastuzumab y lapatinib.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un cultivo que comprende la línea celular del primer aspecto de la invención.

Los inventores, con el fin de obtener la línea celular del primer aspecto de la invención, han desarrollado un procedimiento en el que se expone una línea de cáncer de mama HER2+ (no tiene resistencia primaria ni a L ni T) de manera secuencial a trastuzumab y lapatinib. En particular, han comprobado que se ha de llevar a cabo primero la exposición a L o T y después a una exposición simultánea de L+T, con el fin de que la línea celular resultante muestre las propiedades y ventajas indicadas más arriba (como, por ejemplo, la hiperfosforilación de la familia de receptores HER).

Así, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona un

procedimiento de preparación de una línea celular según se define en el primer aspecto, que comprende: (a) exponer una línea celular progenitora de cáncer de mama HER2+ no resistente, a un compuesto seleccionado de entre lapatinib o trastuzumab, y (b) exponer la línea celular resultante de la etapa (a) a lapatinib y trastuzumab, simultáneamente.

Como ya se ha indicado más arriba, la línea celular de la invención ha resultado ser una herramienta muy útil en el cribado de tratamientos alternativos a los existentes para el cáncer de mama doble resistente.

Así, en un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para determinar si un agente candidato a agente anticancerígeno inhibe la proliferación de la línea celular del primer aspecto, que comprende: a) contactar la línea celular con el agente candidato; b) medir la proliferación de la línea celular contactada con el agente, de tal manera que si se observa una reducción de la proliferación es indicativo que el agente candidato inhibe la proliferación celular.

De igual manera, la línea celular de la invención puede ser utilizada para identificar combinaciones de fármacos. Por ejemplo, se puede dar el caso de fármacos que no tengan una actividad destacable por sí solos, pero que su exposición a la célula cancerosa doble resistente conlleve que ésta sea más sensible a un segundo fármaco.

Así, en un quinto aspecto, la invención también proporciona un método para determinar si un agente candidato a agente anticancerígeno aumenta la sensibilidad de la línea celular del primer aspecto a un agente citotóxico, que comprende: a) contactar la línea celular con el agente candidato en presencia del agente citotóxico; b) medir la proliferación de la línea celular contactada con el agente candidato y el agente citotóxico, de tal manera que si se observa una reducción de la proliferación aún mayor que la que se observa únicamente con el agente citotóxico, es indicativo que el agente candidato aumenta la sensibilidad de la línea celular al agente citotóxico.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una línea celular según el primer aspecto, para la identificación de compuestos candidatos a agente anticancerígeno y/o compuestos que aumentan la sensibilidad a un agente citotóxico.

La utilización de esta nueva línea celular doble resistente como herramienta para el cribado de nuevos tratamientos ha permitido descubrir una

combinación terapéutica que permite tratar el cáncer de mama doble resistente a L+T. Esta combinación comprende un inhibidor de mTOR ("mammalian target of rapamycin") y un inhibidor de la enzima Fatty Acid Synthase (FASN).

Los inventores han encontrado, sorprendentemente, que cuando se administra esta combinación se consigue un efecto sinérgico en cuanto a la inhibición de la proliferación celular en la línea celular doble resistente. Así, como se muestra en los ejemplos, la inhibición de la proliferación celular inducida con la combinación de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de FASN es superior a la suma de las inhibiciones de la proliferación celular inducidas por cada uno de los dos inhibidores en monoterapia cuando se usa como modelo la línea HER2+ doble resistente de la presente invención, y no para otras líneas de cáncer de mama carentes de doble resistencia a L y T como por ejemplo la MDA-MB-231 . En consecuencia, la combinación sinérgica de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de FASN puede ser útil en el tratamiento del cáncer de mama en un paciente que haya desarrollado resistencia a trastuzumab y lapatinib.

Además, el hecho de que la combinación de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de FASN muestre sinergia, implica que se puedan utilizar dosis más bajas en terapia combinada. Al demostrar sinergia, la administración conjunta de los dos tipos de inhibidores puede tener un efecto terapéutico igual o superior al que se obtiene con dosis mucho más altas de cualquiera de los dos tipos de inhibidores en régimen de monoterapia. Así, en un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de un inhibidor de FASN o un derivado del mismo en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer de mama de tipo HER2+ doble resistente a trastuzumab y lapatinib, en donde dicho medicamento es para su uso en combinación terapéuticamente efectiva con un inhibidor mTOR, o un derivado del mismo.

Este sexto aspecto puede ser reformulado como un inhibidor de mTOR para su uso en el tratamiento de cáncer de mama HER2+ doble resistente a T y L en terapia combinada con un inhibidor de FASN.

Así mismo, este sexto aspecto puede ser reformulado también como una combinación de un inhibidor de mTOR y un agente terapéutico adicional que consiste en un inhibidor de FASN para el uso en el tratamiento del cáncer de mama HER2+ resistente a T y L.

De igual manera, este sexto aspecto se puede también reformular como un método para tratar el cáncer de mama HER2+ resistente a trastuzumab y lapatinib que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una combinación que comprende un inhibidor de mTOR o derivado del mismo y un inhibidor de FASN o derivado del mismo. La combinación de un inhibidor de FASN y un inhibidor de mTOR puede formar parte de una composición farmacéutica con fines terapéuticos. Así, un séptimo aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de FASN o un derivado del mismo y un inhibidor mTOR, o un derivado del mismo juntamente con excipientes y/o portadores farmacéuticamente aceptables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 . Expresión de β1 integrina en las células doble resistentes (SKLTR) en comparación con las monoresistentes (SKLR) y parentales (SKBr3). La misma cantidad protéica de lisados de las líneas celulares se separaron por electroforesis y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, dónde se incubaron con el atricuerpo anti-βΐ integrina. La técnica se comprobó utilizando β-actina como control. Los geles mostrados en esta figura son representativos de 2 o 3 experimentos independientes. Se comprobó la diferencia de expresión entre las células SKLTR y las A431 control.

FIG. 2. Efecto de la combinación de temsirolimus más G28UCM en la viabilidad celular, comparando con los tratamientos administrados en monoterapia. Las células SKLTR fueron tratadas durante 48 horas con diferentes concentraciones de G28UCM (1 -10 μΜ), de temsirolimus (0.2-1 μΜ) o la combinación de ambos fármacos (0.2 o 1 μΜ de temsirolimus más diferentes combinaciones de G28UCM (1 -10 μΜ)). Los puntos representan el promedio de los triplicados de un experimento y las barras el error estándar. Se muestra un experimento representativo de cómo mínimo dos realizados por triplicado y diferentes regímenes de combinación. -■- representa la administración G28UCM; -0- representa la administración de 0.2 μΜ temsirolimus y -o- la administración de 1 μΜ de temsirolimus; las línias discontinuas representan la coadministración de temsirolimus + G28UCM (-0- representa la administración de 0.2 μΜ temsirolimus + G28UCM y -o- la administración de 1 μΜ temsirolimus + G28UCM). En el eje de las x se representa la concentración de G28UCM (μΜ) mientras que en el de las y se representa el % de viabilidad celular.

FIG. 3. Efecto de la combinación de temsirolimus más G28UCM en la viabilidad de la línea celular HER2- MDA-MB-231 . Las células MDA-MB-231 fueron tratadas durante 48 horas con diferentes concentraciones de

G28UCM (5-15 μΜ), de temsirolimus (4 -8 μΜ) o la combinación de ambos fármacos (4 o 8 μΜ de temsirolimus más diferentes combinaciones de

G28UCM (5-15 μΜ)). Los puntos representan el promedio de los triplicados de un experimento y las barras el error estándar. Se muestra un experimento representativo de cómo mínimo dos realizados por triplicado y diferentes regímenes de combinación. -■- representa la administración G28UCM; -0- representa la administración de 4 μΜ temsirolimus y -o- la administración de 8 μΜ de temsirolimus; las línias discontinuas representan la coadministración de temsirolimus + G28UCM (-0- representa la administración de 4 μΜ temsirolimus + G28UCM y -o- la administración de 8 μΜ temsirolimus + G28UCM). En el eje de las x se representa la concentración de G28UCM (μΜ) mientras que en el de las y se representa el % de viabilidad celular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones.

Los términos utilizados en la presente solicitud están relacionados con la biología celular y son conocidos por el experto en la materia.

El término "amplificación", referido a un gen, como se utiliza aquí, significa que el gen en cuestión presenta en la célula un número de copias supenor al que presenta en una célula parental. Es decir, la célula parental tiene un número de copias del gen, y después de ser sometida a un cierto tratamiento, presenta un número de copias superior al que tenía antes del tratamiento.

El término "sobreexpresión" o "expresión incrementada", referido a una proteína, como se utiliza aquí, significa que el gen que codifica para la proteína tiene unos niveles de expresión (mRNA) determinados en la célula parental, y que, una vez sometida la célula parental a un cierto tratamiento, se producen una serie de cambios que tienen como consecuencia que los niveles de mRNA se ven incrementados. El término "hiperfosforilado", referido a una proteína presente en, o producida por una línea celular en concreto (sea un enzima, un receptor de membrana, etc), como se utiliza aquí, significa que la proteína presenta una activación mediante fosforilación superior a aquella que presenta la misma proteína en la una línea celular parental. En este sentido, en la presente memoria se utiliza también el término "sobreactivación". Así, si una línea celular parental tiene un nivel determinado de fosforilación de una proteína, y un nivel superior de fosforilación una vez ha sido sometida a un determinado tratamiento, se entiende que la proteína presenta "sobreactivación".

El término "línea celular estable" como se utiliza aquí, significa una línea celular que puede perpetuarse mediante sucesivas divisiones celulares sin perder las características que la diferencian de otras líneas celulares.

El término "resistencia inducida" como se utiliza aquí, significa que la línea celular parental no es resistente a un fármaco en concreto, y que la resistencia al mismo se desarrolla mediante la exposición de la línea celular parental no resistente al fármaco durante un período de tiempo continuado, de tal manera que se selecciona positivamente las mutaciones y/o cambios que confieren dicha resistencia. Otro término sería la "resistencia primaria", según la cual la línea celular es resistente al fármaco en cuestión incluso antes de ser expuesta al mismo. El término "progenia derivada" como se utiliza aquí, significa clones de células obtenidos a partir de la dilución de la línea celular que forma parte de la invención.

El término "inhibición o disminución de la proliferación celular" como se utiliza aquí, significa que al administrarse un compuesto o compuestos en un experimento de cribado, se detecta que tienen efectos citocidas o citostáticos sobre las células cancerosas y como consecuencia, las células expuestas al tratamiento se reproducen menos que aquellas no tratadas. El término "cantidad terapéuticamente aceptable" como es usado aquí, se refiere a una cantidad de un compuesto que, cuando se administra, no provoca efectos secundarios o toxicidad inaceptable al paciente y es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar de algún modo, uno o más síntomas de una enfermedad o afección. La dosis particular de compuesto administrado según la invención será determinada obviamente por las circunstancias asociadas a cada caso, que incluyen el compuesto

administrado, la ruta de administración, la enfermedad que se trata, y consideraciones similares.

El término "composición farmacéutica" se refiere a la mezcla de los

compuestos que se divulgan aquí con otros componentes químicos, como por ejemplo diluyentes. La composición farmacéutica facilita la administración de las vesículas que cargan el agente terapéutico al organismo.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente, o material de encapsulación. Cada componente tiene que ser aceptable

farmacéuticamente en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. Ha de ser adecuado para el uso en contacto con tejidos u órganos de humanos y animales sin demasiada toxicidad, irritación o respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones acordes con un ratio razonable de riesgo/beneficio

El termino "tratamiento" como se utiliza aquí, se refiere a aliviar o eradicar una enfermedad o afección, aliviar o eradicar uno o más síntomas asociados a la enfermedad o afección, o a aliviar o eradicar la causa de la enfermedad o afección.

El término "intervalo terapéuticamente efectivo" como se utiliza aquí, se refiere a un período de tiempo que empieza cuando el inhibidor de mTOR o el inhibidor de FASN son administrados a un paciente y termina en el límite del efecto beneficioso anticancerígeno de la combinación del inhibidor de mTOR y el inhibidor de FASN.

El término "combinación terapéuticamente efectiva" como se utiliza aquí, se refiere a la administración de a) un inhibidor de mTOR y b) un inhibidor de FASN simultáneamente o separadamente, en cualquier orden. Cuando se dan separadamente, los inhibidores de mTOR y FASN pueden ser administrados con diferentes regímenes. Cualquiera de ellos puede ser administrado antes que el otro, siempre y cuando las dos administraciones caigan dentro de un intervalo terapéuticamente efectivo. Los métodos de administración pueden variar. Así, uno de los dos agentes puede ser administrado oralmente, mientras que el otro puede ser administrado por vía intravenosa. En cualquier caso, estos agentes tienen que ser administrados de tal manera que se optimice su rendimiento.

Como se ha descrito anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una línea celular de cáncer de mama HER2+ estable con doble resistencia inducida a lapatinib y trastuzumab caracterizada por que los receptores EGFR, HER2, y HER4 se encuentran hiperfosforilados.

En una realización del primer aspecto de la invención, la línea celular muestra que el receptor EGFR está de 23 a 47 veces más fosforilado que este mismo receptor en una línea celular de cáncer de mama no resistente, el receptor HER2 está de 3 a 6 veces más fosforilado que este mismo receptor en una línea celular de cáncer de mama no resistente y el receptor HER4 está de 4 a 8 más fosforilado que este mismo receptor en una línea celular de cáncer de mama no resistente. Por el contrario, la fosforilación del receptor HER3 disminuye a la mitad, obteniendo una fosforilación del 30 al 70% comparado con el 100% de fosforilación de las células no resistentes.

En otra realización de la invención, el receptor EGFR está 35.5 veces más fosforilado, el receptor HER2 está 4.5 veces más fosforilado, y el receptor

HER4 está 6.5 veces más fosforilado, que los mismos receptores en una línea celular de cáncer de mama no resistente.

En otra realización del primer aspecto de la invención, en la línea celular, los ligandos EGF, TGF-a, AR, BTC, EREG y HB-EGF están sobreexpresados con respecto a estos mismos ligandos en una línea celular de cáncer de mama no resistente.

En otra realización del primer aspecto de la invención, en la línea celular, la expresión de ligando EGF está de 6 a 10 veces, el TGF-a está de 1 .2 a 1 .8 veces, el AR está de 2 a 4 veces, el BTC está de 1 .2 a 1 .8 veces, el EREG está de 10 a 20 veces y el HB-EGF está de 4 a 6 veces incrementada con respecto a la expresión de los mismos ligandos en una línea celular de cáncer de mama no resistente.

En otra realización del primer aspecto de la invención, en la línea celular, la expresión del ligando EGF está 8.1 veces, el TGF-a está 1 .5 veces, el AR está 2.9 veces, el BTC está 1.5 veces, el EREG está 14.4 veces y el HB-EGF está 4.8 veces incrementada con respecto a la expresión de los mismos ligandos en una línea celular de cáncer de mama no resistente. En todavía otra realización del primer aspecto, la línea celular es la que ha sido depositada en la institución "American Type Culture Collection" con la identificación de referencia "Human breast cáncer cell line, SKLTR, created from SKBr3 and resistant to lapatinib and trastuzumab" o una progenia derivada de la misma. La fecha de depósito de esta línea celular es el 26.07.2012. A esta línea celular se le ha otorgado el número de depósito PT-13103 en la American Type Culture Collection.

En todavía otra realización del primer aspecto, la línea celular es la que ha sido depositada en la institución "American Type Culture Collection" con la identificación de referencia "Human breast cáncer cell line, SKLTR, created from SKBr3 and resistant to lapatinib and trastuzumab" y a la que se le ha otorgado el número de depósito PT-13103 en la American Type Culture Collection. En todavía otra realización del primer aspecto, la línea celular es la que ha sido depositada en la institución "American Type Culture Collection" con la identificación de referencia "SKTLR" o una progenia derivada de la misma. La fecha de depósito de esta segunda línea celular es el 19.07.2013. En todavía otra realización del primer aspecto, la línea celular es la que ha sido depositada en la institución "American Type Culture Collection" con la identificación de referencia " SKTLR".

En otra realización de la invención, se proporciona un modelo animal que comprende la línea celular de cáncer de mama del primer aspecto. En esta realización, la línea celular debe ser transplantada en un animal como por ejemplo un ratón desnudo (nude) inmunodeficiente (también se pueden utilizar, la rata o el conejo). Estos ratones, cuando son homocigotos para el gen nude (nu/nu), carecen de timo funcional, y producen un número reducido de células T maduras por lo cual no rechazan tejidos alo y

xenotrasplantados. El hecho de que acepten células transplantadas los convierte en modelos animales que pueden ser utilizados para el screening de compuestos anticancerígenos in vivo.

En este sentido, el método de screening se ha de basar en los siguientes pasos: 1 ) administrar los compuestos candidatos al animal mediante cualquier vía (oral, intravenosa, etc); 2) medir la proliferación de las células transplantadas; 3) seleccionar aquellos compuestos candidatos que provoquen una disminución o inhibición de la proliferación celular en el tumor insertado. Un cribado de compuestos realizado con un modelo animal de estas características puede ser más ventajoso que un cribado in vitro, ya que, si se detecta un efecto terapéutico del agente probado en el animal, se deduce no sólo que el agente probado tiene actividad anticancerígena, sino que además cumple con los requisitos de solubilidad, permeabilidad, absorción, distribución, biodisponibilidad, etc. que son deseables en farmacología. Los agentes terapéuticos a probar pueden ser cualquier tipo de molécula con capacidad citostática o citocida, o moléculas que aumenten la eficacia de un segundo fármaco. El agente candidato puede ser una molécula orgánica, un polipéptido, un ácido nucleico, un anticuerpo, un metal, radioterapia o una combinación de los mismos. Como se ha descrito más arriba, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una línea celular del primer aspecto que comprende: (a) exponer una línea celular progenitora de cáncer de mama HER2+ no resistente, a un compuesto seleccionado de entre lapatinib o trastuzumab, y (b) exponer la línea celular resultante de la etapa (a) a lapatinib y trastuzumab, simultáneamente.

En otra realización del tercer aspecto, la primera etapa del procedimiento se lleva a cabo exponiendo primero la línea progenitora (no resistente) a lapatinib, de manera que pnmeramente dicha línea desarrolle la resistencia a dicho fármaco. A continuación, una vez la línea celular ha desarrollado resistencia a lapatinib, ésta es expuesta a una combinación de lapatinib y trastuzumab. Como se ha indicado más arriba, la manera en que se expone la línea celular de partida a trastuzumab y lapatinib determina el patrón de marcadores de superficie de la célula resultante y, en consecuencia, del tipo de fármacos que se pueden cribar. En otra realización del tercer aspecto, la primera etapa del procedimiento se lleva a cabo exponiendo primero la línea progenitora (no resistente) a trastuzumab, de manera que primeramente dicha línea desarrolle la resistencia a dicho fármaco. A continuación, la línea celular que ya ha desarrollado resistencia a trastuzumab, es expuesta a una combinación de lapatinib y trastuzumab, para acabar teniendo una línea doble resistente.

Como se ha indicado más arriba, la manera en que se expone la línea celular de partida a trastuzumab y lapatinib determina el patrón de marcadores de superficie y, en consecuencia, del tipo de fármacos que se pueden cribar. En vista de lo antenor, en otra realización, la invención proporciona una línea celular obtenible mediante el procedimiento del tercer aspecto de la invención.

En la presente invención, las expresiones "obtenible", "obtenido" y

expresiones equivalentes son usadas de manera intercambiable y, en cualquier caso, la expresión "obtenible" engloba la expresión "obtenido".

Como se ha descrito, en un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de un inhibidor de FASN o un derivado del mismo en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer de mama de tipo HER2+ doble resistente a trastuzumab y lapatinib, en donde dicho medicamento es para su uso en combinación terapéuticamente efectiva con un inhibidor mTOR, o un derivado del mismo. En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo y el inhibidor de FASN o derivado del mismo se administran

separadamente, en cualquier orden, dentro de un intervalo terapéuticamente efectivo. En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo se administra de manera secuencial con el inhibidor de FASN. En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo se administra de manera simultánea con el inhibidor de FASN.

En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste en everolimus, rapamicina y temsirolimus.

En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo es temsirolimus.

En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de FASN o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste en orlistat, C75, EGCG,

G37UCM y 1 ,3-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]naftaleno, de aquí en adelante también referido como G28UCM, y cuya estructura es:

En otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de FASN o derivado del mismo es G28UCM. En todavía otra realización del sexto aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo es temsirolimus y el inhibidor de FASN o derivado del mismo es 1 ,3-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]naftaleno.

Como se ha descrito, en un séptimo aspecto, la invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de FASN o un derivado del mismo y un inhibidor mTOR, o un derivado del mismo juntamente con excipientes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización del séptimo aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste en everolimus, rapamicina y temsirolimus.

En otra realización del séptimo aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo es temsirolimus.

En otra realización del séptimo aspecto, el inhibidor de FASN o derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste en orlistat, C75, EGCG,

G37UCM y G28UCM.

En otra realización del séptimo aspecto, el inhibidor de FASN o derivado del mismo es G28UCM.

En todavía otra realización del séptimo aspecto, el inhibidor de mTOR o derivado del mismo es temsirolimus y el inhibidor de FASN o derivado del mismo es G28UCM.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Los signos numéricos relativos a los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación, son solamente para intentar aumentar la comprensión de la reivindicación, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la protección de la

reivindicación. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.

EJEMPLOS Abreviaturas.

Las abreviaturas de las proteínas citadas en la presente solicitud se listan a continuación, juntamente con su entrada en la base de datos Uniprot modificada el 13 de Junio de 2012 (versión 146). EGF. Epidemial Growth Factor. Entrada en Uniprot P01 133. TGF-a. Transforming Growth Factor alpha. Entrada en Uniprot P01 135. AR. Amphiregulin. Entrada en Uniprot P15514. BTC. Betacellulin. Entrada en Uniprot P35070.

EREG. Epiregulin. Entrada en Uniprot 014944.

NRG-1 . Neuregulin-1 . Entrada en Uniprot E9PHH4. EGFR (sinónimo HER1 ). Epidemial Growth Factor Receptor. Entrada en Uniprot P00533.

HER2 (sinónimo erbB-2). Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2. Entrada en Uniprot P04626.

HER3 (sinónimo erbB-3). Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-3. Entrada en Uniprot P21860.

HER4 (sinónimo erbB-4). Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-3. Entrada en Uniprot Q15303.

AKT (sinónimo proteína quinasa B alpha). Entrada en Uniprot P31749.

ERK1/2 (sinónimo mitogen-activated protein kinase 1 , MAPK). Entrada en Uniprot P27361 . mTOR. mammalian Target of Rapamycin. Entrada en Uniprot P42345. FASN. Fatty acid synthase. Entrada en Uniprot P49327.

HB-EGF. Heparin binding- EGF like growth factor. Entrada en Uniprot Material y Métodos:

Creación de la Línea Doble Resistente (SKLTR). Las células SKBr3 de carcinoma de mama se obtuvieron de Eucellbank (Universidad de

Barcelona). Esta línea celular, es susceptible tanto a lapatinib como a trastuzumab, es decir, no tiene resistencia primaria para ninguno de los dos fármacos. Estas células se cultivan con medio McCoy's (Gibco, Berlín, Alemania) suplementado con el 10% de suero fetal bovino inactivado (FBS, HyClone Laboratories, Utah, EE.UU.), 1 % L-glutamina, 1 % piruvato de sodio, 50 U/mL penicilina y 50 pg/mL estreptomicina (Gibco).

Primero, se crearon las células resistentes a lapatinib SKLR. Se mantuvieron las células SKBr3 en cultivo con una dosis de 1 ,5 μΜ de lapatinib (Tykerb®, proporcionado por Roche, London, Reino Unido), correspondiente a la IC30 de lapatinib en las células parentales SKBr3. Después de un mes de cultivo, se incrementaron la dosis a 3 μΜ, considerando que las células parentales SKBr3 presentan un 50% de viabilidad (IC50) a esta concentración de lapatinib. Estas células SKLR se mantuvieron en cultivo con la dosis de 3 μΜ de lapatinib durante un periodo largo de tiempo (12 meses).

Una vez obtenidas estas células SKLR, se empezaron a co-tratar con lapatinib a 3 μΜ y una dosis inicial de 1 μΜ de trastuzumab (Herceptin®, Hoffmann-La Roche Pharma, Basel, Suiza) durante un mes. Después de este mes, se incrementaron la dosis de trastuzumab a 2 μΜ. (Protocolo

modificado de Nahta R. et al., "In vitro effects of trastuzumab and vinorelbine in trastuzumab-resistant breast cáncer cells" Cáncer Chemother. Pharmacol. 2004, vol. 53, pp. 186-190). Se mantuvieron en cultivo las células SKLTR con el doble tratamiento de lapatinib más trastuzumab durante 12 meses. La resistencia de lapatinib más trastuzumab se confirmó con los experimentos dosis-respuesta que se detallan a continuación.

Creación de la Línea Doble Resistente (SKTLR). Las células SKBr3 de carcinoma de mama se obtuvieron de Eucellbank (Universidad de

Barcelona). Estas células se cultivan con medio McCoy's (Gibco, Berlín, Alemania) suplementado con el 10% de suero fetal bovino inactivado (FBS, HyClone Laboratories, Utah, EE.UU.), 1 % L-glutamina, 1 % piruvato de sodio, 50 U/mL penicilina y 50 μg/mL estreptomicina (Gibco). Primero, se crearon las células resistentes a trastuzumab SKTR. Se mantuvieron las células SKBr3 en cultivo con una dosis de 1 μΜ de trastuzumab (Herceptin®, Hoffmann-La Roche Pharma, Basel, Suiza).

Después de tres meses de cultivo, se incrementó la dosis a 2 μΜ, (Protocolo modificado de Nahta R. et al., Cáncer Chemother Pharmacol., 2004). Estas células SKTR se mantuvieron en cultivo con la dosis de 2 μΜ de trastuzumab durante un periodo largo de tiempo (12 meses). Una vez obtenidas estas células SKTR, se empezaron a co-tratar con trastuzumab a 2 μΜ y una dosis inicial de 0,4 μΜ de lapatinib (Tykerb®, proporcionado por Roche, London, Reino Unido), correspondiente a la IC30 de lapatinib en las células SKTR, durante dos meses y medio. Entonces, las células SKTR eran estables y se incrementó la dosis de lapatinib a 0,7 μΜ, considerando que las células resistentes a trastuzumab SKTR presentan un 50% de viabilidad (IC50) a esta concentración de trastuzumab. Se

mantuvieron en cultivo las células SKTLR con el doble tratamiento de lapatinib más trastuzumab durante un año. Caracterización Molecular de los Receptores de la Familia de Factores de Crecimiento Epidérmico (EGF) y sus Rutas de Señalización. Las células monoresistentes (SKLR) y las dobles resistentes (SKLTR, también

denominada ATCC PT-13103) se deprivaron de suero durante 24 horas con medio McCoy's al 0,5% de FBS. Seguidamente se recogieron, exponiéndolas a tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS y se conservaron a -80°C en formato de pellet celular. Las células se lisaron en frió con tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Inc. , Danvers, MA, EE.UU.) que contiene 1 mM EDTA, 150 mM NaCI, 100 μg/mL PMSF, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) y cocteles inhibidores de proteasas y fosfatasas (Sigma), mezclando con vórtex cada 5 minutos, durante 30 minutos.

Se tomó una muestra para medir el contenido proteico con un ensayo de Lowry (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se calentó la misma cantidad de proteína para cada tipo celular en tampón de muestra LDS y agente reductor (Invitrogen, CA, EE.UU.), durante 10 minutos a 70°C. Las proteínas se separaron por tamaño en geles de SDS-poliacrilamida del 3 al 8 % (SDS-PAGE) (para la detección de EGFR, fosfo-EGFR, HER2, fosfo- HER2, HER3, fosfo-HER3, HER4, fosfo-HER4, mTOR, fosfo-mTOR y FASN) o del 4 al 12 % SDS-PAGE (para la detección de AKT, fosfo-AKT, ERK1/2, fosfo-ERK1/2 and β-actin). A continuación se transfirieron las proteínas separadas a membranas de nitrocelulosa. Para prevenir la unión no específica del anticuerpo, estas membranas se incubaron en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (2,5 % de leche en polvo desnatada disuelta en una solución de tampón fosfato salino que contiene 0,05 % de Tween 20, PBS-Tween (10 mM Tris-HCL pH 8,0 y 150 mM NaCI). Las membranas se incubaron durante la noche a 4°C en agitación con el anticuerpo primario correspondiente diluido en tampón de bloqueo. Al día siguiente, las membranas se lavaron 3 veces agitando durante 5 minutos con PBS-Tween y a continuación se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario correspondiente, que está unido a peroxidasa, y se visualizó utilizando un producto comercial

quimioluminiscente (Sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico o Super Signal West Femto de Thermo Scientific Inc. (NY, EE.UU.) o sustrato Immobilon Western HRP de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.)). Se comprobó la transferencia y la carga de proteína con un anticuerpo contra β-actina. Esta técnica se repitió al menos dos veces con muestras independientes.

A partir de las imágenes obtenidas, y con el programa Kodak de

cuantificación de bandas, se midió la intensidad de señal de cada banda de proteína de interés y se comparó el valor de intensidad obtenido en las bandas de la línea SKLTR con el valor obtenido de la misma banda en la línea parental no resistente (SKBr3) (valor SKLTR / valor SKBr3), para obtener los "Folds" o veces de expresión, es decir, el incremento o disminución en la cantidad proteica que se expresa en las células SKLTR comparada con su control. Caracterización de los ligandos de los receptores de la familia EGF. La expresión de los ligandos, factores de crecimiento epidérmico (EGF) se cuantificaron mediante análisis de PCR cuantitativa. Las células

monoresistentes (SKLR) y las dobles resistentes (SKLTR) se deprivaron de FBS durante 24 horas con medio McCoy's al 0,5% de FBS. Seguidamente se recogieron, tratándolas con tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS y se conservaron a -80°C en formato de pellet celular. El ARN total de cada muestra se aisló utilizando el ensayo RNeasy mini kit (Qiagen, Venlo, Holanda). La concentración de ARN se midió utilizando el espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE.UU.) a 260 nm, y 1 g de cada muestra de ARN fue inversamente-transcrito a ADN

complementario (DNAc) utilizando el ensayo High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). La expresión de los ligandos (factor de crecimiento transformante (TGF-α), amfiregulina (AR), betacelulina (BTC), epiregulina (EPR), factor de crecimiento de unión a heparina similar a EGF (HB-EGF) y neuregulina (NRG-1 )) se cuantificó con PCR a tiempo real, utilizando conjuntos de cebadores y sondas TaqMan® prediseñadas, específicas de cada gen (TaqMan® Gene Expression assays, Applied

Biosystems). La PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando placas de 96 pocilios de formato estándar y utilizando la mezcla TaqMan One-Step

Universal Master Mix (Applied Biosystems) y el sistema de PCR a tiempo real 7300 Real-Time PCR system (Applied Biosystems). Las condiciones de delación fueron: 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Todas las muestras se analizaron en triplicado. La cuantificación relativa de los niveles de ARN mensajero (pg/mL) de los ligandos se llevó a cabo preparando una curva estándar, utilizando diluciones conocidas de los ARN estándares

correspondientes. Entonces, los niveles de ARNm se normalizaron con los niveles de ARNm de los genes endógenos de la proteína de unión a la caja TATA (TBP).

A partir de los valores obtenidos, se comparó el valor de expresión de cada ligando de la línea SKLTR con el valor obtenido del mismo ligando en la línea parental no resistente (SKBr3) (valor SKLTR / valor SKBr3), para obtener los "Folds" o veces de expresión, es decir, el incremento o disminución en la cantidad de ARNm que se expresa en las células SKLTR comparada con su control.

Caracterización Molecular del receptor β1 integrina. Las células parentales SKBR3, las monoresistentes (SKLR), las dobles resistentes (SKLTR) y las células control que sobreexpresan β1 integrina (A431 ) se deprivaron de suero durante 24 horas con medio McCoy's al 0,5% de FBS. Seguidamente se recogieron, exponiéndolas a tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS y se conservaron a -80°C en formato de pellet celular. Las células se lisaron en frió con tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Inc. , Danvers, MA, EE.UU.) que contiene 1 mM EDTA, 150 mM NaCI, 100 pg/mL PMSF, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) y cócteles inhibidores de proteasas y fosfatasas (Sigma), mezclando con vórtex cada 5 minutos, durante 30 minutos. Se tomó una muestra para medir el contenido proteico con un ensayo de Lowry (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se calentó la misma cantidad de proteína para cada tipo celular en tampón de muestra LDS y agente reductor (Invitrogen, CA, EE.UU.), durante 10 minutos a 70°C. Las proteínas se separaron por tamaño en geles de SDS-poliacrilamida del 4 al 12 % SDS-PAGE. A continuación se transfirieron las proteínas separadas a membranas de nitrocelulosa. Para prevenir la unión no específica del anticuerpo, estas membranas se incubaron en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (2,5 % de leche en polvo desnatada disuelta en una solución de tampón fosfato salino que contiene 0,05 % de Tween 20, PBS-Tween (10 mM Tris-HCL pH 8,0 y 150 mM NaCI). Las membranas se incubaron durante la noche a 4°C en agitación con el anticuerpo primario correspondiente, anti-βΐ integrina (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), diluido en tampón de bloqueo. Al día siguiente, las membranas se lavaron 3 veces agitando durante 5 minutos con PBS- Tween y a continuación se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario correspondiente, que está unido a peroxidasa, y se visualizó utilizando un producto comercial quimioluminiscente (Sustrato

quimioluminiscente Super Signal West Pico o Super Signal West Femto de Thermo Scientific Inc. (NY, EE.UU.) o sustrato Immobilon Western HRP de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.)). Se comprobó la transferencia y la carga de proteína con un anticuerpo contra β-actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Esta técnica se repitió al menos dos veces con muestras independientes. Determinación del Efecto de temsirolimus y G28UCM, administrados individualmente (monoterapia). Cuando la línea celular doble resistente (SKLTR) estuvo establecida, las células se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 7000 células/100 L/pocillo. Después de una incubación de 24 horas, las células se habían adherido a la placa, y se substituyó el medio de cultivo por medio nuevo suplementado con

concentraciones crecientes del inhibidor de mTOR, temsirolimus (0,5-15 μΜ) o del inhibidor de FASN, G28UCM (1 -30 μΜ). Los tratamientos no se renovaron durante el periodo de exposición de las células (2 días). Las células control (sin tratamiento), se cultivaron bajo las mismas condiciones y con los mismos cambios de medio de cultivo. Transcurrido el tiempo de exposición, se retiró el medio con tratamiento y se substituyó por medio nuevo (100 L/pocillo) al que se añadió 10 μί de bromuro de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) (5 mg/ml_ en PBS). Se prolongó la incubación durante 3 horas a 37°C. El metabolismo de las células viables sintetiza cristales de formazan, que se disolvieron con dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma), 100

L/pocillo. Se determinó la densidad óptica a 570 nm en un lector de placas (Spectra max 340PC (380), BioNova Científica s.l., Madrid, España). Con los valores de densidad óptica de las células control (OD control) y los de las células tratadas (OD problema), utilizando la fórmula ((OD control - OD problema) / OD control) ^* 100, se obtuvo la viabilidad celular a cada valor de concentración del fármaco. Se realizaron tres experimentos independientes con triplicados en cada uno de ellos.

Determinación del Efecto de temsirolimus más G28UCM, Administrados en Combinación. Las células MDA-MB-231 de carcinoma de mama triple negativo (HER2-/ER-/PR-) se obtuvieron de Eucellbank (Universidad de Barcelona). Estas células se cultivaron con medio Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Gibco) suplementado con el 10% de suero fetal bovino inactivado (FBS, HyClone Laboratories, Utah, EE.UU.), 1 % L- glutamina, 1 % piruvato de sodio, 50 U/mL penicilina y 50 pg/mL

estreptomicina (Gibco).

Conociendo las dosis de temsirolimus y de G28UCM necesarias para inhibir la proliferación de las células SKLTR (IC50) y de las MDA-MB-231 , se trataron las células con la combinación de los dos fármacos para saber si los efectos de ambos tratamientos se multiplican (sinergismo), se suman (aditivismo) o se restan (antagonismo). Utilizamos el método del

isobolograma (Ropero S. et al., " trastuzumab plus tamoxifen: anti- proliferative and molecular interactions in breast carcinoma", Breast Cáncer Res. Treat., 2004, vol. 86, pp. 125-137; Menendez JA., et. al. , "Inhibition of tumor-associated fatty acid synthase heperactivity induces synergistic chemosensitization of Her-2/neu-overexpressing human breast cáncer cells to decetaxel (taxotere)" Breast Cáncer Res. Treat. 2004, vol. 84, pp. 183- 195). Explicado de forma resumida, las células SKLTR o MDA-MB-231 se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 7000 células/100 L/pocillo. Después de una incubación de 24 horas, las células se habían adherido a la placa, y se substituyó el medio de cultivo por medio nuevo suplementado con concentraciones fijadas del inhibidor de mTOR, temsirolimus (0,05, 0, 1 , 0, 15, 0,2, 0,5, 1 , 4, 6 y 8 μΜ) más concentraciones crecientes del inhibidor de FASN, G28UCM (0, 1 -25 μΜ). Los tratamientos no se renovaron durante el periodo de exposición de las células (2 días). Las células control (sin tratamiento), se cultivaron bajo las mismas condiciones y con los mismos cambios de medio de cultivo.

Transcurndo el tiempo de exposición, se retiró el medio con tratamiento y se substituyó por medio nuevo (100 L/pocillo) al que se añadió 10 μί de bromuro de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma) (5 mg/mL en PBS). Se prolongó la incubación durante 3 horas a 37°C. El metabolismo de las células viables sintetiza cristales de formazan, que se disolvieron con dimetiisulfoxido (DMSO, Sigma), 100 L/pocillo. Se determinó la densidad óptica a 570 nm en un lector de placas (Spectra max 340PC (380), BioNova Científica s.l., Madrid, España). Con los valores de densidad óptica de las células control (OD control) y los de las células tratadas (OD problema), utilizando la fórmula (OD control - OD problema) / OD control) ^* 100, se obtuvo la viabilidad celular a cada valor de concentración del fármaco y se pudo extrapolar la concentración que inhibe el 30 % de la proliferación celular (IC30) de la línea de tendencia.

A partir de la IC30 se puede graficar y calcular el ¡sobólo. En resumen, se sitúa la concentración que provoca el 30 % de inhibición de la proliferación celular (IC30) en el eje horizontal, y la concentración del otro fármaco que provoca el mismo efecto en la viabilidad de las células, en el eje vertical. Se traza una línea entre éstos dos puntos, que representa la interacción cero, los efectos de los dos fármacos se suman (aditivismo). La concentración de cada fármaco que al combinarse provoca la muerte del 30 % de las células también se representan en el gráfico, son los puntos experimentales de la combinación. Cuando estos puntos se sitúan por debajo de la línea de aditivismo, los efectos de la combinación de los dos fármacos se consideran supra-aditivos (sinergismo). Al contrario, si los puntos se sitúan por encima de la línea, los efectos de los dos fármacos al combinarse se restan, se considera antagonismo.

También se obtuvo un índice cuantitativo con la fórmula Ix = (A/a) + (B/b); a y b representan las concentraciones de los fármacos (temsirolimus y G28UCM) requeridas para producir el 30 % de inhibición de la proliferación celular, cuando se administran solos. A y B, representan las concentraciones de los fármacos requeridas para obtener el mismo efecto en la viabilidad celular, cuando se administran en combinación. Ix es el índice de interacción, si el valor de Ix es <1 indica sinergismo, si el valor es 1 representa aditivismo, y si es >1 la combinación es antagónica. Los experimentos se realizaron un mínimo de dos veces y en triplicados.

Resultados:

Caracterización Molecular de los Receptores de la Familia EGF y sus Rutas de Señalización. La adquisición de resistencia a trastuzumab más lapatinib (inhibidores de los receptores EGFR y HER2) se puede deber a cambios en la expresión y/o activación de receptores alternativos de la misma familia (EGF) que mantienen activada la ruta de supervivencia celular de las líneas tumorales (AKT, MAPK, mTOR) (Gravdal Lm. et al. "EGF receptor inhibitors increase ErbB3 mRNA and protein levéis in breast cáncer cells" Cell Signal. 2012, vol. 24, pp. 296). Las células SKLTR, mostraron hiperfosforilación para los receptores EGFR (p-EGFR), HER2 (p-HER2) y HER4 (p-HER4). Como consecuencia, se sobreactivó la quinasa ERK1/2 (p-ERK1/2), mientras que las proteínas AKT (p-AKT) y mTOR (p-mTOR) mantuvieron el mismo nivel de activación que las células parentales. Estas proteínas (AKT, ERK1/2 y mTOR) forman parte de la ruta de señalización de la familia de receptores EGFR y provocan el mantenimiento de la viabilidad celular, entre otros procesos tumorales. Al adquirir resistencia, también se incrementó la expresión de FASN. Estos descubrimientos indican que las células dobles resistentes de la presente invención, con FASN sobreexpresado, podrían ser un modelo in vitro de tumores que han adquirido un fenotipo más agresivo al adquirir resistencia a trastuzumab más lapatinib.

En relación a lo señalado más arriba, se realizó una valoración de la variación en el patrón de hiperfosforilación de los receptores de la familia HER en la línea doble resistente con respecto a la línea parental no resistente, es decir, la cantidad de receptor fosfori lado en las SKLTR con respecto a las SKBr3 parentales sensibles a L y T. Como se puede comprobar en la Tabla 1 , varios de los receptores de la familia Her presentan una fosforilación claramente superior en las SKLTR (doble resistente, ATCC PT-13103) que en la célula parental (sensible a L y T) una vez se desarrolló resistencia a los dos fármacos.

Tabla 1

Caracterización de los ligandos de los receptores de la familia EGF. Se estudiaron los ligandos que provocan la dimehzación y con ello activación de los receptores de la familia HER. En el proceso de adquisición de doble resistencia a partir de las células resistentes a lapatinib (SKLR), la mayoría de los ligandos EGF de las células SKLTR se vieron altamente

sobreexpresados.

En relación a lo señalado más arriba, se realizó una valoración de la variación en el patrón de expresión de genes de los ligandos de los receptores de la familia HER en la línea doble resistente con respecto a la línea parental, es decir, la relación de expresión génica en SKLTR con respecto a SKBr3. Como se puede comprobar en la Tabla 2, muchos de ellos tienen expresiones claramente superiores (a nivel de mRNA) una vez se desarrolló resistencia a los dos fármacos.

Tabla 2

Veces con respecto a

EGF TGF-a AR BTC EREG NRG-1 HB-EGF SKBr3

SKLTR 8.1 1 .5 2.9 1 .5 14.4 N.d. 4.8 Caracterización Molecular del receptor β1 integrina. Después de crear las células con resistencia a lapatinib más trastuzumab, adquirida a largo plazo (SKLTR), se caracterizó la ruta de la familia de los receptores de crecimiento epidérmico (HER) y, como se comprueba más arriba, se demostró que éstas son capaces de sobrevivir al tratamiento anti-tumoral gracias a la activación de receptores alternativos de la misma familia (EGFR, HER2, HER3 y/o HER4) ya sea por la sobreexpresion de estos o por la sobreactivación debida a un incremento de sus ligandos (TGF-α, AR, BTC, EPR, HB-EGF y/o NRG- 1 ).

Con el objetivo de demostrar que la línea celular de la invención tiene mecanismos moleculares de supervivencia y proliferación diferentes a los de otras líneas que se encuentran en el estado de la técnica, como por ejemplo la divulgada por Huang et.al. (citada más arriba), se comprobó el nivel de activación de la ruta mediada por la integrina β1 en las células de la invención SKLTR.

Como se muestra en la FIG. 1 , se comprobó que las células SKLTR no expresan una cantidad significativa de proteína β1 integrina. Según la figura, se comprobó que la expresión de la integrina ni se incrementa al adquirir las células resistencia a lapatinib (SKLR) a partir de las células parentales (SKBr3), ni al adquirir resistencia a lapatinib más trastuzumab a partir de las células SKLR. Por lo tanto, en la línea celular de la invención, la integrina β1 no está implicada en la adquisción de resistencia a L+T, demostrándose así que los mecanismos de resistencia desarrollados por las SKLTR están claramente diferenciados de aquéllos desarrollados por la línea divulgada por Huang et.al.

Determinación del Efecto de temsirolimus y G28UCM, administrados en monoterapia. Las células de cáncer de mama resistentes a trastuzumab y a lapatinib (SKLTR) mantienen activada la ruta de señalización para

supervivencia y proliferación celular (ERK1/2, AKT y mTOR) y además sobreexpresan la sintasa de ácidos grasos (FASN). En nuestro estudio in vitro, temsirolimus muestro un gran efecto antitumoral en células de cáncer de mama HER2+ que han adquirido resistencia a los tratamientos actuales para este tipo de carcinoma mamario. Bajas concentraciones de este fármaco consiguieron inhibir la proliferación celular de las células doble resistentes, SKLTR (IC30 = 5,7 ± 1 ,2 μΜ; IC50 = 5,7 ± 1 ,2 μΜ) (Tabla 3). G28UCM, también muestra un gran efecto antitumoral en estas células SKLTR (IC30 = 5,5 ± 1 , 1 μΜ; IC50 = 9,4 ± 1 ,5 μΜ) (Tabla 3).

SKLTR

IC ₃₀ (μΜ) IC ₅₀ (μΜ)

Trastuzumab n.s. n.s.

Lapatinib n.s. n.s.

Temsiroiimus 5,7 ± 1 ,2 5,7 ± 1 ,2

G28UCM 5,5 ± 1 ,1 9,4 ± 1 ,5

Tabla 3. Los valores IC30 y IC50 son la concentración (μΜ) del fármaco que inhibe el 30 y el 50 % de viabilidad celular, respectivamente. Los resultados se muestran en promedio ± error estándar, de como mínimo 3 experimentos independientes en triplicados.

Determinación del Efecto de temsiroiimus más G28UCM, administrados en combinación. Una estrategia común utilizada en clínica es la combinación de dos o más fármacos antitumorales para evitar la toxicidad debida a las elevadas concentraciones utilizadas. El co-tratamiento consigue poder disminuir la concentración de los fármacos necesaria para obtener un determinado efecto antitumoral. De esta forma menos concentración de fármaco afecta a las células no tumorales y por consiguiente se disminuye la toxicidad en este tipo de células.

La combinación de temsiroiimus con G28UCM mostró unos efectos altamente sinérgicos en las células de cáncer de mama HER2+/FASN+ resistentes a lapatinib y a trastuzumab (SKLTR). Combinando una muy baja concentración de temsiroiimus (0, 15 μΜ) con aproximadamente 5,25 μΜ de G28UCM se inhibió un 30 % la proliferación celular de SKLTR. Para conseguir este efecto con monoterapia, es necesario administrar 5,7 μΜ de temsiroiimus o 5,5 μΜ de G28UCM. Por lo tanto, con el co-tratamiento es posible reducir más de 38 veces la concentración de temsiroiimus necesaria para afectar a la

proliferación de las células tumorales SKLTR (FIG. 2). Con el objetivo de verificar si este efecto sinérgico se da en cualquier línea celular de cáncer de mama, se utilizó como control la línea de cáncer de mama MDA-MB-231 , la cual es (HER2-/ER-/PR-). Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 no mostraron una mayor inhibición de la proliferación celular al ser tratadas con la combinación de los dos fármacos que al tratarse con cada uno de los fármacos por separado (FIG. 3). De hecho, las células MDA-MB-231 tienen la proteína mTOR sobreexpresada y por consiguiente se vieron afectadas por el inhibidor de mTOR, temsirolimus. Pero no expresan significativamente la proteína FASN y por ello, el inhibidor de FASN (G28UCM) casi no tuvo efecto en su viabilidad celular. Se concluyó, por tanto, que la combinación de los dos fármacos no es sinérgica en cualquier tipo de cáncer de mama, sino en el cáncer de mama de la línea celular de la invención.

En conclusión, la combinación del inhibidor mTOR (temsirolimus) con el inhibidor FASN (G28UCM) es especifica de tipos de cánceres de mama que sobreexpresen ambas dianas (mTOR y FASN), como las células de cáncer de mama resistentes a lapatinib y trastuzumab, SKLTR.

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD

O'Brien N., et.al. "Activated phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling confers resistance to Trastuzumab but not Lapatinib" Mol. Cáncer Therap. 2010, vol. 9, pp. 1489-1502.

Rexer B., et.al., "Overcoming resistance to tyrosine kinase inhibitors" Cell Cycle 2009, vol 8, pp. 18-22.

Barok, M., et. al. "Trastuzumab-DM1 causes tumour growth inhibition by mitotic catastrophe in trastuzumab-resistant breast cáncer cells in vivo" Breast Cáncer Res. 201 1 , vol. 13, pp. 1 -1 1 . Huang C, et. al. "β1 integrin medíate an alternative survival pathway in breast cáncer cells resistant to Lapatinib". Breast Cáncer Res. 201 1 , vol. 13, pp. 1 -15. Nahta R. et al., "In vitro effects of trastuzumab and vinorelbine in

trastuzumab-resistant breast cáncer cells" Cáncer Chemother. Pharmacol. 2004, vol. 53, pp. 186-190.

Ropero S. et al., " Trastuzumab plus tamoxifen: anti-proliferative and molecular interactions in breast carcinoma", Breast Cáncer Res. Treat., 2004, vol. 86, pp. 125-137. Menendez JA., et. al., "Inhibition of tumor-associated fatty acid synthase heperactivity induces synergistic chemosensitization of Her-2/neu- overexpressing human breast cáncer cells to decetaxel (taxotere)" Breast Cáncer Res. Treat. 2004, vol. 84, pp. 183-195. Gr0vdal Lm. et al. "EGF receptor inhibitors increase ErbB3 mRNA and protein levéis in breast cáncer cells" Cell Signal. 2012, vol. 24, pp. 296.