发明名称:一禾中 普件滴 染 齐' I 技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域， 涉及一种广谱性病毒感染抑制剂。

背景技术

[0002] 近年来， 诸如 SARS、 MERS、 禽流感和埃博拉等新发突发传染病疫情的暴发 日 趋频繁， 人类面临病毒性传染病的现实和潜在威胁日益 严峻， 人类应对突发传 染病的防控压力日感倍增， 但愈来愈多的实际情况表明： 当病毒发生突变或出 现新型病毒而导致传染病疫情暴发吋， 原来的特异性防治药物难以发挥应有防 控效果， 甚至毫无疗效， 而人类认知水平和科研周期的限制， 又使具有显著疗 效的新一代特异性预防和治疗药物难以在短吋 间内推出， 极易导致疫情的迅速 扩散和局部地区的灾难性暴发， 不仅对当地的公共卫生服务造成极大的破坏， 同吋也对社会的政治和经济造成巨大的冲击。 因此， 依据病毒的基本生物学特 性， 针对病毒侵染宿主细胞的共性靶点， 研发新型病毒感染抑制剂， 对于应对 病毒性传染病疫情的持续挑战具有重要意义。

[0003] 植物化合物被称为"第七类营养素"， 广泛存在于日常食物， 是一类对人体健康 具有特殊作用的非营养性化学物质。 相关研究发现部分植物化合物具有抑制病 毒感染的生物活性， 并逐渐成为抗病毒研究的热点之一。 初步的研究结果显示 ： 植物化合物的生物学效应主要表现在其对细胞 膜生物学特性的影响和局部微 环境平衡的改变等方面， 部分植物化合物通过直接嵌入细胞膜脂质双层 结构， 改变细胞膜正常的功能性流动和电势电位差， 进而发挥一定的生物学效应。 问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 本发明的目的是提供一种广谱性病毒感染抑制 剂。

[0005] 本发明所提供的用于抑制病毒感染的制剂， 主要由表没食子儿茶素没食子酸酯

(EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖混合而成； 所述表没食子儿茶素没食子酸酯 （E GCG) 、 所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比可为 (0.5-1.0) ： (0.5-1.0) ： (0.5-1.5

[0006] 在本发明的一个实施例中， 所述用于抑制病毒感染的制剂具体由表没食子 儿茶 素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖混合而成； 所述表没食子儿茶素没 食子酸酯 （EGCG) 、 所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为 1 : 1： 1.5。

[0007] 所述用于抑制病毒感染的制剂的制备方法也属 于本发明的保护范围。

[0008] 所述用于病毒感染的制剂的制备方法， 具体可包括如下步骤： 将表没食子儿茶 素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为 （0.5-1.0) ： (0.5 -1.0) ： (0.5-1.5) 的比例混合， 得到所述制剂。

[0009] 其中， 所述表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG) 、 所述单宁酸和所述黄芪多 糖的质量配比具体可为 1 : 1： 1.5。

[0010] 所述用于抑制病毒感染的制剂在制备用于用于 抑制病毒感染的产品中的应用也 属于本发明的保护范围。 其中， 所述病毒可为如下中的四种、 任三种或任两种

： 流感病毒、 腺病毒、 痘病毒和冠状病毒。

[0011] 所述用于抑制病毒感染的制剂在抑制病毒感染 中的应用也属于本发明的保护范 围。 其中， 所述病毒可为如下中的四种、 任三种或任两种： 流感病毒、 腺病毒

、 痘病毒禾卩冠状病毒 °

[0012] 在本发明中， 所述抑制病毒感染具体为如下 （a) 或 （b) ：

[0013] (a) 预防病毒感染；

[0014] (b) 在与病毒同吋作用于宿主或宿主细胞吋， 抑制所述病毒对所述宿主或所 述宿主细胞的感染。

[0015] 更加具体的， 在本发明的实施例中， 所述制剂对所述病毒感染的抑制作用具体 体现为： 以哺乳动物细胞作为病毒感染对象， 在病毒感染细胞的同吋或者在病 毒感染细胞前施用所述制剂， 所述制剂对病毒的半数抑制浓度与抑制病毒感 染 的阳性对照药物相比显著降低。 所述阳性对照药物具体为利巴韦林 （Ribavirin)

[0016] 在本发明中， 当所述病毒为流感病毒吋， 所述哺乳动物细胞 （或 （b) 中所述 的宿主细胞） 具体为犬肾细胞 （MDCK细胞） 。 在本发明中， 当所述病毒为腺 病毒吋， 所述哺乳动物细胞 （或 （b) 中所述的宿主细胞） 具体为人胚肾细胞株 (293细胞） 。 在本发明中， 当所述病毒为痘病毒吋， 所述哺乳动物细胞 （或 （ b) 中所述的宿主细胞） 具体为非洲绿猴肾细胞 （Vera细胞） 。 在本发明中， 当 所述病毒为冠状病毒吋， 所述哺乳动物细胞 （或 （b) 中所述的宿主细胞） 具体 为鼠成纤维细胞 （17C1-1细胞） 。

[0017] 在本发明中， 所述流感病毒为甲型流感病毒。 在本发明中， 所述腺病毒为 5 型腺病毒。 在本发明中， 所述痘病毒为痘苗病毒。 在本发明中， 所述冠状病毒 为鼠肝炎冠状病毒。 更加具体的， 所述甲型流感病毒为 H1N1亚型流感病毒。 在 本发明的一个实施例中， 所述流感病毒具体为 H1N1亚型流感病毒 A/Beijing/501/2 009 (H1N1)株。 所述腺病毒具体为 5型腺病毒 309株。 所述痘病毒具体为痘苗病 毒 WR株。 所述冠状病毒具体为鼠肝炎冠状病毒 A59株。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0018] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。 下述实施例中 所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 下述实施例中涉 及的定量实验数据以均数 ±标准差 (±s)表示， 采用 SPSS 17.0统计软件运用单因素 水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计 处理。

[0019] 人胚肾细胞株 （293细胞） ， 犬肾细胞 （MDCK细胞） ， 非洲绿猴肾细胞 （Ver o细胞） 均为 ATCC产品， 293细胞的编号为 ATCC CRL-1573 , MDCK细胞的编号 为 ATCC CCL-34, Vero细胞的编号为 ATCC CCL-81。 鼠成纤维细胞 （17C1-1细 胞） ， 由英国布里斯托大学 Stuart Siddell教授馈赠， 记载于 "Lin Lei, Sun Ying, Wu Xiaoyan, Sun Zounan, Yang Yi ,Su Wenli, Hu Yi, Zhu Qingyu, Guo Deyin, Liu Jingmei, Chang Guohui. Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl. PLoS ONE, 2013 8(4):e61166.，，一文， 公众可从申请 人处获得， 仅用于重复本发明实验使用。 各细胞均按常规方法传代培养。

[0020] 5型腺病毒 （ 309株） ， 记载于 "Radko S, Jung R, Olanubi 0, Pelka P. Effects of Adenovirus Type 5 El A Isoforms on Viral Replication in

Arrested Human Cells. PLoS One. 2015 Oct 8;10(10):e0140124. doi:

10.1371/joumal.pone.0140124. eCollection 2015."一文， 公众可从申请人处获得， 仅用于重复本发明实验使用。 甲型 H1N1流感病毒 （A/Beijing/501/2009 (H1N1)株

) ， 记载于 "Xiaoping Kang, Tao Jiang, Yongqiang Li, Fang Lin, Hong Liu, Guohui Chang, Qingyu Zhu, Ede Qin, Chengfeng Qin and Yinhui Yang. A duplex real-time RT-PCR assay for detecting H5N1 avian influenza virus and pandemic H1N1 influenza vims. Virology Journal, 2010, 7: 113"—文， 公众可从申请人处获得， 仅 用于重复本发明实验使用。 痘病毒 （痘苗病毒 WR株， Vaccinia Virus WR Strain

) ， 记载于 "Sjoerd H. E. van den Worm , Klara Kristin Eriksson , Jessika C.

Zevenhoven, Friedemann Weber, Roland Ziist, Thomas Kuri, Ronald Dijkman,

Guohui Chang, Stuart G. Siddell, Eric J. Snijder, Volker Thiel, Andrew D. Davidson. Reverse Genetics of SARS-Related Coronavirus Using Vaccinia Virus-Based

Recombination. PLoS One. 2012;7(3)"—文， 公众可从申请人处获得， 仅用于重复 本发明实验使用。 冠状病毒 （鼠肝炎冠状病毒 A59株， 简称 MHV-A59) 记载于"

Lin Lei, Sun Ying, Wu Xiaoyan, Sun Zounan, Yang Yi ,Su Wenli, Hu Yi, Zhu Qingyu. Guo Deyin, Liu Jingmei, Chang Guohui. Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by

Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl. PLoS ONE, 2013 8(4):e61166.，，一文， 公众可从申请人处获得， 仅用于重复本发明实验使用。

[0021] 培养液： 1) 、 细胞生长培养液： 以 DMEM培养基 （Glibo公司产品） 为母液， 分别加入 10% (体积分数） 胎牛血清 （Sigma公司产品） ， 0.2mg/ml谷氨酰胺 ( Glibo公司产品） ， lOO U/ml青霉素和链霉素。 2) 、 细胞维持培养液， 胎牛血清 含量为 2% (体积分数） ， 其余与 1) 均相同。 3) 、 病毒增殖培养液： 腺病毒、 痘病毒和冠状病毒的增殖培养液与细胞生长培 养液相同； H1N1流感病毒的增殖 培养液， 需加入 2 g/ml TPCK-Trypsin (Sigma公司产品） ， 其余成分与细胞生长 培养液相同。

[0022] 表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG) ： Sigma公司产品 （分析纯度 >95%) ， 产品编号为 E4143 , CAS#989-51-5。

[0023] 单宁酸 （Tannin) ： Sigma公司产品 （分析纯度 >99%) ， 产品编号为 V900190

； CAS#1401-55-4。

[0024] 黄芪多糖 （APS) ： 上海金穗生物科技有限公司产品 （2-(Chloromethyl)-4-(4-ni trophenyl)-l,3-thiazole) (分析纯度〉 70%) ， 产品编号为 JS11328; CAS#89250- 26-0。

[0025] 阳性对照药物： 利巴韦林 （Ribavirin) ， 美仑生物公司产品。 因目前还未有通 过改变宿主细胞膜特性抑制病毒感染的标准阳 性对照药物。 本研究以目前抗病 毒最常用药物利巴韦林作为对照。 实验前以 PBS缓冲液溶解， 制成 2560 g/ml过 滤， 除菌后， -20°C保存。

[0026] 倒置相差显微镜： 日本 Olympus公司产品。

[0027] 细胞培养箱： 美国 Thermo公司产品。

[0028] 多功能酶仪： 美国 Molecular Devices公司 SpectraMax M5型多功能酶标仪。

[0029] 1、 细胞复苏与传代

[0030] 液氮中分别取出 MDCK细胞、 293细胞、 Vero细胞和 17C1-1细胞， 37°C水浴， 融 化后， 以 lOOOrpm离心 5min， 弃上清， 加入适当的细胞生长培养液， 反复吹打均 匀， 使细胞密度约为 2x10 5个 /ml， 以 10ml/瓶， 于 T25细胞培养瓶中， 细胞培养箱 中常规培养。 24h后于镜下观察， 细胞的贴壁情况， 48-72h后， 或待细胞生长到 密度大约为 95%吋， 弃原培养液， 加入 PBS缓冲液， 漂洗两次， 0.5ml

0.25% (0.25g/100ml) EDTA， 于 37°C培养箱中温育消化， 当细胞收缩变圆吋， 迅速加入细胞生长培养液， 终止消化， 反复吹打均匀后， 以 lOOOrpm离心， 5min ， 弃上清， 使悬浮细胞浓度约为 1x10 ⁵ 个 /ml， 10ml/每瓶， 移入 T25细胞培养瓶， 放置细胞培养箱， 进行常规传代培养。

[0031] 2、 病毒增殖

[0032] 取细胞生长密度约为 80%的 T25细胞培养瓶， 弃原液， 以 PBS， 漂洗两次， 以 去除血清残留， 加入已稀释病毒 （稀释液为 PBS缓冲液） ， 接种量 MOI=0.01， 以及 lml培养基， 晃匀， 置于细胞培养箱中吸附 lh， 弃上清， 每瓶加入 10ml相应 病毒增殖培养液。 观察细胞病变， 48-72h后， 或待细胞病变达 75%以上吋， 收毒 ， 取上清， 反复冻融 3次， 以 3000rpm， 4°C， 离心 5min， 分装上清， 并测定病毒 滴度 TCID 50°

[0033] 3、 病毒滴度 TCID _5Q 测定

[0034] 采用致细胞病变法 （CPE) 测定， 以单细胞悬液， 加入 96孔微量培养板中， 每 孔 200μ1， 使细胞量达到 2x10 ⁵ 个 /ml， 细胞培养箱中培养 48-72h， 直至细胞单层 密度约为 80%吋， 取出， 弃培养基， 以 PBS漂洗两遍 （MDCK以含 2 g/ml TPCK-Trypsin维持培养基漂洗） ， 利用病毒增殖培养液将病毒原液 10倍梯度稀 释为 10 - 3〜10 - 13， 每浓度梯度 8孔一列， 每孔 100μ1， 设立空白对照两列， 于细胞 培养箱中吸附 lh， 弃上清， 后加入维持培养液 200μ1。 每日镜下观察， 当病毒对 照组细胞病变为" ++++"吋记录实验结果。 按 Reed-Muench两氏法计算， 病毒滴 度 TCID ₅ 。。 每组毒株， 重复三次。

[0035] lgTCID so

= (高于 50%病变率的百分数 -50%) I (高于 50%病变率的百分数 -低于 50%病变率 的百分数） X稀释度对数之间的差 +lg (高于 50%病变率的稀释度） 。

[0036] 实施例 1、 植物提取物复合配方病毒感染抑制剂的制备

[0037] 将表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖按照质量配比为 1 ： 1： 1.5的比例混合均匀， 得到植物提取物复合配方制剂。

[0038] 实验前以 PBS缓冲液溶解， 制成 2560 g/ml (EGCG、 单宁酸和黄芪多糖在溶液 中的总浓度） 过滤， 除菌后， -20°C保存备用。

[0039] 实施例 2、 细胞毒性试验

[0040] 本实施例采用中性红吞噬法测定实施例 1制备的复合配方制剂对哺乳动物细胞 的细胞毒性。 具体操作如下：

[0041] 将实施例 1制备的复合配方制剂溶液 （2560

g/ml) 倍比梯度稀释， 得到 2(Vg/ml， 4(Vg/ml， 8(Vg/ml， 16(Vg/ml， 32(Vg/ml ， 64(Vg/ml， 128(Vg/ml共 6个浓度。 然后将不同稀释度的稀释液分别添加至培养 有 293细胞、 MDCK细胞、 Vero细胞和 17C1-1细胞， 且细胞密度约为 80%的 96孔 细胞培养板中， 每孔 100μ1， 各个稀释度均做 4个复孔， 以正常细胞 （即未添加复 合配方制剂） 作为对照， 作用 2h后， 弃受试液， 加入细胞维持培养液， 每孔加 入 200μ1， 置于细胞培养箱中培养， 48 h后， 每孔加入 0.1% (O.lg/lOOmL) 中性 红 25μ1， 于 37°C中作用 1.5h后， 将每孔中的液体吸出， 用 PBS漂洗 2次。 每孔加入 ΙΟΟμΙ的细胞裂解液 （乙酸:乙醇:水 =1:50:49， 体积比） ， 每孔加入 100μ1， 且设空 白对照， 利用 SpectraMax M5多功能酶标仪 （美国 Molecular Devices公司） ， 设 定吸收光波长为 492nm， 测定 OD值， 通过单因素方差分析， 比较各浓度组与对 照组 （正常细胞， 即未添加复合配方制剂） OD值之间的统计学差异， 确定实施 例 1制备的复合配方制剂的最大无毒性浓度 （即与对照组 OD值相比无统计学差异 的最大浓度） 。

[0042] 实验同吋设置表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖这三 种化合物的单体作为复合配方制剂的单体对照 ； 并设置抗病毒感染阳性对照药 利巴韦林作为阳性对照。

[0043] 结果如表 1所示， 可见： 复合配方制剂对 293细胞、 MDCK细胞、 Vera细胞和 17 C1-1细胞的最大无毒性浓度介于 64(Vg/ml〜128(Vg/ml之间， 略优于上市药物利 巴韦林的最大无毒性浓度。 其中 Vera细胞耐受各种待测样品的浓度最高， 均为 1 28(Vg/ml， 黄芪多糖对细胞的毒性最低， 其对各种细胞的最大无毒性浓度均高达 128(Vg/ml， 实施例 1制备的植物化合物复合配方制剂仍然保持较� �的安全性。

[0044] 表 1植物化合物单体和复合配方制剂的细胞最大� �毒性实验结果

[XXXX

[0045] 实施例 3、 病毒感染抑制试验

[0046] 本实施例采用 CPE法测定实施例 1制备的复合配方制剂对各种病毒感染的抑制 效果。

[0047] 一、 对 5型腺病毒感染的抑制效果

[0048] 供试腺病毒为 5型腺病毒 309株。

[0049] 取已长成单层细胞生长密度约为 80%的培养有 293细胞的 96孔培养板， 倒掉培 养液， 用 PBS漂洗细胞 3遍后， 分别以 A， B， C三种条件下添加实施例 1制备的复 合配方制剂： [0050] A.于病毒吸附同吋： 将等体积的 2xl00TCID ₅ 。的 5型腺病毒的病毒液与 2倍浓度 的受试物溶液混合后， 于细胞培养板中加入混合液 ΙΟΟμΙ/孔， 于细胞培养箱中， 待病毒吸附 l h后， 弃之。 PBS冲洗细胞面 3遍后， 加入细胞维持培养液。

[0051] B.于病毒吸附前： 每孔加入相应稀释度的受试物溶液

ΙΟΟμΙ, 弃受试物溶液， PBS冲洗细胞面 3遍后， 加入滴度为 100TCID ₅ 。的 5型腺病 毒的病毒液 100μ1， 于细胞培养箱中， 待病毒吸附 l h后弃之。 PBS冲洗细胞面 3 遍后， 加入细胞维持培养液。

[0052] C.于病毒吸附后： 100TCID ₅ 。的 5型腺病毒的病毒液 ΙΟΟ μΙ/孔， 于细胞培养箱中 ， 待病毒吸附 l h后弃之。 加入相应稀释度的受试物溶液每孔 100 μ1， 弃受试物 溶液， 于细胞培养箱中吸附 l h后弃病毒液。 PBS漂洗 3遍后， 加入细胞维持培 养液。

[0053] 其中， 受试物为表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖这 三种化合物的单体、 实施例 1制备的复合配方制剂， 或抗病毒感染阳性对照药利 巴韦林。 受试物溶液的浓度设置如下浓度梯度： 2(Vg/ml， 4(Vg/ml， 80μ _β /ιη1, 1 6(Vg/ml， 32(Vg/ml， 64(Vg/ml， 128(Vg/ml。

[0054] 每组实验设置空白对照与阳性对照组 （阳性对照为只加入 100TCID ₅ 。病毒， 空 白对照只加入细胞维持培养液） ， 于细胞培养箱中培养，每日于倒置显微镜下观 察， 当病毒对照组 （即阳性对照组） 细胞病变为" ++++"吋记录实验结果。 按 Reed-Muench两氏法计算半数抑制浓度 IC ₅ 。。

[0055] 结果显示： EGCG、 单宁酸、 黄芪多糖、 实施例 1制备的植物提取物复合配方制 剂和利巴韦林分别以三种方式 （A表示病毒吸附同吋添加抑制剂组， B表示病毒 吸附前添加抑制剂组， C表示病毒吸附后添加抑制剂组） 干预 5型腺病毒感染吋 ， 除黄芪多糖在 A和 C两种条件下不能有效抑制腺病毒感染外， 其余抑制剂在三 种条件下均可抑制腺病毒感染。 其中， EGCG在 B条件下、 植物提取物复合配方 制剂在 A和 B条件下抑制腺病毒感染的效果较好。 相对于利巴韦林， 3种植物提取 物及其复合配方制剂在感染前 1小吋给药吋， 均可有效抑制 5型腺病毒的感染。 但是， 黄芪多糖在病毒感染同吋和感染后给药吋， 均无抑制腺病毒感染的效果 。 在三种感染条件下， 虽然利巴韦林均可抑制腺病毒的感染， 但在感染后给药 效果最好， 感染前和感染同吋给药吋， 其半数抑制浓度明显较高。 在单体抑制 剂中， EGCG在病毒吸附前添加吋， 其抑制病毒的感染效果最好， 病毒半数抑制 浓度为 162±l l g/ml。 具体结果见表 2。

[0056] 表 2各抑制剂对 5型腺病毒感染的半数抑制浓度 （IC ₅ 。）

[0057] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。

[0058] 二、 对流感病毒感染的抑制效果

[0059] 供试流感病毒为甲型 H1N1流感病毒 A/Beijing/501/2009 (H1N1)株。

[0060] 实验方法参见步骤一， 将其中的 293细胞替换为 MDCK细胞， 将 5型腺病毒替换

[0061] 结果显示： EGCG、 单宁酸、 黄芪多糖、 实施例 1制备的植物提取物复合配方制 剂和利巴韦林分别以三种方式 （A表示病毒吸附同吋添加抑制剂组， B表示病毒 吸附前添加抑制剂组， C表示病毒吸附后添加抑制剂组） 干预甲型 H1N1流感病 毒感染吋， 单宁酸在 C条件下和黄芪多糖在三种条件下均不能有效� �制病毒感染 夕卜， EGCG、 植物提取物复合配方制剂和利巴韦林在三种条 件下均可抑制病毒 感染。 其中， 复合配方制剂在感染前和感染同吋给药效果最 优， 吸附前半数抑 制浓度仅为 92 g/ml， EGCG、 单宁酸和利巴韦林的半数抑制浓度明显高于复 合 配方制剂。 但在感染后给药的情况下， 利巴韦林显然具有更大优势。 在单体抑 制剂中， 单宁酸在病毒吸附的同吋添加， 其抑制病毒的感染效果最好， 病毒半 数抑制浓度为 234±36 g/ml。 具体结果见表 3。

[0062] 表 3各抑制剂对甲型 H1N1病毒感染半数抑制浓度 （IC ₅ 。）

[0063] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。

[0064] 三、 对痘病毒感染的抑制效果

[0065] 供试痘病毒为痘苗病毒 WR株。

[0066] 实验方法参见步骤一， 将其中的 293细胞替换为 Vero细胞， 将 5型腺病毒替换为

[0067] 结果显示： 在三种方式给药方式条件下， EGCG、 植物复合配方制剂和利巴韦 林均可干扰痘病毒感染 Vera细胞。 其中， 在病毒吸附同吋和吸附前添加抑制剂 的情况下， 植物提取物复合配方制剂抑制病毒感染的效果 最好， 其病毒半数抑 制浓度分别为 162±29 g/ml和 87±17 g/ml， 而在病毒吸附后添加抑制剂的条件下 ， 对照药品利巴韦林抑制病毒的效果较好， 其病毒半数抑制浓度为 238±21μ _§ /ιη1 。 在单体抑制剂中， EGCG在病毒吸附前添加吋， 其抑制病毒的感染效果最好， 病毒半数抑制浓度为 271±13 g/ml， 在病毒吸附前添加黄芪多糖和吸附后添加单 宁酸和黄芪多糖吋， 均不能有效抑制痘病毒的感染。 具体结果见表 4。

[0068] 表 4各抑制剂对痘病毒感染半数抑制浓度 （IC 5o)

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[0069] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。

[0070] 四、 对冠状病毒感染的抑制效果

[0071] 供试冠状病毒为鼠肝炎冠状病毒 A59株。

[0072] 实验方法参见步骤一， 将其中的 293细胞替换为 17C1- 1细胞， 将 5型腺病毒替换 为冠状病毒。

[0073] 结果显示： 在三种方式给药方式条件下， EGCG、 植物复合配方制剂和利巴韦 林均可干扰冠状病毒感染 17C1-1细胞。 其中， 在病毒吸附同吋和吸附前添加抑制 剂的情况下， 植物提取物复合配方制剂抑制病毒感染的效果 最好， 其病毒半数 抑制浓度分别为 127±17 g/ml和 107±12 g/ml， 而在病毒吸附后添加抑制剂的条件 下， 对照药品利巴韦林抑制病毒的效果较好， 其病毒半数抑制浓度为 257±31μ _§ / ml。 在单体抑制剂中， EGCG在病毒吸附前添加吋， 其抑制病毒的感染效果最好 ， 病毒半数抑制浓度为 172±14 g/ml， 在病毒吸附后添加单宁酸和黄芪多糖吋， 均不能有效抑制痘病毒的感染。 具体结果见表 5。

[0074] 表 5各抑制剂对冠状病毒感染半数抑制浓度 （IC 5o)

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[0075] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。

[0076] 综合实施例 2和 3的实验结果， 可见： 本发明所提供的复合配方制剂的细胞毒性 不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林 ， 较为安全。 在安全的使用浓度 下， 预防性使用本发明所提供的植物提取物复合配 方制剂， 可以有效的抑制 5型 腺病毒、 甲型 H1N1流感病毒、 痘病毒和冠状病毒的感染。 由于研究中使用的病 毒具有不同生物特性、 遗传物质和增殖特点， 分属不同的病毒类别： 5型腺病毒 为无囊膜的 DNA病毒， 甲型 H1N1流感病毒为具囊膜的分阶段 RNA病毒， 痘病毒 为具囊膜的 DNA病毒， 冠状病毒为具囊膜的单链 RNA病毒， 因此， 本发明的实 验结果具有普遍性， 所提供的复合配方制剂具有进一步研发为广谱 性病毒感染 抑制剂的商业价值。

[0077] 对比例、 不同配比的植物提取物复合配方制剂对病毒感 染的抑制效果比较 [0078] 一、 对 5型腺病毒感染的抑制效果

[0079] 实验方法参见实施例 3步骤一， 受试物为实施例 1制备的复合配方制剂、 对照复 合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2、 对照复合配方制剂 3， 或抗病毒感染阳性对 照药利巴韦林， 其余操作均同实施例 3步骤一。 其中， 对照复合配方制剂 1、 对 照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3的配方如下：

[0080] 对照复合配方制剂 1 : 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 0.5: 1： 0.5的比例混合而成。

[0081] 对照复合配方制剂 2: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 0.5： 1的比例混合而成。 [0082] 对照复合配方制剂 3: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 1： 1的比例混合而成。

[0083] 结果显示： 对照复合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3对 5 型腺病毒感染的半数抑制浓度 （ic ₅ 。

) 在八、 B和 C三种条件下均显著低于实施例 1制备的复合配方制剂 （p<0.05) 。 具体结果参见表 6。

[0084] 表 6不同复合配方制剂对 5型腺病毒感染的半数抑制浓度 （IC ₅ 。）

[XXXX

[0085] 注： *表示与利巴韦林组比较， ρ<0.05。 #表示与实施例 1复合配方制剂组比较 ， ρ<0.05。

[0086] 二、 对甲型 H1N1流感病毒感染的抑制效果

[0087] 实验方法参见实施例 3步骤二， 受试物为实施例 1制备的复合配方制剂、 对照复 合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2、 对照复合配方制剂 3， 或抗病毒感染阳性对 照药利巴韦林， 其余操作均同实施例 3步骤二。 其中， 对照复合配方制剂 1、 对 照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3的配方如下：

[0088] 对照复合配方制剂 1 : 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 0.5: 1： 0.5的比例混合而成。

[0089] 对照复合配方制剂 2: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 0.5： 1的比例混合而成。

[0090] 对照复合配方制剂 3: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 1： 1的比例混合而成。 [0091] 结果显示： 对照复合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3对 甲型 H1N1流感病毒感染的半数抑制浓度 （IC ₅ 。） 在 、 B和 C三种条件下均显著 低于实施例 1制备的复合配方制剂 （p<0.05) 。 具体结果参见表 7。

[0092] 表 7不同复合配方制剂对甲型 H1N1流感病毒感染半数抑制浓度 （IC ₅₀ )

[0093] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。 #表示与实施例 1复合配方制剂组比较 ， p<0.05。

[0094] 三、 对痘病毒感染的抑制效果

[0095] 实验方法参见实施例 3步骤三， 受试物为实施例 1制备的复合配方制剂、 对照复 合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2、 对照复合配方制剂 3， 或抗病毒感染阳性对 照药利巴韦林， 其余操作均同实施例 3步骤三。 其中， 对照复合配方制剂 1、 对 照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3的配方如下：

[0096] 对照复合配方制剂 1 : 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 0.5: 1： 0.5的比例混合而成。

[0097] 对照复合配方制剂 2: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 0.5： 1的比例混合而成。

[0098] 对照复合配方制剂 3: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 1： 1的比例混合而成。

[0099] 结果显示： 对照复合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3对 痘病毒感染的半数抑制浓度 （IC ₅ 。） 在 、 B和 C三种条件下均显著低于实施例 1 制备的复合配方制剂 （p<0.05) 。 具体结果参见表 8。 [0100] 表 8不同复合配方制剂对痘病毒感染半数抑制浓� � （IC 50/

[0101] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。 #表示与实施例 1复合配方制剂组比较 ， p<0.05。

[0102] 四、 对冠状病毒感染的抑制效果

[0103] 实验方法参见实施例 3步骤四， 受试物为实施例 1制备的复合配方制剂、 对照复 合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2、 对照复合配方制剂 3， 或抗病毒感染阳性对 照药利巴韦林， 其余操作均同实施例 3步骤四。 其中， 对照复合配方制剂 1、 对 照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3的配方如下：

[0104] 对照复合配方制剂 1 : 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 0.5 : 1： 0.5的比例混合而成。

[0105] 对照复合配方制剂 2: 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 0.5： 1的比例混合而成。

[0106] 对照复合配方制剂 3 : 将表没食子儿茶素没食子酸酯、 单宁酸和黄芪多糖按照 质量配比为 1 : 1： 1的比例混合而成。

[0107] 结果显示： 对照复合配方制剂 1、 对照复合配方制剂 2和对照复合配方制剂 3对 冠状病毒感染的半数抑制浓度 （IC ₅ 。

) 在八、 B和 C三种条件下均显著低于实施例 1制备的复合配方制剂 （p<0.05) 。 具体结果参见表 9。

[0108] 表 9不同复合配方制剂对冠状病毒感染半数抑制� �度 （IC ₅₀ )

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[0109] 注： *表示与利巴韦林组比较， p<0.05。 #表示与实施例 1复合配方制剂组比较 ， p<0.05。

工业实用性

[0110] 本发明以冠状病毒 （mouse hepatitis

virus, MHV) 、 痘病毒、 5型腺病毒 （Ad-5) 和甲型 H1N1流感病毒为实验对象 ， 采用观察细胞病变的方法， 在不同的感染条件下， 分别分析了表没食子儿茶 素没食子酸酯 （EGCG) 、 单宁酸和黄芪多糖这三种植物化合物单体及其 混合制 剂抑制病毒感染的规律和特点。 结果证实： 本发明所提供的三种植物化合物单 体和复合配方混合物的细胞毒性均不高于已经 获得安全许可的对照样品利巴韦 林， 较为安全。 在安全的使用浓度下， 预防性使用 EGCG和单宁酸等植物化合物 单体以及植物提取物复合配方混合物， 可以有效的抑制 5型腺病毒、 甲型 H1N1 、¾? 感病毒、 痘病毒和冠状病毒的感染。 研究中使用的病毒具有不同生物特性、 遗 传物质和增殖特点， 分属不同的病毒类别： 5型腺病毒为无囊膜的 DNA病毒， 甲 型 H1N1流感病毒为具囊膜的分阶段 RNA病毒， 痘病毒为具囊膜的 DNA病毒， 冠 状病毒为具囊膜的单链 RNA病毒， 因此， 实验结果具有普遍性， 相关植物化合 物单体和复合配方混合物具有进一步研发为广 谱性病毒感染抑制剂的商业价值

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