本发明涉及一种对植物害虫具有毒力的毒素和 工程菌，具体涉及一种对半翅目水稻褐飞 虱高毒力的 Bt毒素 CrylAb-loop2-P2S和工程菌； 属生物防治技术领域。

背景技术 水稻是我国最主要的粮食作物， 然而水稻的病虫害繁多， 严重影响我国水稻的生产。转 Bt基因等抗鳞翅目和鞘翅目害虫水稻的种植，� ��期可有效地防治这类害虫的危害（Tang e/ 2006; Wang e/ /， 2010)。 同时， 也不可避免地带来加重非 Bt杀虫蛋白靶标昆虫刺吸性口器 害虫如飞虱、 叶蝉等危害的可能性 （Chen e/ ， 2011 )。 因此， 创制发展针对稻飞虱等刺吸 性害虫的新型昆虫毒素迫在眉睫。 苏云金杆菌 Bacillus thuringie is Bt) 是世界上应用最广的微生物杀虫剂。 其产 生的 Cry系列毒素蛋白 （δ-Endotoxins) 是 Bt产生的最重要的毒素蛋白之一， 已经被广泛应 用于对鳞翅目、 鞘翅目、 双翅目害虫及植物病原线虫的防治 （ Arenas e/ ， 2010)。 ^基因 也是应用最广的用于转基因作物的杀虫基因。 转^基因农作物 （如玉米、 棉花、 大豆、 马 铃薯、 烟草、 番茄、 油菜、 水稻等） 已被大面积种植， 有效地控制了鳞翅目与鞘翅目害虫的 危害， 成为害虫管理的一种重要手段 （Rie， 2000; Shelton i?/ /, 2002; Wang ί?/ Ζ， 2010)。 然而， Bt及其所含昆虫毒素对半翅目及同翅目等刺吸� ��口器害虫无明显毒性，迄今还未 发现对这类害虫有显著毒效的 Bt株系。 鉴于飞虱、 叶蝉、 蚜虫等刺吸性害虫对农业生产的 重大危害及转基因抗虫品种的种植带来的加重 刺吸性害虫爆发性危害的现实可能性，迫切需 要研发针对此类害虫的新型抗性基因。 以^基因为基础， 通过改造 Cry毒素分子， 开发能 够产生针对刺吸性害虫的新型 Cry毒素工程菌， 是一项具有重大理论和应用价值的研究。 发明内容 本发明的目的是提供对半翅目害虫水稻褐飞虱 具有高毒力的 Bt毒素 CrylAb-l ₀₀ p2-P2S 和工程菌。 以 Bt Cry毒素作用模型 Bravo模型 （Knowles, B. H. & J. A. Dow., 1993 ) 为理论基础， 利用噬菌体短肽文库展示技术筛选出可以和水 稻褐飞虱中肠结合的短肽 P2S; 进一步， 将短 肽序列利用分子片段替换的方法替换 Cry分子 Domain II的 1οορ2序列， 构建出 毒素基因， 将该基因与通用表达载体 pGEX-KG (购自 GE Healthcare )连接 BL21-DE3中， 经过稳定性测定、结合活性测定及毒力测 定， 获得了能够表达对水稻褐飞虱有高毒性作用 CrylAb-loop2-P2S毒素的工程菌 lAb-P2S, 该菌株为人工构建质粒的工程菌， 宿主为肠埃希氏菌、 Escherichia Co//) BL21 ( DE3 ) , 于 2012年 8月 13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普� ��微生物中心， 北京市朝阳区北 辰西路 1号院 3号， 菌株保藏号为： CGMCC NO : 6427。 所述 1οορ2序列为 Cry分子中决定受体识别的环区， 其氨基酸序列为： RRPFNIGINNQ; 所述大肠杆菌 BL21-DE3菌株由市场购得。 所述噬菌体展示技术 （phage display) 是将基因 表达与亲和选择相结合的技术， 其基本原理是将编码诱饵蛋白的 DNA片段插入噬菌体基因 组， 并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因进行融合表 达， 该重组噬菌体侵染宿主细菌后， 复制 形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直 接用于捕获靶标蛋白库中与诱饵蛋白相互作用 的蛋白质。 本发明的技术方案， 操作步骤如下：

1. 与水稻褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选 利用膜伺喂法让水稻褐飞虱若虫获取含短肽文 库的噬菌体 （Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽 库试剂盒， New England Biolabs公司） 营养液 （含 25%蔗糖 PBS缓冲液）。 让若虫取食混有 噬菌体的营养液 16h后， 用洗脱缓冲液洗脱并回收结合在中肠内膜表面 的噬菌体。将获得的 噬菌体感染大肠杆菌 ER2738扩增后， 重复上述"生物淘洗" （Bio-panning ) 过程。 经 3轮淘 洗后， 将最后一轮筛选出的噬菌体感染细菌， 铺板培养， 从单个噬菌斑得到的噬菌体经培养 扩增后， 提取单链噬菌体 DNA进行测序， 获得具有抗原 （Epitope) 性及能形成表面环状 ( Surface loo ) 结构的短肽 P2S。 短肽 P2S能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合， 短肽 P2S的基因具有如 SEQ ID ΝΟ: 1所示 的核苷酸序列。 短肽 P2S具有如 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。 所述 PBS缓冲液为 Na ₂ HP0 ₄ · 12H ₂ 0 3.473g NaH ₂ P0 ₄ · 12H ₂ 0 0.226g、 NaCl 0.9g溶于 1L三蒸水； 洗脱缓冲液为 0.2M Glycine-HCl pH2.2, lmg/ml BSA; 所述大肠杆菌 ER2738为 M13噬菌体宿主菌， 包含于 Ph.D.-C7C ^TM 噬菌体展示肽库试剂盒中； 所述 Ph.D.-C7C ^TM 噬菌 体展示肽库试剂盒由市场购得。 所述生物淘洗指噬菌体短肽文库结合与洗脱过 程， 详见 Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽库试剂盒说明书。

2. c/jZ^基因的克隆 以含 c/jZ^基因质粒 DNA为模板， 设计一对 引物 crylAb-F、 crylAb-R, 克隆 crylAb基因获得一个 3483bp的 crylAb全长片段 （图 1 )， 再将 crylAb基因克隆到通用表达 载体 pGEX-KG 的 7/¾H l及 / 1位点上 （图 2)， 并进行双酶切验证 （图 3 )。 引物为： crylAb-F： 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 ' crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '。 所述 c/j/ 基因已公布于美国国立生物技术信息中心网站 ( National Center For Biote clmology Information, NCBI)。 所述 3483bp c^Z^基因全长片段参照 NCBI数据库， 基因 编号 AY395148.1。

3. 利用短肽 P2S对 crylAb基因的改造 以步骤 2获得的 crylAb质粒 DNA为模板， 设计一对引物 md-F、 md-R, 将 crylAb基因 序列中待改造的 1448bp片段进行扩增， 获得^ ^ 基因序列中待改造片段 (图 5、 6)。 引 物为： md-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 '。 所述 基因序列中待改造片段， 具有如 SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。 进一步， 设计一对引物 up-F、 up-R, 扩增 1οορ2上游片段序列 （图 7)。 引物为： up-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '

更进一步， 设计一对引物 down-F、 down-R, 扩增 1οορ2下游片段序列 （图 7)。 引物为： down-F: 5 down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 ' 最后， 利用 md-F与 md-R引物， 以 1οορ2上下游片段 DNA为模板进行扩增， 获得短肽 P2S替换 1οορ2的片段基因 domainll-loop2-p2s (图 8、 9)。 所述 /w/ //-/^^ y基因序列中待改造片段，具有如 SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。

4. 含^ ^^- 毒素基因表达载体的构建 将步骤 3获得的片段基因 domainll - op2-p2s与 2中获得的 yZ ^基因亚克隆质粒 共同用限制性内切酶 Spe I和 Mim I双酶切， 利用 T4连接酶将改造后的片段连回 crylAb i 粒基因中，获得 毒素基因（图 10、 11 )。将该质粒转化入大肠杆菌 BL21-DE3 内，获得能够表达对水稻褐飞虱有高毒力的 CrylAb_loop2-P2S毒素工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)

CrylAb-loop2-p2s毒素对水稻褐飞虱具有毒性， ^的毒素基因具有如 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

5. 毒素蛋白在工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)中的表达及纯化 将步骤 4获得的工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)接入 LB培养基中， 37°C培养至对数 前期 （OD ₆ (X 0.4)， 加入 IPTGC终浓度 0.8mM)， 16°C诱导 24h。 经过细胞收集、 细胞破碎后， 利用谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione s-transferase, GST )标签纯化获得 CrylAb-loop2-P2S 毒素蛋白 （图 12) 。

CrylAb-loop2-p2s毒素蛋白对水稻褐飞虱具有毒� �， CrylAb-loop2-p2s毒素蛋白具有如 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。 所述 LB培养基为胰蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， 氯化钠 10g溶于 1L蒸馏水， 分装后 灭菌； IPTG为异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （Isopropyl β-D- 1 -Thiogalactopyranoside )

6. 杀虫生物活性测定 测试昆虫为： 鳞翅目害虫一小菜蛾 （ plutella xylostella)； 半翅目害虫一褐飞虱 （ Nilaparvata lugens) 本发明使用的所有化学试剂均为分析纯。 本发明具有以下优点：

本发明使用噬菌体短肽文库展示技术，通过膜 伺喂法筛选出能够与水稻褐飞虱中肠内膜 结合的短肽 P2S; 利用本发明筛选到的短肽 P2S对 Bt 基因进行定向改造， 经过表达载体 构建， 获得能够表达毒素 CrylAb-loop2-P2S的工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)。 该工程 菌表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻褐飞虱的毒性作用与改造� �的 CrylAb毒素蛋白 相比提高了近 20倍。 说明该工程菌所表达的 CrylAb-l ₀₀ p2-P2S能够有效防治水稻褐飞虱， 且利用噬菌体短肽文库筛选短肽并定向改造 Bt Cry毒素的方法能够有效的扩展 Bt毒素杀虫 谱。

附图说明： 图 1为^^ 基因的克隆。 其中泳道 1为 crylAb基因； M为 250bp Marker。 图 2为 ^^ 表达亚克隆构建示意图。 图 3为 crylAb连接表达载体 pGEX-KG的双酶切验证。 其中泳道 M为 250bp Marker, 泳道 2为 crylAb-PK ΒαητΆ I及 / 1双酶切验证。 图 4为 crylAb基因序列在 NCBI的比对结果。 图 5为 ^^ 基因待改造片段的克隆。 其中泳道 1为 crylAb基因待改造片段； 泳道 2为 crylAb亚克隆质粒 DNA; 泳道 M为 250bp Marker。 图 6为 crylAb待改造片段连接 pMD-18T克隆载体的双酶切验证。 其中泳道 1为 I及 Mun I双酶切验证； 泳道 M为 250bp Marker。 图 7为 CrylAb 1οορ2上下游片段的克隆。 其中泳道 1为 1οορ2上游片段； 泳道 2为 1οορ2下游片段； M为 250bp Marker。 图 8为短肽 P2S替换 CrylAb 1οορ2的改造示意图， 图中所示片段为 ^^ 基因中待改 造的 1448bp片段。 图 9为短肽 P2S替换 crylAb基因 1οορ2后的 domainli-hop2-p2s片段。 其中泳道 1为 domain li-hop2-p2s片段； 泳道 M为 250bp Marker。 图 10为改造后 ^^^- 表达亚克隆构建示意图。 图 11改造后 ^Z^- 表达亚克隆双酶切验证。 其中泳道 1为 ¾y表达亚克隆质粒 ΒωηΆ I及 双酶切验证； 泳道 2 为 crylAb亚克隆质粒 ΒωηΆ I及 / I双酶切验证。 图 12为 CrylAb-loop2-P2S利用 GST标签蛋白纯化结果。 其中泳道 1为 CrylAb-loop2-P2S纯化蛋白； 泳道 M为 SDSPAGE蛋白 Marker。 图 13为工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对敏感 品系小菜蛾致死终浓度 （LC _5Q )， 单位为 g/ml。 图 14为工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO : 6427)表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻 褐飞虱致死终浓度 （LC _5Q )， 单位为 g/ml。 具体实施方式 以下叙述本发明的实施例。 应该说明的是， 本发明的实施例对于本发明只有说明作用， 而没有限制作用。 实施例 1、 与水稻褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选 利用膜伺喂法让水稻褐飞虱若虫获取含短肽文 库的噬菌体 （Ph.D.-C7C™噬菌体展示肽 库试剂盒， New England Biolabs公司） 营养液 （含 25%蔗糖 PBS缓冲液）。 让若虫取食混有 噬菌体的营养液 16h后， 解剖褐飞虱若虫中肠， 研磨后经 PBS缓冲液清洗 3次， 用洗脱缓 冲液洗脱并回收结合在中肠内膜表面的噬菌体 。将获得的噬菌体感染细菌扩增后， 重复上述 "生物淘洗" （Biopatming) 过程。 经 3轮淘洗后， 将最后一轮筛选出的噬菌体感染细菌， 铺 板培养， 从单个噬菌斑得到的噬菌体经培养扩增后， 提取单链噬菌体 DNA进行测序， 获得 具有抗原 （Epitope) 性及能形成表面环状 （Surface loop) 结构的短肽 P2S。 实施例 2、 /jZ^基因的克隆 以含 c/jZ^基因质粒 DNA为模板， 设计一对 引物 crylAb-F、 crylAb-R, 克隆 crylAb基因获得一个 3483bp的 crylAb全长片段 （图 1 )， 再将 crylAb基因克隆到通用表达 载体 pGEX-KG 的 BamY I及 / 1位点上 （图 2)， 并进行双酶切验证 （图 3 )。 经 NCBI比 对证明该基因为^ 7 基因 （图 4)。 引物为： cry 1 Ab-F： 5 ' -GGATCCATGGATAACAATCCGAACAT-3 ' crylAb-R: 5'-GTCGACTTACTATTCCTCCATAAGGAGTAATTC-3 '。 实施例 3、 利用短肽 P2S对 crylAb基因的改造 以实施例 2中获得的 crylAb质粒 DNA为模板， 设计一对引物 md-F、 md-R, 将 crylAb 基因序列中待改造的 1448bp片段进行扩增， 获得^ ^ 基因序列中待改造片段 (图 5、 6)。 引物为： md-F： 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 ' md-R: 5'-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAACCCGGG-3 ' 进一步， 设计一对引物 up-F、 up-R, 扩增 1οορ2上游片段序列 （图 7)。 引物为： up-F: 5 ' -CCCGGGACTAGTTGATATAATATGGGGAATTT-3 '

更进一步， 设计一对引物 down-F、 down-R, 扩增 1οορ2下游片段序列 （图 7)。 引物为：

down-R: 5 '-GGGCCCCAATTGATGTATGGAATTGTAAA-3 ' 最后， 以 md-F及 md-R为引物以 1οορ2上下游片段 DNA为模板进行扩增， 获得短肽 P2S替换 1οορ2的片段基因 domainll- op2-p2s (图 8、 9)。 实施例 4、 含 ^Z^- ¾¾^- y毒素基因表达载体的构建 将实施例 3中获得的 片段与实施例 2中获得的 c Z^基因亚克隆质粒 共同用限制性内切酶 Spe I和 Mun I双酶切， 利用 T4连接酶将改造后的片段连回 crylAb 粒基因中， 获得 c/7Z^- ¾¾^- y质粒基因 （图 10 )。 将该质粒转化入大肠杆菌 BL21-DE3 内，形成能够表达对水稻褐飞虱高毒力的 CrylAb-loop2-P2S毒素工程菌 lAb-P2S。提取该工 程菌质粒 DNA经双酶切验证 （图 11 ) 及序列测定， 获得^ Z^- ¾¾^^ y毒素基因序列， 该基因具有如 SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。 实施例 5、 毒素蛋白在工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)中的表达及纯化 将工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)在 LB中 37 °C培养至对数前期 （OD ₆ QQ-0.5 )， 加入 IPTG至终浓度 0.8mM过夜诱导蛋白表达， 纯化方法参照实施例 3。 获得的纯化 CrylAb-loop2-P2S蛋白 （图 12)。 实施例 6、 杀虫生物活性测定 测试昆虫为： 鳞翅目害虫一小菜蛾 （ plutella xylostella)； 半翅目害虫一褐飞虱 （ Nilaparvata lugens) 杀虫生物测定方法： 小菜蛾： 采用甘蓝叶片称重后浸叶法， 48小时调查结果; 稻飞虱： 采用膜伺毒法， 24小时调查结果。

( 1 ) 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达蛋白对小菜蛾毒性结果： 如表 1所示， CrylAb工程菌表达的未改造 CrylAb蛋白对小菜蛾的毒性很高， 致死终 浓度达到 0.88 g/ml， 由于识别受体环区的替换工程菌 lAb-P2S表达的 CrylAb-loop2-P2S蛋 白对小菜的毒性较之 CrylAb工程菌有所下降， 致死终浓度为 32.5 g/ml。 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达的蛋白对敏感品系小菜蛾致死终浓度 （图 13 )。

( 2 ) 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)表达蛋白对水稻褐飞虱毒性结果： 如表 2所示， CrylAb工程菌表达的未改造 CrylAb蛋白对水稻褐飞虱的毒性较弱， 致 死终浓度为 233 g/ml，而利用能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合� �短肽 P2S替换 CrylAb 1οορ2 后制备的工程菌 lAb-P2S所表达的毒素蛋白 CrylAb-loop2-P2S对水稻褐飞虱的毒性上升近 20倍， 致死终浓度为 18.75 g/ml。 据此结果证明， 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)所表达 的 CrylAb-loop2-P2S毒素对水稻褐飞虱毒性效果作用� �著。 工程菌对水稻褐飞虱的致死终 浓度 （图 14)。 ∞

表 1 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)对敏感品系小菜蛾毒性效果 （48小时） 样品 蛋白浓度 （pg/ml) 重复 总虫数 48小时死虫数 48小时校正死亡率

0.4 3 60 21 32.71%

0.7 3 60 28 44.85%

CrylAb 1.0 3 60 36 58.63%

1.5 3 60 42

2.4 3 60 52 86.21%

0.3 3 60 8 10.38%

1.2 3 60 10 13.82%

Cr lAb-loop2 2.4 3 60 13 18.99%

-P2S 10 3 60 24 37.95%

20.0 3 60 30 48.29%

55.0 3 60 44 72.42% 表 2 工程菌 lAb-P2S (CGMCC NO: 6427)对水稻褐飞虱毒性效果 （24小时） 样品 蛋白浓度 （pg ml) 重复 总虫数 24小时死虫数 24小时校正死亡率

25 3 60 9 5.56%

50 3 60 13 12.96%

CrylAb 100 3 60 17 20.37%

200 3 60 37 57.41%

1 3 60 23 35.09%

5 3 60 27 42.11%

CrylAb-loop2 10 3 60 32 50.88%

-P2S 25 3 60 37 59.65%

50 3 60 42 68.42%

100 3 60 50 82.46%