BLäSCHEN, SOWIE VERFAHREN ZURHERSTELLUNG UND MANIPULATION VON BLäSCHEN

Die Erfindung betrifft Bläschen, insbesondere Vesikel oder Flüssigkeitszellen, Verfahren zur Herstellung und Manipulation der Bläschen und eine Anordnung zur Manipulation der Bläschen.

Durch die rasante Entwicklung in der Biotechnologie werden Techniken nachgefragt, mit denen kleinste Flüssigkeitsmengen manipulierbar werden können. Die Tendenz zur Miniaturisierung wird dabei vor allem durch folgende Vorteile getrieben: Kleine

Stoffmengen sind billiger und weniger giftig, oft sind biologische Substanzen auch nur in kleinsten Mengen verfügbar. Darüber hinaus sind hierbei die Reaktions- und Analysezeiten um Größenordnungen kleiner und die Spezifität und Effizienz ist deutlich höher. Daher werden mikrofluidische Systeme heute schon verwendet in so genannten Lab-on-a-Chip Systemen, μ-TAS (Total Analysis System) und MEMS (Micro-Electro- Mechanical-System). Wichtige Bestandteile auf derartigen Plattformen sind Pumpen, Ventile und integrierte Mischer. Bei solchen mikrofluidischen Systemen handelt man sich auch Nachteile ein: das Durchmischen ist aufgrund der laminaren Strömung nur noch diffusiv möglich. Der übergang von dem laminaren, schwer zu mischenden System zum turbulenten System wird durch die sogenannte Reynoldszahl charakterisiert, die Trägheitskräfte und viskose Kräfte ins Verhältnis setzt. Ist die Reynoldszahl kleiner als etwa 1000 so spricht man vom laminaren Regime, in dem benachbarte Flüssigkeitsschichten „nebeneinander" fließen und sich nur diffusiv durchmischen können. Ist die Reynoldszahl hingegen groß, so treten Turbulenzen auf, die Durchmischungen dramatisch beschleunigen. Zur Mischung solcher kleinster

Flüssigkeitsmengen wird z.B. das Mischen mit Oberflächenwellen (SAW) verwendet (Wixforth A., Acoustically driven planar microfluidics, Superlattices Microstruct 2003;

33: 389-396). Prinzip dabei ist gezielt Wirbel in der Flüssigkeit zu erzeugen, die bei makroskopischen Flüssigkeiten viel leichter, quasi automatisch entstehen, mit dem Ziel eine möglichst große Grenzfläche zwischen den zu mischenden Flüssigkeiten zu erzeugen. Weiterhin ist das unabhängige Positionieren einzelner Reagenzien äußerst schwierig. Die kontrollierte Manipulation ist aber insbesondere für Anwendungen von immenser Bedeutung. Beispielsweise werden bei so genannten "drug delivery"- Systemen verschiedene Substanzen in Vesikel eingeschlossen (Szostak J.W., Bartel D.P., Luisi P.L., Synthesizing life, Nature 2001; 409: 387-390). Diese werden dann beispielsweise mit Hilfe von Spritzen an der gewünschten Stelle im Körper injiziert.

JP 2006045132 A offenbart ein Liposom, das magnetisches Kontrastmittel für Magnet- Resonanz Messungen enthält. - US 5,078,986 A offenbart ein in einem Liposom eingeschlossenes magnetisches Kontrastmittel, das nach dem Erreichen eines gewünschten Ortes im Körper freigesetzt wird. - US 4,728,575 A offenbart in Vesikel eingeschlossenes paramagnetisches Material als Kontrastmittel für die NMR Bildgebung. - WO 2006/049497 Al offenbart permeable Kapseln, die durch Stabilisierung von Vesikeln erzeugt werden. Diese Kapseln können magnetische Partikel als diagnostisches Mittel enthalten. Die Vesikel werden mittels elektrochemischer Polymerisation erzeugt. - DD 290 807 A5 offenbart in Vesikel eingeschlossenes Kontrastmittel für NMR. - GB 2 078 660 A offenbart magnetisch- lokalisierbare, biologisch-abbaubare Lipid-Bläschen. Die Bläschen enthalten zusätzlich zum magnetischen Material (Magnetit) einen medizinischen Wirkstoff. Nach Injektion der Bläschen in einen Körper, werden die Bläschen durch einen an der gewünschten, zu behandelnden Stelle angewandten Magneten (z.B. in der Nähe eines Tumors) an dieser Stelle gehalten. Nach einer bestimmten Zeit wird die Hülle des Bläschens vom Körper abgebaut (aufgelöst) und der Wirkstoff so an der gewünschten Stelle freigesetzt.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Bläschen, Bläschen in Trägerflüssigkeit und ein Verfahren zur Herstellung und Manipulation von Bläschen bereitzustellen, mit dem kleinsten Flüssigkeitsmengen möglichst kontrollierbar manipuliert werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale des Anspruchs 1, 15, 19, 35 bzw. 39. Bevorzugte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Gemäß Anspruch 19 wird ein Bläschen, insbesondere ein Vesikel oder eine Flüssigkeitszelle, bereitgestellt mit einer Hülle und zumindest einer in der Hülle eingeschlossenen Flüssigkeit, wobei die Hülle zumindest ein magnetisches Partikel einschließt. Vorzugsweise ist eine Vielzahl von magnetischen Partikeln in der Hülle eingeschlossen. Die zumindest eine Flüssigkeit kann eine reine Flüssigkeit oder ein Flüssigkeitsgemisch sein. Beispielsweise eine Suspension, eine Emulsion oder eine Lösung. Durch die Hülle wird die eingeschlossene Flüssigkeit abgeschirmt bzw. separiert, z.B. von einer die Hülle umgebende Flüssigkeit, um eine unerwünschte Durchmischung mit der Umgebung zu verhindern.

Ein magnetisches Partikel kann ein einzelnes magnetisches sein oder aus mehreren Komponenten bestehen, die insgesamt ein magnetisches Teilchen ergeben.

Bevorzugt ist die Hülle des Bläschens aus Polymeren ausgebildet oder weist Polymere auf. Dabei müssen Polymermoleküle nicht oder nicht vollständig polymerisiert vorliegen.

Alternativ oder in Ausgestaltung ist die Hülle aus oder im Wesentlichen aus amphiphilen Molekülen aufgebaut. Insbesondere aus Lipiden oder amphiphilen Polymeren. Das heißt, das Ausgangsmaterial bzw. die "Bausteine" der Hülle weisen zumindest einen polaren und einen unpolaren Teilbereich bzw. einen hydrophilen und eine hydrophoben Teilbereich auf. Aufgrund der anziehenden und abstoßenden Kräfte dieser Bausteine, ordnen sich diese zu selbstorganisierten Strukturen wie Bläschen, (z.B. Vesikel, Zellen) oder Membranen an. Beispielsweise kann eine Hülle aus den Lipiden Sphingomyelin, Phosphatidylcholin und Cholesterol aufgebaut sein, welche auch Hauptbestandteile von roten Blutkörperchen sind. Ein weiteres Ausgangsmaterial für eine Hülle können Block-Polymere sein, d.h. Polymere, die im Unterschied zu

Homopolymeren aus mindestens zwei verschiedenen Monomerbausteinen A und B aufgebaut sind. Je nach Verteilung der Monomere A und B in der Polymerkette

unterscheidet man zwischen statistischen (AABABBBAABB), alternierenden (ABABABAB) oder Block- (AAAABBBB) Copolymeren, wobei mindestens eines der Monomere unpolar und mindestens ein anderes polar ist, um die oben beschriebene Strukturen auszubilden.

Bevorzugt weist die Hülle eine oder mehrere Schichten auf. Insbesondere bei Vesikeln ist eine Vielzahl verschiedener Anzahlen von Schichten möglich. Bevorzugt sind Vesikel mit mehreren konzentrisch angeordneten Schichten. Weiter bevorzugt weisen die Vesikel eine Doppelschicht auf, d.h. sie sind unilamellar. Insbesondere bei kleinsten eingeschlossenen Flüssigkeitsmengen liegt eine einzelne Schicht vor, d.h. eine Mizelle.

Bevorzugt schließt die Hülle ein Volumen in der Größenordnung von bis zu 10 Mikroliter ein, vorzugsweise bis zu 1 Mikroliter, weiter bevorzugt bis zu 100 Femtoliter. Damit können durch ein Bläschen kleinste Flüssigkeitsmengen von einem umgebenden Medium separiert werden.

Bevorzugt weist die Hülle zumindest einen funktionalisierten Baustein auf, z.B. um einen Kanal in der Hülle zu bilden. Vorzugsweise ist die Hülle eine Membran, insbesondere eine flüssigkeitsdurchlässige Membran wie z.B. eine Zellwand. Beispielsweise weist die Hülle spezielle, in die Hülle eingebettete Proteine auf, um membranartig nur spezifische Stoffe durch die Hülle durchtreten zu lassen. Das Bläschen stellt ein Depot für den spezifischen Stoff, z.B. Arzneimittel, bereit, der eine bestimmte Dosis dieses Stoffes durch die permeable Hülle abgeben kann. Beispielsweise kann eine Dosis erhöht werden durch Erhöhung der Anzahl der Kanäle, so dass mehr Arzneimittel von innerhalb eines Bläschens durch die Hülle an eine Umgebung freigegeben wird.

Besonders bevorzugt können in der Hülle eingebaute funktionalisierte Bausteine zur Markierung der Bläschen verwendet werden. Beispielsweise können durch Einbau von Antikörpern oder von adhäsiven Molekülen Bläschen an spezifische Zellen gebunden werden. Beim Transport der Bläschen in einer Trägerflüssigkeit binden diese funktionalisierten Bausteine an die spezifischen Zellen (mit Rezeptoren für die

funktionalisierten Bausteine) und ein in dem Bläschen enthaltener Wirkstoff kann lokal deponiert werden.

Bevorzugt ist die eingeschlossene Flüssigkeit eine wässrige Lösung oder enthält eine 5 solche. Beispielsweise eine Zuckerlösung oder eine ionische Lösung, wie eine

Kochsalzlösung. Weiter bevorzugt ist die eingeschlossene Flüssigkeit eine Suspension oder eine Emulsion. Beispielsweise sind in der Hülle Feststoffe wie z.B. Arzneimittel eingeschlossen. Zusätzlich oder alternativ ist die eingeschlossene Flüssigkeit eine Emulsion aus einer polaren und einer unpolaren Flüssigkeit wie z.B. Wasser und öl, o wobei der Emulsion vorzugsweise ein Emulgator zugegeben wird.

Vorzugsweise sind zumindest zwei Bläschen vorgesehen, die jeweils unterschiedliche Flüssigkeiten bzw. Wirkstoffkomponenten oder Reaktanden einschließen, insbesondere Wirkstoffkomponenten, die bei Wechselwirkung reagieren und/oder aktiviert werden.5

Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist innerhalb der Hülle zumindest ein weiteres Bläschen eingeschlossen, insbesondere zumindest ein weiteres Vesikel. Vorzugsweise sind mehrere Vesikel in der Hülle eingeschlossen. Das heißt innerhalb des Bläschens, das für sich ein separiertes Volumen darstellt, ist ein weiteres separiertes o Volumen angeordnet.

Vorzugsweise ist zumindest in einem der weiteren Bläschen eine weitere Flüssigkeit eingeschlossen, insbesondere eine von der das weitere Bläschen umgebenden Flüssigkeit unterschiedliche Flüssigkeit. Diese weitere Flüssigkeit kann einen Wirkstoff 5 oder eine Wirkstoffkomponente enthalten. Durch das oder die weiteren Bläschen innerhalb der Hülle können mehrere Wirkstoffkomponenten oder Reaktanden abgeschirmt voneinander in der Hülle deponiert werden. Insbesondere bei Wirkstoffkomponenten, die durch Kontakt miteinander aktiviert werden, wird so ein Bläschen bereitgestellt, das zu einem gewünschten Zeitpunkt Wirkstoffe aktiviert 0 und/oder aktivierte Wirkstoffe freisetzt, beispielsweise durch Zerstören der Hülle des

Bläschens und der Hülle der weiteren Bläschen zu diesem gewünschten Zeitpunkt, wodurch die Wirkstoffe in Kontakt miteinander kommen.

Bevorzugt ist das zumindest eine magnetische Partikel paramagnetisch, insbesondere superparamagnetisch. D.h. bei Anlegen eines äußeren Feldes tritt eine Magnetisierung der Partikel in Richtung des Feldes auf. Zudem lagert sich zumindest ein Teil der Vielzahl von magnetischen Partikeln bei Anlegen eines äußeren Magnetfeldes aneinander an und bilden insbesondere zumindest ein Aggregat oder einen Cluster innerhalb der Hülle. Insbesondere bei Vorliegen eines inhomogenen Magnetfeldes werden die magnetischen Partikel in Gebiete mit höherer Feldstärke gezogen, d.h. die Partikel folgen einem Gradienten des inhomogenen Magnetfeldes. Weiterhin können ferromagnetische Partikel verwendet werden.

Das zumindest eine oder die Vielzahl der magnetischen Partikel haben vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 5 Nanometer und 2 μm, bevorzugt einen maximalen Durchmesser von 10 μm vorzugsweise von maximal 1 μm oder 50 Nanometer. Die magnetischen Partikel können eine beliebige Form aufweisen. Vorzugsweise sind die magnetischen Partikel kugelförmig oder im Wesentlichen kugelförmig.

Besonders bevorzugt sind die magnetischen Partikel biokompatibel. D.h. bei Verwendung der Partikel, haben diese z.B. im menschlichen oder tierischen Körper keinen schädlichen Einfluß auf diesen Körper und können z.B. von diesem problemlos wieder ausgeschieden werden. Alternativ oder zusätzlich ist die magnetische Substanz oder Elemente des Partikels in einer Hülle oder einer Matrix eingeschlossen. Beispielsweise in Latex, Kohlenstoff oder dergleichen.

Gemäß einer Ausgestaltung sind innerhalb der Hülle des Bläschens weitere Partikel eingeschlossen und die Hülle bildet ein Transportmittel für die weiteren Partikel, insbesondere für Arzneimittel oder Arzneimittelkomponenten. Weitere Partikel sind beispielsweise Krebsmarker, Antikörper oder Impfstoffe.

Gemäß Anspruch 35 ist eine Kombination aus zumindest einer Trägerflüssigkeit und zumindest einem in der zumindest einen Trägerflüssigkeit enthaltenen Bläschen vorgesehen, wobei das zumindest eine Bläschen wie oben beschrieben ausgebildet sein

kann. Bevorzugt enthält das Bläschen einen Wirkstoff, der mit der Trägerflüssigkeit in Wechselwirkung tritt, insbesondere reagiert. Bevorzugt wird durch die Wechselwirkung der Wirkstoff aktiviert. Eine Wechselwirkung kann einerseits durch ein Austreten des Wirkstoffs aus dem Bläschen durch oben beschriebene Kanäle entstehen oder durch ein öffnen oder zumindest teilweises Zerstören der Hülle des Bläschens.

Dabei ist der Begriff "Trägerflüssigkeit" als die die Bläschen tragende bzw. enthaltende Flüssigkeit zu verstehen. Das bedeutet, dass einerseits eine Flüssigkeit zur "Lagerung" von Bläschen - d.h. ohne dass diese Flüssigkeit Bestandteile enthält, die zur Wechselwirkung mit einem Wirkstoff der Bläschen vorgesehen sind - als

Trägerflüssigkeit bezeichnet wird. Andererseits kann ebendiese Trägerflüssigkeit mit den Bläschen beispielsweise einer Blutprobe zugegeben werden, wobei dann das Blut der Blutprobe die Trägerflüssigkeit für die Bläschen bildet.

Besonderes bevorzugt enthält die Trägerflüssigkeit Untereinheiten mit denen eine in dem oder den Bläschen enthaltener Wirkstoff in Wechselwirkung tritt, insbesondere reagiert. Beispielsweise mit zellulären Bestandteilen wie Blutkörperchen bei der Verwendung von Blut als Trägerflüssigkeit.

Weiter bevorzugt enthalten in der Trägerflüssigkeit vorliegende Bläschen jeweils unterschiedliche Wirkstoffe oder Komponenten, die miteinander in Wechselwirkung treten oder reagieren, insbesondere bei Wechselwirkung miteinander aktiviert werden.

Die Trägerflüssigkeit ist bevorzugt eine wässrige Lösung oder enthält eine solche, insbesondere eine oder mehrere der Folgenden: eine Zuckerlösung, ionische Lösung, Blut, Blutplasma.

Gemäß Anspruch 39 wird ein Verfahren zur Herstellung zumindest eines Bläschens, insbesondere eines Bläschens wie oben beschrieben vorgesehen. Zunächst werden magnetische Partikel und zumindest ein Ausgangsmaterial für eine Hülle bereitgestellt.

Ein Ausgangsmaterial sind z.B. amphiphile Polymere. Den magnetischen Partikeln und dem Ausgangsmaterial wird zumindest eine Flüssigkeit hinzugefügt. Die Hülle eines

sich ausbildenden Bläschens schließt zumindest einen Teil der Flüssigkeit und zumindest eines der magnetischen Partikel ein. Nach dem Ausbilden liegt somit ein von der umgebenden Flüssigkeit separiertes Volumen vor.

Bevorzugt weist das zumindest eine Ausgangsmaterial zumindest einen Polymerbildner auf. Insbesondere können die oben beschriebenen Polymere eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt wird nach dem Hinzufügen der zumindest einen Flüssigkeit zum Ausgangsmaterial eine elektrische Spannung, insbesondere eine Wechselspannung, angelegt, um die Bildung von Bläschen zu unterstützen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden die magnetischen Partikel und das zumindest eine Ausgangsmaterial bereitgestellt durch Aufbringen einer Vielzahl magnetischer Partikel auf ein Trägersubstrat und eines das Ausgangsmaterial enthaltenden Lösungsmittels auf das Trägersubstrat. Nach dem Abziehen, Abdampfen und/oder Verdunstenlassen des Lösungsmittels, bleibt das Ausgangsmaterial für die zumindest eine Hülle auf dem Trägersubstrat zurück. Vorzugsweise weist das Trägersubstrat Elektroden auf und/oder das Trägersubstrat ist eine Elektrode, um wie oben beschrieben eine Spannung an die Flüssigkeit anzulegen. Die Elektroden sind vorzugsweise korrosionsfrei und/oder biokompatibel, insbesondere bioinert.

Vorzugsweise werden Elektroden durch Aufbringen einer Schutzschicht (z.B. Quarz) vor Korrosion geschützt, wobei die aufgebrachte Schicht das Trägersubstrat bildet.

Zur Unterstützung des Ausbildens von Bläschen wird beim Bilden der Bläschen die Temperatur der Flüssigkeit in einem Bereich gehalten, in der insbesondere die amphiphilen Moleküle in einer fluiden Phase vorliegen. In der fluiden Phase ist z.B. eine aus diesen Molekülen ausgebildete Membran "flüssig", d.h. leicht verformbar. Damit ist gewährleistet, dass sich z.B. ausgehend von einer ebenen Membranfläche diese Membran ausreichend krümmen bzw. verformen kann, um ein Bläschen auszubilden.

Vorzugsweise weist die hinzugefugte Flüssigkeit weitere Partikel wie funktionalisierte Partikel und/oder Wirkstoffsubstanzen auf oder es werden auf das Trägersubstrat weitere Partikel aufgebracht. Dabei werden die weiteren Partikel beim Bilden der Bläschen in das Bläschen eingeschlossen und/oder in die Hülle mit eingebaut. Beispielsweise sind die funktionalisierten Partikel Krebsmarker, wie oben beschrieben.

Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zur Manipulation zumindest eines von einer Trägerflüssigkeit umgebenen Bläschens bereitgestellt. Vorzugsweise ist das Bläschen ein Bläschen wie oben beschrieben oder nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Insbesondere weist das Bläschen eine Hülle auf mit zumindest einer darin eingeschlossenen Flüssigkeit und zumindest einem darin eingeschlossenen magnetischen Partikel. Das Verfahren sieht das Anlegen eines äußeren Magnetfelds vor, so dass auf das zumindest eine magnetische Partikel innerhalb der Hülle des Bläschens eine Kraft ausgeübt wird.

Vorzugsweise lagert sich durch das Anlegen eines Magnetfeldes zumindest ein Teil der Vielzahl magnetischer Partikel aneinander an und bildet insbesondere eine Vielzahl von Aggregaten oder Clustern, insbesondere mit länglicher Form.

Bevorzugt wird das Magnetfeld zeitlich geändert und zusätzlich oder alternativ räumlich geändert, wodurch das zumindest eine magnetische Partikel oder ein Aggregat von magnetischen Partikeln beeinflusst wird, insbesondere bewegt wird. Bevorzugt weist das Magnetfeld einen räumlichen Gradienten und/oder eine Magnetfelddichteänderung auf, um räumlich oder zeitlich veränderliche Kräfte auf den oder die magnetischen Partikel auszuüben.

Weiter bevorzugt ist das Magnetfeld ein rotierendes Magnetfeld, mit dem ein magnetisches Partikel ein Cluster von magnetischen Partikeln zur Rotation angeregt wird. Eine solche Rotation der magnetischen Partikel bzw. Aggregate kann durch räumlich rotierende Permanentmagneten oder Spulen erzeugt werden. Eine weitere

Möglichkeit ist das Anordnen mehrere Spulen nebeneinander, wobei durch

alternierendes oder sukzessives Schalten der Spulen ebenfalls ein bewegtes (z.B. ein rotierendes Magnetfeld) erzeugt wird.

Insbesondere wird durch Anlegen eines Magnetfeldes das zumindest eine magnetische Partikel innerhalb der Hülle bewegt oder relativ zur Trägerflüssigkeit bewegt. Damit ergibt sich die Möglichkeit ein Bläschen mittels der innerhalb des Bläschens enthaltenen magnetischen Partikel zu bewegen. Insbesondere kann durch die auf die magnetischen Partikel übertragene Kraft ein Bläschen unabhängig von oder sogar entgegen außerhalb des Bläschens vorliegenden Strömungen bewegt werden. Beispielsweise kann ein Bläschen auf diese Weise im Blutkreislauf unabhängig von der Blutströmung an eine bestimmte Stelle transportiert bzw. dort plaziert oder festgehalten werden. Weiterhin kann beispielsweise auf diese Weise ein Bläschen auf einem fluidischen Analysechip unabhängig von einer Flußrichtung auf dem Chip positioniert bzw. transportiert werden.

Bevorzugt ist die Bewegung des Partikels durch ein Magnetfeld eine Linearbewegung, eine Rotations- oder Kreisbahnbewegung oder eine Kombination von Linear- und Kreisbahnbewegung. D.h. das magnetische Partikel kann durch ein Magnetfeld auf einer vorgegebenen oder vorgebbaren Bahn bewegt werden. Insbesondere kann z.B. durch das Anregen einer Rotation und/oder Vibration des magnetischen Partikels ein Mischen von mehreren innerhalb der Hülle vorhandenen Flüssigkeiten verbessert bzw. beschleunigt werden.

Beim Vorsehen zumindest eines weiteren Bläschen innerhalb der Hülle kann durch eine Bewegung der magnetischen Partikel, beispielsweise durch deren Rotation, die Hülle des einen weiteren Bläschen zerstört werden oder zumindest teilweise zerstört werden. So kann beispielsweise eine Flüssigkeit oder ein Wirkstoff dieses weiteren Bläschens freigesetzt werden. Dieser Wirkstoff kann nun wiederum mit der Flüssigkeit innerhalb der Hülle reagieren oder diese aktivieren. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn ein zu aktivierender Wirkstoff nur für kurze Zeit nach der Aktivierung wirksam ist. Somit können in den Bläschen kleinste Mengen verschiedener Wirkstoff- oder

Reaktionskomponenten gelagert werden, um erst bei Bedarf zur Reaktion gebracht zu werden.

Bevorzugt kann die Hülle des Bläschens und/oder die weitere Hülle der oder der weiteren Bläschen zumindest teilweise zerstört werden, um die darin enthaltene

Flüssigkeiten und/oder Wirkstoffe, z.B. die oben beschriebenen aktivierten Wirkstoffe, in die Trägerflüssigkeit freizusetzen. Vorzugsweise wird die Hülle mittels zumindest eines magnetischen Impulses zumindest teilweise zerstört. Weitere Möglichkeiten zur Zerstörung oder öffnung der Hülle (Hüllen) sind das Anlegen eines elektrischen Feldes oder Ultraschall und zusätzlich oder alternativ Mikrowellenstrahlen. Energie von Mikrowellenstrahlen wird dabei hauptsächlich von den magnetischen Partikeln absorbiert und haben insbesondere kaum Einfluß auf eine wässrige Trägerflüssigkeit. Alternativ kann der Trägerflüssigkeit ein Lösungsmittel zugefügt werden, das die Hülle des oder der Bläschen auflöst.

Bevorzugt wird die nach dem öffnen oder zumindest teilweisen Zerstören der Hülle freigesetzte Flüssigkeit mit der Trägerflüssigkeit mittels der ebenfalls freigesetzten magnetischen Partikel wie oben beschrieben vermischt, indem ein Magnetfeld angelegt wird oder das Magnetfeld angelegt bleibt. Insbesondere wird eine Rotation der freigesetzten magnetischen Partikel angeregt. Somit wird ein Vermischen der freigesetzten Flüssigkeit mit der Trägerflüssigkeit verbessert bzw. beschleunigt und eine effiziente und schnelle Reaktion oder Aktivierung eines freigesetzten Wirkstoffes wird insbesondere am Ort der Freisetzung ermöglicht.

Besonders bevorzugt reagiert die freigesetzte Flüssigkeit mit in der Trägerflüssigkeit enthaltenen Untereinheiten. Beispielsweise bei der Verwendung von Blut als Trägerflüssigkeit reagiert die freigesetzte Flüssigkeit mit zellulären Blutbestandteilen, wie Blutplättchen. Diese Reaktion wird durch das oben beschriebene Vermischen mittels der magnetischen Partikel ebenfalls verbessert bzw. beschleunigt. Insbesondere kann durch das Verfahren eine im Bläschen enthaltene Flüssigkeit gezielt mit beispielsweise bestimmten Organen oder Gefäßwänden (z.B. Adern) in Kontakt

gebracht werden und damit eine gewünschte Reaktion der freigesetzten Flüssigkeit mit diesen verbessern bzw. beschleunigen.

Bei einer weiter bevorzugten Ausgestaltung werden erste Bläschen mit zumindest einer ersten Wirkstoffkomponente und zweite Bläschen mit zumindest einer zweiten

Wirkstoffkomponente in einer Trägerflüssigkeit bereitgestellt. Die zumindest eine erste Wirkstoffkomponente ist dabei zur Reaktion mit der zumindest einen zweiten Wirkstoffkomponente bestimmt. Beispielsweise können die Bläschen mit den jeweiligen Wirkstoffkomponenten getrennt voneinander hergestellt und anschließend zusammengeführt werden, um eine Trägerflüssigkeit mit Bläschen bereitzustellen, die jeweils unterschiedliche Wirkstoffkomponenten enthalten. Die Wirkstoffe in den Bläschen können auf die zuvor beschriebene Weise freigesetzt werden, insbesondere nach einer Positionierung bzw. Transport der Bläschen, wobei eine Reaktion der ersten mit der zweiten Wirkstoffkomponente durch das oben beschriebene Verfahren bzw. Vermischen mittels der magnetischen Partikel verbessert wird.

Durch das beschriebene Verfahren kann somit ein Wirkstoff oder ein Reagenz gezielt positioniert werden und an dieser Position gezielt aktiviert und freigesetzt werden. Zusätzlich wird eine Vermischung mit einer Trägerflüssigkeit, mit Untereinheiten einer Trägerflüssigkeit und/oder eine Vermischung verschiedener freigesetzter

Wirkstoffkomponenten verbessert. Dieses Verfahren kann beispielsweise im Körper (in vivo) eingesetzt werden, aber auch im Labor (in vitro), beispielsweise auf sogenannten Analysechips zur DNA-, PCR- oder Blutanalyse. Ein weiterer Anwendungsbereich liegt in der genauen Positionierung von Reaktanden bei der Synthese von nano-strukturierten Stoffen.

Bevorzugt werden nach dem Freisetzen oder nach dem Vermischen durch Anlegen eines Magnetfeldes das zumindest ein magnetischer Partikel oder die Vielzahl von magnetischen Partikeln aus der Trägerflüssigkeit entfernt oder in der Trägerflüssigkeit lokal konzentriert. Insbesondere bei Verwendung dieses Verfahrens bei fluidischen

Analyse- Vorrichtungen kann so die Trägerflüssigkeit ausgetauscht oder entnommen werden, ohne die magnetischen Partikel zu entfernen. D.h. nach dem Austausch einer

Trägerflüssigkeit stehen dieselben magnetischen Partikel einem weiteren Experiment oder Test zur Verfügung.

Gemäß Anspruch 15 ist eine Anordnung zur Manipulation von Bläschen vorgesehen mit einer Trägerflüssigkeit und einem in der Trägerflüssigkeit enthaltenen Bläschen, wobei das Bläschen eine Hülle und zumindest ein in der Hülle enthaltenes magnetisches Partikel aufweist. Weiterhin ist zumindest ein Magnetfelderzeuger vorgesehen, der an das Bläschen ein Magnetfeld anlegt, insbesondere ein räumlich und zusätzlich oder alternativ zeitlich veränderbares Magnetfeld. Insbesondere kann mit einer solchen Anordnung ein wie oben beschriebenes Bläschen gemäß den oben beschriebenen Verfahren manipuliert werden.

Bevorzugt ist der zumindest eine Magnetfelderzeuger geeignet, ein fokussiertes Magnetfeld zu erzeugen, wobei der zumindest eine Magnetfelderzeuger eine Einrichtung aufweist, um ein erzeugtes Magnetfeld gezielt zu positionieren.

Vorzugsweise ist bei Verwendung im Labor eine Einrichtung zur Aufnahme der Trägerflüssigkeit mit den darin enthaltenen Bläschen separat zum Magnetfelderzeuger angeordnet, so dass die Trägerflüssigkeit für verschiedene Experimente leicht ausgewechselt werden kann. Alternativ ist die Aufhahmeeinrichtung als Einwegprodukt konzipiert, so dass nach einem Experiment oder einem Test keine Reinigung von fluidischen Komponenten nötig ist.

Zusammenfassend können mittels der beschriebenen Verfahren, Vorrichtung und Bläschen kleinste Mengen an Flüssigkeiten und/oder Wirkstoffe - separiert von einem umgebenden Medium - gezielt transportiert und positioniert werden und die Flüssigkeiten/Wirkstoffe gezielt an dieser Position freigesetzt werden. Zusätzlich wird vor dem Freisetzen der Flüssigkeiten/Wirkstoffe oder nach dem Freisetzen ein Mischen derselben innerhalb des Vesikels oder mit einer Trägerflüssigkeit verbessert bzw. beschleunigt.

Anhand von Figuren werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Quellkammer zur Erzeugung von Bläschen, Fig. 2 ein erstes Ausfuhrungsbeispiel eines Bläschens,

Fig. 3 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Bläschens, in dem ein weiteres Bläschen enthalten ist,

Fig. 4 das Bläschen von Fig. 2 unter Einfluss eines Magnetfeldes, Fig. 5 das Bläschen von Fig. 3 unter Einfluss eines Magnetfeldes, Fig. 6 das Bläschen von Fig. 2 unter Einfluss eines Magnetfeldes zum Transport des

Bläschens,

Fig. 7 das Bläschen von Fig. 2 mit geöffneter Hülle, Fig. 8 das Bläschen von Fig. 7 ohne Einfluss eines Magnetfeldes, und Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Manipulation von Bläschen.

Fig. 1 zeigt eine Quellkammer 12, die zur Herstellung von Vesikeln 2 verwendet wird. Im Folgenden wird beispielhaft ein Verfahren zur Herstellung von Vesikeln 2 unter Verwendung eines elektrischen Feldes beschrieben. Dabei wird ein dünner Lipidfilm in wässriger Lösung gequollen und der Film durch ein elektrisches Wechselfeld abgelöst und zu Vesikeln 2 umgeformt.

Bei den beschriebenen Beispielen werden zwei verschiedene Lipide als Hauptbestandteil der Quelllösungen verwendet: DOPC (l,2-Dioleyol-sn-Glycero-3- Phoshocholine) ist ein Lipid, das im gesamten experimentell zugänglichen

Temperaturbereich in der fluiden Phase ist. DMPC (l,2-Dimyristol-sn-Glycero-3- Phosphocholine Chloroform) kann bei niedrigen Temperaturen in die Gelphase überfuhrt werden. Die erste Quelllösung ist eine Mischung aus 150 μl DOPC Chloroformlösung mit einer Konzentration c=2,5 mg/ml sowie 10 μl Texas-Red™ DHPE Chloroformlösung mit einer Konzentration c= 0,5 mmol/1. Die

Zusammensetzung der zweiten Quelllösung ist gleich, allerdings wird die DOPC- Lösung durch eine DMPC-Lösung mit gleicher Konzentration ersetzt. Als

Trägersubstrat 14, 14' werden Glasplatten verwendet, die vorzugsweise mit Indium- Zinn-Oxid (ITO) beschichtet sind. Da die Platten transparent sind, kann die Bildung der Vesikel 2 in der Quellkammer 12 unter dem Mikroskop beobachtet werden. Die leitfähige ITO-Beschichtung dient als Elektrode.

Als magnetische Partikel werden Magnetbeads 8 verwendet. Um Vesikel 2 mit eingeschlossenem Magnetbeads 8 quellen zu können, wird vor dem Auftragen einer Lipidlösung bzw. Quelllösung auf das Trägersubstrat 14, 14' zunächst 10 μl einer Magnetbead-Lösung auf das Trägersubstrat 14, 14' verteilt und im Vakuum getrocknet. Danach wird 10 μl der DOPC- oder DMPC-Quelllösung auf das Trägersubstrat 14, 14' aufgetragen. Das Trägersubstrat 14, 14' wird dann für 3 Stunden ins Vakuum gelegt, um das Chloroform abdampfen zu lassen. Dann werden jeweils zwei Trägersubstrate 14, 14' mit einem Abstandshalter 16, insbesondere einem Teflonspacer, zu der Quellkammer 12 zusammengeklebt. Die Grundfläche der Quellkammer 12 beträgt ca. 20 x 50 mm ² , der Abstand der Trägersubstrate beträgt ca. 2 mm. Nachfolgend wird die Quellkammer 12 mit einer Flüssigkeit 6, insbesondere einer Zuckerlösung, gefüllt.

Zum Quellen wird an die Trägersubstrate 14, 14' bzw. an die Elektroden mittels einer Wechselspannungsquelle 18 eine 10 Hz Wechselspannung angelegt, die langsam von 0 auf 2,6 Volt erhöht wird. Der eigentliche Quellvorgang dauert ca. 18 Stunden.

Wie in Fig. 1 dargestellt, kann unter dem Mikroskop beobachtet werden, dass sich zunächst auf den Platten blasenartige Membranformen bilden, die sich langsam mit Flüssigkeit 6 füllen und sich schließlich ablösen, um jeweils eine Hülle 4 eines Vesikels 2 bilden. Einige der gebildeten Vesikel 2 enthalten einzelne Magnetbeads 8, beispielsweise bis zu dreißig Magnetbeads 8. Zum größten Teil sind die Vesikel unilamellar, d.h. sie weisen zwei einlagige Lipidschichten (d.h. eine Lipiddoppelschicht) auf. Die Größe der Vesikel 2 liegt zwischen 10 und 60 μm, wobei einige Vesikel 2 auch bis zu 130 μm groß werden können. Nach dem Quellen können die Vesikel 2 abpipettiert und im Kühlschrank gelagert werden.

Bei der Herstellung von DMPC-Vesikeln 2 muss beachtet werden, dass die Phasenübergangstemperatur dieses Lipids bei 23° C liegt. Im Vergleich dazu liegt die Phasenübergangstemperatur von DOPC bei 20° C. Da Lipide während des Quellens in der fluiden Phase (L _α -Phase) sein müssen, um ausreichend verformbar zu sein, wird die 5 Quellkammer 12 bei der Erzeugung von DMPC-Vesikeln 2 im Wärmebad inkubiert. Des weiteren verringert sich beim übergang von der fluiden Phase in die sogenannte Gelphase die Fläche einer Lipiddoppelschicht um ca. 30 %. Um ein Platzen der Vesikel 2 durch die Membrankontraktion beim Abkühlen zu vermeiden, muss das Volumen der Vesikel 2 vorher osmotisch verringert werden. Dazu wird zusätzlich Sucrose zu der0 DMPC- Vesikel-Lösung gegeben, um die Gesamtkonzentration auf 300 mM zu erhöhen. Damit erhöht sich das verfügbare Volumen in den Vesikeln 2 und ein Platzen der Vesikel 2 wird verhindert.

Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines beispielsweise mit dem oben beschriebenen5 Verfahren hergestellten Vesikels 2 mit einer Hülle 4, die die Flüssigkeit 6 und

Magnetbeads 8 einschließt. Die Hülle 4 kann eine Vielzahl von Schichten aufweisen.

Vorzugsweise ist sie unilamellar, d. h. besteht aus einer Lipiddoppelschicht. Die

Flüssigkeit 6 kann eine Mischung aus mehreren Flüssigkeiten sein oder zusätzlich weitere funktionalisierte Partikel (nicht dargestellt) enthalten, wie z.B. Wirkstoffe, o Reagenzien oder Marker. Das Vesikel 2 bildet ein von der äußeren Umgebung abgeschirmtes Kompartiment oder einen Behälter für die Flüssigkeit 6 und/oder die funktionalisierten Partikel.

Fig. 3 zeigt eine weiteres Ausführungsbeispiel eines Vesikels 2' in dessen Hülle 4' ein 5 weiteres Vesikel 2", die Beads 8 und eine Flüssigkeit 6' eingeschlossen ist. Dieses weitere Vesikel 2" enthält eine weitere Flüssigkeit 6". Die weitere Flüssigkeit 6" kann eine Substanz enthalten oder sein, die zur Reaktion mit der Flüssigkeit 6' geeignet ist. Insbesondere sind die Flüssigkeiten 6', 6" wässrige Lösungen, insbesondere biokompatible Lösungen. Vorzugsweise enthalten die Flüssigkeiten 6', 6" Wirkstoffe o zur medizinischen oder therapeutischen Behandlung. Beispielsweise enthalten die

Flüssigkeiten 6', 6" Impfstoffe oder Krebsmarker. In Ausgestaltung können in dem

weiteren Vesikel 2" weitere Magnetbeads 8' eingeschlossen sein. Das oder die weiteren Magnetbeads 8' können auch anstelle der Magnetbeads 8 vorgesehen sein.

Fig. 4 zeigt das Vesikel von Fig. 1 in einer Trägerflüssigkeit 10 unter Einfluß eines magnetischen Feldes M. Durch das Anlegen eines Magnetfeldes M richten sich die

Magnetbeads 8 nach dem Magnetfeld M aus und bilden insbesondere Aggregate, wobei die Beads insbesondere stäbchenförmig angeordnet sind. Bei Anlegen eines räumlich und/oder zeitlich veränderlichen Magnetfeldes können diese Aggregate bewegt werden. Insbesondere können diese Aggregate als eine Art "Mikro-Rührstäbchen" verwendet werden, wenn sie durch Drehung des äußeren Magnetfeldes M zur Rotation gebracht werden. Somit kann die Flüssigkeit 6 im Inneren der Hülle 4 mittels der Aggregate bzw. der Magnetbeads 8 durchmischt werden.

Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn wie in Fig. 2 dargestellt in der Hülle 6' des Vesikels 2' ein weiteres Vesikel 2" vorliegt. Wie in Fig. 5 dargestellt kann durch die Bewegung der Magnetbeads 8 mittels des äußeren Magnetfelds M die Hülle 4" des weiteren Vesikels 2" zumindest teilweise zerstört werden oder geöffnet werden, so dass die im Inneren des zweiten Vesikels 2" enthaltene Flüssigkeit 6" freigesetzt wird. Nachfolgend kann durch Bewegung (z.B. Rotation) der Magnetbead- Aggregate ein Durchmischen der weiteren Flüssigkeit 6" mit der Flüssigkeit 6' des Vesikels 2' verbessert bzw. beschleunigt werden. So kann zu einem bestimmten Zeitpunkt ein Wirkstoff aus dem weiteren Vesikel 2" freigesetzt werden und gezielt im Vesikel 2' aktiviert werden, ohne das die so aktivierte Flüssigkeit oder der Wirkstoff in die umgebende Trägerflüssigkeit 10 freigesetzt wird.

Fig. 6 zeigt wie durch das Anlegen eines Magnetfeldes beispielsweise das Vesikel 2 von Fig. 1 in einer Trägerflüssigkeit 10 bewegt werden kann. Indem die Aggregate oder auch einzelne Magnetbeads 8 im Magnetfeld M eine Kraft erfahren - in diese Darstellung ist die Kraftwirkung nach rechts gerichtet - bewegen sie sich im Inneren des Vesikel 2 bzw. relativ zur Trägerflüssigkeit 10 fort. Insbesondere wird ein Magnetbead

8 oder die Magnetbeads 8 in einen Fokus des Magnetfeldes M gezogen bzw. folgen dem

Fokus des Magnetfeldes M. Somit kann durch die auf die Beads 8 ausgeübte Kraft das Vesikel 2 gezielt transportiert und positioniert werden.

Fig. 7 zeigt das Freisetzen der Flüssigkeit 6 des Vesikels 2 von Fig. 1. Beispielsweise werden mittels eines magnetischen Impulses die Magnetbeads 8 ruckartig beschleunigt und treten dabei durch die Hülle 4 des Vesikels 2. Eine weitere Möglichkeit zum öffnen der Hülle 4 ergibt sich aus einer Bewegung der Beads 8 mit einer Geschwindigkeit dem das Vesikel 2, z.B. aufgrund der viskosen Gegenkräfte der Trägerflüssigkeit 10 nicht folgen kann. Dabei wird ein Teil der Hülle 4 durch die Beads verformt bzw. in die Länge gezogen bis die Hülle 4 aufgrund der Verformung reißt. Durch das öffnen bzw. das zumindest teilweise Zerstören der Hülle 4 werden die Flüssigkeit 6, ebenso wie die Beads 8 in die Trägerflüssigkeit 10 freigesetzt. Auf die gleiche Weise wird ein wie oben beschriebener aktivierter Wirkstoff freigesetzt.

Nach dem Freisetzen kann wie oben beschrieben mittels Bewegung der - nun in der

Trägerflüssigkeit 10 vorliegenden - Magnetbeads 8 ein Mischen bzw. Durchmischen der Flüssigkeit 6 mit der Trägerflüssigkeit 10 beschleunigt werden.

Fig. 8 zeigt das geöffnete Vesikel 2 von Fig. 7 ohne angelegtes Magnetfeld M. Die Aggregate trennen sich und es liegen wieder einzelne Magnetbeads 8 vor. Die

Magnetbeads können aus der Trägerflüssigkeit 10 wiederum mittels eines Magnetfelds M getrennt werden bzw. von ihr separiert werden. Bei Verwendung der Vesikel im Körper (beispielsweise von Vesikeln 2, 2' im Blut als Trägerflüssigkeit 10) werden biokompatible Magnetbeads 8 verwendet, so dass die Beads 8 keinen schädlichen Einfluß auf den Körper haben und beispielsweise problemlos vom Körper ausgeschieden werden können. Insbesondere weisen die Magnetbeads 8 eine biokompatible Beschichtung auf, wie eine Latexhülle.

Fig. 9 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 20 zur Manipulation von Vesikeln 2, 2'. Mittels an einem Rotor 24 befestigten Permanentmagneten 22, 22' wird unterhalb eines auf einem Träger 21 angeordneten Trägerflüssigkeit 10 ein rotierendes Magnetfeld erzeugt. Dadurch werden in der Trägerflüssigkeit 10 enthaltenen Vesikel 2,

2' mit Magnetbeads 8 auf die oben beschriebene Weise manipuliert. Insbesondere wird eine in den Vesikeln 2, 2' enthaltene Flüssigkeit 6, 6' und/oder ein Wirkstoff freigesetzt und mit der Trägerflüssigkeit 10 durchmischt.

Bezugszeichenliste

2, 2' Vesikel

4, 4', 4" Hülle

6, 6', 6" Flüssigkeit

8 Magnetbeads

10 Trägerflüssigkeit

12 Quellkammer

14, 14' Trägersubstrat

16 Abstandhalter

18 Wechselspannungsquelle

20 Vorrichtung

21 Träger

22, 22' Permanentmagnet 24 Rotor