蟾毒配基衍生物及其制备方法、 包含该衍生物的组合物、 及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于 2011 年 6 月 30 日向中国国家知识产权局提交的发明专利申请 第 201110180620.4号和于 2012年 1月 19 日向中国国家知识产权局提交的发明专利申请 第 201210017717.8号的优先权权益，该申请的全部内� ��在此通过引用全部并入本文，如同完 全记载在本文中一样。 技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体地，本发明涉 及一类新的蟾毒配基衍生物 (bufotalinsX 其制备方法、包括该衍生物的药物组合物、及 其用途。所述蟾毒配基衍生物对肿瘤细胞株 具有抑制活性， 可用作治疗恶性肿瘤的药物。 背景技术

肿瘤是威胁人类生命的恶性疾病之一， 全世界因患肿瘤死亡人数每年在 500万以上， 在中国每年新发现肿瘤患者有 160多万，死亡 130多万， 因而世界各国都特别关注抗肿瘤 药物的研究。

长期以来，强心苷主要作为钠泵抑制剂用于治 疗充血性心力衰竭及心率不齐等心脏疾 患。 除此之外， 强心苷还具有选择性抑制肿瘤细胞增殖的作用 。 早在 1964年就有文献报 道了强心苷在体外具有很强的抗鼻咽癌活性 [Kupchan S. M.， Hemingway R. J.， Doskotch R. W. Tumor inhibitors. IV. Apocannoside and cymarin, the cytotoxic principles of apocynum cannabinum L. J. Med. Chem. 7, 803-804 (1964).】。 后来研究证实， 强心苷在低于治疗心力 衰竭的有效血药浓度就对多种恶性肿瘤具有选 择性地诱导肿瘤细胞坏死的活性【 Yeh J. Y.， Huang W. J.， Kan S. F.， Wang P. S. Inhibitory effects of digitalis on the proliferation of androgen dependent and independent prostate cancer cells. J. Urology, 166, 1937-1942 (2001)； Lopez-Lazaro M.， Pastor N., Azrak S. S.， Ayuso M. j.， Austin C. A., Cortes F. Digitoxin inhibits the growth of cancer cell lines at concentrations commonly found in cardiac patients. J. Nat. Prod. 68， 1642-1645 (2005).】。这一重要发现使我们看到强心苷的� �药用前景一新型抗肿瘤 药物。因此，近二十年来，世界各国学者纷纷 转向对强心苷抗肿瘤的作用机制、提取分离、 全合成、结构改造与构效关系以及临床试验等 相关研究。至今已有大量的相关研究及综述 被报道【Melero， C. P.; Medarde, M.; Feliciano, A. S.， A short review on cardiotonic steroids and their amino guanidine analogues. Molecules 2000, 5 (1), 51-81.； Chen, J. Q.; Contreras, R. G.; Wang, R.; Fernandez, S. V.; Shoshani, L.; Russo, I. H.; Cereijido, M.; Russo, J.， Sodium/potasium ATPase (Na+， K ⁺ -ATPase) and ouabain/related cardiac glycosides: a new paradigm for development of anti-breast cancer drugs. Breast Cancer Res Tr 2006, 96 (1), 1-15.； Mijatovic, T.; Lefranc, F.; Quaquebeke, E. V.; Vynckt, F. V.; Darro, F.; Kiss, R.， UNBS 1450: A new hemi-synthetic cardenolide with promising anti-cancer activity. Drug Develop Res 2007, 68, 164-173.】。

蟾酥是中国传统的名贵中药，药用历史悠久， 现已有多种中药制剂用于肿瘤的辅助治 疗，其抗肿瘤的主要有效成分为一类强心 核上连有双不饱和六元内酯环的蟾毒配基类化 合物， 结构式如下所示。

蟾毒灵（bufalin) 酯蟾毒配基 ( resibuf ogenin) 华蟾毒精 (cinobufagin)

因此， 合成蟾毒配基新类似物， 进行抗肿瘤构效关系研究， 发现新的具有高效、低毒 的蟾毒配基类衍生物具有重要意义。 WO 2007081835 A2公开了一类下式所示的强心内酯 和蟾蜍二烯烃酸内酯化合物及其调节局部和全 身缺氧事件作用的用途，具体涉及如下化合 物：

WO 2011085641 Al公开了一类蟾毒灵衍生物及其治疗癌症的用� ��， 并具体公开了下 列化合物：

但是， 上述化合物的药理活性尚不能令人满意， 且提供给患者的选择仍然不足。 因 此， 有必要进一步开发蟾毒灵衍生物来满足患者的 需求。 发明内容

本发明的一个目的是提供一类通式 I所示的蟾毒配基衍生物或其药学上可接受的� �。 所述蟾毒配基衍生物对人源肿瘤细胞株具有抑 制活性， 可用作治疗恶性肿瘤的药物。

本发明的再一目的为提供制备上述蟾毒配基衍 生物的方法。

本发明的再一目的为提供包含治疗有效量的选 自根据本发明的蟾毒配基衍生物和其 药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成 分的药物组合物。所述药物组合物任选可以 进一步包含药学上可接受的载体、 佐剂或辅料。

本发明的再一目的为提供上述蟾毒配基衍生物 或其药学上可接受的盐、和包含该衍生 物的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药 物中的用途。 本发明的再一目的为提供一种药物组合物，其 包含治疗有效量的选自根据本发明的蟾 毒配基衍生物和其药学上可接受的盐中的一种 或多种作为活性成分以及其他药学上可接 受的治疗剂，特别是其他抗肿瘤药物。所述药 物组合物任选可以进一步包含药学上可接受 的载体、 佐剂或辅料。

本发明的再一目的为提供一种治疗恶性肿瘤的 方法，所述方法包括给具有该需要的患 者给药治疗有效量的选自根据本发明的蟾毒配 基衍生物和其药学上可接受的盐中的一种 或多种，或根据本发明的包含治疗有效量的选 自根据本发明的蟾毒配基衍生物和其药学上 可接受的盐中的一种或多种作为活性成分的药 物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一类具有下面通 式 I所示结构的蟾毒配基衍生物， 或其 药学上可接受的盐，

式中：

X为 0或 NH;

Ri为选自以下任一结构基团中的一个基团:

其巾：

n ₅ 为 0、 1、 2或 3;

¾为 0、 1、 2、 3或 4;

n ₇ 为 0、 1、 2、 3或 4; 且 ¾和 n ₇ 不同时为 0;

W为 CH;

V为 R ₁₅ -N _;

5为11、 d-C ₆ 烷基、 -CC ^R^ -S0 ₂ -R ₁₂ 或者氨基酸残基； 优选为 H、 d-C ₄ 烷基、 -C(=0)R„、 或 -S0 ₂ -R _{12 ;} 最优选为11、 甲基、 乙基；

¾为 1、 2或 3 ;

Y为 N;

R ₅ 为 H或 d-C ₆ 烷基； 优选为 H或 d-C ₄ 烷基； 最优选为11、 甲基或乙基；

R6和 R ₇ 各自独立地为 H或 d-C ₆ 烷基； 优选为 H或 d-C ₄ 烷基； 最优选为11、 甲基 或乙基；

n ₃ 为 0、 1、 2或 3 ;

为 0、 1、 2或 3 ; 且 n ₃ 和 Π4不同时为 0;

U为 0、 R ₁₃ -N或 R ₁₄ -CH;

3为 H、 d-C ₆ 烷基、 -C(=0)R„ -S0 ₂ -R ₁₂ 或者氨基酸残基；优选为 H或 d-C ₄ 烷基； 最优选为15、 甲基或乙基；

Ru和 R ₁₂ 各自独立地为 H、 d-C ₆ 烷基、 C ₃ -C ₇ 环烷基、 d-C ₆ 烷氧基羰基、 苄基、 芳 基、 氨基 （NH ₂ )、 d-C ₆ 烷氧基羰基 d-C ₄ 烷基、 C ₃ -C ₇ 环烷基取代的氨基、 苄基或苯基 取代的氨基、 d-C ₆ 烷氧基或者 5-7元芳香杂环基； 优选为 H、 d-C ₄ 烷基、 d-C ₄ 烷氧基 羰基、 苄基、 芳基、 氨基 （NH ₂ )、 d-C ₄ 烷氧基羰基 d-C ₂ 烷基、 C ₅ -C ₇ 环烷基取代的氨 基、 苄基或苯基取代的氨基、 d-C ₄ 烷氧基或者吡啶基； 最优选为11、 甲基、 乙基、 甲氧 基羰基、 乙氧基羰基、 苄基、 苯基、 吡啶基， 用甲基、 硝基或甲氧基羰基取代的苯基、 氨 基 （NH ₂ )、 用乙氧基羰基乙基、 环己基或苄基取代的氨基、 甲氧基、 乙氧基或吡啶基；

Ri4 ¾ H, d-C ₆ 烷基、 羟基、 C ₃ -C ₇ 环烷基、 苄基、 芳基、 氨基 （NH ₂ )、 用 d-C ₄ 烷 基或羟基 d-C ₄ 烷基取代的氨基、 d-C ₆ 烷氧基或者 5-7元芳香杂环基； 优选为 H、 d-C ₄ 烷基、 羟基、 C ₃ -C ₇ 环烷基、 氨基 （NH ₂ )、 用 d-C ₄ 烷基或羟基 d-C ₄ 烷基取代的氨基或 d-C ₄ 烷氧基； 更优选为11、 甲基、 羟基、 羟甲基氨基、 羟乙基氨基或二甲氨基；

所述芳基可以是苯基、 萘基或联苯基， 或者用选自卤素、 d-C ₆ 烷基、 氰基、 硝基、 氨基（NH ₂ )、 羟基、 羟基 d-C ₄ 烷基、 卤代 d-C ₄ 烷基、 羧基、 d-C ₄ 烷氧基、 卤代 d-C ₄ 烷氧基、 巯基和 d-C ₄ 烷氧基羰基中的 1-4个取代基取代的苯基， 优选为苯基， 或者用选 自 d-C ₄ 烷基、硝基、氨基（NH ₂ )、羟基、羟基 d-C ₄ 烷基、 卤代 d-C ₄ 烷基、羧基、 Ci-C ₄ 烷氧基和 d-C ₄ 烷氧基羰基中的 1个取代基取代的苯基；

R ₂ 为 -OH;

R ₃ 为 -H _;

R4为 -H，

上述化合物中不包括如下化合物：

在本发明中， 术语 "芳基"是指芳香族环基， 优选是碳原子数为 6〜14个的芳基， 更 优选为碳原子数为 6〜12个的芳基， 如： 苯基、 萘基、 联苯基， 用选自卤素、 d-C ₆ 烷基、 氰基、 硝基、 氨基 （NH ₂ )、 羟基、 羟基 d-C ₄ 烷基、 卤代 d-C ₄ 烷基、 羧基、 d-C ₄ 烷氧 基、 卤代 d-C ₄ 烷氧基、 巯基、 d-C ₄ 烷氧基羰基中的 1-4个取代基取代的苯基， 如： 4- 甲基苯基、 4-羟基苯基、 2，3-二羟基苯基、 3-羟基苯基、 4-甲氧基苯基、 3-甲氧基 -4-羟基 苯基、 3，4-二甲氧基苯基， 更优选是苯基、 4-羟基苯基、 4-甲氧基苯基、 3-甲氧基 -4-羟基 苯基。

在本发明中， 术语" d-C ₆ 烷基"是指主链上具有 1至 6个碳原子的直链或支链烷基， 非限制性地包括甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 戊基、 已 基等； 优选异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基。

在本发明中， 术语 "d-C ₆ 烷氧基 "是指主链上具有 1至 6个碳原子的直链或支链烷氧 基， 非限制性地包括甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 丁氧基等； 优选甲氧基、 乙氧 基。

在本发明中， 术语" C ₃ -C ₇ 环烷基 "是指在环上具有 3至 7个碳原子的环状烷基， 非限 制性地包括环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基或环庚基； 优选环戊基、 环己基和环庚基。

在本发明中， 术语 "5-7元芳香杂环基"是指在环上具有至少一个选� �� N、 0和 S中 的杂原子的 5-7元芳香环基， 非限制性地包括呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁 唑基、咪唑基、 吡唑基和吡啶基； 优选吡咯基、 咪唑基和吡啶基。

在本发明中，所述氨基酸残基是指将氨基酸通 过縮合反应连接到本发明的化合物结构 上后形成的氨基酸部分，所述氨基酸是本领域 中公知的，非限制性地包括甘氨酸、苏氨酸、 脯氨酸、 酪氨酸、 色氨酸、 天冬氨酸、 谷氨酸等， 优选为甘氨酸、 脯氨酸、 酪氨酸、 色氨 酸。

本发明中的术语 "药学上可接受的盐"是指与磷酸、 硫酸、 盐酸等无机酸， 或醋酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苹果酸等有机酸， 或天冬氨酸、 谷氨酸等酸性氨基酸形成的盐， 或与上 述酸成酯或酰胺后再与无机碱形成的盐， 如钠、 钾、 钙、 铝盐和铵盐。 在本发明一个优选的实施方案中， 提供了一种下面通式 II表示的蟾毒配基衍生物， 或其药学上可接受的盐，

其中， 、 R ₂ 、 R ₃ 和 R4如通式 I中所定义，

：

在本发明一个更优选的实施方案中， 上述通式 Π中，

n ₅ 为 0、 1或 2:

¾为 0、 1、 2、 3或 4;

n ₇ 为 0、 1、 2、 3或 4; 且 和 n ₇ 不同时为 0;

W为 CH;

V为 R ₁₅ -N;

R ₁₅ 为 H或 d-C ₆ 烷基。

在本发明另一个优选的实施方案中， 提供了一种由下面通式 III表示的蟾毒配基衍生 物， 或其药学上可接受的盐，

 6

H H HO ^^ ^ o 80-am

薦 IOZXD/工：) <i 98Z000/CT0Z OAV

II1D22- 在本发明的第二方面，还提供了一种制备根据 本发明的蟾毒配基衍生物的方法，所述 方法为以下方法：

方法 A: 对于 X为 0的

反应式 1

( 1 ) 如反应式 1所示， 将化合物 1与氯甲酸对硝基苯酯经酯化反应得到中间体� �合 物 A， 其中， 所述酯化反应的具体条件是本领域技术人员的 常规选择， 例如， 可以在例如 三乙胺、 二异丙基乙基胺、 吡啶 （Py) 或 4-(N，N-二甲基)氨基吡啶 （DMAP)等的碱的存 在下， 在例如二氯甲烷 （DCM) 等的有机溶剂中进行；

(2)将中间体化合物 A与最终产物相应的氨（ 或

) 经取代反应得到通式 I化合物中的氨基甲酸酯化合物， 其中， 所 述取代反应的具体条件是本领域技术人员的常 规选择，例如，可在室温条件下在例如三乙 胺、 碳酸钾、 吡啶等的碱存在下进行；

( 3 ) 将步骤 （2) 中合成的氨基甲酸酯与最终产物相对应的酰氯 、 异氰酸酯或磺酰 氯 （R ₁₂ S0 ₃ C1， 其中 R ₁₂ 如通式 I所定义） 反应得到哌嗪氨基甲酸酯的酰化产物； 所述酰 化反应的具体条件是本领域技术人员的常规选 择，例如，可在室温在例如二氯甲烷等的溶 剂中在例如三乙胺、 碳酸钾、 吡啶等的碱存在下进行；

方法 B: 对于 X为 N的情况， 如下面反应式 2所示进行

反应式 2

( 1 ) 将化合物 1经氧化反应得到中间体化合物 D， 所述氧化反应的具体条件是本领 域技术人员的常规选择， 例如， 可在例如二氯甲烷 （DCM) 等的有机溶剂中用例如三氧 化铬吡啶 （PDC) 等的氧化剂进行；

(2)将化合物 D经还原反应得到中间体化合物 E， 所述还原反应的具体条件是本领 域技术人员的常规选择， 例如， 可在例如甲醇 （MeOH) —四氢呋喃 （THF) 的混合溶剂 等的有机溶剂中在例如三氯化铈（CeCl ₃ )的催化剂存在下用例如 NaBH ₄ 等的还原剂进行；

(3 ) 将化合物 E经叠氮化反应得到中间体化合物 F， 所述叠氮化反应的具体条件是 本领域技术人员的常规选择，例如，可在例如 四氢呋喃等的有机溶剂中用例如偶氮二甲酸 二乙酯 -叠氮化磷酸二苯酯 -三苯基膦等的叠氮化试剂进行；

(4)将化合物 F经还原反应得到中间体化合物 G， 所述还原反应的具体条件是本领 域技术人员的常规选择， 例如， 可在例如四氢呋喃-水的混合溶剂等的有机溶� �中用例如 三苯基膦的还原剂进行；

其中， 各取代基的定义如通式 I中所定义。

利用本发明所得的蟾毒配基衍生物或其药学上 可接受的盐可给药于人， 可以口服、 直肠、 肠胃外 (静脉内、 肌肉内或皮下)、 局部给药 (粉剂、 软膏剂或滴剂)。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒剂。 在这些固体剂 型中， 活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂 (或载体)混合， 如柠檬酸钠或磷酸二钙， 或 与下述成分混合： （a) 填料或增容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸;

(b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；

(c) 保湿剂， 例如， 甘油； （d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸盐、 和碳酸钠； （e) 缓溶剂， 例如石蜡； （f) 吸收加速剂， 例如， 季 胺化合物； （g) 润湿剂， 例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯； （h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠， 或其 混合物。 胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠衣和 其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂 ， 并且， 这种组合物中活性化合物或化合物 的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分 中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物 质和蜡类物质。 必要时， 活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种 形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的 乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆或酊剂。 除了活性化合物外， 液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释 剂， 如水或其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1，3-丁二醇、 二 甲基甲酰胺以及油， 特别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油或这些 物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外， 上述组合物也可包含助剂， 如润湿剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、 矫味剂和香料。

除了活性化合物外， 悬浮液可包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十八烷醇、 聚氧乙烯 山梨醇和脱水山梨醇酯、 微晶纤维素、 甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受 的无菌含水或无水溶液、 分散液、 悬 浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射 溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非 水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏 剂、散剂、喷射剂和吸入剂。活性成分 在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防 腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂 一起混合。

因此， 在本发明的第三方面， 还提供了一种药物组合物， 它含有治疗有效量的选自 根据本发明蟾毒配基衍生物和其药学上可接受 的盐中的一种或多种作为活性成分，以及任 选的药学上可接受的载体、 赋形剂、 佐剂、 辅料和 /或稀释剂。

在本发明第四方面， 提供了根据本发明的蟾毒配基衍生物或其药学 上可接受的盐、 和包含该衍生物的药物组合物在制备用于治疗 恶性肿瘤的药物中的用途，其包括给具有该 需要的患者给药治疗有效量的选自根据本发明 的蟾毒配基衍生物和其药学上可接受的盐 中的一种或多种，或根据本发明的包含治疗有 效量的选自根据本发明的蟾毒配基衍生物和 其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性 成分的药物组合物。本发明所述的化合物或 其药学上可接受的盐可以单独给药，或者与其 他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是 与其他抗肿瘤病药物组合。 所述治疗剂包括但不限于： 作用于 DNA化学结构的药物抗肿 瘤药如顺铂， 影响核酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤 (MTX)、 5-氟尿嘧啶 (5FU)等， 影响 核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素、 阿克拉霉素、光辉霉素等， 作用于微管蛋白 合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春瑞滨等，芳 香化酶抑制剂如氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、 瑞宁德等， 细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制 剂伊马替尼（Im _a tinib)、 吉非替 尼 （Gefitinib)、 埃罗替尼 （Erlotinib)、 拉帕替尼 （Lapatinib) 等 。 待组合的各成分可同 时或顺序地给予， 以单一制剂形式或以不同制剂的形式给予。所 述组合不仅包括本发明的 化合物和一种其它活性剂的组合，而且包括本 发明的化合物和两种或更多种其它活性剂的 组合。

因此， 在本发明的第五方面， 提供了一种药物组合物， 其包含治疗有效量的选自根据 本发明的蟾毒配基衍生物和其药学上可接受的 盐中的一种或多种作为活性成分以及其他 药学上可接受的治疗剂，特别是其他抗肿瘤药 物。所述药物组合物任选可以进一步包含药 学上可接受的载体、 赋形剂、 佐剂、 辅料和 /或稀释剂。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗恶性肿 瘤的方法，所述方法包括给具有该需要 的患者给药治疗有效量的选自根据本发明的蟾 毒配基衍生物和其药学上可接受的盐中的 一种或多种，或根据本发明的包含治疗有效量 的选自根据本发明的蟾毒配基衍生物和其药 学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分 的药物组合物。

在本发明中， 所述恶性肿瘤非限制性地包括肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 胃癌、 食道癌、 结 肠癌、 白血病、 淋巴癌、 前列腺癌、 肾癌、 皮肤癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 脑癌、 骨髓癌和纤 维肉瘤等； 优选为肝癌、 肺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胃癌、 白血病等。 本发明设计与合成了一类新型的蟾毒配基衍生 物， 其对对肿瘤细胞株具有抑制活性， 可用作治疗恶性肿瘤的药物。 本发明化合物合成简单， 易于制备， 且合成原料丰富。 具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不限制本发明。本发明的实验操作具 有通用性， 不限于发明中提到的化合物。

下述制备例中， 1H-NMR用 Varian Mercury AMX300型仪测定。 MS用 VG ZAB-HS 或 VG-7070型以及 Esquire 3000 plus-01005测定。所有溶剂在使用前均经过重新� �馏， 所 使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得 。除说明外，所有反应均是在氩气保护下进 行并用 TLC跟踪， 后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥 过程。 产品的纯化除说 明外均使用硅胶 (200-300 目）的柱色谱法， 所使用的硅胶包括 200-300目， GF ₂₅₄ 为青岛海 洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。 蟾酥用 95%乙醇提取， 浓縮后经两次柱层析得到蟾 毒灵粗品， 粗品经乙醇重结晶得到蟾毒灵。

实施例 1 化合物 II1B-01

在 50 mL 圆底烧瓶中， 将氯甲酸对硝基苯酯 （1.206 g， 6 mmol ) 溶于 10 mL无水二 氯甲烷中， 加入干燥吡啶 （0.67 mL)， 立刻出现白色沉淀， 氮气保护条件下滴加蟾毒灵 (2 mmol ) 的二氯甲烷溶液 （10 mL)， 在室温下搅拌 6小时，反应完毕后用水洗涤两次，无水 硫酸钠干燥后， 减压浓縮经硅胶柱层析 （90: 10， 石油醚 /丙酮） 得到中间体 A。

在 10 mL 圆底烧瓶中， 将中间体 A溶于 3 mL二氯甲烷中， 加入三乙胺 （35 L)， 加 入 N，N-二甲基乙二胺 （6 mmol),在室温下搅拌 2小时 (以下类似反应的反应时间由薄层层 析检测确定)， 反应完毕后用饱和碳酸钠溶液洗涤一次， 反复用水洗涤直至溶液澄清， 无 水硫酸钠干燥后， 减压浓縮经硅胶柱层析 （石油醚 /丙酮 /氨水， 50:50:0.5)， 得到产物 II1B-01 , 产率为 91%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J= 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d， 1H, J= 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J= 9.6 Hz), 5.00 (br s, 1H)， 3.40 (s, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.77 (t， 2H, J = 6.3 Hz), 2.46 (s, 3H), 1.08-2.21 (m, 22H), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ , 75 MHz) δ 16.7, 21.5, 21.6, 24.1, 25.5, 26.7, 28.9, 29.8, 30.9, 32.9, 35.4, 36.0, 36.4, 37.4, 37.4, 41.0, 42.5, 48.5， 48.6， 49.8， 51.4， 71.4, 85.4， 115.4， 122.9, 147.0, 148.7, 155.5， 162.6; ESI-MS (m/z) 501.4 [M+l]+。

实施例 2 化合物 II1B-02的制

反应操作如化合物 II1B-01的制备， 原料用 N，N-二乙基乙二胺代替 N，N-二甲基乙二 胺； 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 78%。 1H NMR CCDC1 ₃ ，300 MHz) δ 7.84 (dd， 1H， J= 9.6， 2.4 Hz), 7.22 (d, 1H， J = 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 5.21 (br s， 1H), 3.23 (d， 2H, J= 5.4 Hz), 2.55 (m， 6H)， 1.02 (t， 6H， J= 7.2 Hz), 1.09-2.26 (m， 22H), 0.94 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ ， 75 MHz) δ 11.8， 11.8， 16.7, 21.5, 21.6, 23.9, 25.5, 26.6, 28.9, 29.9, 30.9, 32.9, 35.3, 36.0, 36.9, 38.7, 41.0， 42.5, 47.1, 47.1, 48.5， 51.4， 52.1, 70.7, 85.5， 115.4， 122.9, 147.1, 148.7, 156.6， 162.6; ESI-MS (m/z) 529.5 [M+l] +。

实施例 3化合物 II1B-03的制

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 Ν,Ν,Ν'-三甲基乙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /三乙胺 （60:40:0.5)， 产率为 90%。 1H NMR (CDC1 ₃ ，300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J= 9.6， 2.4 Hz), 7.22 (d, 1H， J = 2.4 Hz), 6.24 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 4.99 (br s， 1H), 3.36 (t， 2H, J= 7.2 Hz), 3.36 (s， 3H), 2.44 (t， 2H, J= 7.2 Hz), 2.26 (s， 6H)， 1.20-2.20 (m， 22H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ ， 75 MHz) δ 16.7, 21.5, 21.6, 24.1, 25.5, 26.6, 28.9, 29.8, 30.9, 32.9, 34.6, 35.3, 36.0, 37.4, 41.0， 42.5, 47.1, 45.9， 48.5， 51.4， 57.0, 57.4, 71.2, 85.4， 115.4， 122.9, 147.1, 148.7, 156.1， 162.6; ESI-MS (m/z) 515.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 4 化合物 II1B-04的制备

反应操作如 IIlB-01的制备，原料用 N，N-二甲基 -Ν'-乙基乙二胺代替 N，N-二甲基乙二 胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚 /丙酮 /三乙胺 (60:40:0.5)， 产率为 73%。1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J= 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H， J = 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 5.01 (br s， 1H), 3.31 (m， 4H)， 2.46 (t， 2H, J= 6.9 Hz), 2.27 (s， 6H)， 1.21-2.20 (m， 22H), 1.13 (t， 3H, J= 7.2 Hz), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 529.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 5 化合物 II1B-05的制

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 N-乙基乙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱 层析洗脱液：石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 72%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J = 9.6， 2.4 Hz), 7.22 (d， 1H, J = 2.4 Hz), 6.25 (d， 1H， J = 9.6 Hz), 4.98 (br s, 1H)， 3.27 (q， 2H, J= 6.0 Hz), 2.75 (t， 2H, J = 6.0 Hz), 2.65 (t， 2H, J= 6.0 Hz), 1.12-2.45 (m， 22H), 1.10 (t， 3H, J= 7.2 Hz), 0.93 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 501.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 6 化合物 II1B-06的

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 Ν,Ν'-二乙基乙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅 胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 91%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H， J = 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 5.01 (br s， 1H), 3.34 (m， 4H)， 2.67 (t， 2H, J= 7.2 Hz), 1.16-2.24 (m， 22H), 1.11 (t, 6H， J= 7.2 Hz), 0.95 (s _: 3H), 0.70 (s， 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ , 75 MHz) δ 14.0, 15.4, 16.7, 21.5, 21.6, 24.1, 25.6, 26.7, 28.9, 29.8， 31.0, 32.9, 35.4, 36.0, 37.5, 41.0, 42.5, 42.7, 44.2, 47.0, 48.1, 48.5， 51.4, 71.1, 85.4， 115.4, 122.9, 147.1, 148.7, 156.1， 162.6; ESI-MS (m/z) 529.5 [M+l] ⁺ 。

实施例 7化合物 II1B-09的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 1，2-乙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析 洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 85%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J = 9.7 Hz), 7.22 (s， 1H), 6.24 (d， 1H, J = 9.7 Hz), 4.98 (s， 1H), 3.40 (t， 2H, J = 6.6 Hz), 3.21 (t， 2H, J = 6.6 Hz), 2.44 (m， 1H)， 1.13-2.50 (m， 21H), 0.90 (s， 3H), 0.67 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 473.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 8 化合物 IIlB-10的

反应反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 1，3-丙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱 层析洗脱液：石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 85%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.84 (d， 1H， J = 9.7 Hz), 7.23 (s, 1H)， 6.26 (d, 1H， J = 9.7 Hz), 5.03 (s, 1H)， 4.98 (s, 1H)， 3.27 (m， 2H), 2.78 (t， 2H, J = 6.6 Hz), 2.45 (m， 1H), 1.13-2.48 (m， 23H), 0.94 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 487.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 9 化合物 II1B-07的制

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 Ν,Ν'-二甲基丙二胺代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅 胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 91%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.22 (s, 1H), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.99 (br s, 1H), 3.32 (t， 2H, J = 6.0 Hz), 2.89 (s， 3H), 2.58 (t， 2H, J= 6.3 Hz), 2.42 (s， 3H), 1.16-2.41 (m， 24H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 515.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 10 化合物 II1B-08的制备

反应操作如 II1B-01的制备，原料用 N，N-二乙基 Ν'-甲基丙二胺代替 N，N-二甲基乙二 胺； 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率为 86%。 1H NMR CCDC1 ₃ ，300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.4), 7.22 (d， 1H, J= 2.4 Hz), 6.25 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 4.96 (br s， 1H), 3.23 (m， 2H), 2.52 (m， 6H)， 1.16-2.24 (m， 24H), 1.05 (t， 6H， J= 7.2 Hz), 0.93 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 557.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 11 化合物 IIlD-01的制备

反应操作如 IIlB-01 的制备， 原料用哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析洗脱 液： 石油醚 /丙酮 (80:20)， 产率为 74%。 1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (dd, 1H, J= 9.6, 2.7 Hz), 7.23 (d, 1H， J = 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 5.01 (br s， 1H)， 3.41 (m， 4H)， 1.17-2.49 (m， 28H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 520.4 [M+23] ⁺ 。

实施例 12 化合物 II1D-04的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 4-羟基哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层 析洗脱液： 石油醚 /丙酮 (70:30)， 产率为 97%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd, 1H， J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H， J= 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J= 9.6 Hz), 5.00 (br s, 1H), 3.88 (m， 3H)， 3.09 (m， 2H), 1.17-2.49 (m， 26H), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ ， 75 MHz) δ 16.7, 21.5, 21.6, 24.1, 25.5, 26.7, 28.9, 29.9， 31.0, 33.0, 34.3, 34.3, 35.4, 36.0, 37.4, 41.0, 41.4, 41.4, 42.5, 48.6， 51.4， 67.7, 71.3, 85.5， 115.5， 122.9, 147.1, 148.8， 155.5， 162.7; ESI-MS (m/z) 514.4 [M+l]十。

实施例 13 化合物 II1D-05的制备

反应操作如 IIlB-01 的制备， 原料用哌嗪代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析洗脱 液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 87% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H, J= 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.02 (br s， 1H), 3.45 (t， 4H， J = 5.1 Hz), 2.84 (t， 4H， J = 5.1 Hz), 1.06-2.49 (m， 22H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ , 75 MHz) δ 16.7, 21.5, 21.6, 24.1, 25.5, 26.6, 28.9, 29.8, 31.0, 32.9, 35.4, 36.0, 37.4, 41.0, 42.5, 44.8， 44.8， 45.9， 45.9， 48.5， 51.4， 71.3, 85.4， 115.4， 122.9, 147.1, 148.7, 155.2, 162.6; ESI-MS (m/z) 499.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 14 化合物 II1D-03的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 N-甲基哌嗪代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层 析洗脱液：石油醚 /丙酮 /氨水 (80:20:0.5)， 产率 83%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.23 (d, 1H, J= 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.02 (br s， 1H), 3.49 (t， 4H， J= 4.8 Hz), 2.39 (t， 4H， J= 4.8 Hz), 2.30 (s, 3H), 1.10-2.48 (m， 22H), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 513.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 15 化合物 IIlE-01的制

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 4-氨基哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层 析洗脱液：石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 81%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 400 MHz) δ 7.85 (dd， 1H, J= 9.6， 2.5 Hz), 7.22 (d, 1H， J= 2.5 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.60 (br s， 1H), 5.00 (br s， 1H), 4.09 (br s, 2H), 2.83 (m， 5H)， 1.04-2.48 (m， 26H), 0.95 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ , 75 MHz) δ 16.7, 21.6, 21.6, 24.1, 25.5, 26.7, 28.9, 29.9, 30.9, 33.0, 35.4, 35.6, 35.6, 36.1, 37.4, 41.1， 42.6, 42.9, 42.9, 48.6， 48.9， 51.4， 71.2, 85.5， 115.5， 122.9, 147.0, 148.7, 155.2, 162.6; ESI-MS (m/z) 513.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 16 化合物 II1E-02的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 4-氨甲基哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱 层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 86%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d， 1H, J = 2.4 Hz), 6.25 (d， 1H， J = 9.6 Hz), 5.00 (br s, 1H)， 4.14 (br s， 2H), 2.74 (t， 2H, J = 4.2 Hz), 2.59 (d， 1H, J = 6.6 Hz), 1.05-2.48 (m， 27H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 527.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 17化合物 II1E-03的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 2-氨甲基哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱 层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 94%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d， 1H, J = 2.4 Hz), 6.25 (d， 1H， J = 9.6 Hz), 4.98 (br s, 1H)， 3.10 (m， 1H), 3.08 (m， 2H), 2.63 (m， 2H), 1.05-2.46 (m， 26H), 0.94 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 527.5 [M+l] ⁺ 。

实施例 18 化合物 II1E-04的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 4-氨基 -N-甲基哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅 胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 83%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 400 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J = 9.7 Hz), 7.23 (s， 1H), 6.26 (d, 1H， J = 9.7 Hz), 4.98 (br s， 1H), 3.74 (m， 1H)， 3.54 (d， 2H, J= 11.2 Hz), 2.80 (m， 5H)， 1.06-2.45 (m， 26H), 0.94 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 527.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 19 化合物 II1E-05的

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用 4-氨基 -1-乙酰哌啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅 胶柱层析洗脱液：石油醚 /丙酮 (50:50)， 产率 S /Q H NMR (CDC1 ₃ ， 400 MHz) δ 7.84 (d， 1H， J = 9.7 Hz), 7.22 (s， 1H), 6.23 (d, 1H， J = 9.7 Hz), 5.67 (d， 1H， J = 7.8 Hz )， 4.97 (br s， 1H)， 4.08 (d， 2H, J = 13.8 Hz), 3.91 (m， 1H), 2.88 (m， 4H)， 2.45 (m， 1H), 1.20-2.40 (m， 25H), 0.93 (s， 3H), 0.68 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 555.2 [M+l] ⁺ 。

实施例 20 化合物 II1D-06的制备

反应操作如 IIlB-01 的制备， 原料用高哌嗪代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析洗 脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 86% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H， J= 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H， J= 9.6 Hz), 5.03 (br s， 1H)， 3.52 (m， 4H)， 2.93 (t， 2H, J= 5.1 Hz), 2.87 (m， 2H), 1.17-2.46 (m， 24H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ¹³ C NMR (CDC1 ₃ , 75 MHz) δ 16.7, 21.6, 21.7, 24.2, 25.6, 26.7, 28.9, 29.9, 30.6, 31.1, 33.0, 35.4, 36.1, 37.5, 41.1, 42.6, 46.0， 48.2, 48.6， 49.5， 49.7, 51.5, 71.1, 85.5， 115.5, 122.9, 147.1, 148.8, 156.0, 162.6; ESI-MS (m/z) 513.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 21化合物 II1D-19的制备

反应操作如 IIlB-01 的制备， 原料用咪唑啉代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析洗 脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 43% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 400 MHz) δ 7.84 (dd， 1H, J= 9.7, 3.0 Hz), 7.23 (d, 1H， J= 3.0 Hz), 6.27 (d, 1H， J= 9.7 Hz), 5.03 (br s， 1H)， 4.15 (s, 1H)， 4.12 (s, 1H), 3.47 (m, 2H), 3.29 (s, 1H), 2.98 (m, 2H), 2.46 (m, 1H), 1.18-2.22 (m, 21H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 485.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 22 化合物 II1D-20的制

反应操作如 IIlB-01 的制备， 原料用六氢嘧啶代替 N，N-二甲基乙二胺； 硅胶柱层析 洗脱液：石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 36%。 1H NMR (CDC1 ₃ ， 400 MHz) δ 7.84 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.22 (s, 1H), 6.26 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 5.02 (br s, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.61 (t， 1H, J = 3.0 Hz), 3.52 (m， 1H), 3.25 (s, 1H), 2.98 (t， 1H, J = 3.0 Hz), 2.82 (m， 1H), 2.45 (m， 1H)， 1.24-2.24 (m， 23H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 485.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 23 化合物 II1D-22的

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用哌啶 -4-酮代替 N，N-二甲基乙二胺， 得中间体， 中间体与甲胺反应经氰基硼氢化钠还原， 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 45% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.84 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.22 (d， 1H, J= 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.99 (br s， 1H), 4.07 (br s， 2H )， 2.86 (t, 2H, J= 10.5 Hz), 2.52 (m， 3H )， 2.44 (s， 3H), 2.20 (m， 1H), 1.30-2.20 (m， 26H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 527.7 [M+l] ⁺ 。

实施例 24 化合物 II1D-23的

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用哌啶 -4-酮代替 N，N-二甲基乙二胺， 得中间体， 中间体与乙胺反应经氰基硼氢化钠还原， 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)，产率 47%。1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) 57.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.25 (d, 1H _: J= 2.7 Hz), 6.26 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 5.00 (br s， 1H), 4.10 (br s， 2H )， 2.84 (t， 2H, J= 10.5 Hz), 2.69 (q， 2H, J = 6.00 Hz), 1.25-2.48 (m， 26H), 1.20 (t， 3H, J = 6.00 Hz), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 541.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 25 化合物 II1D-24

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用哌啶 -4-酮代替 N，N-二甲基乙二胺， 得中间体， 中间体与 2-羟基乙胺反应经氰基硼氢化钠还原， 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 46% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.22 (d， 1H, J= 2.7 Hz), 6.25 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 4.99 (br s， 1H), 3.66 (t， 2H, J= 6.0 Hz )， 2.82 (t， 2H, J= 6.0 Hz), 2.65 (m， 1H )， 2.44 (m， 1H), 2.20 (m， 1H), 1.02-2.50 (m， 25H), 0.93 (s， 3H), 0.69 (s _: 3H); ESI-MS (m/z) 557.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 26 化合物 II1D-25的制备

反应操作如 IIlB-01的制备， 原料用哌啶 -4-酮代替 N，N-二甲基乙二胺， 得中间体， 中间体与二甲胺反应经氰基硼氢化钠还原， 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 (50:50:0.5)， 产率 46% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.25 (d， 1H, J= 2.7 Hz), 6.26 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.01 (br s， 1H), 4.18 (br s， 2H ), 2.78 (t, 2H, J= 10.5 Hz), 2.45 (m， 1H )， 2,29 (s， 6H )， 1.15-2.50 (m， 25H), 0.96 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 541.4 [M+l

实施例 27化合物 II1D-07的制备

在 10 mL 圆底烧瓶中， 将化合物 II1D-05 (30 mg， 0.06 mmol ) 溶于 2 mL无水二氯甲 烷中， 加入 3-异氰酰丙酸乙酯 (0.18 mmol )， 在室温下搅拌 2小时， 反应完毕后用水洗涤 两次，无水硫酸钠干燥后，减压浓縮经硅胶柱 层析（氯仿 /丙酮， 85:15),得到产物 II1D-07, 产率 98% 1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.22 (s, 1H), 6.25 (d， 1H, J = 9.6 Hz), 5.26 (t， 1H-N, J = 5.4 Hz), 5.03 (br s， 1H), 4.14 (q， 2H, J = 6.9 Hz), 3.50 (m， 6H)， 3.36 (m， 4H)， 2.54 (t， 2H, J= 5.7 Hz), 1.26 (t， 3H, J= 6.9 Hz), 1.16-2.47 (m， 22H), 0.95 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 642.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 28 化合物 II1D-08的制备

反应操作如 II1D-07的制备， 原料用异氰酸环己酯代替 3-异氰酰丙酸乙酯； 硅胶柱层 析洗脱液：氯仿 /丙酮 (85:15)， 产率83%。1H NMR (CDCl ₃ ，300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H，J= 9.9， 2.4 Hz), 7.22 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 9.9 Hz), 5.03 (br s， 1H), 4.26 (d， 1H-N, J = 7.2 Hz), 3.63 (m， 1H), 3.47 (m， 4H)， 3.35 (m， 4H)， 1.02-2.48 (m， 32H), 0.95 (s, 3H), 0.69 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 624.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 29 化合物 II1D-09的制备

反应操作如 II1D-07的制备， 原料用苄基异氰酸酯代替 3-异氰酰丙酸乙酯； 硅胶柱层 析洗脱液： 氯仿 /丙酮 (85:15)， 产率 92%。 1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (d, 1H, J= 9.9 Hz), 7.32 (m， 5H)， 7.22 (s, 1H)， 6.24 (d, 1H， J = 9.9 Hz), 5.03 (br s， 1H)， 4.76 (br s， 1H-N), 4.22 (d， 2H, J = 5.4 Hz), 3.49 (m， 4H)， 3.40 (m， 4H)， 1.16-2.48 (m， 22H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 632.5 [M+l] ⁺ 。

实施例 30 化合物 IIlD-10的制备

在 10 mL 圆底烧瓶中， 将化合物 II1D-05 (30 mg， 0.06 mmol ) 溶于 2 mL无水二氯甲 烷中， 依次加入三乙胺 （25 μΐ) 和甲磺酰氯 (0.18 mmol ), 在室温下搅拌 2小时， 反应完 毕后用水洗涤两次， 无水硫酸钠干燥后， 减压浓縮经硅胶柱层析 (石油醚 /丙酮， 80:20)， 得到化合物 II1D-10, 产率 95% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J= 9.9 Hz), 7.23 (s, 1H)， 6.26 (d, 1H, J = 9.9 Hz), 5.05 (br s， 1H), 3.60 (t, 4H， J = 4.5 Hz), 3.22 (t, 4H， J = 4.5 Hz), 2.80 (s， 3H), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 577.2 [M+l] ⁺ 。 实施例 31 化合物 IIlD-11的制备

反应操作如 IIlD-10的制备，原料用对甲苯磺酰氯代替甲磺� �氯；硅胶柱层析洗脱液: 石油醚 /丙酮 (80:20)， 产率 92% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.82 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.62 (d， 2H, J= 8.1 Hz), 7.33 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.22 (s, 1H), 6.24 (d， 1H, J = 9.6 Hz), 4.95 (br s， 1H), 3.55 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 2.97 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 2.43 (s， 3H), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.92 (s， 3H), 0.68 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 653.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 32 化合物 II1D-12的制备

反应操作如 IIlD-10的制备， 原料用 2- (磺酰氯)苯甲酸甲酯代替甲磺酰氯； 硅胶柱层 析洗脱液：石油醚 /丙酮 (70:30)， 产率 93%。 iH NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (m， 2H), 7.62 (m， 2H), 7.49 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.22 (s, 1H), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.98 (br s, 1H), 3.94 (s， 3H), 3.55 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 3.19 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 697.3 [M+l] ⁺ 。

实施例 33 化合物 II1D-13的制备

反应操作如 IIlD-10的制备， 原料用邻硝基苯磺酰氯代替甲磺酰氯； 硅胶柱层析洗脱 液： 石油醚 /丙酮 (70:30)， 产率 90% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.99 (dd， 1H，J= 7.2, 1.8 Hz), 7.83 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.74 (m， 2H), 7.63 (dd， 1H, J= 7.2, 1.8 Hz), 7.26 (s， 1H), 6.25 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 5.01 (br s， 1H), 3.57 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 3.30 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.95 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 684.7 [M+l] ⁺ 。

实施例 34 化合物 II1D-14的制备

在 10 mL 圆底烧瓶中， 将化合物 II1D-05 (30 mg， 0.06 mmol ) 溶于 2 mL无水二氯甲 烷中， 依次加入吡啶 （15 μν, 和相应乙酸酐 (0.18 mmol ), 在室温下搅拌 2小时， 反应完 毕后用水洗涤两次， 无水硫酸钠干燥后， 减压浓縮经硅胶柱层析 (石油醚 /丙酮 70:30)， 得 到化合物 II1D-14, 产率 83 NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (d, 1H, J= 9.9 Hz), 7.23 (s， 1H), 6.25 (d， 1H, J= 9.9 Hz), 5.04 (br s， 1H), 3.60 (t， 2H, J= 5.1 Hz), 3.47 (t， 6H， J= 5.1 Hz), 2.11 (s， 3H), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.95 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 541.2 [M+l] ⁺ 。

实施例 35 化合物 II1D-15的制备

反应操作如 II1D-14的制备， 原料用草酰氯单乙酯代替乙酸酐； 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 (70:30)， 产率 89% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (d， 1H, J= 9.6 Hz), 7.23 (s， 1H)， 6.26 (d， 1H, J = 9.6 Hz), 5.05 (br s， 1H), 4.35 (q， 2H, J = 7.2 Hz), 3.63 (t， 2H, J = 5.1 Hz), 3.54 (t， 4H， J = 5.1 Hz), 3.45 (t， 2H, J = 5.1 Hz), 1.37 (t， 3H, J = 7.2 Hz), 1.20-2.49 (m， 22H), 0.96 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 599.3 [M+l]+。

实施例 36 化合物 II1D-16的制备

反应操作如 II1D-14的制备， 原料用苯甲酰氯代替乙酸酐； 硅胶柱层析洗脱液： 石油 醚 /丙酮 (70:30)， 产率 86% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 8.08 (d， 1H,J= 9.9 Hz), 7.58 (m， 5H)， 7.23 (s, 1H)， 6.26 (d, 1H， J = 9.9 Hz), 5.05 (br s， 1H)， 3.76 (m， 2H), 3.50 (m， 6H)， 1.20-2.49 (m， 22H), 0.94 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 603.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 37化合物 IIIlA-01的制备

III1A-01 室温条件下， 蟾毒灵 （l mmol) 用二氯甲烷 （DCM) 溶解于 25 mL的圆底烧瓶中， 缓慢加入三氧化铬吡啶 PDC (4 mmol), 反应过夜， 反应液过滤得红棕色液体， 减压蒸馏 除去溶剂， 经硅胶柱层析 （石油醚： 丙酮 =5:1) 得白色固体 D。

0°C条件下， 七水合三氯化铈（1.3 mmol)用甲醇溶于 25 mL的圆底烧瓶中， 缓慢加 入硼氢化钠 （NaBH ₄ ) (1.2 mmol), 将反应体系温度降至 -78 °C， 缓慢加入上述化合物 D ( 1 mmol) 的四氢呋喃 （10 mL) 溶液， 反应 1小时， 滴加 I mL水， 然后将溶液升至室 温， 减压蒸馏除去溶剂， 再用二氯甲烷溶解， 分别用水、 饱和食盐水洗涤， 有机相减压蒸 馏除去溶剂得白色固体 E， 直接投下一步反应。

冰浴条件， 氮气保护下， 上述产物白色固体 E ( 1 mmol)和三苯基膦（TPP, 2 mmol) 用无水四氢呋喃溶解 （10 mL)， 加入叠氮磷酸二苯酯 （DPPA), 然后缓慢加入偶氮二甲 酸二乙酯 （DEAD), 溶液颜色逐渐变黄， 将反应体系温度升至室温， 搅拌过夜， 减压蒸 馏除去溶剂， 用二氯甲烷溶解， 分别用水、 饱和食盐水洗涤， 收集有机相， 减压蒸馏得黄 色油状物， 经硅胶柱层析 （石油醚： 丙酮 =6:1 ) 得白色固体 F。

上述固体 F ( 1 mmol) 和三苯基膦 （1.2 mmol) 用四氢呋喃 10 mL溶解， 加入 1 mL 水， 在 70 °C回流过夜， 减压蒸馏除去溶剂， 用二氯甲烷溶解， 分别用水、 饱和食盐水洗 涤， 收集有机相， 减压蒸馏除去溶剂得黄色油状物， 经硅胶柱层析， 先用石油醚： 丙酮 =4:1洗脱，然后用石油醚 /丙酮 /氨水 (20:10:0.1)洗脱得白色固体 III1A-01。 1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz ) δ 7.85 (dd， 1H, J = 9.6， 2.7 Hz), 7.23 (d， 1H, J= 2.7 Hz), 6.27 (d， 1H, J = 9.6 Hz), 5.30 (br s， 1H), 3.48 (br s， 1H), 3.27 (br s， 1H), 2.45 (d， 1H, J = 2.7 Hz), 1.20-2.49 (m， 21H), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 386.4 [M+l]+。

实施例 38化合物 III1D-02的制备

室温条件下， 化合物 IIIlA-01 ( 1 mmol) 用二氯甲烷溶解于 10 mL的圆底烧瓶中， 氮气保护下加入碳酰二咪唑（3 mmol), 三乙胺 （3 mmol)反应 2 小时， 反应液经水洗干 燥后加入哌嗪（3 mmol)和三乙胺 （3 mmol), 反应 3 小时， 反应结束后， 反应液经水洗 干燥后经硅胶柱层析（石油醚 /丙酮 /氨水， 50:50:0.5 )得产物， 产率 60%。 1H NMR (CDC1 ₃ , 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J = 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d， 1H, J = 2.4 Hz), 6.26 (d， 1H, J = 9.6 Hz), 4.65 (d， 1H, J= 6.0 Hz), 4.12 (s， 1H), 3.34 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 2.88 (t， 4H， J= 5.1 Hz), 2.46(m, 1H )， 1.04-2.40 (m， 21H), 0.95 (s, 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 498.3 [M+l]+。

实施例 39 化合物 III1D-03的制备

反应操作如 III1D-02的制备， 原料用 N-甲基哌嗪代替哌嗪； 硅胶柱层析洗脱液： 石 油醚 /丙酮 /氨水 （50:50:0.5)，产率 53% 1H NMR (CDC13, 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.23 (d, 1H， J = 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H， J = 9.6 Hz), 4.61 (d, 1H， J = 6.0 Hz )， 4.12 (s, 1H), 3.49 (t， 4H, J= 4.8 Hz), 2.39 (t， 4H, J= 4.8 Hz), 2.30 (s， 3H), 1.12-2.27 (m， 22H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 512.3 [M+l]+。

实施例 40 化合物 III1D-04的

反应操作如 III1D-02的制备， 原料用高哌嗪代替哌嗪， 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 / 丙酮 /氨水 （50:50:0.5)， 产率 56% 1H NMR (CDC13, 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J= 9.6， 2.4 Hz), 7.23 (d, 1H， J = 2.4 Hz), 6.26 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 4.61 (d， 1H, J = 6.0 Hz), 4.12 (s， 1H)， 3.50 (m， 4H)， 2.96 (t， 2H， J = 6.0 Hz), 2.90 (t， 2H， J = 6.0 Hz), 2.45(m, 1H )， 1.12-2.44 (m， 23H), 0.95 (s， 3H), 0.69 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 512.4 [M+l] ⁺ 。

实施例 41 化合物 IIIlE-01的

反应操作如 III1D-02的制备， 原料用 4-氨基哌啶代替哌嗪， 硅胶柱层析洗脱液： 石 油醚 /丙酮 /氨水 （50:50:0.5)， 产率 56% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz ) δ 7.84 (dd， 1H, J= 9.6， 2.7 Hz), 7.23 (d， 1H, J= 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.68 (d， 1H, J = 6.0 Hz), 4.10 (br s， 1H), 3.86 (d， 2H, J= 9.0 Hz), 2.83 (t， 4H， J= 12.0 Hz), 2.46 (m， 1H), 1.12-2.45 (m， 25H), 0.93 (s， 3H), 0.73 (s， 3H); ESI-MS (m/z) 512.2 [M+l] ⁺ 。 实施例 42 化合物 III1E-02的制备

反应操作如 III1D-02的制备， 原料用 2-胺甲基哌啶代替哌嗪； 硅胶柱层析洗脱液： 石油醚 /丙酮 /氨水 （50:50:0.5)， 产率 53% 1H NMR (CDC1 ₃ ， 300 MHz) δ 7.83 (dd， 1H， J = 9.6， 2.7 Hz), 7.23 (d, 1H, J= 2.7 Hz), 6.25 (d, 1H， J= 9.6 Hz), 4.61 (d, 1H, J= 6.0 Hz), 4.12 (s, 1H), 3.49 (d， 2H， J = 4.8 Hz), 3.12 (m， 1H), 2.39 (m， 2H), 1.12-2.30 (m， 27H), 0.95 (s， 3H), 0.70 (s, 3H); ESI-MS (m/z) 526.3 [M+l]+。

实施例 43 化合物 II1B-02盐酸 -02'HC1) 的制备

将 II1B-02 (1 mmol)溶于 30 mL 1%的稀盐酸中， 室温搅拌 2 小时， 反应结束后， 经 过滤得到的粗产品， 用乙醇重结晶， 得到白色固体 III1B-02*HC1， 产率 80%。

所有其它化合物的盐酸盐， 均可以用实施例 43的方法将相应的化合物与稀盐酸反应 进行制备。

本发明所提及的化合物的有机酸和无机酸盐均 可用与实施例 43类似的方法将所述化 合物与相应的有机酸或无机酸反应进行制备。 试验实施例

试验实施例 1体外抗肿瘤活性实验

1) 试验材料

Hela人宫颈癌细胞株、 A-549人非小细胞性肺癌细胞株、 NCI-H2228人肺癌细胞株、 NCI-H460 人肺癌细胞株， MDA-MB-231 人乳腺癌细胞株、 MCF-7 人乳腺癌细胞株， Bel-7402人肝癌细胞株、 Hep3B人肝癌细胞株、 QGY-7703人肝癌细胞株， MV-4-11人白 血病细胞株、 DAUDI人白血病细胞株、 Jurkat人白血病细胞株， A498肾癌细胞株， LoVo 人结肠癌细胞株、 HCT1116人结肠癌细胞株， A431人皮肤癌细胞株， PA C-1人胰腺癌 细胞株， U87-MG人脑癌细胞株、 SH-SY5Y人脑癌细胞株， RPMI-8226人骨髓癌细胞株， HT1080 人纤维肉瘤细胞株， PC-3 人前列腺癌细胞株， AGS 人胃腺癌细胞株、 BGC-823 人胃腺癌细胞株 （购自中国科学院细胞库）。

阳性对照为蟾毒灵 （按常规方法配制);纯度由 HPLC-UV检测 98 %以上，结构由 NMR 确证。 待测化合物和阳性对照物以生理盐水稀释， 浓度梯度为 10— ⁴ M、 10— ⁵ M、 10— ⁶ M、 10 M、 10— ⁸ M。

2) 实验方法

SRB还原法：

根据细胞生长速率， 将处于对数生长期的肿瘤细胞以 100 孔接种于 96孔培养板， 贴壁生长 24小时再加待测化合物或阳性对照物 10 L /孔。 每个浓度设三复孔。 并设相应 浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿 瘤细胞在 37 °C、5% C0 ₂ 条件下培养 72小时， 然后倾去培养液 （RPMI-1640), 用 10%冷 TCA固定细胞， 4 °C放置 1小时后用蒸馏水 洗涤 5次， 空气中自然干燥。 然后加入由 1 %冰醋酸配制的 SRB ( Sigma) 4 mg/mL溶液 100 μΙ7孔， 室温中染色 15分钟， 去上清液， 用 1% 醋酸洗涤 5次， 空气干燥。 最后加入 150 μΙ7孔的 Tris溶液， 酶标仪 515 nm波长下测定 A值。按以下列公式计算肿瘤细胞生长 的抑制率：

抑制率％= [(阴性对照吸光值 -空白吸光值 M样品吸光值-空白吸光值) ]/(阴性对照吸光 值-空白吸光值) xl 00%

药物作用浓度： 10 μΜ、 1 μΜ、 0.1 μΜ、 10 ηΜ、 1 ηΜ、 0.1 ηΜ。

用 GraphPad Prism 4 拟合出 IC ₅₀ 。

对我们制备的衍生物首先在人源 Hela肿瘤细胞株上进行细胞增殖抑制活性的评� �， 结果见表 1。

表 1、 部分蟾毒灵 (BufaHn)衍生物对人源 Hela肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性 化合物 IC ₅₀ (nM) 化合物 IC ₅₀ (nM) 化合物 IC ₅₀ (nM)

蟾毒灵 7.27 II1D-03 3.49 II1D-23 1.12

II1B-01 1.79 II1D-04 37.97 II1D-24 7.30

II1B-02 3.73 II1D-06 0.45 II1D-25 5.44

II1B-03 1.58 II1D-07 2.60 II1E-01 1.40

II1B-04 2.17 II1D-10 16.27 II1E-02 4.31

II1B-05 1.65 II1D-12 41.75 II1E-03 0.80

II1B-06 1.11 II1D-14 23.13 III1D-02 5.68

II1B-07 1.15 II1D-16 44.65 III1D-03 41.62

II1B-08 3.43 II1D-19 5.80 III1D-04 3.98

II1B-09 5.72 II1D-20 1.19 III1E-01 7.20

II1B-10 1.82 II1D-22 7.34 III1E-02 8.68 通过对蟾毒灵衍生物抑制人源 Hela肿瘤细胞株的细胞增殖活性评价， 发现部分蟾毒 灵衍生物抑制人源 Hela肿瘤细胞株的细胞增殖活性强于蟾毒灵。

选取了活性较强的部分蟾毒灵衍生物对几种人 源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性进 行了评价， 结果见表 2。

表 2、 部分蟾毒灵 (Bufalin)衍生物对几株人源肿瘤细胞株的细胞增 殖抑制活性

以上实验数据表明部分蟾毒灵衍生物对多种人 源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性都 有明显地提高。

评价了蟾毒灵、 II1E-01和 II1E-01*HC1对 17株人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性， 结果见表 3。

表 3、 蟾毒灵和 II1E-01、 II1E-01*HC1对人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活� ��

以上实验数据表明蟾毒灵衍生物 II1E-01和 II1E-01.HC1对所选的 16株 （Hep3B除 外） 人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性都有明显 地提高。 试验实施例 2化合物 II1E-01*HC1小鼠体内急性毒性实验

1) 受试样品

样品名称： 蟾毒灵、 II1E-01*HC1

2) 试验方法

称取 35.8 mg II1E-01 HC1,加入 1.78 mL无水乙醇，超声完全溶解，加入 16.02 mL 5% 葡萄糖注射液振荡混匀， 用 0.2 μηι滤膜过滤， 为浓度为 2 mg/mL原液 （其中乙醇含量为 10%), 按小鼠给药体积为 0.1 mL/10 g体重计算， 其最高剂量为 20 mg/kg。

3) 试验结果

试验结果显示， 化合物 II1E-01*HC1雄鼠静脉给药的 LD _5Q 约为 13.60 mg/kg， 雌鼠静 脉给药的 LD _5Q 约为 16.51 mg/kg; 雄鼠腹腔给药的 LD _5Q 约为 14.75 mg/kg, 雌鼠腹腔给药 的 LD _5Q 约为 18.21 mg/kg; 蟾毒灵雄鼠腹腔给药的 LD _5Q 约为 2.4 mg/kg, 蟾毒灵雌鼠腹腔 给药的 LD _5Q 约为 2.8 mg/kg。上述实验结果说明化合物 ΙΙ1Ε-01·Ηα在小鼠体内的急性毒 性低于蟾毒灵。 试验实施例 3对人源肺癌 Α549细胞裸鼠移植瘤的体内疗效评价

1) 试验目的

评估化合物蟾毒灵、 II1D-06*HC1、 II1E-01 HC1 II1B-02 HC1对移植于裸鼠的人肺 癌 A549肿瘤生长的体内药效。

2) 材料方法

溶剂对照： 4%DMSO & 2%Tween-80 & 5%PEG-400生理盐水溶液

1) DMSO: SIGMA-ALDRICH CHEMIE GMBH公司。 2) Tween-80: SIGMA-ALDRICH CHEMIE GMBH公司。 3) PEG-400:南京威尔化工有限公司。 4)生理盐水： 上海长征富民药 业华中有限公司。

受试化合物： 蟾毒灵、 化合物 II1B-02'HC1、 II1E-01 HC1 II1D-06'HC1。

配制方法： 化合物用 DMSO溶解后配制成储存原液， DMSO终浓度为 4%， 配制成注射 液。

阳性对照药： 雷帕霉素 （Rapamycin) 配制方法： DMSO终浓度为 5%， 配制成注射液。 3) 实验方法与结果

肿瘤生长至大约 200 mm ³ ， 根据肿瘤大小将荷瘤鼠随机分为 8组， 包括溶剂对照组、 阳性对照组雷帕霉素 5 mg/kg组、 化合物 II1E-01*HC1 2 mg/kg, 化合物 II1E-01*HC1 4 mg/kg 化合物 II1E-01*HC1 6 mg/kg 化合物 II1B-02*HC1 4 mg/kg 化合物 II1D-06*HC1

4 mg/kg、蟾毒灵 1.6 mg/kg (剂量选择：蟾毒灵 1.6 mg/kg为最大可耐受剂量， II1E-01*HC1

6 mg/kg为最大可耐受剂量）。 其中， 雷帕霉素静脉注射给药， 每周一次， 其他各组腹腔 注射给药， 隔天给一次。 21天后， 将瘤块称重以计算抑瘤率。 抑瘤率 （IR)计算公式为： IR = (W _c - W _T ) / W _C X 100%, 其中， W _c 表示对照组瘤重； W _T 表示治疗组瘤重。 结果见 表 4。

表 4、 对人非小细胞肺癌 A549裸小鼠移植瘤的疗效

剂 量 5口 S3 动物数 瘤重 (g) 抑瘤率 组 别

(mg/kg) 方 案 始 1

1 终 平均值 ±标准差 % 溶剂对照组 溶剂 15 / ¹ 15 1.6833±0.0564 - 雷帕霉素 5 iv 6 / ' 6 0.6925±0.0652** 58.86%

II1E-01 HC1 2 10 / ' 10 1.1375±0.1044** 32.43%

II1E-01 HC1 4 10 / ¹ 10 0.4953±0.0301** 70.57%

II1E-01 HC1 6 10 / ¹ 10 0.2070±0.0193** 87.70%

II1D-06 HC1 4 6 / , 6 1.0580±0.0866* 37.15%

II1B-02 HC1 4 6 / ' 6 0.7013±0.0707* 58.34% 蟾毒灵 1.6 6 / ' 6 1.5320±0.0624* 8.99% 注： 与溶剂对照组比较， *P<0.05， **P<0.01; ip: 腹腔注射给药； iv: 静脉注射给药;

II1B-02 HC1 II1E-01*HC1具有明显抑制人肺癌 A549的生长， 其中 II1E-01*HC1 的抑瘤活性最强，且抑制作用具有剂量依赖性 。而蟾毒灵在最大可耐受剂量下（1.6 mg/kg) 没有显示出抑瘤活性。 试验实施例 4 II1E-01*HC1对人源肝癌 HepG2细胞、 人源乳腺癌 MDA-MB-231细胞、 人 源肺癌 H469细胞、 人源结肠癌 HCT-116细胞、 人源淋巴 MV-4-11细胞、 人源 前列腺 PC-3细胞裸鼠移植瘤的疗效评价

1) 实验目的 考察化合物 II1E-01*HC1对人源肝癌 HepG2细胞、 人源乳腺癌 MDA-MB-231细胞、 人源肺癌 H469细胞、 人源结肠癌 HCT-116细胞、 人源淋巴 MV-4-11细胞、 人源前列腺 PC-3细胞裸鼠移植瘤的体内生长的抑制作用。

组

2) 试验材料

别

对照溶剂配制（5%无水乙醇 & 5%葡萄糖水溶液)： 量取 2.5 mL无水乙醇， 装入 50 mL离心管， 加入 47.5 mL浓度为 5%注射用葡萄糖溶液， 振荡混匀； 室温保存备用。 化合物制剂配制 (II1E-01HC1): 分别配置浓度为 0.4 mg/mL和 0.6 mg/mL浓度 的给药制剂。称取适量 II1E-01*HC1装入 50mL离心管中， 加入适量溶剂， 在涡旋混合仪 上涡旋混合， 待固体物质全部溶解后分装于 4 mL棕色瓶中， 2〜8°C冰箱保存。 阳性对照药： 长春瑞滨 （Vinorelbine); 雷帕霉素； 舒尼替尼 （Sunit iib)。 溶剂材料： 吐温 -80 (Tween-80); 聚乙二醇 -400 (PEG-400) ； 无水乙醇； 0.5%葡萄 糖注射液； 生理盐水。 试验动物： Balb/c裸小鼠 （雄性， 6周龄）。 移植性肿瘤瘤株： 人源肝癌 HepG2细胞、人源乳腺癌 MDA-MB-231细胞、人源肺癌 H469细胞、 人源结肠癌 HCT-116细胞、 人源淋巴 MV-4-11细胞、 人源前列腺 PC-3细胞

3) 试验方法与结果

表 5、 对人源肝癌 He G2裸小鼠移植瘤的疗效

瘤重 (g)

给药方法 抑瘤率 （％)

Mean± S.E 溶剂对照组 溶剂 iv，QODxl4d 10/10 0.7656±0.0300 雷帕霉素 10 iv, QW l4d 10/10 0.4806±0.0269** 37.23% 长春瑞滨 8 iv, QW l4d 10/10 0.4719±0.0660** 38.36%

II1E-01HC1 2 iv, QOD l4d 10/10 0.3177±0.0410** 58.50%

II1E-01HC1 4 iv, QOD l4d 10/10 0.0938±0.0121** 87.75%

II1E-01HC1 6 Iv, QOD xl4d 10/10 0.0262±0.0054** 96.58% 注： 与溶剂对照组比较， *P<0.05， **P<0.01, HepG2细胞在体外培养扩增， 收取对数生长期细胞， 重悬于 DMEM无血清培养液后 接种于裸鼠右前肢腋窝皮下， 11天后， 肿瘤生长至约 250 mm ³ ， 根据肿瘤大小将荷瘤鼠 组

分为 6组， 包括溶剂对照组、 阳性对照雷帕霉素 10 mg/kg组和长春瑞滨 8 mg/kg组， 受 别

试物 II1E-01.HC1设为低、 中、 高三个剂量组， 分别为 2 mg/kg、 4 mg/kg禾卩 6 mg/kg。 各 组均尾静脉注射给药， 溶剂对照尾静脉注射给予空白溶剂， 隔天给药 1 次 （QOD ) ; II1E-01 HC1低、 中、 高三个剂量组隔天给药 1次 (QOD), 阳性对照雷帕霉素 10 mg/kg 组和长春瑞滨 8 mg/kg组每周给药一次 （QW)， 给药周期均为 2周。 观测肿瘤及动物生 长情况。 连续给药两周 （接种后第 25天） 后，， 计算瘤重和抑瘤率， 结果见表 5。 阳性对照雷 帕霉素 10 mg/kg 和长春瑞滨 8 mg/kg 组的抑瘤率分别为 37.23%和 38.36%， 受试物 II1E-01 HC1 2 mg/kg组、 4 mg/kg组和 6 mg/kg组抑瘤率分别为 58.50%、87.75%和 96.58%。 阳性对照组和各受试组瘤重与溶剂对照组比较 均存在极显著性差异 （P<0.01 )。 表 6、 对人源 MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的疗效

剂 量

给药方法 抑瘤率 (mg/kg) 始 I终 平均值 ±标准差

溶剂对照组 空白溶剂 iv, QODx7d 10 / ' 10 3.1160±0.2051 -

II1E-01 HC1 2 iv, QODx7d 10 / ' 10 2.6063±0.2731 16.36%

II1E-01 HC1 4 iv, QODx7d 10 / ' 10 2.0569±0.1340** 33.99%

II1E-01 HC1 6 iv, QODx7d 10 / ' 10 1.4887±0.1763** 52.23% 注： 与溶剂对照组比较， *P<0.05， **P<0.01

MDA-MB-231瘤块接种 19天后，瘤块生长至约 617 mm ³ ,开始分组给药。 II1E-01 HC1 组每两天给药一次 （QOD), 溶剂对照组给予空白溶剂。 试验结束时计算瘤重和抑瘤率， 结果见表 6。 高、 中剂量组对 MDA-MB-231移植瘤生长有明显的抑制作用， 量效关系明 显。 本试验中的瘤块在给药前已经体积长到比较大 （瘤块生长至约 600 mm ³ , 与一般在 200-300 mm ³ 开始给药相比）， 相当于临床中晚期肿瘤。 化合物 IIlE-O HCl 对该 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤模型在中和高剂量组仍然表现出明 显的生长抑制作用， 提示可 能有较高的临床应用价值。 表 对人源肺癌 H460裸小鼠移植瘤的疗效

剂 量 动物数 瘤重 (g)

组 别 给药方法 抑瘤率 （％)

(mg/kg) 始 I终 平均值 ±标准差

溶剂对照组 溶剂 iv，QOD x21d 10/ 10 1.3468±0.1514 -

II1E-01 HC1 4 iv, QOD x21d 10/ 10 0.5125±0.0307** 61.94%

II1E-01 HC1 6 iv, QOD x21d 10/ 10 0.3246±0.0692** 75.90% 注： 与溶剂对照组比较， **P<0.01。 采用瘤块接种方法，建立 NCI-H460移植瘤模型；接种 19天后，肿瘤生长至约 210 mm ³ , 根据肿瘤大小采用随机区组法将荷瘤鼠分为 3组， 每组 10只， 包括溶剂对照组、 受试样 品 IIlE-O HCl 4 mg/kg QOD和 IIlE-O HCl 6 mg/kg QOD剂量组。 溶剂对照组尾静脉注 射给药 5%葡萄糖， 隔天 1次； 受试样品尾静脉注射给药， 隔天 1次。 给药周期 21天， 给药期间观测肿瘤及动物生长情况。 连续给药 21天（接种 40天）后， 计算瘤重和抑瘤率， 结果见表 7。 ΙΙ1Ε-01·Ηα高（6 mg/kg QOD ) , 低 （4 mg/kg QOD ) 剂量组均显示出明显的抗肿瘤生长作用， 抑瘤率分别 为 75.90% ( P<0.01 ) 和 61.94% (P<0.01 )。

表 8、 对人源结肠癌 HCT-116裸小鼠移植瘤的疗效 剂 量 动物数 瘤重 (g)

组 别 给药方法 抑瘤率 （％)

(mg/kg) 始 I终 平均值 ±标准差 溶剂对照组 溶剂 iv，QOD x l4d 10/ 10 1.2691±0.0966 -

II1E-01 HC1 4 iv, QOD l4d 10/ 10 0.8017±0.0480** 36.82%

II1E-01 HC1 6 iv, QOD l4d 10/ 10 0.4147±0.0212** 67.33% 注： 与溶剂对照组比较， **P<0.01。

HCT-116细胞在体外培养扩增， 收取对数生长期细胞， 重悬于 RPMI-1640无血清培养 液后接种于裸鼠右前肢腋窝皮下； 14天后， 肿瘤生长至约 470 mm ³ ; 根据肿瘤大小采用 随机分组法将荷瘤鼠分为 3组， 包括溶剂对照组、 受试物 II1E-01*HC1 4 mg/kg剂量组和 IIlE-OlflCl 6 mg/kg剂量组。 溶剂对照组尾静脉注射葡萄糖注射液， 隔天 1次； 受试药 物 ΙΙ1Ε-01·Ηα尾静脉注射给药（iv)， 隔天 1次， 连续 14天， 观测肿瘤及动物生长情况。 连续给药 14天（接种第 28天）后，计算瘤重和抑瘤率，结果见表 8。受试物 II1E-01*HC1 在 4 mg/kg QOD、 6 mg/kg QOD齐 U量下， 抑瘤率分别为 36.82%、 67.33%。 表 9、 对人源白血病 MV-4-11裸小鼠移植瘤的疗效 剂 量 动物数 瘤重 (g)

组 别 给药方法 抑瘤率 （％)

(mg/kg) 始 I终 平均值 ±标准差 溶剂对照组 溶剂 ig，QD x21d 6/6 2.8348±0.3005 - 舒尼替尼 40 ig, QD x21d 6/6 0.0000±0.0000** 100.00%

II1E-01HC1 4 iv, QOD x21d 6/6 0.0000±0.0000** 100.00% 注： 与溶剂对照组比较， **P<0.01。

MV-4-11细胞在体外培养扩增， 收取对数生长期细胞， 重悬于 IMDM无血清培养液后 接种于裸鼠右前肢腋窝皮下， 37天后， 肿瘤生长至约 270 mm ³ ， 根据肿瘤大小采用随机 区组法将荷瘤鼠分为 3组， 每组 6只， 包括溶剂对照组、 阳性对照舒尼替尼 40 mg/kg组， 受试样品 IIlE-0 HC14mg/kgQOD。 阳性对照组灌胃给药， 每天 1次 （QD); 受试样品 组尾静脉注射给药， 隔天 1次。 给药周期 21天， 给药期间观测肿瘤及动物生长情况。 连续给药 21天 （接种 58天） 后， 计算瘤重和抑瘤率， 结果见表 9。 阳性对照舒尼替 尼在 40 mg/kg剂量下显示出明显抗肿瘤作用， 给药 10天后肿瘤完全萎縮消失， 试验结束 时， 抑瘤率为 100.00% (P<0.01); 受试物 II1E-01'HC1在 4mg/kgQOD剂量下， 给药 14 天后肿瘤完全萎縮消失， 试验结束时， 抑瘤率为 100.00% (P<0.01)。