Mikroorganismen Burkholderia rhizoxina, neue Endosymbionten aus Rhizopus sp. und Verfahren zur Herstellung von Rhizoxin und / oder Rhizoxin-Derivaten unter Verwendung dieser Mikroorganismen

Erfindung betrifft Mikroorganismen Burkholderia rhizoxina, neue Endosymbionten aus Rhizopus sp. und Verfahren zur Herstellung von Rhizoxin und / oder Rhizoxin-Derivaten unter Verwendung dieser Mikroorganismen.

Rhizoxin [(1) in Tabelle 1] ist ein Polyketidmetabolit mit antifungaler und zytotoxischer Wirkung, der aus verschiedenen Pilzen der Gattung Rhizopus (z.B. Rhizopus microsporus) isoliert wurde (J. Jennessen et al. 2005, J. Agric. Food Chem. 53: 1833-18409).

Die zytotoxische Wirkung des Rhizoxin kommt durch eine sehr effektive Bindung an ß-Tubulin zustande, was die Hemmung der Mitose zu Folge hat (Y. Koga-Ban et al. 1995, DNA Res. 2: 21-26; M. Takahashi et al. 1987, Biochim. Biophys. Acta 926: 215-223).

Aufgrund dieser antimitotischen Aktivität, die in den meisten eukaryotischen Zellen beobachtet wird, insbesondere in verschiedenen humanen Tumorzelllinien, hat Rhizoxin großes Interesse als potentieller Antitumorwirkstoff geweckt (T. Tsuruo et al. 1986, Cancer Res. 46: 381-385; A. Jordan et al. 1998, Med. Res. Rev. 18: 259-296).

ähnlich starke antifungale und antitumorale Wirkungen wurden auch für die Rhizoxin-Derivate [(29 bis (10) in Tabelle 1] beobachtet (S. Kiyoto et al. 1986, J. Antibiot. 39: 762-772; S. Iwasaki et al. 1986, J. Antibiot. 39: 424-429; S. Iwasaki et al., 1986, Chem. Pharm. Bull. 34: 1387-1390).

Die Produktion von Rhizoxin und seinen Derivaten durch Fermentation von Rhizopus-Stämmon und die Aufreinigung der zytotoxischen Verbindungen ist jedoch aufwendig und die Ausbeute an Rhizoxin oder Derivaten von Rhizoxin ist gering.

Aufgabe der Erfindung ist es, neue Mikroorganismen bereitzustellen, die Rhizoxin oder Derivaten von Rhizoxin synthetisieren und ein Verfahren zur Herstellung von Rhizoxin oder Derivaten von Rhizoxin

anzugeben, das die Nachteile des Standes der Technik vermeidet und Rhizoxin und / oder seine Derivate aufwandgeringer und mit einer höheren Ausbeute bereitstellt.

Unter dem Ausdruck „Derivat" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Varianten verstanden, die die gleichen funktionellen Eigenschaften wie Rhizoxin besitzen. Die Derivate können auch eingeschränkte funktionelle Eigenschaften besitzen.

überraschender weise wurde gefunden, dass nicht die Rhizopus sp.- Stämme die Produzenten von Rhizoxin sind, sondern bakterielle Endosymbionten Burkholderia rhizoxina, die eng mit Spezies der Gattung Burkholderia verwandt sind, diese Naturstoffe produzieren und dass diese bakteriellen Endosymbionten aus Rhizopus sp. dazu geeignet sind, die Herstellung von Rhizoxin und / oder seinen Derivaten aufwandgeringer und mit einer höheren Ausbeute in Flüssigkultur zu ermöglichen.

Die Isolation der bakteriellen Endosymbionten erfolgt erfindungsgemäß aus Rhizoxin-Bildnern, wie z.B. Rhizopus microsporus van Tieghem var. chinensis (ATCC 62417), Rhizopus sp. F-1360 (ATCC 20577), Rhizopus microsporus var. microsporus (Stämme CBS 699.68 und CBS 308.87), indem man die Rhizopus-Stämme in flüssigen Medium (1 % Mais-Stärke, 0.5 % Glycerol, 1 % Glutenmehl, 1 % Hefe, 1 % Cornsteep, und 1 % CaCO ₃ - pH 6.5) oder Malzextrakt-Pepton-Medium bei 30 ⁰ C und Schütteln bei 120-200 rpm kultiviert, das Mycel einer wachsenden Rhizopus-Kultaτ (bspw. 20 ml) anschließend in ein Gefäß (bspw. 50 ml-Gefaß) überführt, mechanisch durch Pipettieren zerteilt und mechanisch aufschließt. Die aufgeschlossenen Zellen waren einer Gradientenzentrifugation unterworfen (bspw. 500 rpm für 5 min, 4000 rpm für 20 min). Nach jedem Zentrifugationsschritt werden Aliquots des überstands auf Agarplatten (5.0 g Pepton, 3.0 g Fleischextrakt, 15.0 g Agar, 1000 ml Wasser) ausgestrichen und bei 30 ⁰ C inkubiert. Die vereinzelten Kolonien des Endosymbionten sind nach der Kultivierung als Reinkulturen von den Platten isolierbar.

Es ist bspw. der Endosymbionten-Stamm DSM 17360 (Burkholdeήa rhizoxinä) isolierbar.

Der Stamm Burkholdeήa rhizoxinä (DSM 17360) wurde in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig. Mascheroder Wege 1, unter der Bezeichnung hinterlegt.

Der Endosymbionten-Stamm DSM 17360 unterscheidet sich von den bisher bekannten Stämmen anhand seiner 16S r-RNA-Sequenz, wie in der phylogenetischen Veranschaulichung in Fig. 1 dargestellt.

Erfindungsgemäß können die auf diese Weise erhaltenen bakteriellen Kolonien (Burkholderia rhizoxina-Stämmo) für die Herstellung von Rhizoxin und Rhizoxin-Derivaten wie folgt eingesetzt werden: Die Fermentation der Bakterien-Stämme erfolgt als Submerskultur in flüssigen Medium (1 % Maisstärke, 0.5 % Glycerol, 1 % Glutenmehl, 1 % Hefe, 1 % Cornsteep und 1 % CaCO ₃ - pH 6.5) bei 30 ⁰ C oder 5.0 g Pepton und 3.0 g Fleischextrakt in 1000 ml Wasser bei 30 ⁰ C.

Das Rhizoxin bzw. die Rhizoxin-Derivate sind aus dem Kulturüberstand gewinnbar, indem mit organischen Lösungsmitteln, z.B. Ethylacetat, extrahiert wird. Alternativ können bekannte Verfahren zur Festphasenextraktion eingesetzt werden.

Die Ausbeute an Rhizoxin bzw. die Rhizoxin-Derivate liegt dabei in einem Bereich von 10 mg/1 bis über 200 mg/1 Kulturüberstand.

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