Die Zahl der Erkrankungen an Diabetes nimmt weltweit stetig zu. Proportional dazu steigt der Bedarf an Insulin oder Derivaten des Insulin. Damit besteht die Aufgabe, die bestehenden Verfahren hinsichtlich der Ausbeute an Wirkstoff zu optimieren. Im Europäischen Patent EP-B1 0 489 780 ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin oder Derivaten hiervon vorgeschlagen. Die dort beschriebenen Vektoren dienen zur Herstellung von Humaninsulin mit dem Plasmid pINT90d oder als Ausgangsplasmide zur Konstruktion des in der Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 821 006 beschriebenen Plasmides pINT302d, das zur Herstellung eines His (B31) His (B32) Gly (A21)-Insulinderivates dient, oder zur Konstruktion des in der Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 885 961 beschriebenen Vektors plNT329d, der zur Herstellung des Lys (B3) Glu (B29) Insulinderivates dient.

Es wurde nun gefunden, daß besonders vorteilhafte Proinsulinderivate solche der Formel I sind, Fus-B (1-30)-RDVP-Yn-A (1-21) (I) ; wobei Fus ein optional vorhandener Fusionsanteil beliebiger Sequenz ist ; B (1-30) die B-Kette von humanem Insulin ist, Y für eine Aminosäurekette steht, welche mit einer basischen Aminosäure C-terminal endet ; n gleich 2 bis 50 ist und die Länge der Aminosäurekette Y angibt ; und A (1-21) die A-Kette von humanem Insulin ist,

und die A-und/oder die B-Kette durch Aminosäureaustausche, Deletionen und/oder Additionen modifiziert sein können. Überraschend werden dabei je nach Zusammensetzung der Insulin A-bzw.-B-Kette gleiche und voneinander verschiedene Vorteile beobachtet.

Verbindet man die humane B-mit der humanen A-Kette über das vorteilhafte C-Peptid, so entsteht ein Proinsulin, das sich bzgl. Expressionsausbeute wie Wildtyp-Proinsulin verhält, dessen enzymatische Prozessierung zu Insulin aber leichter steuerbar ist, so daß keine störende Spuren von um Arginin verlängerter B-Kette entstehen, die bei der Herstellung zum Arzneimittel abgetrennt werden müssen, wodurch Ausbeuteverluste auftreten.

Verbindet man eine um di-Histidin C-terminal verlängerte B-Kette mit der A-Kette von Humaninsulin, die in Position A21 Glycin enthält, mit dem erfindungsgemäßen C- Peptid, so beobachtet man eine um ca. 20% höhere Expressionssausbeute im Vergleich zu den mit dem Plasmid pINT90d erzielbaren Ausbeuten und eine fast fünffach höhere Ausbeute, als dies mit dem Plasmid pINT302d beobachtet wurde.

Zudem ist die Steuerung der enzymatischen Prozessierung ebenso vereinfacht, wie vorher beschrieben wurde.

Verbindet man eine Lys (B3) Glu (B29) modifizierte B-Kette mit der A-Kette von Humaninsulin über das modifizierte C-Peptid, so beobachtet man verbesserte Faltungseigenschaften des Proinsulinderivates im Vergleich zu dem von pINT329d kodierten Proinsulin. Die Ausbeute an Rohfusionsprotein ist erhöht und erreicht ein gleiches Niveau wie mit dem Plasmid plNT9Od beobachtet wird. Zudem ist die Steuerung der enzymatischen Prozessierung vereinfacht.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des neuen C-Peptids ist durch folgende Aminosäuresequenz charakterisiert : CGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTG R D V P Q V E L G G G P G A G S L Q P L -

GCGCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGC (SEQ ID NO. : 1) A L E G S L Q K R (SEQ ID NO. : 2) Ebenfalls angegeben ist eine von vielen möglichen DNA-Sequenzen, die für das angegebene C-Peptid kodiert.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Vorläufer von humanem Insulin oder eines Insulinanalogons der Formel I Fus-B (1-30)-RDVP-Yn-A (I) ; wobei Fus ein optional vorhandener Fusionsanteil beliebiger Sequenz ist ; B (1-30) die B-Kette von humanem Insulin ist, Y für eine Aminosäurekette steht, welche mit einer basischen Aminosäure C-terminal endet ; n gleich 2 bis 50 ist und die Länge der Aminosäurekette Y angibt ; und A (1-21) die A-Kette von humanem Insulin ist, und die A-und/oder die B-Kette durch Aminosäureaustausche, Deletionen und/oder Additionen modifiziert sein können, insbesondere wobei Yn für die Aminosäuren 5 bis 35 des C-Peptids von humanem oder Affen-Insulin steht, bevorzugt, wobei Yn für die Aminosäuren 11 bis 35 von humanem Insulin steht.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Vorläufer wie oben beschrieben, wobei die B-Kette von humanem Insulin die Modifikationen Lys (B3) Glu (B29) oder wobei die B-und A-Ketten von humanem Insulin die Modifikationen His (B31) His (B32) Gly (A21) enthalten.

Darüberhinaus ist Gegenstand der Erfindung eine DNA, kodierend für einen Vorläufer wie oben beschrieben.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend eine DNA, kodierend für einen Vorläufer wie oben beschrieben, vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Expressionsvektor geeignet zur Expression in E. coli ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine E. coli-Zelle, enthaltend einen Vektor wie oben beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers wie oben beschrieben, wobei (a) eine DNA wie oben beschrieben in einen Vektor wie oben beschrieben eingebracht wird ; (b) der Vektor aus (a) in eine E. coli-Zelle eingeschleust wird ; (c) die E. coli-Zelle aus (b) enthaltend den Vektor aus (a) zur Expression benutzt wird ; und (d) der Vorläufer aus dem Kulturüberstand isoliert wird.

Darüberhinaus ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer DNA wie oben beschrieben, wobei (a) ausgehend von der cDNA des humanen oder Affen-Insulin mittels PCR und anderer molekularbiologischen Techniken diese DNA erzeugt und (b) isoliert wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von humanem Insulin, oder eines Insulinanalogons, wobei (a) ein Vorläufer wie oben beschrieben gemäß dem Verfahren wie oben beschrieben erzeugt wird ; (b) der Vorläufer gemäß (a) unter geeigneten Bedingungen so gefaltet wird, daß sich die Disulfidbrücken wie in Humaninsulin ausbilden können, und der RDVP-Yn-Teil und gegebenenfalls der Fusionsanteil Fus enzymatisch entfernt werden ; und (c) das humane Insulin oder das Insulinanalogon aufgereinigt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Vorläufers wie oben beschrieben zur Herstellung von Insulin oder eines Insulinanalogons, vorzugsweise wobei die Herstellung von Insulin oder einem Insulinanalogon gemäß dem Verfahren wie oben beschrieben erfolgt.

Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer DNA wie oben beschrieben zur Herstellung eines Vorläufers wie oben beschrieben.

Auch ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines Vektors wie oben beschrieben zur Herstellung eines Vorläufers wie oben beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer E. coli-Zelle wie oben beschrieben zur Herstellung eines Vorläufers wie oben beschrieben.

Die Erfindung wird nun anhand der Beispiele näher erläutert, ohne sich aber darauf zu beschränken.

Beispiel 1 : Expression von Proinsulinderivaten Die Expression erfolgt wie in EP-B1 0 489 780 beschrieben. Dabei können bei Fermentation im großen Volumen Modifikationen eingeführt werden. Beim Vergleich der Expressionsraten werden aber stets die gleichen Bedingungen eingehalten.

Für das Arbeiten in größeren Maßstäben gilt folgendes aligemeines Fermentationsrezept, das beispielhaft für ein Volumen von 7,5 Litern beschrieben wird : Fermentationsvolumen : 7, 51 Sterilisationsbedingungen : 121°C, 20 Minuten, bei pH 3,5, nach Sterilisation mit NH3 auf 7,0 eingestellt.

Fermentationstemperatur : 37°C pH-Regulierung : pH 7,0, Einstellung mit 25% Ammoniakwasser

Rührerdrehzahl : 1500 UpM Belüftung : 15 Nl/min (2 wm) Dauer : ca. 24h Feeding : 65% ige Glucose wurde ab einem OTR-Wert von 200 mmoll-1h-1 mit einer konstanten Rate von 12 gl-1 h-1 zudosiert.

Vorkultur : Eine Schüttelkultur wurde mit einer Seed-Ampulle beimpft und für 3-4h bei 37°C, 250 UpM bis zu einer OD A540-I inkubiert.

Beimpfung : Die Fermenter wurden mit etwa 40 ml Vorkultur angeimpft.

Induktion : Bei einer A540 von >40 mit 40 mg/l (300 mg/Fermenter) Indolpropionsäure gelöst in ca. 10 ml einerwäßrigen Na2CO3-Lsg. (mit 0, 17g Na2CO3).

Hierbei bedeuten NI = Normliter, wm = VolumenNolumen/Minute und OTR = Oxygen Transfer Rate.

Fermentationsmedien : Rezeptnummer GAI 100/95-000 : Menge g/l Glucose-1-hydrat, D (+) min. 80% 44 Citronensäure-1-hydrat 3,48 Ammoniumsulfat min. 95% 6,0 Phosphorsäure, ortho, 85% 2,99 Di-Kalium-hydrogenphosphat 1,18 Natriumsulfat 3,0 Magnesiumsulfat-7-hydrat, minimum 98% 2,0 Eisen(III)-sulfat x H20 0, 5 Spurenelementlsg. : RL 1/85-000 1,0 ml Thiamin-HCI 0,005 Desmophen 3600 0,5

Spurenelementisg. : RL 1/85-000 Menge q/l Kupfer (I I) sulfat-5-hydrat 1,6 Kaliumjodid 4,0 Ammoniummolybdat-4-hydrat 8,0 Mangan (II)-sulfat-1-hydrat 12,3 Zinksulfat-7-hydrat 16 Borsäure 20 Medium im Schüttelkolben : Menge g/l Hefeextrakt 8,0 Glucose 1, 0 NaCl 3,5 KH2PO4 1,32 K2HP04 3,68 Beispiel 2 : Herstellung von Insulinen Die Herstellung von Insulinen erfolgt gemäß bekannter Methoden, wie sie z. B. in EP- B1 0 489 780 oder EP-A 0 885 961 beschrieben oder diskutiert wurden. Bevorzugt zur Faltung und Aufarbeitung des jeweiligen Fusionsproteins ist dabei die in EP-B1 0 668 282 (s. Beispiel 2) beschriebene Methode. Dabei kann nach Faltung entsprechend EP 0 288 809 der Ansatz vor weiterer Aufarbeitung filtriert werden.

Beispiel 3 : Konstruktion des Plasmids pINT358d kodierend für das in bezug auf die C-Kette derivatisierte humane Proinsulin B-RDVP C11-35-A Zur Herstellung des Plasmides wurden die in EP-B1 0 489 780 beschriebenen Primer Tir und lnsu11 verwendet. Zusätzlich wurden zwei neue Primersequenzen synthetisiert.

Primer PlNT358fill hat folgende Sequenz : 5'-CCC AAG ACC CGC GAT GTT CCT CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT-3' (SEQ ID NO. : 3) B28 B29 B30 Arg Asp Val Pro C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 (SEQ ID NO. : 4) Primer PINT358revll hat die Sequenz : 5'-CAGCTCCACCTGAGGAACATCGCGGGTCTTGGGTGTGTAG-3' (SEQ ID NO. : 5) Mit DNA des Plasmides pINT90d als Matrize werden mit den Primerpaaren Tir/PINT358revil und Insu11/PINT358fIII entsprechend EP-B1 0 489 780 je eine PCR durchgeführt. Aliquots der Produkte der beiden Reaktionen werden kombiniert und zusammen mit dem Primerpaar Tir/Insu11 in einer dritten PCR eingesetzt. Das Produkt dieser Reaktion wird mit den Enzymen Sall/Ncol doppelverdaut und das Produkt dieses Restriktionsverdaus nach Reinigung in die mit Ncol/Sall geöffnete Vektor DNA des ebenfalls in EP-B1 0 489 780 beschriebenen Plasmides pINT91d insertiert. Das so konstruierte Plasmid erhält die Bezeichnung pINT358d. Die Struktur wird mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Kompetente E. coli Zellen werden mit DNA des Plasmides transformiert. Die Expression des Proinsulins in Bakterien erfolgt gemäß. Beispiei 1. Nach Faltung gemäß Beispiel 2 erfolgt die enzymatische Umsetzung des Proinsulin zu Insulin und weitere Reinigung gemäß EP-B1 0 347 781.

Dabei kann im Vergleich zu dem aus pINT90d abgeleiteten Verfahren im lonentauscherchromatographieschritt eine Randfraktion zusätzlich aufgefangen werden, da diese nicht mit Arg (B31)-Insulin kontaminiert ist.

Beispiel 4 : Konstruktion des Plasmides plNT362d zur Herstellung von Lys (B3) Glu (B29)-RDVP-C 35-Proinsulin Zur Konstruktion des Plasmides werden DNA der Plasmide pINT329d und pINT358d als Matrize und die Primer Tir und Insu11 benötigt. Zusätzlich werden zwei neue Primer Salforward und 329rev synthetisiert.

Primer Salforward hat die Sequenz : 5'-TACACACCCGAGACCCGCGATGTTCCTCAGG-3' (SEQ ID NO. : 6)

Dabei markiert der fett gedruckte Sequenzabschnitt die Sequenz, die mit dem Plasmid plNT358dhybridisiertwährend derrestlicheTeil homologzuSequenzendesdie B- Kette kodierenden Abschnittes des Plasmides pINT329d ist.

Primer 329rev hat folgende Sequenz : 5'-CCTGAGGAACATCGCGGGTCTCGGGTGTGTAG-3' (SEQ ID NO. : 7) Dabei markiert der fett gedruckte Abschnitt die Region, die homolog zu dem Antisense Strang ist, der das Ende der B-Kette bildet und das Triplet für Arginin im Plasmid pINT329d beschreibt. Die restliche Sequenz hybridisiert mit Plasmid pINT358d. Zwei PCR-Ansätze werden durchgeführt Dabei dient die DNA des Plasmides plNT329d als Matrize für das Primerpaar Tir/329rev und pINT358d DNA als Matrize für das Paar Salforward/Insu11.

Beide Reaktionen resultieren in Fragmenten, die sich um die Sequenz des Primer Salforward überlappen. Damit können die beiden Fragmente in einer dritten PCR vereinigt werden und mit Hilfe der Primer Tir und Insu11 zu einer DNA-Sequenz zusammengefügt werden, die das Insulinanalogon kodiert. Dieses Reaktionsprodukt wird mit den Restriktionsenzymen Ncol/Sall gespalten und anschließend in das Sall/Ncol geöffnete Vektorfragment aus pINT91d insertiert. Kompetente Zellen des Stammes E.coli K12 MM294 werden mit dem entsprechenden Ligationsansatz transformiert. Plasmid DNA wird von Transformanten isoliert und charakterisiert. Das richtige Plasmid erhält die Bezeichnung pINT362d.

Nach Expression wird eine zu pINT90d vergleichbare Rohausbeute an Fusionsprotein beobachtet. Jedoch ist die beobachtete Faltungsausbeute im Vergleich zu pINT329d um ca 40% besser.

Die Struktur des Fusionsproteins kodiert durch pINT362d sieht wie folgt aus : MATTSTGNSAR FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET RDVPQVELGGGPG

Fusions-B-Kette C-Kette Anteil AGSLQPLALEGSLQKR GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO. : 8) C-Kette (Forts.) A-Kette Beispiel 5 : Konstruktion des Plasmides plNT349d zur Herstellung von His (B31) His (B32) Gly (A21)- )- RDVP -C11-35-Proinsulin Zunächst wird das Plasmid plNT140d, dessen DNA das Insulinanalogon Gly (A21)- Insulin kodiert, hergestellt.

Dazu werden zwei Oligonukleotide zur Verwendung in einer PCR als Primer benötigt : Oligonucleotid Tir wird als'Sense'und Oligonukleotid 140drev als'Antisense'- Primer verwendet : 140drev 5-'AAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTA-3' (SEQ ID NO. : 9) Stop Stop Gly Cys Tyr A21A20 A19 Beide Primer werden in einer Standard PCR mit DNA des Plasmides plNT9Od eingesetzt. Das Reaktionsprodukt wird entsprechend EP-B1 0 489 780 mit den Restriktionsenzymen Ncol und Sall umgesetzt und anschließend in den entsprechend geöffneten Vektor plNT69d eingesetzt. Es entsteht das Plasmid pINT140d das nach Transformation in E. coli K12 MM294 reisoliert und mittels Restriktions-und Sequenzanalyse charakterisiert wird.

Ausgehend von der DNA des Plasmides plNT140d werden zwei PCR-Ansätze durchgeführt. Die erste Reaktion benutzt den Primer Tir und als reversen Primer PINT349a mit folgender Sequenz :

Val Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr (SEQ ID NO. : 10) 5'-CACCTGAGGAACATCGCGGTGGTGGGTCTTGGGTGTGTAG-3' (SEQ ID NO. 11) C12 C11 * * * * * B30 B29 B28 B27 B26 Dabei bezeichnen die mit Stern markierten Sequenzen die Codone für die neu eingeführten Aminosäuren.

Die zweite PCR wird mit den Primern lnu11 und P ! NT349b durchgeführt.

Primer PINT349b hat die Sequenz : Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu (SEQ ID NO. : 12) 5'-ACCCAAGACCCACCACCGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTG-3' (SEQ ID NO. : 13) B28 B29 B30 * * * * * C11 C12 C13 C14 Von Position 34 bis Position 1 der DNA-Sequenz ist der Primer komplementär zu PINT349a. Daher können die Reaktionsprodukte der beiden PCR in einer dritten PCR mit den Primer Tir und Insu11 zu dem DNA-Fragment zusammengefügt werden, das f9r das gewünschte Proinsulinderivat kodiert. Das Produkt dieser Reaktion wird wie beschrieben mit den Enzymen Ncol und Sall umgesetzt und in das mit diesen Enzymen geöffnete Vektorfragment pINT91 d eingesetzt und nach E. coli K12 transformiert. Nach Charakterisierung der Plasmide aus Transformanten erhalten richtige Plasmidkonstruktionen die Bezeichnung pINT349d.

Exprimiert man das Fusionprotein, so zeigt sich ein deutliche Erhöhung der Ausbeute an Fusionsprotein. Die Ausbeute ist überraschend ca 20% höher als dies mit plNT9Od zu erzielen ist und ca. 5 mal größer als mit Plasmid pINT30d erzielt. Die Faltungsrate ist dabei vergleichbar mit der bei Affenpräproinsulin, kodiert von pINT90d, erzielten Rate.